CN108578675A - 一种小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型的建立方法及应用,本发明采用花生蛋白经口致敏和花生蛋白接触皮肤致敏两种方式加强嗜酸性粒细胞的活化和聚集,建立了小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型。通过利用本发明建立的动物模型,本发明还发现鹌鹑蛋灌胃治疗能在治疗期间引起模型组对鹌鹑蛋的免疫反应,对花生蛋白特异性IgE及IgG1都表现出抑制作用,可以降低花生蛋白特异性IgE及IgG1抗体水平,抑制TH2细胞的极化,治疗类EOE样食物过敏反应。本发明为研究和治疗嗜酸性粒细胞食管炎提供了动物模型和便捷的方法。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学与动物医学模型应用领域,特别是涉及一种小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型的建立方法及该模型在研究抗过敏剂对于过敏病症治疗中的作用。
背景技术
嗜酸性粒细胞食管炎(Eosinophilic esophagitis,又称EoE)是一种迟发型食物过敏反应,在西方国家人群中,发病率从每100,000人的10人上升到50人。亚洲已报道的关于EoE疾病的研究相对较少,但有学者发现EoE疾病在亚洲的发病率与西方国家相似。对于许多患者甚至是医生来说,EoE属于一种食物过敏的概念都是陌生的,因为EoE没有表现出过敏疾病典型的症状,如荨麻疹,肿胀,瘙痒,哮喘或过敏性休克。相反,它会引起食道功能障碍,如吞咽困难,食物阻塞,呕吐和疼痛。
美国国家过敏和传染病研究所专家小组将食物过敏定义为由于反复暴露于某种特定食物而发生的不利于健康的特异性免疫反应。一些研究表明EoE作为一种无法消退的食道炎症状态,避免与特定食物过敏原接触能够阻止该疾病的发生,而重复接触特定食物过敏原会导致疾病复发,因此,食物过敏原对EoE疾病的发生至关重要。
嗜酸性粒细胞在EoE发病中发挥关键作用。尤其是在组织、血液和骨髓中升高的嗜酸性粒细胞数量是EoE的标志之一,并且与疾病严重程度相关,这表明嗜酸性粒细胞是EoE的病理生理学中许多关键效应细胞之一。在EoE过敏疾病中,嗜酸性粒细胞的激活能促进各种介质的分泌,包括细胞因子如IL-4、IL-5、IL-13,转化生长因子(TGF)-β,趋化因子如CCL5、RANTES和CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子-1,和脂质介质如白三烯C4。这些介质对炎症反应具有深远的影响,包括上调粘附分子,增强细胞运输和激活,以及调节血管通透性和肌肉收缩。此外,嗜酸性粒细胞分泌毒性颗粒蛋白,其损害肠道上皮细胞,包括嗜酸性粒细胞过氧化物酶、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白、嗜酸性粒细胞衍生神经毒素和主要碱性蛋白,所有这些在EoE病人的组织都显示有明显地增加,促进组织损伤与功能障碍。
目前,由蛋白引发的EoE疾病较为常见,而评价蛋白致敏性最直接的方法是建立一种动物模型。动物模型在了解食物过敏反应发生和发展过程中所包含的复杂的免疫学及病理生理学机制等方面有极高的研究价值,动物模型还可用于研究抗过敏剂对于过敏病症的缓解作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型的建立方法。
本发明的另一目的在于提供鹌鹑蛋在抗过敏中的应用。
本发明首先提供一种小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型的建立方法,通过经口诱导和经皮肤诱导两种方式联合诱导来建立小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型。
所述经口诱导为:选BALB/c小鼠,在实验第0,7和14天分别经腹腔注射50-200μL致敏剂;实验第29-49天,小鼠每隔一天用100-300μL PBS灌胃刺激,所述PBS中溶有1-3μg/μL花生蛋白。
优选地,在实验第0,7和14天分别经腹腔注射100μL致敏剂;实验第29-49天,小鼠每隔一天用200μL PBS灌胃刺激,所述PBS中溶有2μg/μL花生蛋白。
所述BALB/c小鼠为7至8周龄雌性BALB/c小鼠。
所述致敏剂为含1-3μg/μL的花生蛋白和10-30μg/μL氢氧化铝凝胶的PBS溶液。
优选地,所述致敏剂为含2μg/μL的花生蛋白和20μg/μL氢氧化铝凝胶的PBS溶液。
本发明小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型的建立方法中,所述经皮肤诱导是指:将小鼠皮肤用胶带粘贴、剥离反复刺激,实验第1-7天、21-28天和42-49天,小鼠分别进行3次花生蛋白皮肤接触性致敏,并将含有PBS的胶带贴于皮肤致敏5-9天后取下,所述PBS含有花生蛋白。所述PBS含有2-6μg/μL花生蛋白。优选地,所述PBS含有4μg/μL花生蛋白。
优选地,小鼠皮肤剃毛后用密封胶带粘贴于剃毛处反复剥离刺激4-8次。在本发明的一个较佳实施例中,将小鼠经背部剃毛后用苏格兰密封胶带粘贴于剃毛处反复剥离刺激6次。
单纯使用花生蛋白经口诱发嗜酸性粒细胞活化并不能达到显著性水平,本发明中联合使用花生蛋白径口致敏和花生蛋白接触性皮肤致敏两种方式加强嗜酸性粒细胞的活化和聚集,建立了一种BALB/c小鼠EoE样食物过敏反应模型。在本发明所建立的动物模型中,用胶带反复剥离刺激六次,有利于皮肤接触致敏,增加了皮肤朗格汉斯细胞及树突状细胞对抗原的反应,允许抗原进入。树突状细胞提呈抗原,导致皮肤细胞释放的细胞因子(特别是TSLP)可能通过影响树突状细胞的能力而影响T细胞的极化。TSLP是一种类于IL-7的细胞因子,它由角质细胞释放,并在皮炎患者中高表达。皮肤致敏通过活化皮肤树突状细胞,促进Th2细胞因子分泌,诱导Th2极化。有证据表明TSLP能调节树突状细胞的极化,引发Th2炎症反应。因此,在实验第三周,本发明进行了灌胃激发。
本发明方法建立的动物模型可使致敏小鼠产生体重降低,体温下降、抓挠等***性过敏反应症状和腹泻、皮炎等局部过敏反应症状,同时引发了食管、肺部和肠组织中嗜酸性粒细胞的聚集以及相关趋化因子,细胞因子等的表达,促进过敏原特异性IgE和IgG1的产生,表现出类EoE样的食物过敏反应。而在致敏后经鹌鹑蛋持续治疗发现可有效抑制类EoE样食物过敏反应,包括过敏性反应症状,过敏原特异性抗体水平,脾脏EoE相关细胞因子,嗜酸性粒细胞聚集和炎症反应等,该模型发病机制如图12所示。
本发明还提供一种小鼠嗜酸性粒细胞食管炎鹌鹑蛋过敏模型的建立方法,包括以下步骤:遵循上述小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型的建立方法,在实验第21-49天,在花生蛋白灌胃刺激1小时前,将15-20mg/kg·bw鹌鹑蛋粉,溶于PBS中,给BALB/c小鼠灌胃,同时向饮水瓶中添加15-20mg/L鹌鹑蛋粉使小鼠连续摄入鹌鹑蛋。
在本发明的一个实施例中,具体是采用以下步骤:
(1)径口诱导:选用7至8周龄雌性BALB/c小鼠,在实验第0,7和14天分别经腹腔注射致敏剂100μL PBS,所述100μL PBS中溶有2mg氢氧化铝凝胶剂和200μg花生蛋白;实验第29-49天,小鼠每隔一天用200μLPBS灌胃刺激,所述200μL PBS中溶有2mg花生蛋白;
(2)皮肤诱导:将小鼠经背部剃毛后用苏格兰密封胶带粘贴于剃毛处反复剥离刺激六次,实验第1-7天、21-28天和42-49天,小鼠分别进行3次花生蛋白皮肤接触性致敏,并将1×1cm含有50μL PBS的胶带贴于剃毛处致敏7天取出,所述50μL PBS中含有200μg花生蛋白;
(3)鹌鹑蛋粉灌胃处理:实验第21-49天,在花生蛋白灌胃刺激1小时前,将17mg/kg·bw鹌鹑蛋粉,溶于200μL PBS中,给BALB/c小鼠灌胃,同时向饮水瓶中添加17mg/L鹌鹑蛋粉使小鼠连续摄入鹌鹑蛋。
本发明也发现鹌鹑蛋灌胃治疗能在在治疗期间引起模型组对鹌鹑蛋的免疫反应。在本发明中,发现鹌鹑蛋对花生蛋白特异性IgE及IgG1都表现出抑制作用,可以降低花生蛋白特异性IgE及IgG1抗体水平。本发明拟将鹌鹑蛋作为一种日常饮食物质进行推广,而非具有较短生物半衰期的口服补充剂,大多数口服补充剂倾向于具有更短的生物半衰期,一般在3和4小时之间,因此本发明设计不仅经口灌胃鹌鹑蛋溶液,还向饮用水中添加适量鹌鹑蛋粉进行功能性研究。但在本发明治疗的过程中,发现鹌鹑蛋可能引发治疗组血清中鹌鹑蛋特异性IgE及IgG1水平的升高,而单独的鹌鹑蛋处理也未产生食物过敏反应,这可能由于鹌鹑蛋中某些蛋白可能与花生蛋白存在交叉反应。但这种情况可以在治疗第三周后减少,随着试验进行,鹌鹑蛋特异性IgE的升高逐渐消失。该数据表明鹌鹑蛋含有的卵类黏蛋白与已确定的过敏原蛋白不同,具有低致敏性或不具有致敏性,可作为安全的过敏反应治疗剂进行应用。此外,鉴于鹌鹑蛋具有抑制蛋白酶活性的作用,本发明深入研究并确定了鹌鹑蛋发挥抗过敏作用的机理,即通过抑制组织中可引发炎症反应的PAR2活化以及其下游NF-κB信号通路的激活而发挥作用。
在肠道过敏反应期间,肠神经***(ENS)和免疫***双向通信以调节神经生理效应,包括神经源性炎症和肠内离子转运和运动性以及相关性腹泻的变化。二次暴露于抗原导致肥大细胞脱颗粒、组胺激活、协调分泌及ENS推动性运动的防御反应,其作用是快速排出来自肠的抗原刺激源。口服抗原诱导的花生致敏小鼠腹泻的发展与血清中增加的组胺及类胰蛋白酶有着密切的关系,其表明肥大细胞脱颗粒的程度。肥大细胞分泌的介质增加,有可能导致白细胞在炎症部位的募集,特别是嗜酸性粒细胞,诱发EoE样疾病。
在这个模型中,在用抗原进行皮肤和灌胃激发后,嗜酸性粒细胞的积累不仅限于食道,在模型组小鼠的小肠中嗜酸性粒细胞,包括一些炎症介质也有明显地增加。在EoE过敏疾病中,嗜酸性粒细胞的激活能促进各种介质的分泌,包括细胞因子如IL-4、IL-5、IL-13,转化生长因子(TGF)-β,趋化因子如CCL5、RANTES和CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子-1,和脂质介质如白三烯C4。这些介质对炎症反应具有深远的影响,包括上调粘附分子,增强细胞运输和激活,以及调节血管通透性和肌肉收缩。此外,嗜酸性粒细胞分泌毒性颗粒蛋白,其损害肠道上皮细胞,包括嗜酸性粒细胞过氧化物酶、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白、嗜酸性粒细胞衍生神经毒素和主要碱性蛋白,所有这些在EoE病人的组织都显示有明显地增加,促进组织损伤与功能障碍。EoE作为一种食物引发的炎症性疾病,可能经日常摄入鹌鹑蛋而得以改善,将会成为一种有效无副作用的治疗过敏性疾病的策略。
综合本发明的研究结果,鹌鹑蛋治疗类EOE样食物过敏反应作用如图13所示。鹌鹑蛋抑制了TH2细胞的极化,在其处理后,TH2型细胞因子(IL-4,IL-5)水平显著降低,但未影响IL-13的水平。TH2型细胞因子水平的减少直接抑制了花生蛋白特异性IgE和IgG1的产生,但几乎未产生鹌鹑蛋特异性抗体。我们发现在实验第35天,鹌鹑蛋特异性IgE水平会显著增加,这与已报道的临床研究结果一致,即鹌鹑蛋治疗过程中可观察到的患者血清中鹌鹑蛋特异性IgE突然升高,但随后开始显著降低。另外,鹌鹑蛋引发IgE水平的升高远低于花生蛋白特异性IgE水平的升高。IgE和IgG1水平的降低也影响了过敏反应效应阶段肥大细胞和嗜碱性粒细胞的激活,我们研究中也发现肥大细胞介质(组胺,类胰蛋白酶)和嗜碱性粒细胞介质(mcpt-8)释放水平的降低。鹌鹑蛋中具有抑制蛋白酶活性的成分,并与组织中的PAR2结合,阻断了过敏反应效应细胞释放的类蛋白酶介质与PAR2受体的结合,进而抑制了PAR2下游NF-κB信号通路激活引发的炎症反应。我们的研究结果也表明鹌鹑蛋治疗后炎症反应相关的细胞因子(IL-6,IL-8,TNF-α,eotaxin 1,LTC4,ECP,TSLP,IL-15等)、趋化因子(RANTES TGF-β)、粘附因子(ICAM-1,VCAM-1)等水平显著降低。
本发明利用上述模型验证了鹌鹑蛋对于机体过敏病症缓解的作用机理,提供了鹌鹑蛋的多种新用途,包括:
鹌鹑蛋在制备缓解嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏反应症状的膳食补充剂中的应用。
鹌鹑蛋在制备降低脾细胞中嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏相关细胞因子的产生的膳食补充剂中的应用。
鹌鹑蛋在制备花生蛋白特异性IgE/IgG1抑制剂中的应用。
鹌鹑蛋在制备嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏PAR2和NF-κBp65表达抑制剂中的应用。
本发明的有益效果是:本发明得到的小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型克服了体外模拟实验无法对外源蛋白产生免疫应答的缺陷,能用于评价食品原料的致敏性,还可用于研究抗过敏剂对于机体过敏病症缓解作用的机理。
附图说明
图1EOE小鼠模型病理组织分析。
图2EOE小鼠模型血常规分析。
图3食物过敏与皮炎模型结合小鼠致敏模型病理组织分析。
图4连续性灌胃鹌鹑蛋及过敏小鼠模型的建立方法。
图5鹌鹑蛋缓解了BALB/c小鼠EoE样食物过敏反应症状,其中图5A为最后一次刺激后40min内小鼠体温变化图,图5B为临床小鼠过敏症状评分,图5C为不同处理方式下的小鼠粪便状态,图5D为不同处理方式下的小鼠腹泻评分,图5E为小鼠刺激后60min内抓挠后背次数,图5F为不同处理方式小鼠背部皮肤溃烂程度图,图5G为小鼠背部皮炎评分,图5H为第一次刺激和最后一次刺激后小鼠体重改变率。
图6鹌鹑蛋口服治疗对小鼠免疫细胞比例的影响。
图7鹌鹑蛋对花生蛋白特异性IgE、IgG1和过敏介质分泌的影响图,其中图7A为小鼠花生特异性和鹌鹑蛋特异性IgE水平,图7B为小鼠花生特异性和鹌鹑蛋特异性IgG1水平,图7C为小鼠血清中的组胺水平,图7D为小鼠血清中的类胰蛋白酶水平,图7E为小鼠血清中的嗜酸性粒细胞阳离子蛋白水平。
图8鹌鹑蛋对脾细胞中EoE相关细胞因子产生的影响图,其中图8A为小鼠Th2型细胞因子(IL-4)的表达,图8B为小鼠Th2型细胞因子(IL-5)的表达,图8C为小鼠Th2型细胞因子(IL-13)的表达,图8D为小鼠的iNKT型细胞因子IL-15的表达,图8E为小鼠胸腺基质淋巴细胞生成素的表达,图8F为小鼠的负调节因子IL-10的表达。
图9鹌鹑蛋对组织中小鼠嗜酸性粒细胞相关标志物表达的影响图,其中图9A为小鼠食管、肺脏和肠组织中TNF-α的mRNA水平,图9B为小鼠食管、肺脏和肠组织中IL-6的mRNA水平,图9C为小鼠食管、肺脏和肠组织中IL-8的mRNA水平,图9D为小鼠食管、肺脏和肠组织中RANTES的mRNA水平,图9E为小鼠食管、肺脏和肠组织中TGF-β的mRNA水平,图9F为小鼠食管、肺脏和肠组织中ICAM-1的mRNA水平,图9G为小鼠食管、肺脏和肠组织中VCAM-1的mRNA水平,图9H为小鼠食管、肺脏和肠组织中类胰蛋白酶水平,图9I为小鼠食管、肺脏和肠组织中IL-15的水平,图9J为小鼠食管、肺脏和肠组织中TSLP的mRNA水平,图9K为小鼠食管、肺脏和肠组织中IL-13的水平,图9L为小鼠食管、肺脏和肠组织中mMCP-8的mRNA水平。
图10为鹌鹑蛋对组织中炎症相关细胞因子产生的影响,其中,图10A为小鼠的食管、肺脏和肠组织嗜酸性粒细胞聚集情况,图10B为小鼠的食管、肺脏和肠组织嗜酸性粒细胞含量,图10C为小鼠的食管、肺脏和肠组织中IL-5水平,图10D为小鼠的食管、肺脏和肠组织中Eotaxin-1水平,图10E为小鼠的食管、肺脏和肠组织中LTC-4水平,图10F为小鼠的食管、肺脏和肠组织中ECP水平。
图11鹌鹑蛋通过抑制组织中PAR2和NF-κBp65表达而治疗EoE样过敏性疾病,其中图11A为小鼠的食管、肺脏和肠组织中PAR2水平,图11B为小鼠的食管、肺脏和肠组织中PAR2含量,图11C为小鼠的食管、肺脏和肠组织中NF-κB p65的表达。
图12皮肤及经口食物过敏诱导EoE样疾病的发病机制。
图13施用鹌鹑蛋对EoE疾病的治疗作用。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
表1本发明实施例所用的主要试剂
表2本发明实施例使用的主要仪器
仪器 | 公司 |
低温高速离心机(Centrifuge 5804R) | 德国E花生蛋白ndoff公司 |
冻干机 | Alpha 1-2LD plus |
Thermo Varloskan Flash多功能酶标仪 | Thermo Scientific |
MDF-382E超低温冰箱 | Sanyo |
干燥箱 | 上海一恒科学仪器有限公司 |
动物血液分析仪 | 美国HAMAVET 950FS |
红外温度计 | Beurer |
MiDrop 100UV Spectrophotometer | Bioyong Technologies |
BioRad CFX96TM Real-Time System | BioRad Laboratories,Inc |
MCO-18AIC二氧化碳培养箱 | Sanyo |
MSL-3750高压灭菌锅 | Sanyo |
电子天平(JB5374-91) | 常熟市金羊码仪器有限公司 |
GelDoc-ItTM影像*** | 美国UVP公司 |
BX51T-PHD-J11显微镜 | 日本奥林巴斯 |
多功能真彩色细胞图象分析管理*** | 美国Media Cybernetics公司Imag e-Pro Plus |
WT-1N洁净工作台 | 王堂蓝冀 |
本发明实施例所用的SPF级BALB/c小鼠购买自北京维通利华实验动物技术有限公司(SCXK(京)2016-0001),饲养于中国农业大学食品科学与营养工程学院SPF级动物实验室。饲养环境温度维持在22±1℃,湿度稳定在55±5%,每12小时昼夜气流交替一次,空气交换为15次/h。试验期间,动物可自行饮水摄食。小鼠日常饲料为商业化的SPF级大小鼠维持饲料,购自北京科澳协力饲料有限公司(Beijing,China),饲料主要营养成分(水分,灰分,粗蛋白,脂肪,粗纤维,钙磷)满足Chinese Standard GB14924.3-2010要求,并且未检测出黄曲霉毒素(≤20μg/kg)。本发明中的动物实验已通过中国农业大学动物伦理委员会审查。
实施例1BALB/c小鼠EoE样食物过敏模型的建立
1、经口诱导EoE模型
EoE小剂量经口诱导小鼠模型:7至8周龄雌性BALB/c小鼠按体重随机分成两组,分别为对照组及模型组,适应性喂养1周后,进行动物实验。第0,14天给予花生蛋白及铝佐剂腹腔注射致敏(200μg花生蛋白+1mg氢氧化铝凝胶剂溶于0.2mL生理盐水),而对照组给予生理盐水加铝佐剂腹腔注射。第21到35天,每两天一次,经口灌胃激发,模型组给予100μg花生,对照组给予相同体积的生理盐水。第35天激发后20到24小时处理小鼠,终止实验。
EoE大剂量径口诱导小鼠模型,第0,7,21天给予花生蛋白加铝佐剂腹腔注射致敏(500μg花生蛋白+2mg氢氧化铝凝胶剂溶于0.2mL生理盐水)而对照组腹腔注射给予生理盐水加铝佐剂。第35到42天,每天径口灌胃激发,模型组给予20mg溶于0.25mL生理盐水的花生蛋白,对照组给予相同体积的生理盐水。第42天激发后20到24小时后,处理小鼠,终止实验。
2、皮肤及径口诱导EoE模型
EoE小鼠模型:7至8周龄雌性BALB/c小鼠在实验第0,7和14天分别经腹腔注射致敏(2mg氢氧化铝凝胶剂和200μg花生蛋白溶于100μLPBS)。实验第1,21和42天小鼠分别进行3次花生蛋白皮肤接触性致敏。具体方法如下:小鼠经背部剃毛后用苏格兰密封胶带粘贴剃毛处六次,并将1×1cm含有200μg花生蛋白(溶于50μL PBS)的胶带贴于剃毛处致敏一周后取出。实验第29-49天,小鼠每隔一天经2mg花生蛋白(溶于200μLPBS中)灌胃刺激。实验第50天,即最后一次灌胃刺激24h后处理小鼠,终止实验。对照组小鼠不以任何方式接触花生蛋白,仅以2mg氢氧化铝凝胶剂溶于100μLPBS致敏,50μL PBS皮肤接触性致敏和200μL PBS刺激。
嗜酸性粒细胞的表达是EoE疾病发生的关键,本发明选用细胞计数仪测定血液中嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等细胞数及百分比,进行病理组织分析,验证EoE模型是否成功建立。如图1(注:箭头标识组织浸润性嗜酸性粒细胞)和图2所示,从小鼠体内免疫细胞数量来看,对照组与模型组相比无任何差异。虽然在大剂量模型组有嗜酸性粒细胞的产生,但是数量特别少,与对照组相比无任何差异。同时,病理组织分析结果表明在大剂量模型组的小肠固有层也发现有少量嗜酸性粒细胞,但是这数量与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。并且,病理组织分析和血常规分析发现,在最主要的组织-食道中,无任何模型组表现出嗜酸性粒细胞的浸润。
皮炎模型也可以引发EoE疾病,本发明将皮肤诱导与径口诱导相结合,重新建立EoE小鼠模型。如图3所示(注:箭头标识组织浸润性嗜酸性粒细胞),与对照组相比,本发明发现,模型组除了在小肠中有嗜酸性粒细胞的积累,并且在食道也可以发现嗜酸性粒细胞的显著增加,证明EoE模型成功建立。
3、连续性灌胃鹌鹑蛋过敏小鼠模型建立
将BALB/c小鼠分为四组(n=15/组):
组1,对照组(C);
组2,花生蛋白致敏组(P);
组3,花生蛋白致敏和鹌鹑蛋粉治疗组(P+Q);
组4,无花生蛋白致敏,仅用鹌鹑蛋粉治疗组(Q)。
实验第21-49天,在花生蛋白灌胃刺激1小时前,BALB/c小鼠经17mg/kg·bw鹌鹑蛋粉(溶于200μL PBS中)灌胃处理,同时向饮水瓶中添加17mg/L鹌鹑蛋粉使小鼠连续摄入鹌鹑蛋。鹌鹑蛋粉综合疗法的每日推荐摄入量为84mg,中国人平均体重约60公斤。因此,遵循动物和人之间剂量转换简单实践指南,鹌鹑蛋粉处理小鼠的剂量约为17mg/kg·bw。计算公式及计算过程为:
4、临床过敏症状评分
最后一次刺激后40min内,由独立人员盲法观察并记录小鼠临床过敏症状,包括***性过敏反应症状(体温及临床过敏反应症状评分)和局部过敏反应症状(腹泻,瘙痒和皮炎)。
体温测定致敏前后40min内小鼠肛温下降程度。临床过敏症状参照Li等评分标准进行记录。具体标准为:0=无症状;1=挠鼻,眼睛和唇周浮肿;2=活动减少;3=呼吸困难,口尾紫绀;4=刺激后无反应,痉挛;5=死亡。
收集最后一次刺激后小鼠粪便,对腹泻进行评分]。0=无粪便或粪便固态正常;1=索状粪便;2=松散粪便;3=粪便浆液;4=水状粪便或腹泻。
对小鼠抓挠行为进行评价,以最后一次刺激后60min内后爪及嘴部刮擦背部瘙痒反应计数,皮炎基于红斑或出血,表皮脱落或糜烂,结垢或干燥等现象进行评分,0=无症状;1=较轻度;2=轻度;3=中度;4=严重。
为了初步确定鹌鹑蛋在EoE食物过敏模型中发挥的作用,本发明进行了更深入的研究,连续性灌胃鹌鹑蛋及过敏小鼠模型建立的全面实验方案如图4所示。为了初步确定鹌鹑蛋能否降低EoE食物过敏反应,本发明检测并记录了最后一次刺激后40min内各组小鼠***性和局部过敏反应症状。
最后一次刺激后40min内,小鼠体温下降至最低点。与C组小鼠相比,P组体温显著降低了6.5±0.76℃(P<0.05),而鹌鹑蛋处理后(P+Q组)体温下降程度显著降低(-2±0.56℃,P<0.05),单独鹌鹑蛋处理(Q组)并未对小鼠体温产生影响(图5A)。临床小鼠过敏症状评分结果与体温下降结果一致,P组小鼠过敏症状评分为3.2±0.77,而鹌鹑蛋处理后症状评分下降为2.00±0.53(P<0.05,图5B),而与对照组相比,单独鹌鹑蛋处理没有差异(C组:0.00±0.00比Q组:0.87±0.35)。
多次刺激引发了小鼠腹泻的症状(P组:2.87±0.64),而鹌鹑蛋可显著抑制小鼠的腹泻症状(P+Q组:1.40±0.51),较好的改善了小鼠粪便的水稀状态,同时,单独鹌鹑蛋处理未使小鼠产生腹泻症状(Q组:1.00±0.85图5C-图5D)。针对皮炎症状,我们记录了小鼠刺激后60min内抓挠后背次数,并对小鼠背部皮肤溃烂程度进行了评分(图5E-图5G),P组小鼠每60min内平均抓挠192.53±40.01次,皮炎程度评分为3.13±0.74,而P+Q组小鼠每60min内平均抓挠次数为103.27±25.24次,皮炎程度评分为2.2±0.77,表明鹌鹑蛋处理后可缓解花生直接接触皮肤引发的过敏性皮炎症状。
此外,本发明还记录了第一次激发(第29天)和最后一次激发(第49天)后小鼠体重下降程度,与C组小鼠相比,花生蛋白刺激后可显著降低小鼠体重(P组:-9.40±2.75,P<0.05),而鹌鹑蛋处理后可缓解体重的下降(P+Q组:-2.81±4.76,P<0.05),单独鹌鹑蛋处理并未影响小鼠的体重变化(图5H)。
从体重,***性和局部过敏反应症状结果综合来看,如图5所示,本发明可以确定鹌鹑蛋可缓解花生蛋白引发的食物过敏反应症状。
5、血常规检测
最后一天经口大刺激处理后,20-24小时收集小鼠全血,用细胞计数仪测定血液中嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等的细胞数及百分比。图6表示小鼠血细胞中的嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和单核细胞在给予鹌鹑蛋治疗后无显著性差异(P>0.05)。然而,在模型组发现淋巴细胞显著增加(P<0.05),而鹌鹑蛋处理组表现出淋巴细胞比例的降低(2.71±0.55;P>0.05)。虽然鹌鹑蛋对照组比阴性对照组有更多的淋巴细胞数量,但是无显著性差异(P>0.05)。此外,与鹌鹑蛋对照组相比,鹌鹑蛋处理组的淋巴细胞较少,具有显著性差异(P<0.05)。
6、花生蛋白及鹌鹑蛋特异性抗体水平的测定
BALB/c小鼠经最后一次刺激后眼部内眦静脉采血,经4000×g离心15min后收集血清,-80℃保存。ELISA法检测血清中花生及鹌鹑蛋特异性IgE和IgG1水平。使用花生蛋白或鹌鹑蛋预先包被的96孔板,每孔加入100μL血清于37℃下孵育2h,再加入100μL生物素标记抗体工作液于37℃下孵育1h,洗涤3次后每孔加入100μL HRP标记的亲和素工作液,37℃下孵育1h,洗涤5次后每孔加入90μL底物溶液,于37℃下避光孵育15-30min。最后加入50μL终止溶液后轻轻混匀,5min内用酶标仪测定各孔在450nm波长下的吸光值。
结果说明鹌鹑蛋降低了花生蛋白特异性IgE,IgG1和过敏介质的分泌水平。过敏原特异性IgE及IgG1均属于Th2型抗体,可反映机体的免疫状态。同时,鹌鹑蛋也能使机体产生特异性抗体,因此本发明检测了花生及鹌鹑蛋特异性的IgE及IgG1抗体水平,如图7所示。
第一次刺激前(实验第28天),花生蛋白特异性IgE水平显著升高(P<0.05)。随后在第29-49天的刺激阶段,花生蛋白特异性IgE水平呈现下降趋势,在最后一次刺激后(实验第50天)达到了最高水平。鹌鹑蛋处理后(P+Q组)可显著降低花生蛋白特异性IgE水平(P<0.05),而单独鹌鹑蛋处理(Q组)未影响花生蛋白特异性IgE的产生。实验期间,各组中鹌鹑蛋特异性IgE水平基本没有变化,仅在实验第35天,P+Q组和Q组中显著增加(P<0.05,图7A),随后又恢复正常。此结果表明鹌鹑蛋处理不仅未影响机体鹌鹑蛋特异性IgE抗体的产生,还可抑制花生蛋白特异性IgE抗体的合成及分泌。
IgG1水平变化与IgE结果基本一致。致敏阶段(实验第28天),P组即表现出高花生特异性IgG1水平,并持续至实验结束(P<0.05),随着鹌鹑蛋的治疗,P+Q组中花生蛋白特异性IgG1水平呈现降低趋势,同时Q组中花生蛋白特异性IgG1水平也逐渐升高,这可能由于鹌鹑蛋中某些蛋白与花生蛋白存在交叉反应。各组鹌鹑蛋特异性IgG1水平与实验前(实验第0天)相比均有所升高,其中P+Q组的升高具有显著性差异(P<0.05)。此结果表明鹌鹑蛋治疗后可抑制花生蛋白特异性IgG1水平,但单独鹌鹑蛋处理也会增加花生蛋白特异性IgG1水平。同时鹌鹑蛋治疗也会增加鹌鹑蛋特异性IgG1的水平。
肥大细胞与嗜酸性粒细胞的激活在速发型过敏反应中发挥重要作用。因此,本发明也研究了血清中的过敏介质组胺、类胰蛋白酶和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)水平,从而反映肥大细胞和嗜碱性粒细胞的激活程度,如图7C-E所示。与C组相比,P组中这三个指标水平均显著增加(P<0.05),而鹌鹑蛋(P+Q组)可降低三者的升高。
7、过敏反应介质及细胞因子水平的检测
BALB/c小鼠经最后一次激发后无菌取脾脏并制备脾脏单细胞悬液。各组分别加入含有200μg/mL花生蛋白、70μg/mL鹌鹑蛋粉或同时含有花生蛋白和鹌鹑蛋粉的RPMI1640培养基于37℃,0.5%CO2条件下体外刺激72h,收集上清液,参照ELISA试剂盒(eBioscience)说明书测定TH2型细胞因子(IL-4、IL-5,IL-10和IL-13),II型天然免疫细胞(ILC2)细胞因子(TSLP)和恒定自然杀伤细胞(iNKT)细胞因子(IL-15)水平。收集小鼠血浆,利用ELISA(eBioscience)检测血浆中组胺,类胰蛋白酶和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)水平。同时收集了BALB/c小鼠食道,肺和小肠组织,充分匀浆后14,000×g离心30分钟收集上清。根据ELISA说明书(eBioscience)测量组织中IL-5,IL-13,IL-15,TSLP,嗜酸性粒细胞趋化因子-1,嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP),类胰蛋白酶,白三烯C4(LTC4)和NF-κB65水平。
结果说明鹌鹑蛋降低了脾细胞中EoE相关细胞因子的产生。小鼠和人体临床研究发现EoE会引发TH2型和iNKT型细胞因子的产生。因此,接下来检测了鹌鹑蛋治疗对Th2型细胞因子(IL-4,IL-5和IL-13),负调节因子IL-10,iNKT型细胞因子IL-15以及过敏性皮炎相关细胞因子胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的影响,如图8所示。
与C组相比,P组中TH2型细胞因子IL-4,IL-5水平均显著增加(P<0.05),而鹌鹑蛋治疗后其水平可恢复至正常水平,单独鹌鹑蛋处理未产生过量IL-4和IL-5(图8A-B)。本发明的结果发现IL-13并未受花生蛋白致敏和鹌鹑蛋治疗的影响(图8C)。IL-15和TSLP结果与Th2型细胞因子变化一致(图8D-E)。负调节因子IL-10的变化则相反(图8F),花生蛋白刺激后显著降低了血清中IL-10水平(P<0.05),而鹌鹑蛋处理后可显著抑制其降低水平,但仍未恢复至正常水平。
结果还发现鹌鹑蛋降低了组织中炎症相关细胞因子的产生。EoE疾病中组织炎症反应与其他过敏性疾病炎症反应机制相似,受炎症相关细胞因子,趋化因子以及粘附因子的影响。因此,本发明检测了食管、肺脏和肠组织中促炎细胞因子TNF-α,IL-6,IL-8,RANTES和TGF-β的mRNA水平以及粘附分子ICAM-1和VCAM-1的mRNA水平,结果如图9所示(注:结果显示为平均值±SEM,P<0.05,*与对照组相比;#与模型组相比)。发现鹌鹑蛋可降低花生蛋白引发的促炎细胞因子和粘附分子水平的显著升高(P<0.05,图9A-G),但食管中未发现TNF-α水平的变化。
与脾细胞中细胞因子产生结果一致,鹌鹑蛋也降低了组织中花生蛋白引发的类胰蛋白酶,IL-15和TSLP的升高(P<0.05,图9H-J),同样没有观察到IL-13水平的变化(图9K)。在EoE样过敏反应中,嗜碱性粒细胞也发挥关键效应作用,本发明结果也发现花生蛋白组中显著升高的(P<0.05)mMCP-8水平可被鹌鹑蛋治疗而恢复(图9L)。
8、实时定量PCR
Trnzol提取空肠总RNA,经反转录合成cDNA(TransScript One-Step gDNARemovaland cDNA Synthesis SuperMix,TransGen Biotech,China),SYBR Green荧光标记(TransStart Top Green qPCR SuperMix,TransGen Biotech,China)进行定量分析。从NCBI nucleotide数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide)中获取PCR引物序列的FASTA序列文件。PCR引物序列为表3所示。
表3 BALB/c小鼠RNA引物序列
以β-actin为内参基因,用2–△△Ct法计算mRNA相对定量水平。
许多研究均报道在食物诱发的EoE样过敏性疾病患者组织中可发现嗜酸性粒细胞的聚集。在动物研究中也发现口服花生诱发的EoE小鼠的食管、气道和肠组织嗜酸性粒细胞增多并聚集,因此,本发明进一步确定鹌鹑蛋能否影响EoE小鼠模型中嗜酸性粒细胞的聚集,结果如图10所示(注:箭头标识组织浸润性嗜酸性粒细胞,比例尺,25μm。插图:x4放大的整个图像聚焦嗜酸性粒细胞结果显示为平均值±SEM,P<0.05,*与对照组相比;#与模型组相比)。
本发明在高倍视野下对食管,肺和小肠组织中嗜酸性粒细胞数量进行统计。结果表明P组中这些组织中嗜酸性数量显著增加(P<0.05,食道:((10.04±1.57)×102,肺:(11.60±1.70)×102,小肠:(9.34±1.96)×102每mm2tissue layers),而鹌鹑蛋处理(P+Q组)后可抑制嗜酸性粒细胞的聚集作用,基本恢复至正常水平(P<0.05,食道:((6.97±1.25)×102,肺:(6.62±1.46)×102,小肠:(6.05±0.48)×102),单独的鹌鹑蛋处理(Q组)未影响嗜酸性粒细胞数量(P>0.05,食道:((5.30±1.07)×102,肺:(5.36±1.34)×102,小肠:(5.87±0.95)×102每mm2tissue layers)(图10A-B)。
嗜酸性粒细胞聚集源于IL-5和eotaxin-1的趋化作用,嗜酸性粒细胞聚集激活后合成脂质介质白三烯(LTC4)和毒性颗粒蛋白嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP),损伤组织,引发过敏反应症状。因此,本发明检测了组织中这些趋化因子和过敏介质的表达。花生蛋白引发的组织中IL-5(图10C),eotaxin-1(图10D),LTC4(图10E)和ECP(图10F)水平的升高(P<0.05)可被鹌鹑蛋处理所抑制,基本恢复至正常水平。结果说明鹌鹑蛋降低了组织中小鼠嗜酸性粒细胞相关标志物的表达。
9、组织病理学分析
将动物食道,肺及小肠固定在4%多聚甲醛中,经石蜡包埋切片进行HE常规染色,观察组织中炎症渗透,组织损坏,肠道上皮细胞绒毛变形和水肿等病变。并在高倍视野(HPF)下对组织中嗜酸性粒细胞进行计数(图10A-B)。
10、免疫组化分析PAR2水平
利用免疫组化分析食管,气道和肠组织中PAR2受体的表达。组织经4%多聚甲醛固定后包埋,切片,脱蜡,加入山羊血清室温下封闭20min,加入Anti-PAR2antibody mAb于4℃下孵育过夜。清洗后加入生物素标记的IgG抗体37℃下孵育20min。清洗后加入HRP标记的链酶卵白素工作液(S-A/HRP),37℃下孵育20min,清洗后DAB显色。苏木精复染细胞核后显微镜下观察。以免疫组织化学分数(IHS)对阳性染色进行定量分析。
本发明建立了EoE样食物过敏反应模型中,进一步研究了鹌鹑蛋是否通过抑制PAR2受体的活化发挥治疗EoE样过敏性疾病的作用,结果如图11所示(注:结果显示为平均值±SEM,P<0.05,*与对照组相比;#与模型组相比)。
利用免疫组化对食管,肺和肠组织中PAR2表达进行定性和定量分析,本发明发现花生蛋白刺激后食管和肺部组织中PAR2的表达水平显著升高(P<0.05,食管:59.75±18.55%;肺部:79.00±39.03%),而鹌鹑蛋处理(P+Q组)可显著地降低PAR2的活化(P<0.05,食管:29.75±14.16%;肺部:33.00±16.09%),而Q组其表达水平与C组无统计学差异(P>0.05)。各组小肠组织中PAR2表达无变化(图11A-B)。
PAR2能够激活下游NF-κB信号通路而发挥促炎作用,p65的磷酸化是NF-κB信号通路激活的关键。研究结果发现,花生蛋白刺激后,p65(Ser536)磷酸化水平显著升高(P<0.05),鹌鹑蛋处理后显著抑制了此过程(P<0.05),单独鹌鹑蛋处理并未影响p65(Ser536)的活化(P>0.05,图11C)。结果说明鹌鹑蛋通过抑制组织中PAR2和NF-κBp65表达而治疗EoE样过敏性疾病。
11、统计分析
数据处理采用GraphPad Prism统计分析软件的单因素方差分析(One-way ANOVA)多重比较,P<0.05表示有显著性差异。综上,本发明结果表明鹌鹑蛋可以作为膳食补充剂,用于治疗类EOE样食物过敏反应,改善食物过敏患者的生活。
虽然,上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做出一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型的建立方法
<130> KHP181111003.6
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtccttccta ccccaatttc ca 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
<212> DNA
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<211> 35
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<211> 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cctagaagca tttgcggtgc acgatg 26
Claims (10)
1.一种小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型的建立方法,其特征在于,通过经口诱导和经皮肤诱导两种方式联合诱导来建立小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型。
2.如权利要求1所述的建立方法,其特征在于,所述经口诱导为:选BALB/c小鼠,在实验第0,7和14天分别经腹腔注射50-200μL致敏剂;实验第29-49天,小鼠每隔一天用100-300μLPBS或生理盐水灌胃刺激,所述PBS中溶有1-3μg/μL花生蛋白。
3.如权利要求2所述的建立方法,其特征在于,所述BALB/c小鼠为7至8周龄雌性BALB/c小鼠。
4.如权利要求2所述的建立方法,其特征在于,所述致敏剂为含1-3μg/μL的花生蛋白和10-30μg/μL氢氧化铝凝胶的PBS溶液。
5.如权利要求1-4任一所述的建立方法,其特征在于,所述经皮肤诱导是指:将小鼠皮肤用胶带粘贴、剥离反复刺激,实验第1-7天、21-28天和42-49天,小鼠分别进行3次花生蛋白皮肤接触性致敏,并将含有PBS的胶带贴于皮肤致敏5-9天后取下,所述PBS含有花生蛋白。
6.如权利要求5所述的建立方法,其特征在于,小鼠皮肤剃毛后用密封胶带粘贴于剃毛处反复剥离刺激4-8次。
7.如权利要求5所述的建立方法,其特征在于,所述PBS含有2-6μg/μL花生蛋白。
8.一种小鼠嗜酸性粒细胞食管炎鹌鹑蛋过敏模型的建立方法,其特征在于,采用权利要求1-7任一所述建立方法,实验第21-49天,花生蛋白灌胃刺激1小时前,将15-20mg/kg·bw鹌鹑蛋粉溶于PBS中,给BALB/c小鼠灌胃,同时向饮水瓶中添加15-20mg/L鹌鹑蛋粉使小鼠连续摄入鹌鹑蛋。
9.鹌鹑蛋在制备花生蛋白特异性IgE及IgG1抑制剂中的应用。
10.鹌鹑蛋在制备嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏PAR2和NF-κBp65表达抑制剂中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20180928 |