CN108535229B - 一种获取受限熔体中单个聚合物分子扩散以及运动模式的测量方法 - Google Patents

一种获取受限熔体中单个聚合物分子扩散以及运动模式的测量方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种获取受限熔体扩散场单个聚合物分子扩散信息以及运动模式的测量方法。该方法包括如下步骤：1)将荧光分子探针标记于聚合物分子的末端；2)将所述聚合物的溶液与荧光标记聚合物的溶液混合，然后采用所述混合溶液制备受限超薄膜熔体；3)将激光照射于所述受限超薄膜过冷熔体上，收集所述荧光分子探针发射的荧光信号；所述荧光信号被单光子探测器检测到，通过对荧光信号强度的分布分析可以精确的得到标记聚合物分子的位置信息；4)通过在受限超薄膜熔体内提取标记聚合物分子的空间坐标，就能计算得到受限熔体中单个聚合物分子的扩散信息和对应的扩散模式。该方法既可以得到精确位置的扩散信息，而且具有单分子级别的分辨率和灵敏度。

Description

一种获取受限熔体中单个聚合物分子扩散以及运动模式的测 量方法
技术领域
本发明属于高分子物理基础研究领域，特别涉及到一种获取受限熔体中单个聚合物分子扩散信息的测量方法。
背景技术
测量聚合物分子受限熔体中的扩散信息一直是高分子物理领域的重要基础性研究工作。聚合物分子在受限熔体中的扩散与其和扩散介质的相互作用有着密切的联系，这方面的研究不仅将帮助我们更好的理解聚合物熔体宏观动态粘弹性的微观物理过程，也将帮助我们理解一些细胞介质中生物大分子的微观输运过程。
受限熔体中的扩散可大体分为布朗扩散和分形布朗扩散。对于受限熔体中的布朗扩散Steve Granick等人用荧光恢复漂白技术成功的得到了界面上受限聚苯乙烯的平均布朗扩散信息(Changqian Yu and Steve Granick.Revisiting Polymer SurfaceDiffusion in the Extreme Case of Strong Adsorption，Langmuir，2014，30：14538-14544)；Michael Rubinstein等人用二次离子质谱技术成功的测得了氘代聚苯乙烯的熔体薄膜中布朗扩散的分布信息(Michael Rubinstein et al.,Long-Range Effects onPolymer Diffusion Induced by a Bounding Interface，Phys.Rev.Lett，1997,79:241-244)；对于受限熔体的分形布朗扩散Cecile Fradin等人用荧光关联光谱技术测得生物受限环境中单个聚合物的受限扩散信息(Daniel Banks,Charmaine Tressler and CecileFradin.Single Characterizing anomalous diffusion in crowded polymer solutionsand gels over five decades in time with variable-lengthscale fluorescencecorrelation spectroscopy，Soft Matter，2016，12：4190-4203)。
然而，荧光恢复漂白技术对于受限熔体布朗扩散的平均信息可以获得很好的提取，但并不具备测量单个聚合物扩散信息的能力；二次离子质谱可以通过对聚合物标记，得到扩散的分布信息，但受制于标记的浓度要求，也无法获得单个聚合物的扩散信息。荧光关联光谱技术可以测量受限熔体中单个聚合物的扩散信息，但是对于解析扩散的运动模式有一定的模型依赖性，而在受限环境中的扩散往往偏离了理论模型的假设，并且这种技术更适合快扩散体系的测量，对于强受限体系的扩散灵敏度不够，因此不能满足受限环境中单个聚合物分子的扩散信息的测量和运动模式的解析。
发明内容
本发明的目的是提供一种获取受限熔体中单个聚合物分子扩散信息以及运动模式的测量方法，该方法既可以得到精确位置的扩散信息，而且具有单分子级别的分辨率和灵敏度。
本发明所提供的获取受限熔体扩散场单个聚合物分子扩散信息以及运动模式的测量方法，包括如下步骤：
1)将荧光分子探针标记于聚合物分子的末端，得到荧光标记聚合物；
2)将所述聚合物的溶液与所述荧光标记聚合物的溶液混合，得到混合溶液；然后采用所述混合溶液制备受限超薄膜熔体；
3)将激光照射于所述受限超薄膜熔体上，收集所述荧光分子探针发射的荧光信号；所述荧光信号被单光子探测器检测到，通过对荧光信号强度的分布分析可以精确的得到标记聚合物分子的位置信息；
所采用的测量***包括：
一用于作为激发光照射待测样品的激发光光源单元；
一用于将所述激发光光源单元发出的激发光会聚到待测样品，同时将待测样品产生的荧光信号收集并导出的光学显微单元；
一用于对待测样品进行单分子显微成像的单分子荧光成像单元；
4)通过在受限超薄膜熔体内提取标记聚合物分子的空间坐标，通过坐标计算标记分子的均方位移，将所述均方位移与间隔时间进行线性拟合，从而得到受限熔体中单个聚合物分子的扩散信息和对应的扩散模式。
上述测量方法中，步骤1)中所述荧光分子探针以化学反应键和的方式标记于聚合物分子的末端；所述荧光分子探针与所述聚合物分子的摩尔比为1：1～1.5，具体摩尔比可为1:1。
上述测量方法中，步骤2)中所述聚合物的溶液的浓度为104～106nM，具体可为105nM；所述标记的聚合物的溶液的浓度为1～10nM；所述混合溶液中聚合物与标记的聚合物的摩尔比为103～106：1，具体可为105：1。
上述测量方法中，步骤2)中所述的受限超薄膜熔体是采用旋涂法制备的；具体是由能够实施精确旋涂的甩膜仪完成的；所述甩膜仪的甩膜速度从1000rpm到6000rpm精确可控。所述受限超薄膜熔体的厚度为5-50nm，具体可为6nm。
上述测量方法中，步骤3)中所述激发光光源单元包括一个激发光光源、若干反射镜、一个格兰泰勒棱镜、一个1/4波片、两个光阑、一个激光扩束镜、一个中性密度滤波片、一个二向色镜和一个光学凸透镜；所述激发光光源发出的激发光经若干反射镜反射后依次进入所述格兰泰勒棱镜和所述1/4波片使所述激发光由线偏振光转化为圆偏振光；所述圆偏振光依次经第一光阑、激光扩束镜、反射镜、第二光阑、反射镜、中性密度滤波片、二向色镜使之成为平行光；经所述二向色镜出射的平行光进入光学凸透镜，通过调节所述光学凸透镜实现激发光于所述光学显微单元的物镜后焦平面处聚焦从而出射为平行扩束的圆偏振光，进入所述光学显微单元。
步骤3)中所述光学显微单元采用倒置显微镜，圆偏振光经高数值孔径物镜聚焦待测样品，待测样品的荧光探针经圆偏振光激发产生荧光，荧光经所述高数值孔径物镜收集并依次经光学凸透镜、二向色镜、发射光滤光片和反射镜发射到所述单分子荧光成像单元。
步骤3)中所述单分子荧光成像单元采用单光子探测器，所述的单光子探测器可以为EMCCD相机。
上述测量方法中，步骤4)中通过对荧光信号强度的分布分析得到信号的强度空间分布的中心坐标值；对荧光信号强度的分布分析采用信号强度分析***，该***包括数据采集卡和商业化软件。
上述测量方法中，所述的荧光探针分子具体可为perylene diimide derivative(PDI)，其最大吸收波长为532nm，其结构式如式(I)所示：
Figure BDA0001626616440000031
上述测定方法中，所述的聚合物分子具体可为人工合成的聚己内酯(PCL,n＝83，Mn/Mw＝1.5)，其结构式如式(II)所示：
Figure BDA0001626616440000032
由于荧光分子探针是以化学反应键和的方式标记于聚合物分子的末端，而所述荧光分子探针的大小相比所述聚合物长链可以忽略不计，因此荧光分子的扩散就可以代表聚合物分子的扩散。
本发明的测量方法，采用自行设计搭建的一种单分子荧光成像的测量***，具有高的空间和时间分辨率，具有单分子级别的灵敏度，测量样品的浓度可以达到nM水平。
附图说明
图1是本发明所用的实验装置“单分子荧光成像的测量***”的示意图。
图2是荧光信号位置分布图。
图3是单个聚合物分子的扩散信息以及对应的特定扩散模式。
图中：
0.二向色镜，1.金属膜全反射镜，2.光阑，3.中性密度滤波片，4.激光扩束镜，5.盖玻片，6.格兰泰勒棱镜，7.1/4波片，8.光学凸透镜，9.发射光滤光片，10.激光光源，11.EMCCD，12.高数值孔径物镜。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、受限熔体薄膜中聚己内酯分子扩散位置分布以及运动模式
1.末端荧光标记聚己内酯的制备
1)将10mg PCL(Mn＝9500；购买于加拿大polymer source公司)溶解在5ml DCM(二氯甲烷，百灵威)溶剂中；
2)将1mg的PDI染料(991.00g/mol；购买于TCI,Japan；直接使用)的DCM溶液加入步骤1)配制好的DCM溶液中，均匀混合，并加入1mg DCC(N,N-二环己基碳二亚胺,Alfa Aesar)和0.1mg DMAP(4-二甲胺基吡啶,Alfa Aesar)，在室温下，避光过夜反应；
3)将染色反应的混合物通过以THF的为流动相的交联聚苯乙烯凝胶色谱柱(Bio-X1media；Bio-Rad,USA)分离除去自由染料，上述过程重复至少3次直至滤出液中未检测到荧光信号，获得PDI标记的PCL。
2.掺杂有PDI标记的PCL的受限PCL超薄膜熔体的制备
将5mg PCL(Mn＝9500；购买于加拿大polymer source公司)溶解在5ml DCM溶剂中，得到PCL的溶液；将1mg PDI标记的PCL溶解在100ml DCM溶剂中，得到PDI标记的PCL的溶液；将上述两种溶液按照1000：1的体积比混合；然后用能够实施精确旋涂的甩膜仪在盖玻片上制备受限超薄膜过冷熔体，所述甩膜仪的甩膜速度为4000rpm，旋涂时间为30秒，膜厚度为6nm。
3.获取受限熔体薄膜中聚己内酯分子扩散位置分布以及运动模式
采用图1所示的实验装置“单分子荧光成像的测量***”进行测量，
如图1所示，激发光光源单元包括一个激发光光源10(本实施例中采用的激发光波长为532nm)、若干金属膜全反射镜1、一个格兰泰勒棱镜6、一个1/4波片7、两个光阑2、一个激光扩束镜4、一个中性密度滤波片3、一个二向色镜0和一个光学凸透镜8；所述激发光光源1发出的激发光经若干金属膜全反射镜1反射后依次进入所述格兰泰勒棱镜6和所述1/4波片7使所述激发光由线偏振光转化为圆偏振光；所述圆偏振光依次经第一光阑2、激光扩束镜4、金属膜全反射镜1、第二光阑2、金属膜全反射镜1、中性密度滤波片3、二向色镜0使之成为平行光；经所述二向色镜出射的平行光进入光学凸透镜，通过调节所述光学凸透镜实现激发光于所述光学显微单元的物镜后焦平面处聚焦从而出射为平行扩束的圆偏振光，进入所述光学显微单元。
所述光学显微单元采用倒置显微镜，圆偏振光经高数值孔径物镜12聚焦待测样品，待测样品的荧光探针经圆偏振光激发产生荧光，荧光经所述高数值孔径物镜12收集并依次经光学凸透镜8、二向色镜0、发射光滤光片9和金属膜全反射镜1发射到所述单分子荧光成像单元。
所述单分子荧光成像单元采用EMCCD相机。
具体操作步骤如下：
1.打开激发光源(532nm)；
2.通过格兰泰勒棱镜和1/4波片使激发光由线偏振光转化为圆偏振光；
3.将圆偏振光通过光阑和激光扩束镜使之成为平行激发光；
4.平行激发光被凸透镜聚焦于物镜后焦平面上并使激发光透过高数值孔径显微物镜以平行光的方式出射；
5.切换到油浸物镜，并在显微镜物镜上加入40μL镜油，并向上调节使之达到合适的探测位置；
6.将带有受限超薄膜熔体的盖波片放置到物镜上；
7.微调物镜高度使得探测到的荧光信号最佳；
8.打开EMCCD，获取正焦的荧光探针的空间位置分布信息图案，如图2所示，并通过连续拍摄(0.1s为时间间隔)定位每幅图案中荧光探针的中心坐标；
通过数据拟合得到单个聚合物分子的特定位置的扩散信息和运动模式,如图3所示，根据所得到的轨迹坐标计算分子的均方位移(MSD)与时间关系(Δt)，通过线性拟合(<r(Δt)2>＝4DΔtα)得到扩散系数0.0025μm2/s,于相同聚合物不受限的情况相比(5μm2/s)降低了3个数量级。进一步通过数据结果的斜率分析，得到了0.3的斜率，而普通斜率的扩散斜率为1。通过链接单个聚合物分子的轨迹，如图3插图所示，分子的运动模式是在“笼子效应”影响下的受阻扩散模式。所述结果表明，通过自行搭建的单分子荧光成像的测量***，成功测量了受限熔体中的单个聚合物分子的扩散信息和对应的运动模式。

Claims (4)

1.一种获取受限熔体扩散场单个聚合物分子扩散信息以及运动模式的测量方法，包括如下步骤：
1)将荧光分子探针标记于聚合物分子的末端，得到荧光标记聚合物；
2)将所述聚合物的溶液与所述荧光标记聚合物的溶液混合，得到混合溶液；然后采用所述混合溶液制备受限超薄膜熔体；
3)将激光照射于所述受限超薄膜熔体上，收集所述荧光分子探针发射的荧光信号；所述荧光信号被单光子探测器检测到，通过对荧光信号强度的分布分析可以精确的得到标记聚合物分子的位置信息；
所采用的测量***包括：
一用于作为激发光照射待测样品的激发光光源单元；
一用于将所述激发光光源单元发出的激发光会聚到待测样品，同时将待测样品产生的荧光信号收集并导出的光学显微单元；
一用于对待测样品进行单分子显微成像的单分子荧光成像单元；
4)通过在受限超薄膜熔体内提取标记聚合物分子的空间坐标，通过坐标计算标记分子的均方位移，并且和间隔时间进行线性拟合，从而得到受限熔体中单个聚合物分子的扩散信息和对应的扩散模式；
所述步骤2)中，所述聚合物的溶液的浓度为105～106nM；所述标记的聚合物的溶液的浓度为1～10nM；所述混合溶液中聚合物与标记的聚合物的摩尔比为105～106：1；
所述步骤2)中，所述的受限超薄膜熔体是采用旋涂法制备的；具体是由能够实施精确旋涂的甩膜仪完成的；所述甩膜仪的甩膜速度从1000rpm到6000rpm精确可控；所述受限超薄膜熔体的厚度为5nm-50nm；
所述步骤3)中，所述激发光光源单元包括一个激发光光源、若干反射镜、一个格兰泰勒棱镜、一个1/4波片、两个光阑、一个激光扩束镜、一个中性密度滤波片、一个二向色镜和一个光学凸透镜；所述激发光光源发出的激发光经若干反射镜反射后依次进入所述格兰泰勒棱镜和所述1/4波片使所述激发光由线偏振光转化为圆偏振光；所述圆偏振光依次经第一光阑、激光扩束镜、反射镜、第二光阑、反射镜、中性密度滤波片、二向色镜使之成为平行光；经所述二向色镜出射的平行光进入光学凸透镜，通过调节所述光学凸透镜实现激发光于所述光学显微单元的物镜后焦平面处聚焦从而出射为平行扩束的圆偏振光，进入所述光学显微单元；
所述光学显微单元采用倒置显微镜，圆偏振光经高数值孔径物镜聚焦待测样品，待测样品的荧光探针经圆偏振光激发产生荧光，荧光经所述高数值孔径物镜收集并依次经光学凸透镜、二向色镜、发射光滤光片和反射镜发射到所述单分子荧光成像单元；
所述单分子荧光成像单元采用单光子探测器，所述的单光子探测器具体为EMCCD相机；
所述步骤4)中，通过对荧光信号强度的分布分析得到信号的强度空间分布的中心坐标值；对荧光信号强度的分布分析采用信号强度分析***，该***包括数据采集卡和商业化软件。
2.根据权利要求1所述的测量方法中，其特征在于：所述步骤1)中，所述荧光分子探针以化学反应键和的方式标记于聚合物分子的末端；所述荧光分子探针与所述聚合物分子的摩尔比为1：1～1.5。
3.根据权利要求1所述的测量方法，其特征在于：所述的荧光探针分子为荧光染料，具体为PDI，其最大吸收波长为532nm，其结构式如式(I)所示：
Figure FDA0002658699900000021
4.根据权利要求1所述的测量方法，其特征在于：所述的聚合物分子为聚己内酯，其结构式如式(II)所示：
Figure FDA0002658699900000022
其中，n＝83,Mn/Mw＝1.5。
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Granted publication date: 20201027

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