CN108576064B - 一种菠萝蜜提取物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种菠萝蜜提取物的应用，具体应用于防治植物病害。通过室内生物测定和大棚幼苗试验，本发明提供了菠萝蜜叶片的乙醇提取物对椰子泻血病病原奇异长喙壳菌(Ceratocystis paradoxa)有良好的防治应用。本发明对菠萝蜜及其提取物用于防治植物病害的新用途提出了新的思路，为开发环境友好型植物源杀菌剂提供了新的资源，对解决病原菌对化学药剂的抗性问题及果实安全问题具有重大意义。

Description

一种菠萝蜜提取物及其应用
技术领域
本发明属于植物保护领域,涉及一种高效防治椰子泻血病菌的菠萝蜜提取物及其应用。
背景技术
奇异根串珠霉菌(Thielaviopsis paradoxa)的有性世代奇异长喙壳菌(Ceratocystis paradoxa)引起的椰子茎泻血病(Stem Bleeding Disease of Coconut)，是椰子的主要病害之一，该病原还能引起椰子茎干腐烂、椰子果腐。该病在椰子种植国中都有发生，一般从伤口侵入，如果不采取防治措施，发病植株在症状出现后3～4月内就会死亡，如果在阴雨天气，椰子茎干会腐烂，会提早落果，给椰子产业造成严重损失。同时该菌是棕榈科植物的重要病原菌，几乎可以危害所有的棕榈科植物，引起茎干腐烂、芽腐、泻血等症状。同时还可危害香蕉、菠萝、甘蔗等重要热带亚热带经济作物，给生产带来重大经济损失。据报道，该病在印度的安德拉邦是最具毁灭性的病害之一，其发病率达到20％。利比亚的幼龄棕榈科植物种植园由于受到该菌的危害，造成的损失高达50％。危害菠萝引起的凤梨病在菠萝产区发病率最高可达40％，严重影响菠萝的市场供应及加工生产。海南省作为我国最大的热带地区，棕榈科植物种植面积大，种类多，同时还是香蕉、菠萝、甘蔗等重要热带亚热带经济作物的主要种植区，由奇异根串珠霉菌引起的椰子茎干腐烂病一旦流行，对热区作物的为害将不可预计。
目前有效防治椰子泻血病病害方法是使用大量的化学杀菌剂。所用药剂有异菌脲、百菌清、烯酰吗啉、甲基硫菌灵、噁霜·锰锌、咪鲜胺锰盐、多菌灵、代森锰锌、十三吗啉和丁子香酚等，其中，丁子香酚、多菌灵、咪鲜胺锰盐对C.paradoxa的菌丝有很强的抑制作用，其他药剂效果一般，有的已经产生了抗药性。但长期使用这些化学杀菌剂，易影响椰子果及其他水果的品质，易使病菌产生抗药性，只有加大用药剂量以控制病害，但却增加生产成本和农药残留量，影响生态环境，破坏生态平衡。实际上人们越来越担心食物链中化学残留物对人类健康的影响，要求降低果蔬产品用药量。于是，寻求安全、无毒、有效的控制植物(果蔬)病害的新方法成为当务之急，利用植物源杀菌剂防治植物病害是解决当前化学杀菌剂诸多负面效应的一个重要研究方向。
植物是天然产物农药的宝库，从植物中寻找新的杀菌抑菌活性物质，研制开发新型植物源杀菌剂，是当今世界新农药开发的热点。多年以来，国内外科研工作者对多种植物如樟科Lauraceae植物印度鳄梨Persea indica、楝科Meliacea植物中米仔兰属Aglaia植物、植物菖蒲、天南星科Araceae等进行了杀虫物质的研究，而植物源抑菌、杀菌活性物质的研究相对较少，实际上据报道有1340种植物有可能作为杀菌剂，植物中的抗毒素、类黄酮、罹病相关的蛋白质、有机酸和酚类化合物等均有杀菌和抗菌活性。植物源杀菌物质大多为复合的抑菌有效成分，且具有多种作用位点和作用机制，因而植物被认为是化学合成杀菌剂替代品最好的开发资源。
随着社会发展及生态环境需要，生物农药的研究与推广受到了空前的重视，特别是植物源农药受到了社会的广泛关注，植物源农药的开发成了研究热点。我国是一个农业大国，农药在农业生产中发挥着十分重要的作用。随着人们健康意识的提高，大多数国家都非常重视农产品的安全性，对农药残留的限制十分严格。中国加入WTO以后，农产品出口面临着非常严峻的“绿色壁垒”，其中农药残留超标是经常遇到的问题，严重影响了我国农产品在国际市场的竞争力。为了降低农药残留量，努力开发新型农药已经成为当务之急。
植物源农药来源于自然，能在自然界降解，一般不会污染环境及农产品，在环境和人体中积累毒性的可能性不大，对人和牲畜相对安全，具有低毒、低残留的特点，能够保持农产品的高品质，再加上使用成本低等，优点越来越受到人们的重视与青睐。在全世界面临人口迅速增长、环境污染压力日趋严重的今天，更深入、更广泛的研究和开发安全、无毒、来源广、成本低的植物源农药具有重要的经济意义、生态意义和社会意义。
菠萝蜜(拉丁学名：Artocarpus heterophyllus Lam.)，是桑科、波罗蜜属的常绿乔木。果肉鲜食或加工成罐头、果脯、果汁。种子富含淀粉，可煮食；树液和叶药用，消肿解毒；果肉有止渴、通乳、补中益气功效。菠萝蜜提取物杀虫活性有见报道，对小菜蛾产卵驱避率和拒食率都很高，但其杀菌活性却尚未见报道，因此，研究菠萝蜜提取物对植物病原菌的抑菌活性，将来有望应用到植物病害的防治上，对解决病原菌对药剂日益突出的抗性问题具有重要的意义。本发明根据这一现状，对菠萝蜜叶片提取物抑制椰子泻血病害的研究进行了初步探讨，旨在为防控由病原奇异长喙壳菌引起的椰子及其他果蔬病害提供理论依据。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种菠萝蜜提取物对植物病原菌的控制作用。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种菠萝蜜提取物在控制椰子泻血病中的应用，该菠萝蜜提取物为菠萝蜜叶片的乙醇提取物
上述菠萝蜜提取物是菠萝蜜的叶片提取物，采用索氏提取法提取，将叶片洗净、晒干、磨成粉后，用乙醇进行浸提，所得滤液再蒸发浓缩至膏状而得，具体为：
A、取菠萝蜜叶片洗净晾干后放入45-50℃烘箱内烘至叶片发脆，经植物高速粉碎机(DWF-100)粉碎至75-95目细粉，称重、密封保存。
B、称取菠萝蜜叶干粉50g放入索氏提取器内，加入250mL乙醇分析纯在90℃水浴下回流提取24h.
C、所得到提取液经减压抽滤后，置于旋转蒸发仪(R-210)，42℃、247Mpa条件下减压浓缩成膏状物，转移至棕色广口瓶内，称重并标记后放入4℃冰箱内保存备用。
上述所提的菠萝蜜提取物可采用现有技术进行制备，本发明只是采用其中一种制备方法说明其制备的可行性。
本发明的菠萝蜜提取物通过抑制菌落生长、分生孢子萌发等方式，对椰子泻血病菌具有抑制作用，同时，该菠萝蜜提取物对防治椰子泻血病菌接种的幼苗具有一定的防治效果，可以进一步开发成新的植物源杀菌剂。本发明提取物的提取方法便捷、易操作和推广；分离所需的材料来源广、易购买、成本低、不污染环境，对人畜安全环保。
附图片说明
图1是本发明的菠萝蜜提取物对椰子泻血病菌菌丝的生长抑制效果图；
其中：1代表菠萝蜜提取物；2代表对照药剂丁子香酚；3代表空白对照无菌水。
图2是本发明的菠萝蜜提取物对椰子泻血病菌菌接种的椰子幼苗防治效果图；
其中：1代表菠萝蜜提取物；2代表对照药剂丁子香酚；3代表空白对照无菌水。
具体实施方式
下面结合具体试验和实施案例对本发明的技术方案作进一步说明。
本发明所使用的原料菠萝蜜叶片在文昌椰子大观园采集，原料供应充足，方便易得。
实施例中用到的病原菌奇异长喙壳菌(Ceratocystis paradoxa)由椰子研究所植物病理学课题组提供。该菌种的活化：采用接种环刮取事先保存在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基的奇异长喙壳菌，重新接入马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基，25℃下培养48-96h。
实施例1
取菠萝蜜叶片洗净后晾干表面水分，放入45-50℃烘箱内烘至叶片发脆，经植物高速粉碎机(DWF-100)粉碎至75-95目细粉，得到菠萝蜜粉末；称取菠萝蜜叶干粉50g放入索氏提取器内，加入250mL乙醇分析纯在90℃水浴下回流提取24h.所得到提取液经减压抽滤后，置于旋转蒸发仪(R-210)，42℃、247Mpa条件下减压浓缩成膏状，得棕褐色菠萝蜜提取物，转移至棕色广口瓶内，称重并标记后放入4℃冰箱内保存备用。
实施例2菠萝蜜提取物对奇异长喙壳菌的抑制效果
称取上述制备的菠萝蜜提取物装入三角瓶中，将药剂分别配成1.25～50mg/mL的溶液，然后分别吸取2ml至培养皿中，把尚未凝固的PDA培养基18ml加入含药剂的培养皿中，混匀凝固。取直径为5mm的病原菌菌碟于含药平板中央，以加1％的乙醇培养基为对照，每个处理重复三次，置于25-30℃培养箱中培养，4d后，按十字交叉法测量菌落的直径。计算药剂对菌丝生长的相对抑制率。按最小二乘法求毒力回归方程，计算EC50。
菌丝生长抑制率(％)＝[(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径-5)]×100％。
表1本发明中菠萝蜜提取物对奇异长喙壳菌菌落生长的抑制作用
Figure BDA0001609307950000041
注：不同小写字母表示显著差异(p<0.05，不同大写字母表示极显著差异(p<0.01)。
结果与分析：本发明的菠萝蜜提取物对奇异长喙壳菌具有一定的抑制效果。室内抑菌试验结果表明：在培养4d后，本发明菠萝蜜提取物对奇异长喙壳菌抑制率为85.40％，略低于对照药剂丁子香酚的抑制效果。方差分析结果表明：菠萝蜜提取物处理和对照药剂丁子香酚处理差异显著，说明菠萝蜜提取物可以用于防治奇异长喙壳菌，具有进一步开发植物源杀菌剂的潜力。
实例3采用载玻片萌发法检测菠萝蜜提取物对奇异长喙壳菌分生孢子萌发的影响。首先将菠萝蜜提取物用无菌水稀释为1.25～50mg/mL的溶液,同时,将奇异长喙壳菌菌饼置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上培养4d，待分生孢子长出后，用无菌水稀释为1×105个/mL的孢子悬浮液，取等量的分生孢子悬浮液与前述稀释后的溶液混合后滴于载玻片上，以丁子香酚为对照药剂,并设空白对照,重复3次,于培养皿或凹槽载玻片中保湿培养10～15h,显微镜下观察分生孢子萌发情况，计算孢子萌发率，结果见下表2。
表2菠萝蜜提取物提取物对孢子萌发的影响
Figure BDA0001609307950000051
注：不同小写字母表示显著差异(p<0.05)，不同大写字母表示极显著差异(p<0.01)
结果与分析：菠萝蜜提取物和丁子香酚均能强烈地抑制分生孢子的萌发，其中菠萝蜜提取物处理奇异长喙壳菌孢子萌发率远远低于未经菠萝蜜提取物处理，但略高于对照药剂丁子香酚处理。方差分析结果表明：菠萝蜜提取物处理和对照药剂丁子香酚处理的差异显著。由于分生孢子可通过雨水、风媒等传播造成病原菌再侵染，从而引起病害发生、导致大量减产，因此，通过施用菠萝蜜提取物抑制分生孢子萌发，可减少再侵染源，减轻或杜绝病害发生。
实例4菠萝蜜提取物对奇异长喙壳菌引起的椰子泻血病的离体叶片防治效果
摘取生长条件一致，同一棵椰子树、同一叶柄上的相邻裂叶，且要保证所采叶片无任何病虫侵害症状。剪取大小基本一致的叶片若干，先用无菌水清洗叶表浮尘，接着用75％的酒精进行表面消毒10s，再用无菌水反复冲洗掉残留的酒精，置于通风柜自然风干。用灭菌针制造同样大小的伤口(每个伤口针刺10次)，再分别取等量的菠萝蜜提取物、丁子香酚、无菌水均匀涂抹于椰子叶伤口处，自然风干，取直径5mm菌碟浓度1×105个/mL的孢子液20ul，均匀涂抹在叶片伤口处，完毕后将叶片放在培养皿中，于温度25-30℃下保湿培养3d，每处理3张叶片并重复3次，采用十字交叉法测量椰子叶片病斑直径大小，计算防治效果，结果见下表3。
防治效果(％)＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-5)]×100％
结果与分析：由表3菠萝蜜提取物对处理后奇异长喙壳菌侵染形成的病斑直径显著小于对照处理的奇异长喙壳菌侵染形成的病斑直径，但略大于对照药剂丁子香酚的病斑直径。同时，通过十字交叉法测量病斑直径，计算防治效果发现：菠萝蜜提取物对奇异长喙壳菌的防治效果低于对照药剂丁子香酚。方差分析结果表明：菠萝蜜提取物处理和对照药剂丁子香酚处理差异显著。说明菠萝蜜提取物可用于防治奇异长喙壳菌引起的病害。
表3本发明菠萝蜜提取物对椰子泻血病的离体叶片防治效果
Figure BDA0001609307950000061
实例4菠萝蜜提取物对奇异长喙壳菌引起的椰子泻血病的幼苗的防治效果
椰子6月龄幼苗在塑料大棚中进行，每棵椰子树选取三片椰子心叶，每片叶子做三个处理。即用无菌水清洗叶表浮尘，接着用75％的酒精进行表面消毒10s，然后用灭菌***叶表，自然风干。再分别取等量的菠萝蜜提取物、丁子香酚、无菌水均匀涂抹于椰子叶伤口处，自然风干，1h后，在每个处理伤口处，均匀涂抹100ul浓度为1×105个/mL的奇异长喙壳菌孢子液，然后用较大的透明保鲜袋子套住叶片，定期往透明袋内面喷雾保湿。实验中每处理3个重复，每个重复3株椰子，每株椰子取三片心叶。对照喷自来水，并设丁子香酚为对照。2、4、6d分别观察发病情况，记录温度，发病程度病斑大小为单位。最终确定取6d的病斑面积为比较对象，在此以矩形面积均一化计量，纵向最长度为长，横向最宽度为宽，单位以cm2计。结果见表4
病斑面积(cm2)＝病斑长度×病斑宽度
防治效果(％)＝[对照病斑面积-处理病斑面积/对照病斑面积]×100％
表4本发明菠萝蜜提取物对椰子泻血病的椰子幼苗片防治效果
Figure BDA0001609307950000062
结果与分析：2、4、6d的观察结果显示，菠萝蜜提取物和丁子香酚处理的叶片病斑几乎再无扩展现象，因此以第6d的结果作为病斑面积统计的标准。由图2可知菠萝蜜提取物对处理后奇异长喙壳菌侵染形成的病斑直径显著小于对照处理的奇异长喙壳菌侵染形成的病斑直径，但略大于对照药剂丁子香酚的病斑直径。同时，通过十字交叉法测量病斑直径，计算防治效果发现：菠萝蜜提取物对奇异长喙壳菌的防治效果低于对照药剂丁子香酚。方差分析结果表明：菠萝蜜提取物处理和对照药剂丁子香酚处理差异显著。说明菠萝蜜提取物可用于防治奇异长喙壳菌引起的病害。

Claims (8)

1.一种菠萝蜜提取物在防治椰子泻血病中的应用，其特征在于，所述菠萝蜜提取物为菠萝蜜的乙醇提取物，是按下述步骤制备而成：
A、取菠萝蜜叶片洗净晾干后放入45-50℃烘箱内烘至叶片发脆，经植物高速粉碎机DWF-100粉碎至细粉，称重、密封保存；
B、称取菠萝蜜叶干粉50g放入索氏提取器内，加入250mL乙醇分析纯水浴回流提取24h；
C、所得到提取液经减压抽滤后，置于旋转蒸发仪R-210，42℃、247Mpa条件下减压浓缩成膏状物，转移至棕色广口瓶内，称重并标记后放入4℃冰箱内保存备用；所述菠萝蜜提取物的浓度为25mg/mL的膏状浓度用于防治椰子泻血病。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将菠萝蜜叶片粉碎成75-95目的细粉。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：菠萝蜜叶干粉加入乙醇后在90℃水浴条件下回流24h。
4.一种菠萝蜜提取物在抑制椰子泻血病病原奇异长喙壳菌中的应用，其特征在于：一定浓度的菠萝蜜提取物抑制菌丝的生长和分生孢子萌发；所述菠萝蜜提取物为菠萝蜜的乙醇提取物，是按下述步骤制备而成：
A、取菠萝蜜叶片洗净晾干后放入45-50℃烘箱内烘至叶片发脆，经植物高速粉碎机DWF-100粉碎至细粉，称重、密封保存；
B、称取菠萝蜜叶干粉50g放入索氏提取器内，加入250mL乙醇分析纯水浴回流提取24h；
C、所得到提取液经减压抽滤后，置于旋转蒸发仪R-210，42℃、247Mpa条件下减压浓缩成膏状物，转移至棕色广口瓶内，称重并标记后放入4℃冰箱内保存备用。
5.根据权利要求4中所述的菠萝蜜提取物在抑制椰子泻血病病原奇异长喙壳菌中的应用，其特征在于：菠萝蜜提取物使用浓度是7.5mg/mL。
6.根据权利要求4中所述的菠萝蜜提取物在抑制椰子泻血病病原奇异长喙壳菌中的应用，其特征在于：在观察抑制分生孢子萌发率的实验中，药剂和孢子液混合液要在培养皿或凹槽载玻片中保湿培养10～15h。
7.根据权利要求4中所述的菠萝蜜提取物在抑制椰子泻血病病原奇异长喙壳菌中的应用，其特征在于：菠萝蜜提取物对离体发病叶片的病斑扩展有抑制作用，3d后观察结果。
8.根据权利要求4中所述的菠萝蜜提取物在抑制椰子泻血病病原奇异长喙壳菌中的应用，其特征在于：菠萝蜜提取物对活体椰子发病幼苗的病斑扩展有抑制作用，观察记录时间是6d。
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