CN108531601A - 一种用于检测肝癌易感性相关的snp位点的引物及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测肝癌易感性相关的SNP位点的引物，该引物包括rs230496位点的引物、rs200842482位点的引物、rs4939827位点的引物、rs7240004位点的引物以及rs7229639位点的引物。采用该引物检测肝癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，包括以下步骤：(1)采集样品并提取DNA；(2)采用引物分别进行目的基因的PCR扩增、胶回收；(3)测定胶回收产物的浓度，进行荧光标记PCR反应，并对反应产物进行纯化；(4)将纯化产物上机测序，并对SNP检测结果进行分析。该引物特异性好、灵敏度高、准确性好，检测方法简单，可预测受检者患肝癌的风险。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测肝癌易感性相关的SNP位点的引物及检测方法。
背景技术
原发性肝癌(简称“肝癌”)是由肝细胞或肝内胆管上皮细胞发生的恶性肿瘤，由于绝大多数肝癌来源于肝细胞，所以通常所说的肝癌多指肝细胞癌。2017年我国肿瘤登记年报显示，在城市地区肝癌在男性恶性肿瘤发病中排第3位，在女性恶性肿瘤发病中排第6位，而肝癌的死亡率在中小城市居第3位，在大城市中居第2位。由于肝癌发病隐匿，初期没有临床症状，多数患者就诊时已错过最佳治疗时机。因此，肝癌的早预测、早预防便显得极其重要。目前普遍认为，肝癌危险因素包括遗传因素、肝炎病毒感染、黄曲霉毒素的暴露、饮酒和吸烟、饮水污染以及肝吸虫感染等。进一步调查研究发现，处于上述危险因素中的不同个体，有着发生与不发生肝癌的差异。是什么导致了这种差异？为什么肝癌发病在两性之间分布不均(男性更易发病)？为什么肝癌的发病有一定的家族聚集现象？这些现象提示我们，肝癌的发病很大程度上还取决于个体的遗传易感性。基因的多态性是导致疾病发生遗传易感性的重要方面，其中以单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphsm，SNP)最为常见。SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，它是人类可遗传的基因组变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500-1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。
迄今为止，本领域未发现为肝癌易感风险检测提供一组密切相关的易感基因及引物。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种用于检测肝癌易感性相关的SNP位点的引物及检测方法，其引物特异性好，检测方法准确性高，可用于肝癌的风险评估，为肝癌的疾病预防提供指导。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于检测肝癌易感性相关的SNP位点的引物，这些引物包括NFKB1基因的rs230496位点的引物、XRCC1基因的rs200842482位点的引物、SMAD7基因的rs4939827位点的引物、SMAD7基因的rs7240004位点的引物以及SMAD7基因的rs7229639位点的引物；
其中，rs230496位点的引物为F：5′-CCAGCAAAGGTTATTGTTCAGT-3′(SEQ ID No：1)和R：5′-AAAGCCCTACATATTCACACC-3′(SEQ ID No：2)；
rs200842482位点的引物为F：5′-GCTCCTCTCAGTAGTCT-3′(SEQ ID No：3)和R：5′-CCAAGTATCGGCCAGA-3′(SEQ ID No：4)；
rs4939827位点的引物为F：5′-GACAAGCCTAAGATAAAAGG-3′(SEQ ID No：5)和R：5′-GATTCATCGTCTGATCTGT-3′(SEQ ID No：6)；
rs7240004位点的引物为F：5′-GCTTAGAATGTTTCAGCAC-3′(SEQ ID No：7)和R：5′-CTTGTGTCTGATGTGTAGG-3′(SEQ ID No：8)；
rs7229639位点的引物为F：5′-CTGAGATCTGTAGCAGGAC-3′(SEQ ID No：9)和R：5′-TTGTGTGTGCTTAGAGATAG-3′(SEQ ID No：10)。
采用上述引物检测肝癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，包括以下步骤：
(1)采集样品并提取其基因组DNA；
(2)采用上述引物分别对基因组DNA进行目的基因的PCR扩增，并对扩增产物进行胶回收；
(3)对胶回收产物进行浓度测定，计算模板量，然后进行PCR扩增(荧光标记反应)并纯化；
(4)将步骤(3)中的纯化产物在3730型全自动序列分析仪(美国AppliedBiosystems公司)上样，用Chromas软件对SNP分型进行分析。
进一步地，步骤(2)中PCR扩增体系为：DNA模板含量为100-150ng，浓度为5pmol/μL的正向引物3.0μL，浓度为5pmol/μL的反向引物3.0μL，Prime STAR MAX 25.0μL，用ddH2O补足体积至50μL。
进一步地，步骤(2)中PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸15s，进行30个循环，最后72℃延伸5min。
进一步地，步骤(3)中PCR扩增体系为：DTCS Master Mix 2.5μL，浓度为5pmol/μL的反向引物1.0μL，DNA模板20ng，用ddH2O补足体积至10μL。
进一步地，步骤(3)中PCR扩增反应条件为：94℃预变性30s，94℃变性25s，55℃退火25s，60℃延伸3min，30个循环，最后60℃延伸20min。
本发明提供的用于检测肝癌易感性相关的SNP位点的引物及检测方法，具有以下有益效果：
(1)本发明提供了用于检测肝癌易感基因相关位点的引物，该引物具有特异性高、准确性好的优点，实现了肝癌易感性相关的SNP位点的检测，提高了检测效率。
(2)本发明还提供了一种检测肝癌易感性相关的SNP位点的方法，该方法为直接测序法，本检测方法简单，其检测结果也具有特异性好，灵敏度高，准确性好等优点，可以为肝癌的疾病预防提供指导。
附图说明
图1为不同受检者血液DNA样品在5种不同引物下进行PCR扩增所得产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为rs230496位点多态性检测的测序结果图；
图3为rs200842482位点多态性检测的测序结果图；
图4为rs4939827位点多态性检测的测序结果图；
图5为rs7240004位点多态性检测的测序结果图；
图6为rs7229639位点多态性检测的测序结果图；
图7为rs230496位点多态性检测结果的荧光验证图；
图8为rs200842482位点多态性检测结果的荧光验证图；
图9为rs4939827位点多态性检测结果的荧光验证图；
图10为rs7240004位点多态性检测结果的荧光验证图；
图11为rs7229639位点多态性检测结果的荧光验证图。
具体实施方式
实施例1设计扩增SNP位点的引物
针对肝癌易感性相关的SNP位点设计了大量的引物，通过引物反应条件的优化和比较，筛选出特异性好的五对引物，包括：
NFKB1基因的rs230496位点的引物为F：5′-CCAGCAAAGGTTATTGTTCAGT-3′(SEQ IDNo：1)和R：5′-AAAGCCCTACATATTCACACC-3′(SEQ ID No：2)；
XRCC1基因的rs200842482位点的引物为F：5′-GCTCCTCTCAGTAGTCT-3′(SEQ IDNo：3)和R：5′-CCAAGTATCGGCCAGA-3′(SEQ ID No：4)；
SMAD7基因的rs4939827位点的引物为F：5′-GACAAGCCTAAGATAAAAGG-3′(SEQ IDNo：5)和R：5′-GATTCATCGTCTGATCTGT-3′(SEQ ID No：6)；
SMAD7基因的rs7240004位点的引物为F：5′-GCTTAGAATGTTTCAGCAC-3′(SEQ IDNo：7)和R：5′-CTTGTGTCTGATGTGTAGG-3′(SEQ ID No：8)；
SMAD7基因的rs7229639位点的引物为F：5′-CTGAGATCTGTAGCAGGAC-3′(SEQ IDNo：9)和R：5′-TTGTGTGTGCTTAGAGATAG-3′(SEQ ID No：10)。
使用肝癌易感性相关的SNP位点的引物对待测基因组DNA分别进行PCR扩增，PCR扩增体系为：DNA模板xμL使其含量为100-150ng，去离子水19-xμL，浓度为5pmol/μL的正向引物3.0μL，浓度为5pmol/μL的反向引物3.0μL，Primer STAR MAX 25.0μL；扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环，最后72℃延伸5min后于4℃保存；将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，其中，1、2、3孔为rs230496位点的引物扩增条带；4、5、6孔为rs200842482位点的引物扩增条带；7、8、9孔为rs4939827位点的引物扩增条带；10、11、12孔为rs7240004位点的引物扩增条带；13、14、15孔为rs7229639位点的引物扩增条带。
由图1可知，目的条带清晰，无杂带，且片段大小与设计的大小一致，说明设计的引物特异性好。
实施例2与肝癌易感性相关的SNP位点多态性的检测
(1)基因组DNA的提取
用EDTA抗凝管采集受检者外周血5mL，其基因组DNA的提取方法参照血液基因组DNA提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)的说明书，按说明书中的操作步骤进行提取。获得的全基因组DNA使用超微量核酸蛋白分析仪(柏精BioDropμLite)检测其浓度以及纯度，记录原始数据。将浓度和纯度都达到要求的DNA置于-20℃冰箱保存备用。
(2)目的基因的PCR扩增、电泳和胶回收
PCR扩增：用上述rs230496，rs200842482，rs4939827，rs7240004和rs7229639位点的引物分别对提取的DNA进行PCR扩增。反应体系为50μL，具体如表1所示，扩增程序如表2所示。PCR反应完成后，取出PCR产物4℃保存(过夜需放置-20℃冻存)。
表1 PCR反应体系
| 试剂 | 体积(μL) |
| DNA | a(100-150ng) |
| ddH2O | 19-a |
| Primer F | 3.0 |
| Primer R | 3.0 |
| Primer STAR MAX | 25.0 |
| total | 50.0 |
表2 PCR扩增程序
PCR扩增结束后，取50μL扩增产物，采用2％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为电压120V，电流400mA，时间30min，电泳结果中无非特异性条带；电泳完成后在凝胶电泳图像分析仪下切取含有目的片段的凝胶，将凝胶块装入EP管中，胶回收的方法参照TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒的说明书，最后对胶回收的产物进行浓度测定，4℃保存备用。
(3)标记、纯化和测序
标记：取一支干净的0.2mL PCR管，依次加入：DTCS Master Mix、测序引物、灭菌超纯水、模板DNA，其中模板DNA和灭菌超纯水的用量由上一步所测定的DNA浓度决定，所添加的模板DNA量为20ng，反应体系为10μL，具体如表3所示，然后进行荧光标记PCR，扩增程序见表4；
表3 PCR反应体系
| 试剂 | 体积(μL) |
| DTCS Master Mix | 2.5 |
| Primer R | 1.0 |
| ddH2O | 6.5-b |
| 模板DNA | b(20ng) |
| 总计 | 10.0 |
表4 PCR扩增程序
纯化：将浓度为3mol/L，pH值为5.2的醋酸钠缓冲液、0.1mol/L，pH值为8.0的Na2EDTA缓冲液和Glycogen以体积比为2:2:1配制终止液，然后取5μL终止液加入上述荧光标记反应PCR产物中充分混匀，离心，将液体转移至一支新的1.5mL EP管中，然后加入50μL预冷无水乙醇，充分混匀，放入冰箱-20℃冷冻10min后于12000r/min离心5min，弃去上清，再向EP管中加入150μL预冷70％乙醇，放入高速离心机离心，12000r/min离心2min，弃去上清，稍离心，用移液器吸干EP管内剩余的液体，打开EP管盖，室温晾干至白色沉淀变透明，再向EP管中加入25μL SLS(Sample Loading Solution)溶解DNA，静置8min，瞬时离心；
测序：将溶解的DNA加入96孔样品板孔中，加入的过程中不能产生气泡，然后再加入适量矿物油；取一块新的96孔板，在对应孔中加入10滴分离缓冲液，向胶槽中加入超纯水至液体接近指示线，最后将96孔样品板、96孔缓冲液和胶槽装入ABI3730全自动序列分析仪进行测序。
通过序列分析软件(ABI3730 Chromas)，将测序结果与标准序列进行比对，寻找SNP位点，通过分析SNP位点处碱基的类型，就可以得到SNP位点的基因型。
图2中2-1、2-2和2-3均为rs230496位点多态性检测的测序结果图，基因型依次为AA、GG和AG；其中AA为rs230496位点的非易感基因型，而GG和AG为rs230496位点的易感基因型。
图3中3-1、3-2和3-3均为rs200842482位点多态性检测的测序结果图，基因型依次为CC、TT和CT；其中CC为rs200842482位点的非易感基因型，而TT和CT为rs200842482位点位点的易感基因型。
图4中4-1、4-2和4-3均为rs4939827位点多态性检测的测序结果图，基因型依次为CC、TT和CT；其中CC为rs4939827位点的非易感基因型，而TT和CT为rs2274223位点的易感基因型。
图5中5-1、5-2和5-3均为rs7240004位点多态性检测的测序结果图，基因型依次为GG、AA和AG；其中GG为rs7240004位点的非易感基因型，而AA和AG为rs7240004位点的易感基因型。
图6中6-1、6-2、6-3均为rs230496位点荧光探针法的检测结果图，基因型依次为AA、GG和AG；其中AA为rs230496位点的非易感基因型，而GG和AG为rs230496位点的易感基因型。
实施例3检测肝癌易感性相关的SNP位点的特异性
本检测方法将特异性定义为测序结果峰图无套峰、背景峰、杂峰、飘峰等现象。
按照本发明提供的检测方法对30个样品进行检测，测序峰图单一，无双峰、背景峰等现象，30个样品检测结果均相同，说明本发明提供的检测方法特异性为100％。
实施例4检测肝癌易感性相关的SNP位点的灵敏度和准确度
本检测方法将灵敏度定义为检测结果符合率。
按照本发明提供的检测方法对50个样品进行检测，同时采用荧光探针法进行验证，两种方法对50个样品的检测结果一致，本检测方法的准确性达到了100％，进一步验证了采用测序法检测SNP位点多态性的灵敏度和准确度高，其结果如图7-图11所示。
其中，图7中7-1、7-2、7-3均为rs230496位点多态性检测结果的荧光验证图，基因型依次为AA、GG和AG；其中AA为rs230496位点的非易感基因型，而GG和AG为rs230496位点的易感基因型。
图8中8-1、8-2和8-3均为rs200842482位点多态性检测结果的荧光验证图，基因型依次为GG、AA和AG；其中GG为rs200842482位点的非易感基因型，而AA和AG为rs200842482位点位点的易感基因型。
图9中9-1、9-2和9-3均为rs4939827位点多态性检测结果的荧光验证图，基因型依次为CC、TT和CT；其中CC为rs4939827位点的非易感基因型，而TT和CT为rs2274223位点的易感基因型。
图10-1、10-2和10-3均为rs7240004位点多态性检测结果的荧光验证图，基因型基因型依次为GG、AA和AG；其中GG为rs7240004位点的非易感基因型，而AA和AG为rs7240004位点的易感基因型。
图11-1、11-2和11-3均为rs7229639位点多态性检测结果的荧光验证图，基因型依次为GG、AA和AG；其中GG为rs7229639位点的非易感基因型，而AA和AG为rs7229639位点的易感基因型。
序列表
<110> 成都中创清科医学检验所有限公司
<120> 一种用于检测肝癌易感性相关的SNP位点的引物及检测方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccagcaaagg ttattgttca gt 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaagccctac atattcacac c 21
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctcctctca gtagtct 17
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccaagtatcg gccaga 16
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacaagccta agataaaagg 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gattcatcgt ctgatctgt 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcttagaatg tttcagcac 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cttgtgtctg atgtgtagg 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgagatctg tagcaggac 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttgtgtgtgc ttagagatag 20
Claims (6)
1.一种用于检测肝癌易感性相关的SNP位点的引物，其特征在于，所述引物包括NFKB1基因的rs230496位点的引物、XRCC1基因的rs200842482位点的引物、SMAD7基因的rs4939827位点的引物、SMAD7基因的rs7240004位点的引物以及SMAD7基因的rs7229639位点的引物；
其中，rs230496位点的引物为F：5′-CCAGCAAAGGTTATTGTTCAGT-3′和R：5′-AAAGCCCTACATATTCACACC-3′；
rs200842482位点的引物为F：5′-GCTCCTCTCAGTAGTCT-3′和R：5′-CCAAGTATCGGCCAGA-3′；
rs4939827位点的引物为F：5′-GACAAGCCTAAGATAAAAGG-3′和R：5′-GATTCATCGTCTGATCTGT-3′；
rs7240004位点的引物为F：5′-GCTTAGAATGTTTCAGCAC-3′和R：5′-CTTGTGTCTGATGTGTAGG-3′；
rs7229639位点的引物为F：5′-CTGAGATCTGTAGCAGGAC-3′和R：5′-TTGTGTGTGCTTAGAGATAG-3′。
2.采用权利要求1所述的引物检测肝癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集样品并提取其基因组DNA；
(2)采用所述引物分别对基因组DNA进行目的基因的PCR扩增，并对扩增产物进行胶回收；
(3)对胶回收产物进行浓度测定，计算模板量，然后进行荧光标记PCR反应，并对反应产物进行纯化；
(4)将步骤(3)中的纯化产物上机测序，并对SNP检测结果进行分析。
3.根据权利要求2所述的检测肝癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增体系为：DNA模板含量为100-150ng，浓度为5pmol/μL的正向引物3.0μL，浓度为5pmol/μL的反向引物3.0μL，Prime STAR MAX 25.0μL，用ddH2O补足体积至50μL。
4.根据权利要求2所述的检测肝癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸15s，进行30个循环，最后72℃延伸5min。
5.根据权利要求2所述的检测肝癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR扩增体系为：DTCS Master Mix 2.5μL，浓度为5pmol/μL的反向引物1.0μL，DNA模板20ng，用ddH2O补足体积至10μL。
6.根据权利要求2所述的检测肝癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR扩增反应条件为：94℃预变性30s，94℃变性25s，55℃退火25s，60℃延伸3min，30个循环，最后60℃延伸20min。
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| CN (1) | CN108531601A (zh) |
Citations (5)
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2018
- 2018-05-29 CN CN201810527251.3A patent/CN108531601A/zh active Pending
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