CN108570113A - 肿节风浸膏残渣多糖、其制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肿节风浸膏残渣多糖、其制备方法及用途。该制备方法以分级沉淀为主，可制备出肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP、肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30、SCRP60和SCRP90。这些多糖可用于制备治疗糖尿病药物或α‑葡萄糖苷酶抑制剂。采用本发明，可实现对肿节风浸膏残渣的资源化利用。

Description

肿节风浸膏残渣多糖、其制备方法及用途
技术领域
本发明涉及一种肿节风浸膏残渣多糖、其制备方法及用途，属于医药技术领域。
背景技术
肿节风[Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai]为金粟兰科(Chloranthaceae)植物草珊瑚的干燥全草。肿节风在国内分布范围广，易于栽培，业已发展出多种剂型，涉及药品、保健品、食品、化妆品等行业，包括复方草珊瑚含片、血康口服液、肿节风注射液等多种产品，年产值已逾100亿元，拥有非常好的发展前景。肿节风在临床上主要应用于辅助***、消化***疾病、呼吸道感染以及血液***疾病，并拥有较好的疗效。然而根据调查现阶段肿节风的研究集中于小分子物质的发现、结构解析以及活性探究上，对肿节风多糖方面的研究较为缺乏。肿节风制剂中销量最好的有复方草珊瑚含片、血康口服液和肿节风注射液等，然而这些制剂仅仅对肿节风浸膏醇沉后的上清进行利用，而弃置沉淀，同时处理这些沉淀耗费大量的人力物力，造成极大浪费。
专利号CN201210013550.8、授权公告号CN102603907B、名称《肿节风多糖及其制法和用途》的中国发明专利，以及专利号CN201310552026.2、授权公告号CN103554290B、名称《一种肿节风酸性多糖及其制备方法、应用》的中国发明专利，是与本发明比较接近的技术方案，但是均无法直接适用于肿节风浸膏残渣，需要专门针对肿节风浸膏残渣量身打造的技术方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：克服现有技术存在的问题，提出肿节风浸膏残渣多糖、其制备方法及用途，有利于对肿节风浸膏残渣的资源化利用。
本发明的主要技术构思如下：现有技术中，先对肿节风浸膏进行热水提取，再对所得提取液进行醇沉，然后对所得上清加以利用，同时将所得沉淀作为残渣弃用。发明人针对该残渣进行初步测定，发现其中含有大量多糖。在此基础上，发明人经过深入地实践研究，得出了从该残渣中制备多个均一活性多糖的技术方案，并对其多糖的结构和活性进行了研究。
本发明的技术方案如下：
肿节风浸膏残渣多糖的制备方法，其特征是，包括以下步骤：取肿节风浸膏残渣，60℃±10℃干燥后粉碎成粉末；向粉末中加入至少100倍重量的去离子水，加热搅拌溶解完全后，离心去除沉淀得上清液；向上清液中加入至少4倍体积无水乙醇醇沉，1℃－4℃放置至少24小时，离心后取沉淀；将沉淀以无水乙醇、丙酮和***洗涤，干燥后所得固体即为肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP；所述肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP的多糖含量为总固体重量的50％以上；其中，所述肿节风浸膏残渣为将肿节风浸膏的水提取液醇沉后所得沉淀。
前述制备方法制得的肿节风浸膏残渣多糖，其特征是，所述肿节风浸膏残渣多糖为肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP，多糖含量为总固体重量的50％以上。
肿节风浸膏残渣多糖的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、取肿节风浸膏残渣，干燥粉碎成粉末；向粉末中加入去离子水，加热搅拌溶解完全后，离心去除沉淀得上清液；向上清液中加入无水乙醇，使乙醇体积浓度达到30±5％，1℃-4℃放置至少24小时，离心后得上清液和沉淀；其中，所述肿节风浸膏残渣为将肿节风浸膏的水提取液醇沉后所得沉淀；
第二步、取第一步所得沉淀，将沉淀以无水乙醇、丙酮和***洗涤并干燥成固体；将该固体溶于20-50倍重量的去离子水，离心取上清液；向上清液中加入D101大孔吸附树脂，室温下搅拌0.5-3小时；固液分离后取液体，将该液体浓缩后，加入4-6倍体积的无水乙醇，1℃-4℃放置至少24小时，离心取沉淀，将沉淀以无水乙醇、丙酮和***洗涤并干燥成固体，备用；
第三步、取第二步所得备用的固体，将其溶于去离子水后，上DEAE-52阴离子交换柱；先以去离子水洗脱，再以0-2±0.5mol/L NaCl溶液梯度洗脱，收集NaCl洗脱的糖峰，浓缩后透析24-36小时；浓缩透析液，以至少4倍体积无水乙醇醇沉，1℃-4℃放置至少24小时，离心后取沉淀，将沉淀以无水乙醇、丙酮和***洗涤并干燥成固体，即得肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30；所述肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30的多糖含量为总固体重量的99％以上。
前述制备方法制得的肿节风浸膏残渣多糖，其特征是，所述肿节风浸膏残渣多糖为肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30，多糖含量为总固体重量的99％以上；数均分子量为6.35±0.5×106Da；单糖组成按重量百分比由2±0.5％岩藻糖、5±1％鼠李糖、7±1.5％***糖、11±2.5％半乳糖、5±1％葡萄糖、0.6±0.15％甘露糖、6±1.2％木糖、44±7.5％半乳糖醛酸、16±3.5％葡萄糖醛酸构成；糖苷键键型包括α(1→4)半乳糖醛酸、α(1→4)半乳糖醛酸甲酯、α(1→5)***糖、β(1→3)半乳糖、α(1→4)葡萄糖，β(1→4，6)葡萄糖，β(1→6)葡萄糖和α(1→2)鼠李糖。
肿节风浸膏残渣多糖的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、取肿节风浸膏残渣，干燥粉碎成粉末；向粉末中加入去离子水，加热搅拌溶解完全后，离心去除沉淀得上清液；向上清液中加入无水乙醇，使乙醇体积浓度达到30±5％，1℃－4℃放置至少24小时，离心后得上清液和沉淀；其中，所述肿节风浸膏残渣为将肿节风浸膏的水提取液醇沉后所得沉淀；
第二步、取第一步所得上清液，向其中加入无水乙醇，使乙醇体积浓度达到60±5％，1℃-4℃放置至少24小时，离心后得上清液和沉淀；
第三步、取第二步所得沉淀，将沉淀以无水乙醇、丙酮和***洗涤并干燥成固体；将该固体溶于去离子水，将其溶于去离子水后，上DEAE-52阴离子交换柱；先以去离子水洗脱，再以0-2±0.5mol/L NaCl溶液梯度洗脱，收集NaCl洗脱的糖峰，浓缩后透析24-48小时；浓缩透析液，以至少4倍体积无水乙醇醇沉，1℃-4℃放置至少24小时，离心后取沉淀，将沉淀以无水乙醇、丙酮和***洗涤并干燥成固体，即得肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60；所述肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60的多糖含量为总固体重量的90％以上。
前述制备方法制得的肿节风浸膏残渣多糖，其特征是，所述肿节风浸膏残渣多糖为肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60，多糖含量为总固体重量的90％以上；数均分子量为4.86±0.5×106Da；单糖组成按重量百分比由2.9±0.6％岩藻糖、6.5±1.4％鼠李糖、9.2±1.9％***糖、34.7±7％半乳糖、17±3.5％葡萄糖，2.1±0.5％甘露糖、3.7±0.8％木糖、19.7±4.0％半乳糖醛酸和4.1±0.8％葡萄糖醛酸构成。
肿节风浸膏残渣多糖的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、取肿节风浸膏残渣，干燥粉碎成粉末；向粉末中加入去离子水，加热搅拌溶解完全后，离心去除沉淀得上清液；向上清液中加入无水乙醇，使乙醇体积浓度达到30±5％，1℃－4℃放置至少24小时，离心后得上清液和沉淀；其中，所述肿节风浸膏残渣为将肿节风浸膏的水提取液醇沉后所得沉淀；
第二步、取第一步所得上清液，向其中加入无水乙醇，使乙醇体积浓度达到60±5％，1℃-4℃放置至少24小时，离心后得上清液和沉淀；
第三步、取第二步所得上清液，向其中加入无水乙醇，使乙醇体积浓度达到90±5％，1℃-4℃放置至少24小时，离心后取沉淀，将沉淀以无水乙醇、丙酮和***洗涤并干燥成固体；
第四步、取第三步所得固体，溶于20-50倍重量的去离子水，离心取上清液；向上清液中加入NKA-9大孔吸附树脂，室温下搅拌0.5-3小时；固液分离后取液体，将该液体浓缩后，加入4-6倍体积的无水乙醇，1℃-4℃放置至少24小时，离心取沉淀，将沉淀以无水乙醇、丙酮和***洗涤并干燥成固体，即得肿节风浸膏残渣多糖SCRP90；所述肿节风浸膏残渣多糖SCRP90的多糖含量为总固体重量的40％以上。
前述制备方法制得的肿节风浸膏残渣多糖，其特征是，所述肿节风浸膏残渣多糖为肿节风浸膏残渣多糖SCRP90，多糖含量为总固体重量的40％以上；数均分子量为1.15±0.1×104Da；单糖组成包括岩藻糖，鼠李糖，***糖，半乳糖，葡萄糖和半乳糖醛酸。
前述肿节风浸膏残渣多糖用于制备治疗糖尿病药物的用途。
前述肿节风浸膏残渣多糖用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的用途。
本发明从肿节风浸膏残渣中提取出一系列活性多糖，有利于对肿节风浸膏残渣的资源化利用。
附图说明
图1是本发明肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30的高效分子排阻色谱。
图2是本发明肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30的红外光谱。
图3是本发明肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30的离子色谱检测单糖组成，其中Fuc表示岩藻糖，Rha表示鼠李糖，Ara表示***糖，Gal表示半乳糖，Glc表示葡萄糖，Man表示甘露糖，Xyl表示木糖，GalA表示半乳糖醛酸，GlcA表示葡萄糖醛酸。
图4是本发明肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30的核磁共振氢谱。
图5是本发明肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30的核磁共振碳谱。
图6是本发明肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的体外抑制作用。
图7是本发明肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP和肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30对模型小鼠粘膜α-葡萄糖苷酶活性的影响。
图8是本发明肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60的高效分子排阻色谱。
图9是本发明肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60的红外光谱。
图10是本发明肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60的离子色谱检测单糖组成，其中Fuc表示岩藻糖，Rha表示鼠李糖，Ara表示***糖，Gal表示半乳糖，Glc表示葡萄糖，Man表示甘露糖，Xyl表示木糖，GalA表示半乳糖醛酸，GlcA表示葡萄糖醛酸。
图11是本发明肿节风浸膏残渣多糖SCRP90的高效分子排阻色谱。
图12是本发明肿节风浸膏残渣多糖SCRP90的红外光谱。
图13是本发明肿节风浸膏残渣多糖SCRP90的离子色谱检测单糖组成，其中Fuc表示岩藻糖，Rha表示鼠李糖，Ara表示***糖，Gal表示半乳糖，Glc表示葡萄糖，GalA表示半乳糖醛酸。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细的说明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。说明书及实施例中采用的药材、填料、化学试剂等，如未特殊说明均按常规实验条件进行操作，或按供应商提供的说明进行操作。
实施例1：制备肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP
本发明各实施例采用的肿节风浸膏残渣，均来源于某制药企业生产复方草珊瑚含片过程中，将肿节风浸膏的水提取液醇沉后所弃置的沉淀。
取一定量肿节风浸膏残渣，置于瓷盘中，50℃烘箱干燥4h后研磨成粉状。取干燥原料1g溶于100mL蒸馏水中，55℃搅拌完全溶解后，4000r.p.m离心5min去沉淀，上清加入4倍体积无水乙醇醇沉，4℃放置24小时，4000r.p.m离心20min收集沉淀，沉淀分别以2倍体积无水乙醇、丙酮和***洗涤，真空干燥得到肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP。
实施例2：制备肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30
S1、取干燥原料3g溶于300mL蒸馏水中，55℃搅拌完全溶解后，4000r.p.m离心5min去沉淀，上清液加入129mL无水乙醇醇沉，4℃放置24小时，4000r.p.m离心20min得备用上清液和备用沉淀。
S2、收集S1的备用沉淀，该沉淀分别以2倍体积无水乙醇、丙酮和***洗涤后真空干燥得到30％醇沉粗品。取1g 30％醇沉粗品溶于50mL蒸馏水中，55℃搅拌完全溶解后，4000r.p.m离心5min去沉淀，上清液中，加入50g大孔非极***换树脂D101脱色除蛋白，室温下搅拌反应30min，使用砂芯漏斗进行固液分离，将溶液浓缩至100mL，并加入600mL无水乙醇沉淀，4℃放置24小时，4000r.p.m离心20min收集沉淀，沉淀分别以2倍体积无水乙醇、丙酮和***洗涤后真空干燥得到30％醇沉脱色产物。
S3、取脱色产物200mg，充分溶解于去离子水，上已平衡好的DEAE-52离子交换柱，规格为(2.6×30cm)，平衡液为去离子水，上样体积为10mL，先以300mL去离子水洗脱，再以0-2mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，分部收集NaCl洗脱部分，硫酸苯酚法跟踪检测，合并同一糖峰。盐洗组分装入8-14k Da透析袋中，流水透析，48h后用硝酸银试剂(0.1％)检测，无白色沉淀生成。将透析液浓缩至约10mg/mL,用4倍体积的无水乙醇沉淀，4℃放置24小时，4000r.p.m离心20min收集沉淀，沉淀分别以2倍体积无水乙醇、丙酮和***洗涤后真空干燥得到肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30。
实施例3：制备肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60
T1、取实施例2的S1所得备用上清液，加入321mL无水乙醇醇沉，4℃放置24小时，4000r.p.m离心20min得备用上清液和备用沉淀；
T2、收集T1中的备用沉淀，将该沉淀分别以2倍体积无水乙醇、丙酮和***洗涤，真空干燥得到60％醇沉粗品。取200mg 60％醇沉粗品，充分溶解于去离子水，上已平衡好的DEAE-52离子交换柱，规格为(2.6×30cm)，平衡液为去离子水，上样体积为10mL，先以300mL去离子水洗脱，再以0-2mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，分部收集NaCl洗脱部分，硫酸苯酚法跟踪检测，合并同一糖峰。盐洗组分装入8-14k Da透析袋中，流水透析，48h后用硝酸银试剂(0.1％)检测，无白色沉淀生成。将透析液浓缩至约10mg/mL,用4倍体积的无水乙醇沉淀，4℃放置24小时，4000r.p.m离心20min收集沉淀，沉淀分别以2倍体积无水乙醇、丙酮和***洗涤后真空干燥得到肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60。
实施例4：制备肿节风浸膏残渣多糖SCRP90
U1、取实施例3的T1所得备用上清液，加入2.25L无水乙醇，4℃放置24小时，4000r.p.m离心20min收集沉淀，沉淀分别以2倍体积无水乙醇、丙酮和***洗涤，真空干燥得到90％醇沉粗品。
U2、取1g 90％醇沉粗品溶于50mL蒸馏水中，55℃搅拌完全溶解后，4000r.p.m离心5min去沉淀，上清液中，加入50g大孔极***换树脂NKA-9纯化，室温下搅拌反应30min，使用砂芯漏斗进行固液分离，溶液浓缩至100mL，并加入600mL无水乙醇沉淀，4℃放置24小时，4000r.p.m离心20min收集沉淀，沉淀分别以2倍体积无水乙醇、丙酮和***洗涤后真空干燥得到肿节风浸膏残渣多糖SCRP90。
实施例5：理化性质测定
1.多糖含量测定
肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP的多糖含量为67％(硫酸苯酚法测定)其中酸性糖含量为33％(间羟联苯法测定)。
肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30多糖含量为99％，其中酸性糖含量为66％。
肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60多糖含量为96％，其中酸性糖含量为32％。
肿节风浸膏残渣多糖SCRP90多糖含量为46％。
2.纯度和分子量测定
肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30、SCRP60、SCRP90的纯度和分子量通过高效分子排阻色谱法测定。
以Shodex SUGAR KS-805(8mmID×300mm)为高效液相色谱柱，采用示差折光检测器；色谱条件为：H2O为流动相，流速1mL/min，样品浓度为2mg/mL，每次进样20μL，检测时间30min。
图1、8和11分别是肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30、肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60和肿节风浸膏残渣多糖SCRP90的高效液相色谱图，可见三种精品多糖都呈单一色谱峰，说明纯度较高。
在同样的分析条件下，绘制不同分子量标准品的分子量对数和保留时间的标准曲线，并获得标准曲线的回归方程，计算得到肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30的数均分子量为6.35×106Da，肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60的数均分子量为4.86×106Da，肿节风浸膏残渣多糖SCRP90的数均分子量为1.15×104Da。
3.单糖组成测定
肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30、SCRP60和SCRP90的单糖组成通过高效阴离子交换色谱法测定，使用美国Thermo Scientific Dionex公司ICS-5000+高效离子色谱仪和脉冲安培检测器。
称取多糖样品10mg于洁净的安瓿瓶中，加0.05mol/L三氟乙酸2.0mL，封口，于90℃水解2h，将水解产物于蒸发皿中80℃蒸干后加入甲醇洗涤4次，溶于2.0mL水中即获得水解样品。
色谱条件为：Carbo PACTMPA10(2.0mm×250mm)阴离子交换柱，Carbo PACTMPA10(2.0mm×50mm)保护柱，脉冲安培检测器；Au工作电极，Ag/AgCl参比电极，四电位波形；淋洗液条件：0-30min，13.5％0.2mol/L NaOH，86.5％超纯水；30-60min，13.5％0.2mol/L NaOH，75％0.2mol/L CH3COONa，11.5％超纯水；流速：0.5mL/min；柱温：28℃；进样体积25μL。
图3、10和13分别为肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30、肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60和肿节风浸膏残渣多糖SCRP90的单糖组成的离子色谱图。
其中，肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30的单糖组成按重量百分比为岩藻糖(2.01％)、鼠李糖(5.34％)、***糖(7.21％)、半乳糖(11.84％)、葡萄糖(5.35％)、甘露糖(0.61％)、木糖(6.57％)、半乳糖醛酸(44.29％)和葡萄糖醛酸(16.78％)；
肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60的单糖组成按重量百分比为岩藻糖(2.94％)，鼠李糖(6.57％)，***糖(9.20％)，半乳糖(34.76％)，葡萄糖(17.01％)，甘露糖(2.11％)，木糖(3.76％)，半乳糖醛酸(19.77％)和葡萄糖醛酸(4.18)；
肿节风浸膏残渣多糖SCRP90的单糖组成包括岩藻糖，鼠李糖，***糖，半乳糖，葡萄糖和半乳糖醛酸。
4.红外光谱分析
取样品5.0mg，溴化钾压片，置于红外光谱仪上400-4000cm-1区间扫描。
图2、9和12分别为肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30、肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60和肿节风浸膏残渣多糖SCRP90的红外光谱。
肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30的红外谱图显示3347cm-1处的宽吸收峰为O-H的伸缩振动，2937cm-1的吸收峰为亚甲基中的C-H振动，1400-1200cm-1一系列峰是C-H变角振动，这两组峰是糖类化合物的特征峰；1605.0cm-1表明有糖醛酸的存在，而1416cm-1的吸收峰也说明羧基的存在；1143cm-1，1074cm-1和1046cm-1这组吸收峰的存在表明分子存在吡喃环。
肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60的红外图谱与肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30的红外图谱相类似，说明两者在结构上可能比较类似。
肿节风浸膏残渣多糖SCRP90的红外光谱较肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30和肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60大部分相类似，然而红外峰较少，说明肿节风浸膏残渣多糖SCRP90的结构较简单。
5.核磁波谱分析
精密称取待测肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30样品50mg溶于D2O中，应用Varian-500核磁波谱仪，检测温度为30℃。分别做13C NMR，1H NMR谱。
图4和5分别是肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30的核磁共振氢谱和核磁共振碳谱，具体分析结果如图表1所示，碳谱和氢谱中显示肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30中α构型和β构型均存在，同时糖苷键键型主要有α(1→4)半乳糖醛酸、α(1→4)半乳糖醛酸甲酯、α(1→5)***糖、β(1→3)半乳糖、α(1→4)葡萄糖，β(1→4,6)葡萄糖，β(1→6)葡萄糖和α(1→2)鼠李糖。
表1 肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30的核磁共振峰归属
实施例6：体外抗α-葡萄糖苷酶活性研究
以4-硝基苯-α-D-毗喃葡萄糖苷(PNPG)为底物，对实施例2中获得的肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30、实施例3中获得的肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60、实施例4中获得的肿节风浸膏残渣多糖SCRP90的α-葡萄糖苷酶抑制活性进行评价。
取不同浓度的SCRP30溶液、SCRP60溶液、SCRP90溶液各160μL分别与α-葡萄糖苷酶溶液20μL(1U/mL)混合，于37℃温孵l0min，再加入PNPG20μL(5umol/L)，37℃保温30min。以阿卡波糖(Acarbose)为阳性对照。计算肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30、SCRP60、SCRP90对α-葡萄糖苷酶的抑制率和半数抑制浓度。
结果如表2所示，肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30、SCRP60、SCRP90能够有效抑制体外α-葡萄糖苷酶的活性，且抑制率随作用浓度升高而增大。
使用SPSS软件分析，肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30、SCRP60、SCRP90，阿卡波糖的半数抑制浓度IC50值分别为52.2μg/mL，138.0μg/mL,56.7μg/mL和125.4μg/mL。体外试验说明SCRP30和SCRP90在相同浓度下比阿卡波糖具有更好的体外α-葡萄糖苷酶抑制作用，且具有浓度依赖性。
表2 肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30、SCRP60、SCRP90、阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性
实施例7：口服肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP和肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30对高脂饲料联合链脲霉素(STZ)诱导的2型糖尿病小鼠的体内降糖作用。
选取体重为18-22g的雄性C57BL/6J小鼠，高脂饲料喂养3周后，按50mg/kg剂量一次性腹腔注射链脉佐菌素(STZ)，继续高脂饲料喂养3周后监测小鼠血糖。
选择空腹血糖值大于7.8mmo1/L的小鼠，随机分为9组，每组8只，设模型组：灌胃给予生理盐水；阳性药组：灌胃给予10mg/kg阿卡波糖；阳性药组：灌胃给与200mg/kg二甲双胍；肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30低剂量组：灌胃给予100mg/kg肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30；肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30中剂量组：灌胃给予200mg/kg肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30；肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30高剂量组：灌胃给予400mg/kg肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30；肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP低剂量组：灌胃给予100mg/kg肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP；肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP中剂量组：灌胃给予200mg/kg肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP；肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP高剂量组：灌胃给予400mg/kg肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP；另选取8只未造模小鼠作为空白组：灌胃给与生理盐水。检测给药0天，7天，14天，21天，28天的各组小鼠血糖浓度。
实验结果如表3所示，给药28天后，给药组血糖明显低于模型组血糖，肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30和肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP以及阳性药组和模型组相比血糖明显下降，其中肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP的效果略优于肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30和阳性药，并且药效呈剂量依赖性。说明从肿节风浸膏残渣中制备的多糖可以有效降低糖尿病模型小鼠的血糖，可用于治疗糖尿病。
表3 SCRP30/SCRP对高脂饲料联合链脲霉素诱导糖尿病小鼠空腹血糖的影响(X±SD，n＝8)
注：与空白组比#p<0.01，与模型组比*p<0.05，**p<0.01
实施例8：口服肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP和肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30对高脂饲料联合链脲霉素(STZ)诱导的2型糖尿病小鼠体内抗α-葡萄糖苷酶活性研究。
本实施例使用与实施例7相同的材料和动物模型，本实施例利用与实施例6相同的方法对肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP和肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30给药后对糖尿病模型小鼠体内小肠α-葡萄糖苷酶活性的影响。
实施例6证实肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30能有效抑制体外α-葡萄糖苷酶的活性，因此本实施例应用糖尿病小鼠模型，检测的是药物对体内小肠α-葡萄糖苷酶的作用。
如图7所示，模型组α-葡萄糖苷酶的活性极显著地高于空白对照组，而给药组的低、中、高剂量的α-葡萄糖苷酶活性均显著下降，其中高剂量组下降幅度最大。因此，抑制小肠粘膜α-葡萄糖苷酶活性可能是肿节风浸膏残渣多糖降糖机制之一。
实施例9：与背景技术涉及专利的比较
将专利号CN201210013550.8、授权公告号CN102603907B、名称《肿节风多糖及其制法和用途》的中国发明专利中涉及的肿节风多糖精品SGP-1，记作1号专利SGP-1；
将专利号CN201310552026.2、授权公告号CN103554290B、名称《一种肿节风酸性多糖及其制备方法、应用》的中国发明专利中涉及的肿节风酸性多糖精品SGP-2，记作2号专利SGP-2；
将本发明肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30、肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60、肿节风浸膏残渣多糖SCRP90，分别记作本发明SCRP30、本发明SCRP60和本发明SCRP90。
上述多糖特性的比较如下表所示：
由此可知，与现有技术相比，本发明多糖在制备原料、制备方法要点、数均分子量、单糖组成以及药理活性等方面均具有独特的特点。

Claims (10)

1.肿节风浸膏残渣多糖的制备方法，其特征是，包括以下步骤：取肿节风浸膏残渣，60℃±10℃干燥后粉碎成粉末；向粉末中加入至少100倍重量的去离子水，加热搅拌溶解完全后，离心去除沉淀得上清液；向上清液中加入至少4倍体积无水乙醇醇沉，1℃－4℃放置至少24小时，离心后取沉淀；将沉淀以无水乙醇、丙酮和***洗涤，干燥后所得固体即为肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP；所述肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP的多糖含量为总固体重量的50％以上；其中，所述肿节风浸膏残渣为将肿节风浸膏的水提取液醇沉后所得沉淀。
2.由权利要求1所述制备方法制得的肿节风浸膏残渣多糖，其特征是，所述肿节风浸膏残渣多糖为肿节风浸膏残渣多糖粗品SCRP，多糖含量为总固体重量的50％以上。
3.肿节风浸膏残渣多糖的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、取肿节风浸膏残渣，干燥粉碎成粉末；向粉末中加入去离子水，加热搅拌溶解完全后，离心去除沉淀得上清液；向上清液中加入无水乙醇，使乙醇体积浓度达到30±5％，1℃-4℃放置至少24小时，离心后得上清液和沉淀；其中，所述肿节风浸膏残渣为将肿节风浸膏的水提取液醇沉后所得沉淀；
第二步、取第一步所得沉淀，将沉淀以无水乙醇、丙酮和***洗涤并干燥成固体；将该固体溶于20-50倍重量的去离子水，离心取上清液；向上清液中加入D101大孔吸附树脂，室温下搅拌0.5-3小时；固液分离后取液体，将该液体浓缩后，加入4-6倍体积的无水乙醇，1℃-4℃放置至少24小时，离心取沉淀，将沉淀以无水乙醇、丙酮和***洗涤并干燥成固体，备用；
第三步、取第二步所得备用的固体，将其溶于去离子水后，上DEAE-52阴离子交换柱；先以去离子水洗脱，再以0-2±0.5mol/L NaCl溶液梯度洗脱，收集NaCl洗脱的糖峰，浓缩后透析24-36小时；浓缩透析液，以至少4倍体积无水乙醇醇沉，1℃-4℃放置至少24小时，离心后取沉淀，将沉淀以无水乙醇、丙酮和***洗涤并干燥成固体，即得肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30；所述肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30的多糖含量为总固体重量的99％以上。
4.由权利要求3所述制备方法制得的肿节风浸膏残渣多糖，其特征是，所述肿节风浸膏残渣多糖为肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP30，多糖含量为总固体重量的99％以上；数均分子量为6.35±0.5×106Da；单糖组成按重量百分比由2±0.5％岩藻糖、5±1％鼠李糖、7±1.5％***糖、11±2.5％半乳糖、5±1％葡萄糖、0.6±0.15％甘露糖、6±1.2％木糖、44±7.5％半乳糖醛酸、16±3.5％葡萄糖醛酸构成；糖苷键键型包括α(1→4)半乳糖醛酸、α(1→4)半乳糖醛酸甲酯、α(1→5)***糖、β(1→3)半乳糖、α(1→4)葡萄糖，β(1→4，6)葡萄糖，β(1→6)葡萄糖和α(1→2)鼠李糖。
5.肿节风浸膏残渣多糖的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、取肿节风浸膏残渣，干燥粉碎成粉末；向粉末中加入去离子水，加热搅拌溶解完全后，离心去除沉淀得上清液；向上清液中加入无水乙醇，使乙醇体积浓度达到30±5％，1℃－4℃放置至少24小时，离心后得上清液和沉淀；其中，所述肿节风浸膏残渣为将肿节风浸膏的水提取液醇沉后所得沉淀；
第二步、取第一步所得上清液，向其中加入无水乙醇，使乙醇体积浓度达到60±5％，1℃-4℃放置至少24小时，离心后得上清液和沉淀；
第三步、取第二步所得沉淀，将沉淀以无水乙醇、丙酮和***洗涤并干燥成固体；将该固体溶于去离子水，将其溶于去离子水后，上DEAE-52阴离子交换柱；先以去离子水洗脱，再以0-2±0.5mol/L NaCl溶液梯度洗脱，收集NaCl洗脱的糖峰，浓缩后透析24-48小时；浓缩透析液，以至少4倍体积无水乙醇醇沉，1℃-4℃放置至少24小时，离心后取沉淀，将沉淀以无水乙醇、丙酮和***洗涤并干燥成固体，即得肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60；所述肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60的多糖含量为总固体重量的90％以上。
6.由权利要求5所述制备方法制得的肿节风浸膏残渣多糖，其特征是，所述肿节风浸膏残渣多糖为肿节风浸膏残渣多糖精品SCRP60，多糖含量为总固体重量的90％以上；数均分子量为4.86±0.5×106Da；单糖组成按重量百分比由2.9±0.6％岩藻糖、6.5±1.4％鼠李糖、9.2±1.9％***糖、34.7±7％半乳糖、17±3.5％葡萄糖，2.1±0.5％甘露糖、3.7±0.8％木糖、19.7±4.0％半乳糖醛酸和4.1±0.8％葡萄糖醛酸构成。
7.肿节风浸膏残渣多糖的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、取肿节风浸膏残渣，干燥粉碎成粉末；向粉末中加入去离子水，加热搅拌溶解完全后，离心去除沉淀得上清液；向上清液中加入无水乙醇，使乙醇体积浓度达到30±5％，1℃－4℃放置至少24小时，离心后得上清液和沉淀；其中，所述肿节风浸膏残渣为将肿节风浸膏的水提取液醇沉后所得沉淀；
第二步、取第一步所得上清液，向其中加入无水乙醇，使乙醇体积浓度达到60±5％，1℃-4℃放置至少24小时，离心后得上清液和沉淀；
第三步、取第二步所得上清液，向其中加入无水乙醇，使乙醇体积浓度达到90±5％，1℃-4℃放置至少24小时，离心后取沉淀，将沉淀以无水乙醇、丙酮和***洗涤并干燥成固体；
第四步、取第三步所得固体，溶于20-50倍重量的去离子水，离心取上清液；向上清液中加入NKA-9大孔吸附树脂，室温下搅拌0.5-3小时；固液分离后取液体，将该液体浓缩后，加入4-6倍体积的无水乙醇，1℃-4℃放置至少24小时，离心取沉淀，将沉淀以无水乙醇、丙酮和***洗涤并干燥成固体，即得肿节风浸膏残渣多糖SCRP90；所述肿节风浸膏残渣多糖SCRP90的多糖含量为总固体重量的40％以上。
8.由权利要求7所述制备方法制得的肿节风浸膏残渣多糖，其特征是，所述肿节风浸膏残渣多糖为肿节风浸膏残渣多糖SCRP90，多糖含量为总固体重量的40％以上；数均分子量为1.15±0.1×104Da；单糖组成包括岩藻糖，鼠李糖，***糖，半乳糖，葡萄糖和半乳糖醛酸。
9.权利要求2、4、6或8所述肿节风浸膏残渣多糖用于制备治疗糖尿病药物的用途。
10.权利要求2、4、6或8所述肿节风浸膏残渣多糖用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的用途。
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