CN108567980B - 光动力诱导的co可控递送***及其构建方法 - Google Patents

光动力诱导的co可控递送***及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了光动力诱导的CO释放方法，CO可控递送***及其构建方法。本发明的CO释放方法通过将近红外光响应型、可用于光动力治疗的光敏剂和一氧化碳释放分子CORM‑401混合，在近红外光的照射下，进行CO的可控释放。本发明基于光动力诱导的CO释放方法，构建了CO可控递送***，包括近红外光响应型、可用于光动力治疗的光敏剂，一氧化碳释放分子CORM‑401，以及负载或结合光敏剂和一氧化碳释放分子CORM‑401的载体。本发明的CO可控递送***，近红外光诱导光敏剂产生的光化学作用可促进CO可控递送***进入细胞，并在细胞内谷胱甘肽的作用下纳米凝胶解体，释放出CORM‑401。近红外光激活同时产生单线态氧和CO分别用于光动力治疗和CO气体治疗，实现联合治疗，抗肿瘤效果显著提高。

Description

光动力诱导的CO可控递送***及其构建方法
技术领域
本发明属于医用生物材料技术领域，涉及一种光动力诱导的CO释放方法，以及基于光动力诱导的CO可控递送***及其构建方法。
背景技术
一氧化碳(CO)作为一种无色、无味的气体，具有很强的血红蛋白结合能力，吸入人体后容易导致血液中形成碳氧血红蛋白，使血红蛋白失去携氧能力，导致机体中毒，因此长期以来CO被视为一类“沉默的杀手”。近年来人们逐渐认识到CO在生物体内发挥着重要的生理和病理作用，它是继一氧化氮(NO)和硫化氢(H2S)之后，被发现的第三种气体递质(gasotransmitters)。CO具有多种重要的生理作用和潜在的药理活性。内源性CO在维持体内自平衡方面发挥着重要作用：可促进血管舒张、抗细胞凋亡、抗炎、抗氧化等。这些发现不断加深了人们对CO本质的认识，使其在心血管疾病、器官移植、休克、败血症、炎症、癌症等方面具有广阔的应用前景。由于其固有的气体特性，如何实现CO在病灶组织部位的精准递送和可控释放是近年来将CO用于临床治疗的一个重要研究方向。
目前临床上已经出现了可供使用的CO吸入装置，可通过装置直接往体内输送定量的CO，但此类装置面临着许多问题：1)吸入大量的CO容易造成全身毒性；2)直接吸入的气体缺乏靶向性，可能会对生命体造成较大破坏。因此，研究者们开发出了一类可释放CO的药物，即一氧化碳释放分子(CORMs)，该分子提供了可在特定部位释放大量CO的方法，弥补了CO吸入装置的缺陷，在一定程度上实现了CO的精准递送。
根据结构的不同，CORMs具有不同的CO释放机制。例如CORM-2和 CORM-3可以在配体如谷胱甘肽(GSH)的作用下通过配体交换释放CO； CORM-A1具有酸敏感性，可通过质子作用提高CO的释放速度；具有酶响应性的CORMs(ET-CORMs)可以在体内的酯酶作用下快速释放CO；另外一类 CORMs(photoCORMs)则具有光敏性，可在紫外光或可见光作用下通过电子转移释放CO。
近年来，虽然不少新型的CORMs被陆续开发出来，并应用于各种疾病的治疗。但是，许多CORMs在治疗方面还存在着一些缺陷。具有酶响应释放的 ET-CORMs和具有配体交换作用释放的CORMs面临CO释放不可控的问题，此类CORMs进入体内后，容易在血液循环中发生CO的提前释放，导致血液中毒和药效损失的现象。此外，当photoCORMs在体内循环时，容易在自然光的照射下发生CO的释放，导致机体中毒，因此在治疗期间往往需要将病人保持在黑暗条件下，给病人生活带来诸多不便。因此，为CORMs提供高效可控的递送***是CO疗法应用于疾病治疗的一个关键性问题。利用可控释放CO的CORMs 来进行治疗不仅可以实现CO在病灶组织的精准递送，还能更好地发挥治疗效果。纵观目前已开发出来的CORMs，最理想的选择是photoCORMs。photoCORMs 可通过调控光照时间、强弱、区域来控制CO的释放，实现释放时间和空间的高度可控。但大多数的photoCORMs是利用紫外光来刺激释放CO的，紫外光对组织的穿透力弱，难以达到深度区域的病灶组织，高能量紫外光还将对组织和细胞产生光毒作用。因此设计并使用更为优异的刺激响应条件来释放CO成为了目前的研究重点。
近红外光(NIR light，650-850nm)具有比紫外光、可见光更深的组织穿透力，且不会对组织产生伤害。因此，使用近红外光来诱导刺激CO的可控释放，对于大力推进CORMs的临床应用具有深远的意义。
发明内容
针对现有的光敏性CO释放的刺激相应条件限于紫外光和可见光，本发明首先提供一种光动力(PDT)诱导的CO释放方法。该方法可在近红外光的照射下，利用光敏剂产生的光化学作用，刺激诱导一氧化碳释放分子释放CO，实现CO 在近红外光诱导下的时间、空间可控释放。
本发明的光动力诱导的CO释放方法，通过将近红外光响应型、可用于光动力治疗的光敏剂和一氧化碳释放分子CORM-401混合，在近红外光的照射下，进行CO的可控释放。
具体地，上述的光敏剂可以是Ce6(二氢卟吩e6)、Ce4(二氢卟吩e4)、HPPH(Photochlor，光克洛)、AlPcS4等具有近红外光刺激响应的可用于光动力治疗的光敏剂。
在具体实施例中，本发明通过将光敏剂Ce6和一氧化碳释放分子CORM-401 混合，在近红外光的照射下，进行CO的可控释放。
为了提高CO的释放量，在具体实施例中，本发明通过将摩尔比为0.05～1:1 的光敏剂Ce6与一氧化碳释放分子CORM-401混合，在近红外光的照射下，进行CO的可控释放。
为进一步地提高CO的释放量，在具体实施例中，本发明通过将摩尔比为 0.1～1:1的光敏剂Ce6与一氧化碳释放分CORM-401混合，在近红外光的照射下，进行CO的可控释放。
本发明还提供基于上述光动力诱导的CO释放方法的CO可控递送***。所述的递送***包括近红外光响应型、可用于光动力治疗的光敏剂，一氧化碳释放分子CORM-401，以及负载或结合光敏剂和一氧化碳释放分子CORM-401的载体。
为利于CO可控递送***进入细胞内，所述的CO可控递送***的粒径在 200nm以下。
在具体实施例中，本发明提供的CO可控递送***为CORM@G3DSP-Ce6 纳米凝胶递送***，所述的CORM@G3DSP-Ce6纳米凝胶递送***包括纳米凝胶G3DSP-Ce6和负载在纳米凝胶G3DSP-Ce6空腔内的一氧化碳释放分子 CORM-401，所述的纳米凝胶G3DSP-Ce6为以多面体低聚倍半硅氧烷POSS为核的三代赖氨酸树状大分子(G3-Lys)与光敏剂Ce6共价偶联得到偶联物G3-Ce6 经交联剂3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯(DSP)交联形成的纳米凝胶。
具体地，上述的CORM@G3DSP-Ce6纳米凝胶递送***中，所述的光敏剂 Ce6与一氧化碳释放分子CORM-401的摩尔比为1:7.5～20。
作为更为优选的方案，上述的CORM@G3DSP-Ce6纳米凝胶递送***中，所述的光敏剂Ce6与一氧化碳释放分子CORM-401的摩尔比为1:15～20。
更具体地，在实施例中，本发明提供上述CORM@G3DSP-Ce6纳米凝胶递送***的制备方法，先通过大分子与光敏剂Ce6共价偶联，再通过交联形成具有丰富空腔结构的纳米凝胶G3DSP-Ce6，最后利用物理负载的方式，将 CORM-401载入纳米凝胶的空腔内，制备同时载有光敏剂Ce6和一氧化碳释放分子CORM-401的纳米凝胶递送***CORM@G3DSP-Ce6，包括以下步骤：
步骤1，将以多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)为核的三代赖氨酸树状大分子 (G3-Lys)与光敏剂Ce6共价偶联得到偶联物G3-Ce6；
步骤2，将G3-Ce6用交联剂3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯 (DSP)交联成纳米凝胶G3DSP-Ce6递送***；
步骤3，利用物理负载的方式，将CORM-401缓慢滴加到G3DSP-Ce6溶液中，搅拌至混合均匀，透析除去游离的CORM-401，冷冻干燥得到 CORM@G3DSP-Ce6纳米凝胶递送***。
具体地，步骤1为：在氮气保护下，将Ce6与N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，常温下，过夜反应以活化羧基，过滤除去二环己基脲(DCU)后，将得到的活化Ce6 (Ce6-NHS)缓慢滴加到G3-Lys溶液中，避光反应，随后将得到的溶液依次于 DMF和水中透析后，冻干得到偶联物G3-Ce6。
具体地，步骤2为：室温下将G3-Ce6溶解于DMF中，搅拌下将含有DSP 的DMF溶液缓慢滴加到G3-Ce6的溶液中，反应结束后，依次于DMF和水中透析，冷冻干燥得到纳米凝胶产物G3DSP-Ce6。
具体地，步骤3为：将G3DSP-Ce6和CORM-401分别溶解于pH为7.4的 PBS溶液中，超声下，将CORM-401缓慢滴加到G3DSP-Ce6溶液中，室温搅拌过夜，将CORM@G3DSP-Ce6混合溶液在水中透析除去游离的CORM-401，冷冻干燥得到纳米凝胶CORM@G3DSP-Ce6递送***。
更具体地，各步骤中，透析时的截留分子量为1000Da。
更具体地，步骤2中，所述的G3-Ce6与DSP的摩尔比为1:2～1:4，所述的纳米凝胶产物G3DSP-Ce6的粒径在200nm以下。
更具体地，步骤3中，CORM-401占CORM-401和G3DSP-Ce6总质量的 10～30％。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明的光动力诱导的CO释放方法可在近红外光的照射下，利用光敏剂产生的光化学作用，刺激诱导一氧化碳释放分子CORM-401释放CO，实现了CO在近红外光诱导下的时间、空间可控释放；
(2)本发明构建的基于光动力诱导的CO可控递送***，近红外光诱导光敏剂产生的光化学作用可促进CO可控递送***进入细胞，提高光敏剂和一氧化碳释放分子CORM-401在细胞内的富集程度，可在较深的病灶组织内释放CO，且CO释放量大，可行性强；
(3)本发明构建的基于光动力诱导的CO可控递送***能够在细胞内谷胱甘肽的作用下纳米凝胶解体，释放出CORM-401。近红外光激活可同时产生单线态氧和CO分别用于光动力治疗和CO气体治疗。光动力治疗和CO气体联合治疗***具有良好的生物安全性，相比于单纯的光动力治疗和CO气体治疗，联合治疗***具有更好的体内外抗肿瘤效果。
附图说明
图1为本发明的光动力诱导的CO释放方法的机制图。
图2为实施例1中CORM-401分别与不同浓度光敏剂Ce6以及PBS 7.4混合溶液在665nm近红外光照射下的CO释放图。
图3为本发明所构建的CORM@G3DSP-Ce6方法图和光动力诱导CO释放方法利用递送***CORM@G3DSP-Ce6用于癌症治疗的方法与原理图。
图4为CORM@G3DSP-Ce6在665nm近红外光照射下的CO释放图。
图5为G3DSP-Ce6与CORM@G3DSP-Ce6在665nm近红外光照射下的H2O2浓度变化图。
图6为G3DSP-Ce6与CORM@G3DSP-Ce6在665nm近红外光照射下的1O2产生图。
图7为CORM@G3DSP-Ce6的细胞摄取图。
图8为CORM@G3DSP-Ce6-1、CORM@G3DSP-Ce6-2和 CORM@G3DSP-Ce6-3的体外抗肿瘤效果对比图。
图9为CORM@G3DSP-Ce6-2的体外抗肿瘤效果图。
图10为CORM@G3DSP-Ce6-2的体内抗肿瘤流程及效果图。
图11为CORM@G3DSP-Ce6-2体内抗肿瘤的安全性评价图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施方式中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
光动力诱导释放CO的方法的可行性研究。
将不同浓度的光敏剂Ce6和一氧化碳释放分子CORM-401(CORM-401浓度固定为1mM，Ce6与CORM-401浓度比从0.01：1至1：1)溶解于pH为7.4 的磷酸盐缓冲液(PBS 7.4)中，并与CO气体检测仪一起放置于一个透明的圆柱形可分离密闭容器中，封闭***。在665nm的近红外光(光能量密度为11.5 mW/cm2)持续照射下，通过读取不同时间点CO气体检测仪的示数来记录CO 的浓度，计算每个CORM-401分子释放CO的量。
假设容器中的气相和液相二者达到平衡，容器中的压强为1个标准大气压，则CORM-401释放CO的量(NCO[mol])通过下面的公式进行计算：
其中，p为CO的分压，Vg和Vl分别为气相和液相的体积，R是气体常数 (0.08205L·atm·mol-1·K-1)，T为温度，c为CO在液相中的浓度，k是CO在水中的亨利定律常数(25℃下为1052.63L·atm·mol-1)。因此，测得的CO气体浓度便可换算为CO的分压p，从而得到CO的释放量。
图1为光动力诱导CO释放机制图。从图中可知光动力治疗过程中产生的过氧化氢来自于光敏剂的光敏化过程。光敏剂Ce6受光辐照后进入单重激发态，经过系间交互(Intersystem crossing)，单重激发态的Ce6转变为三重激发态，继而将电子转移到氧分子上，产生超氧阴离子。超氧阴离子与溶液中的质子氢结合最终产生稳定的过氧化氢。
而一氧化碳释放分子CORM-401在PBS 7.4中处于一个相对稳定的状态。 CORM-401在溶液中容易失去一个CO，失去的CO又会重新结合到CORM-401 上，使得CORM-401处于相对稳定的状态。若溶液中存在过氧化氢，过氧化氢作为一个活跃的配体及氧化剂，便可促使CORM-401释放出CO。CORM-401 是具有18电子结构的金属羰基配合物，根据18电子规则，CORM-401具有比较稳定的结构，因此，过氧化氢分子结构提供的孤电子对无法直接与CORM-401 配位。当CORM-401在溶液中短暂失去一个CO并处于非稳定状态(16电子结构)时，溶液中的过氧化氢作为配体便可与其中心Mn配位，同时阻止了CO重新结合到Mn中心上。配位的过氧化氢继而氧化CORM-401，使配合物的电子由中心金属离子转移到H2O2配体上，削弱Mn与CO之间的反馈π键，从而削弱反馈π键对其σ配键的稳固作用，最终导致Mn与CO之间σ配键的断裂，促进 CO的释放。
图2为CORM-401分别与不同浓度光敏剂Ce6以及PBS 7.4混合溶液在665 nm近红外光照射下的CO释放图。从图中可知光敏剂Ce6在近红外光照射下诱导一氧化碳释放分子CORM-401释放CO的量依赖于Ce6和CORM-401的比例关系。在Ce6:CORM-401大于0.05:1时，CO的释放量较为明显，CO的产生速率较快。
实施例2
基于光动力诱导的CO释放方法的纳米凝胶递送***的构建。
通过POSS为核、赖氨酸为分支单元的三代赖氨酸树状大分子G3-Lys与光敏剂Ce6之间的共价偶联反应，合成了偶联物G3-Ce6。具体为在氮气保护下，将Ce6(83.53mg，0.14mmol)与N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)(433.29mg， 2.10mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(241.69mg，2.10mmol)溶解于10mL 无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，常温下，过夜反应以活化羧基，经过滤除去二环己基脲(DCU)后，将所得到羧基化Ce6(Ce6-NHS)缓慢滴加到G3-Lys (1.00g，0.07mmol)溶液中，避光反应24h，随后将所得到的溶液依次于DMF 和水中透析(透析袋截留分子量为1000Da)后，冻干得到墨绿色絮状物G3-Ce6。
将G3-Ce6用交联剂(DSP)交联成纳米凝胶。室温下将G3-Ce6溶解于DMF 溶剂中，在1500r/min的转速搅拌下，将含有DSP的DMF溶液缓慢滴加到 G3-Ce6的溶液中，其中G3-Ce6与DSP的摩尔比为1:2～1:4。反应24h后，依次于DMF和水中透析(透析袋截留分子量为1000Da)，冷冻干燥得到墨绿色絮状纳米凝胶产物G3DSP-Ce6。
由于纳米凝胶G3DSP-Ce6内部具有众多空腔，可用于物理负载小分子药物。将G3DSP-Ce6和CORM-401首先分别溶解于PBS 7.4溶液中，于超声状态下，将CORM-401缓慢滴加到G3DSP-Ce6溶液中(其中CORM-401占CORM-401 与G3DSP-Ce6总质量的10～30％)，室温搅拌过夜。所得的CORM@G3DSP-Ce6 混合溶液通过在水中透析(透析袋截留分子量为1000Da)除去游离的 CORM-401，最后冷冻干燥得到CORM@G3DSP-Ce6絮状物。
通过物理包覆的方法，将CORM-401载入G3DSP-Ce6纳米凝胶的内部空腔里，构建了具有不同Ce6和CORM-401比例的共载递送***CORM@G3DSP-Ce6 (命名为CORM@G3DSP-Ce6-1、CORM@G3DSP-Ce6-2和 CORM@G3DSP-Ce6-3，其Ce6：CORM-401分别为1：7.5、1：15、1：20)。
此方法的原理示意图如图3所示。表1为G3-Ce6与DSP不同比例下制得的 G3DSP-Ce6的尺寸分布数据，在G3-Ce6与DSP的摩尔比为1:2～1:4的情况下，可获得尺寸在200nm以下的G3DSP-Ce6纳米凝胶。这是由于该尺寸下的纳米粒子可通过胞吞的方式进入细胞，从而达到良好的细胞摄取率，进而保证其治疗效果。
表1 G3-Ce6与DSP不同比例下制得的G3DSP-Ce6的尺寸分布
实施例3
利用CO气体检测仪来检测CORM@G3DSP-Ce6的CO释放行为。用665nm 的近红外持续照射CORM@G3DSP-Ce6溶液，保持光能量密度为11.5mW/cm2，检测CO的释放量。
为探究光动力诱导CO释放的机制，利用Amplex Red试剂和辣根过氧化物酶(HRP)检测G3DSP-Ce6和CORM@G3DSP-Ce6溶液在光诱导下产生的H2O2浓度变化。将G3DSP-Ce6(Ce6浓度0.68μM)和CORM@G3DSP-Ce6(Ce6浓度0.68μM，CORM-401浓度10μM)分别溶解于PBS 7.4中，并取50μL的溶液到96孔板里，利用665nm的近红外光持续照射溶液后(整个过程保持光能量密度为11.5mW/cm2)，向每个孔里加入50μL的Amplex Red(100μM)和 HRP(0.2U/mL)工作溶液，用酶标仪测定每孔的荧光值(激发波长560nm，发射波长586nm)。通过对比过氧化氢标准曲线，计算出过氧化氢浓度。过氧化氢的标准曲线浓度梯度设置为0、0.5、1、2.5、5、10μM。
结果如图4和图5所示，在近红外光的照射下，CORM@G3DSP-Ce6可快速释放出大量的CO。并且根据图5的对比分析可知，光照情况下，CORM-401的存在消耗了光敏剂Ce6产生的过氧化氢，证明了本发明提出的光动力诱导释放 CO的原理在于消耗了光动力过程产生的过氧化氢，促进CORM-401释放CO。
实施例4
为探究光动力治疗效果，利用单线态氧1O2荧光探针(Singlet Oxygen SensorGreen，SOSG)检测了CORM@G3DSP-Ce6和G3DSP-Ce6在近红外光诱导下的1O2产生能力，进而分析CO的释放是否会消耗Ce6产生的1O2。将 CORM@G3DSP-Ce6(Ce6浓度0.68μM，CORM-401浓度10μM)和G3DSP-Ce6 (Ce6浓度0.68μM)与SOSG(1μM)混合溶解于石英比色皿中，用665nm的近红外光照射该混合溶液，保持光能量密度为11.5mW/cm2。在不同的时间点，用荧光分光光度计测定溶液的荧光值(激发波长488nm，发射波长525nm)。 SOSG(1μM)的PBS 7.4溶液设为空白组。
结果如图6所示，CORM@G3DSP-Ce6与G3DSP-Ce6在相同剂量的光诱导下具有相似的单线态氧产生能力，表明CO的释放并未消耗Ce6产生的单线态氧。由于单线态氧为光动力治疗中对细胞、组织造成破坏的主要因子，CORM-401 在释放CO时对单线态氧的产生效率并无影响，因此可推测CORM@G3DSP-Ce6 递送***在近红外光的诱导下产生CO气体的同时，很好的保留了光动力治疗的作用。
实施例5
细胞实验
为了探究CORM@G3DSP-Ce6的细胞摄取率，利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测了CORM@G3DSP-Ce6的细胞摄取情况。
为了选择Ce6和CORM-401的最佳比例，本发明首先研究了 CORM@G3DSP-Ce6-1、CORM@G3DSP-Ce6-2和CORM@G3DSP-Ce6-3的抗小鼠乳腺癌细胞4T1增殖的效果。将100μL细胞密度为5×103个/孔的细胞悬浮液置于96孔板中，于培养箱中培养过夜。待细胞贴壁后，弃掉原有培养基。将具有相同Ce6浓度(2.72μM)的G3DSP-Ce6、CORM@G3DSP-Ce6-1、 CORM@G3DSP-Ce6-2和CORM@G3DSP-Ce6-3分别与4T1细胞培养3h，而后进行低能量的近红外光照(0.25J/cm2)，继续培养1h后，再根据如下分组选择是否对细胞进行光照处理：
1)Control：空白培养基+黑暗
2)CO-1：CORM@G3DSP-Ce6-1+黑暗
3)CO-2：CORM@G3DSP-Ce6-2+黑暗
4)CO-3：CORM@G3DSP-Ce6-3+黑暗
5)PDT：G3DSP-Ce6-3+光照
6)PDT+CO-1：CORM@G3DSP-Ce6-1+光照
7)PDT+CO-2：CORM@G3DSP-Ce6-2+光照
8)PDT+CO-3：CORM@G3DSP-Ce6-3+光照
近红外光照的剂量均为1J/cm2。将细胞继续培养24h后，弃掉培养基，用 PBS 7.4溶液清洗细胞，加入含有10％CCK-8的无血清培养基，于培养箱中孵育1h，用酶标仪测定每个孔在450nm处的光密度值，以此方法测定每个孔的细胞存活率。细胞存活率通过如下公式计算得到：
其中，Ax为实验组的吸收值，Ac为阴性对照组的吸收值，Ab为空白对照组的吸收值。
根据以上实验的结果，选用CORM@G3DSP-Ce6-2检测各个浓度下的抗肿瘤效果，具体操作如上描述进行。
结果如图7-9所示。从图7可知，细胞对CORM@G3DSP-Ce6有较好的摄取效果，并且当进行了近红外光照后，细胞的摄取量更大，达到了92％，细胞内检测到的CORM@G3DSP-Ce6平均荧光强度(MFI)也显著提高。结果表明了近红外光诱导下，CORM@G3DSP-Ce6可以很好地富集在细胞内。
从图8可知，单纯地将CORM@G3DSP-Ce6递送到肿瘤细胞内而不对其进行光照处理，肿瘤细胞的存活率几乎无任何改变，表明单纯的CORM-401对肿瘤治疗无效果。CORM@G3DSP-Ce6-1、CORM@G3DSP-Ce6-2与 CORM@G3DSP-Ce6-3在光照情况下产生的光动力联合CO气体治疗 (PDT+CO-1、PDT+CO-2与PDT+CO-3组)均比单纯的光动力治疗(PDT组) 具有更好的治疗效果，且PDT+CO-2和PDT+CO-3具有最佳的肿瘤细胞杀伤效果，说明CORM@G3DSP-Ce6-2和CORM@G3DSP-Ce6-3在光诱导下具有更为明显的联合治疗效果。
从图9可知CORM@G3DSP-Ce6产生的4T1肿瘤细胞增殖抑制效果 (PDT+CO组)依赖于Ce6与CORM-401的浓度，当Ce6与CORM-401的浓度分别达到1.36与20μM时，细胞存活率明显降低了。
实施例6
动物实验
小鼠乳腺癌模型的构建如下所示：
将生长状况良好的4T1细胞离心(1200rpm，3min)收集，并用PBS 7.4洗涤后，将所得到的细胞悬浮液(细胞密度为1×106个每只小鼠)通过皮下注射到小鼠的背部右后侧，注意观察肿瘤的生长情况并测量肿瘤的尺寸。肿瘤的尺寸用游标卡尺测量计算得到，具体计算公式如下：
V＝W2×L/2
其中V代表肿瘤尺寸(体积)，W为肿瘤的宽度，L为肿瘤的长度。。
本发明利用小鼠4T1乳腺癌肿瘤模型，检测了光动力诱导CO释放方法的治疗效果。采用BALB/c小鼠，在小鼠皮下建立4T1乳腺癌肿瘤模型。当肿瘤长至约100mm3时，将小鼠随机分成4组，通过瘤内注射的方式进行给药，给药1 h后进行低能量的近红外光照(3.0J/cm2)，并根据组别选择是否对小鼠进行光照处理，具体分组如下：
1)PBS：为空白对照组，注射PBS 7.4溶液，黑暗条件；
2)CO：注射CORM@G3DSP-Ce6溶液(Ce6剂量为1.0mg/kg， CORM-401剂量为8.1mg/kg)，黑暗条件；
3)PDT：注射G3DSP-Ce6溶液(Ce6剂量为1.0mg/kg)，分别在给药4h和24h后进行12.0J/cm2的近红外光照；
4)PDT+CO：注射CORM@G3DSP-Ce6溶液(Ce6剂量为1.0mg/kg， CORM-401剂量为8.1mg/kg)，分别在给药4h和24h后进行12.0J/cm2的近红外光照。
以上给药和光照治疗过程分别进行3次，间隔3天。持续观察小鼠身体状况，测量其体重变化和肿瘤大小。18天后，处死小鼠，取其肿瘤和心、肝、脾、肺、肾，并用PBS 7.4溶液清洗掉血渍，并对肿瘤大小形貌进行拍照并称重。取出的肿瘤和主要脏器用4％的多聚甲醛固定。
将肿瘤和主要脏器脱水处理、修剪、包埋、切片后，进行H&E、TUNEL染色以及CD31免疫组化染色，并在玻璃板中密封，最后用显微镜观察并进行图像采集。
本发明还利用酶联免疫吸附方法(Elisa)测定小鼠血浆中的HbCO含量，以评估CORM@G3DSP-Ce6的安全性。
动物实验的结果如图10与图11所示。
图10a为细胞实验的流程示意图。图10b-d表明了CORM@G3DSP-Ce6在光照诱导下可产生光动力治疗和CO气体治疗的联合治疗(PDT+CO)效果。图中的小鼠肿瘤最终大小表明PDT+CO联合治疗很好地抑制了小鼠乳腺癌肿瘤的增殖，其肿瘤抑制率达到了84％(图中*p<0.05)。图10e显示了小鼠肿瘤组织的染色切片分析结果。在H&E染色切片中，PDT+CO联合治疗组的肿瘤组织肿瘤细胞核缩小、组织间隙增大，意味着肿瘤组织受到了较大的破坏。肿瘤组织的凋亡情况用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测后发现，在TUNEL染色切片中， PDT+CO联合治疗组的肿瘤细胞凋亡率明显提高。并且本发明利用目的基因 CD31免疫组织化学法对小鼠肿瘤组织切片进行染色，观察并确定目的基因 CD31表达位置和信号强弱，以此评估小鼠肿瘤组织内的微血管密度。从结果可知肿瘤组织的微血管密度(MVD)在经过PDT+CO联合治疗后显著降低了。图中的标尺长度为50μm。
图11表明了利用CORM@G3DSP-Ce6在近红外光照射下进行治疗的生物安全性评估。如图11a所示，将CORM@G3DSP-Ce6注射到小鼠体内后，并未引起小鼠血液中碳氧血红蛋白(HbCO)含量的上升，表明注射CORM@G3DSP-Ce6 不会引起CO中毒现象，证明了该递送***的安全性。如图11b所示，在进行 PDT+CO治疗过程时，小鼠体重无异常变化，小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)的H&E染色切片(图11c，标尺长度为100μm)并无发现明显的组织炎症和坏死现象，表明了利用CORM@G3DSP-Ce6进行光动力治疗和CO气体治疗具有良好的生物安全性。
综上所述，本发明的光动力诱导CO释放方法具有在近红外光诱导下快速释放CO的性能。光敏剂(例如Ce6)与CORM-401的混合溶液在近红外光(例如波长为665nm)的照射下，可释放出大量的CO，并且随着光敏剂浓度比例的增大，CO的释放量越高。并且本发明构建的CORM@G3DSP-Ce6在近红外光照射下，可快速释放出大量CO。其中，促进CO释放的主要原因是消耗了PDT 过程中产生的大量H2O2。并且CORM@G3DSP-Ce6在释放CO的同时，并未消耗PDT过程中产生的1O2。
本发明的光动力诱导CO释放方法具有联合光动力治疗和CO气体治疗的性能，可用于多种疾病的治疗。近红外光诱导光敏剂产生的光化学作用可促进 CORM@G3DSP-Ce6进入细胞，提高光敏剂和一氧化碳释放分子CORM-401在细胞内的富集程度。并且CORM@G3DSP-Ce6在细胞内谷胱甘肽的作用下纳米凝胶解体，释放出CORM-401。近红外光激活可同时产生单线态氧和CO分别用于光动力治疗和CO气体治疗。光动力治疗和CO气体联合治疗***具有良好的生物安全性，相比于单纯的光动力治疗和CO气体治疗，联合治疗***具有更好的体内外抗肿瘤效果。
通过H&E染色、TUNEL细胞凋亡检测以及CD31免疫组化研究，本发明的联合抗肿瘤机制主要在于：近红外光诱导下，CORM@G3DSP-Ce6同时产生了 CO气体和单线态氧，引起了肿瘤组织的大面积破坏，降低了肿瘤组织的微血管密度MVD，从而切断了肿瘤组织迅速增殖的营养供应链，引起肿瘤细胞的大面积凋亡，最终抑制肿瘤组织的生长。

Claims (10)

1.CO可控递送***，其特征在于，所述的CO可控递送***为CORM@G3DSP-Ce6纳米凝胶递送***，包括纳米凝胶G3DSP-Ce6和负载在纳米凝胶G3DSP-Ce6空腔内的一氧化碳释放分子CORM-401，所述的纳米凝胶G3DSP-Ce6为以多面体低聚倍半硅氧烷POSS为核的三代赖氨酸树状大分子G3-Lys与光敏剂Ce6共价偶联得到偶联物G3-Ce6经交联剂3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯交联形成的纳米凝胶。
2.根据权利要求1所述的CO可控递送***，其特征在于，所述的光敏剂Ce6与一氧化碳释放分子CORM-401的摩尔比为1:7.5～20。
3.根据权利要求1所述的CO可控递送***，其特征在于，所述的光敏剂Ce6与一氧化碳释放分子CORM-401的摩尔比为1:15～20。
4.根据权利要求1～3任一所述的CO可控递送***的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将以多面体低聚倍半硅氧烷POSS为核的三代赖氨酸树状大分子G3-Lys与光敏剂Ce6共价偶联得到偶联物G3-Ce6；
步骤2，将G3-Ce6用交联剂3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯交联成纳米凝胶G3DSP-Ce6递送***；
步骤3，利用物理负载的方式，将CORM-401缓慢滴加到G3DSP-Ce6溶液中，搅拌至混合均匀，透析除去游离的CORM-401，冷冻干燥得到CORM@G3DSP-Ce6纳米凝胶递送***。
5.根据权利要求4所述的CO可控递送***的制备方法，其特征在于，步骤1为：在氮气保护下，将Ce6与N,N'-二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺溶解于DMF中，常温下，过夜反应以活化羧基，过滤除去二环己基脲后，将得到的羧基化Ce6缓慢滴加到G3-Lys溶液中，避光反应，随后将得到的溶液依次于DMF和水中透析后，冻干得到偶联物G3-Ce6。
6.根据权利要求4所述的CO可控递送***的制备方法，其特征在于，步骤2为：室温下将G3-Ce6溶解于DMF中，搅拌下将含有DSP的DMF溶液缓慢滴加到G3-Ce6的溶液中，反应结束后，依次于DMF和水中透析，冷冻干燥得到纳米凝胶产物G3DSP-Ce6。
7.根据权利要求4所述的CO可控递送***的制备方法，其特征在于，步骤3为：将G3DSP-Ce6和CORM-401分别溶解于pH为7.4的PBS溶液中，超声下，将CORM-401缓慢滴加到G3DSP-Ce6溶液中，室温搅拌过夜，将CORM@G3DSP-Ce6混合溶液在水中透析除去游离的CORM-401，冷冻干燥得到纳米凝胶CORM@G3DSP-Ce6递送***。
8.根据权利要求4所述的CO可控递送***的制备方法，其特征在于，各步骤中，透析时的截留分子量为1000Da。
9.根据权利要求4所述的CO可控递送***的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述的G3-Ce6与DSP的摩尔比为1:2～1:4，所述的纳米凝胶产物G3DSP-Ce6的粒径在200nm以下。
10.根据权利要求4所述的CO可控递送***的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述的CORM-401占CORM-401和G3DSP-Ce6总质量的10～30％。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110742856B (zh) * 2019-10-17 2020-11-10 南京工业大学 靶向递送并消耗大量h2o2的同时释放co的纳米凝胶药物载体、制备方法及其应用
GB202004514D0 (en) * 2020-03-27 2020-05-13 Inst De Medicina Molecular Joaeo Lobo Antunes Treatment of Immunosuppressive Cancer
CN111494340B (zh) * 2020-05-09 2021-07-02 山东大学 一种光触发可控释放药物的聚倍半硅氧烷基纳米载药***及其制备方法
CN111686251B (zh) * 2020-06-17 2022-04-12 福建医科大学孟超肝胆医院(福州市传染病医院) 用于声动力/气体协同抗肿瘤治疗的仿生纳米材料及其制备方法
CN113368236B (zh) * 2021-04-28 2022-11-04 温州医科大学附属口腔医院 用于光动力/no协同抗生物膜感染和促伤口愈合的两亲性树状多肽及其制备方法、用途
CN113274497A (zh) * 2021-05-27 2021-08-20 淮阴工学院 一种纳米材料及其制备方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104829652A (zh) * 2015-03-31 2015-08-12 华东理工大学 近红外光光控释放一氧化氮的纳米体系及其制法和应用
CN104888217A (zh) * 2009-06-12 2015-09-09 鹿特丹伊拉斯谟大学医疗中心 用于癌症光动力学治疗的靶向纳米光药物
CN105749280A (zh) * 2016-04-07 2016-07-13 沈阳大学 一种协同化疗与光动力治疗的肿瘤靶向纳米给药***的制备及应用
CN107189780A (zh) * 2017-05-09 2017-09-22 嘉兴学院 上转换发光材料一氧化碳释放剂及其制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104888217A (zh) * 2009-06-12 2015-09-09 鹿特丹伊拉斯谟大学医疗中心 用于癌症光动力学治疗的靶向纳米光药物
CN104829652A (zh) * 2015-03-31 2015-08-12 华东理工大学 近红外光光控释放一氧化氮的纳米体系及其制法和应用
CN105749280A (zh) * 2016-04-07 2016-07-13 沈阳大学 一种协同化疗与光动力治疗的肿瘤靶向纳米给药***的制备及应用
CN107189780A (zh) * 2017-05-09 2017-09-22 嘉兴学院 上转换发光材料一氧化碳释放剂及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"[Mn(CO)4{S2CNMe(CH2CO2H)}], a new water-soluble CO-releasin molecule";Sian H. Crook等;《Dalton Trans.》;20111231;第40卷(第16期);4230-4235
"PDT-Driven Highly Efficient Intracellular Delivery and Controlled Release of CO in Combination with Sufficient Singlet Oxygen Production for Synergistic Anticancer Therapy";Lihuang Wu等;《Advanced Functional Materials》;20180827;第28卷(第41期);1-13

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