CN108531616B - 一种牦牛体格相关的基因分子标记、检测方法和试剂盒 - Google Patents

一种牦牛体格相关的基因分子标记、检测方法和试剂盒 Download PDF

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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

本发明涉及一种牦牛体格相关的基因分子标记、检测方法和试剂盒，属于分子生物学技术领域。本发明通过对牦牛MMP3基因的遗传多态性进行分析，找到MMP3基因的一个可以影响牦牛体格相关的SNP位点；本发明还提供了对上述SNP位点进行检测的PCR方法。通过上述方法可以较好地对牦牛进行分子育种。

Description

一种牦牛体格相关的基因分子标记、检测方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及一种牦牛体格相关的基因分子标记、检测方法和试剂盒，属于分子生物学技术领域
背景技术
动物分子育种(Animal molecular breeding)是利用分子数量遗传学理论和技术来改良畜禽品种的一门新兴学科，是传统的动物育种理论和方法的新发展。从目前发展现状来看，它应包括两方面内容：基因组育种(Genomic breeding)和转基因育种(Transgenicbreed-ing)。其中，基因组育种是在基因组分析的基础上，通过DNA标记技术来对畜禽数量性状座位进行直接选择，或通过标记辅助导入有利基因，通过标记辅助淘汰(Mar-kerassisted culling，MAC)清除不利基因等，以达到更有效地改良畜禽的目的。转基因育种则是通过基因转移技术将外源基因导入某种动物的基因组上，育成转基因畜禽新品种(系)，从而达到改良重要生产性状(如生长率、遗传抗性等)或非常规性育种性状(如生产人类药用蛋白、工业用酶等)的目标。
牦牛是牛属动物中能适应高寒气候环境条件而延续至今的牛种。我国现有牦牛1300余万头，占世界牦牛总数的95％以上，占我国牛只总数的1/6，主要分布在青海、西藏、四川、甘肃、云南、新疆等省区。由于牦牛具有抗逆性强，适合高原气候和耐粗饲等优点，并且受现代良种的冲击比较小，具有地方品种的特异性，是当地畜牧业经济中不可缺少的重要畜种，切实合理地保护和利用这些珍贵的遗传资源，对于发展高海拔地区畜牧业具有重要意义。然而牦牛的生产性能远远低于其他牛种，这极大地限制了这些地区畜牧业经济的进一步发展。如何发挥和利用这一宝贵的基因库，提高当地畜牧业经济效益是我国畜牧界急需研究的重要课题之一。在育种工作中，常规育种方法受到了极大的限制，牦牛产区曾采用种间杂交改良、本品种选育等多种方法来提高牦牛的生产性能，但由于受到杂种雄性不育、牦牛群体无***的生产性能和系谱记录等因素的影响，这些方法没有达到改良牦牛品质、提高生产性能的目的，牦牛至今仍属生产性能较低的原始牛种。因此，应用分子育种的理论和技术探讨提高牦牛生产性能的其他新途径和方法具有十分重要的理论和实际意义。
基质金属蛋白酶3(MMP3)，也称为***溶素1(基质溶素-1)或前明胶酶(明胶酶)，是基质金属蛋白酶家族的一个重要成员。MMP3基因定位于人染色体11q22.3区域，大约1.8kb的长度。MMP3在细胞内形式(proMMP3)生成，有477个氨基酸组成的约57kDa的分子量。MMP3蛋白的结构可以在氨基末端肽区域、氨基末端催化结构域和羧基端结构域三个部分。传统认为，MMP3通过调节细胞外基质的重建发挥其功能。其降解(包括Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ、Ⅹ型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖等)几乎全部的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分，以多种方式调节细胞的增殖和迁移，可以通过水解各种ECM成分激活其他MMPs(MMP1、7、8、9、13)等来实现。此外最新的研究显示MMP3还可以出现在细胞核内，并通过其催化活性诱导细胞凋亡，进一步表明MMP3的功能是多样而复杂的。
本发明通过对牦牛MMP3基因进行多态性分析，以提高其在牦牛分子育种中的应用。
发明内容
本发明提供了一个与牦牛体格相关的基因分子标记，通过该分子标记可以用于牦牛的分子育种，同时本发明也提供了对该基因标记进行检测的PCR方法和试剂盒。
技术方案是：
本发明的第一个方面，提供了：
一种牦牛体格相关的基因分子标记，是牦牛MMP3基因第1324位为G或者T的snp位点。
本发明的第二个方面，提供了：
上述的牦牛体格相关的基因分子标记的PCR检测方法，包括如下步骤：
提取牦牛的DNA样本；
对DNA样本进行PCR扩增，扩增区域中包括MMP3基因第1324位；
对扩增区域进行测序。
在一个实施例中，PCR扩增的过程采用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示。
在一个实施例中，PCR扩增的反应体系25μL，其中含1μL模版DNA，2.0μL10×buffer，3μLdNTP，2μL上下游引物混合液，1μLTaqDNA聚合酶，用ddH2O补足至25.0μL。
在一个实施例中，PCR扩增程序：93℃4min；93℃35s，56℃35s，75℃50s，循环40次；70℃8min。
在一个实施例中，所述的测序是通过Sanger测序或者NGS测序。
本发明的第三个方面，提供了：
上述的牦牛体格相关的基因分子标记的检测试剂盒，包括：
核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示的引物。
本发明的第四个方面，提供了：
用于检测上述的牦牛体格相关的基因分子标记的试剂在用于制备用于牦牛体格相关分子育种试剂中的用途。
所述体格是指体重、体斜长、体高、胸围或者管围。
有益效果
本发明提供的牦牛体格相关的基因分子标记，可以用于牦牛的分子育种，具有上述杂合子的个体，具有体格较大的性状。
附图说明
图1是凝胶电泳图。
图2是GG纯合子样本的测序结果图。
图3是GT杂合子样本的测序结果图。
具体实施方式
本实验选用的牦牛(Bos grunniens)来源于甘肃碌曲县，通过随机选择了连续三代作为群体样本，一代为25头(平均年龄82±9.4个月，公母分别10、15头)，二代为28头(平均年龄50±6.3个月，公母分别13、15头)，三代为42头(平均年龄16±4.4个月，公母分别20、22头)，样本共95头。
DNA的提取
方法：颈静脉采集牦牛样本血10mL/头，ACD抗凝，-20℃保存备用。冻存血样采用苯酚-氯仿法提取基因组DNA。
PCR扩增
根据牦牛(Bos grunniens)MMP3基因序列(GenBank No.NW_005392917.1)，部分序列模板如SEQ ID NO.1所示；
ccgatgtgggattcctgacgttggtttcttcagcacctttcctggggagcccaagtggaagaaaactcacctcacgtacaggtaatgggtccaaagagatttttacatactatgagattttataaattactattacaggagaaaatagtatctttattattactttttttcatacagaattgtgaattacacaaaggatttacccagagatgctgttgattctgccattgaaaaagctctgacggtctgggaggaggtgactccacttaccttctccaggatctatgaaggagaagctgacataatgatcatatttgcagttagaggtaaaaaaacagaaacaagggggaaaaaacccacacaaaattttatctagtgttgtttcattagaaaaagattgcaaagagatcctaattattgatcatccaataattttttctctctctctcttagaacatggggactttttgccttttgatggacctggaaaagttttggctcatgcctacccacctggatcagggttttatggagatgctcactttgatgatgatgaacaatggacaaaggatacatcaggttagcgataca tctctcagaatgattttggtgttgatttttgttttaacttggagaagtctcaataactaagaatattgg(SEQ ID NO.1)；
用Primer Premier 5.0设计和筛选引物，序列为：
Forward：5′-gtgggattcctgacgttg-3′(SEQ ID NO.2)；
Reverse：5′-ttggagaagtctcaataa-3′(SEQ ID NO.3)；
引物由上海生工生物工程公司合成。扩增片段扩增长度642bp。
PCR反应体系25μL，其中含1μL模版DNA，2.0μL10×buffer，3μLdNTP，2μL上下游引物混合液，1μLTaqDNA聚合酶，用ddH2O补足至25.0μL。PCR扩增程序：93℃4min；93℃35s，56℃35s，75℃50s，循环40次；70℃8min。
测序
扩增片段产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，4℃保存。3.0μLPCR产物与7.0μL上样缓冲液(V(6×DNA Loading buffer)∶V(98％甲酰胺)＝1∶3)混合，98℃变性10min，冰浴冷却10min，12％聚丙烯酰胺凝胶(V(丙烯酰胺)∶V(亚甲双丙烯酰胺)＝39∶1)4℃、180V电泳2.5h，银染显带。
电泳图如图1所示，可以看出，各个样本经过扩增后具有单一清楚的条带，片断大小在600～700bp之间，与预期大小相符。
将不同带型PCR扩增产物送上海生工生物工程公司测序，分析测序结果。
部分样本测序结果如图2，在MMP3基因第1324位为G/G纯合子，而部分样本显示在MMP3基因第1324位为G/T杂合子。各样本组的体格情况下如所示(P>0.05)。
Figure BDA0001645707230000041
从上表中可以看出，第一代、第二代与第三代相比，各个基因型组都具有显著性差异(P>0.05)，主要是由于牦牛的生长阶段导致的体格差异。但是，在每一个世代中，都存在着GT杂合子组的体格参数显著不同于GG和TT纯合子组，说明本发明找到的分子标记可以应用于牦牛的分子育种。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所
<120> 一种牦牛体格相关的基因分子标记、检测方法和试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 660
<212> DNA
<213> Bos grunniens
<400> 1
ccgatgtggg attcctgacg ttggtttctt cagcaccttt cctggggagc ccaagtggaa 60
gaaaactcac ctcacgtaca ggtaatgggt ccaaagagat ttttacatac tatgagattt 120
tataaattac tattacagga gaaaatagta tctttattat tacttttttt catacagaat 180
tgtgaattac acaaaggatt tacccagaga tgctgttgat tctgccattg aaaaagctct 240
gacggtctgg gaggaggtga ctccacttac cttctccagg atctatgaag gagaagctga 300
cataatgatc atatttgcag ttagaggtaa aaaaacagaa acaaggggga aaaaacccac 360
acaaaatttt atctagtgtt gtttcattag aaaaagattg caaagagatc ctaattattg 420
atcatccaat aattttttct ctctctctct tagaacatgg ggactttttg ccttttgatg 480
gacctggaaa agttttggct catgcctacc cacctggatc agggttttat ggagatgctc 540
actttgatga tgatgaacaa tggacaaagg atacatcagg ttagcgatac atctctcaga 600
atgattttgg tgttgatttt tgttttaact tggagaagtc tcaataacta agaatattgg 660
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgggattcc tgacgttg 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttggagaagt ctcaataa 18

Claims (6)

1.用于检测牦牛体格相关的基因分子标记的试剂在用于制备用于牦牛体格相关分子育种试剂中的用途，其特征在于，所述的基因分子标记是牦牛MMP3基因第1324位为G或者T的snp位点。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述体格是指体重、体斜长、体高、胸围或者管围。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，包括如下步骤：
提取牦牛的DNA样本；
对DNA样本进行PCR扩增，扩增区域中包括MMP3基因第1324位；
对扩增区域进行测序。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，PCR扩增的反应体系25μL，其中含1μL模版DNA，2μL10×buffer，3μLdNTP，2μL上下游引物混合液，1μLTaqDNA聚合酶，用ddH2O补足至25.0μL。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，PCR扩增程序：93℃4min；93℃35s，56℃35s，75℃50s，循环40次；70℃8min。
6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的测序是通过Sanger测序或者NGS测序。
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