CN108531503A - 优化拟南芥转基因效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高拟南芥转基因效率的方法，配置转化介质浸染拟南芥植株上的花序，并将每株拟南芥植株用保鲜膜包裹，置于黑暗条件下培养24小时后置于光周期24小时、湿度60‑70％、22℃的条件下培养拟南芥植株，收取种子，其中，光周期24小时为16小时光照及8小时黑暗。本发明具有可重复实现提高拟南芥植株和转化介质的利用率、提高拟南芥植株转化效率的有益效果。
Description
技术领域
本发明涉及拟南芥转基因技术领域。更具体地说，本发明涉及一种优化拟南芥转基因效率的方法。
背景技术
拟南芥Arabidopsis thaliana是一种广泛分布于亚洲、欧洲以及北非地区的小型开花植物。作为近年来最为广泛应用的模式植物，拟南芥在分子遗传学、植物学以及农业科学的研究中发挥了重要的作用，被称为植物中的果蝇，是目前公认的五大模式生物之一。
用农杆菌转化拟南芥现在普遍采用的方法是浸花法。一般情况下，用于转化的拟南芥植株需在正常条件下培养4周，选取第一批抽苔开花的拟南芥花序，培养带目的基因的农杆菌，配制转化介质，将处理好的拟南芥花序放到含有农杆菌的转化介质中浸泡3-5分钟，再将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24小时之后，再在自然光条件下进行培养。然而，此方法具有如下不足：由于仅选取第4周左右第一批抽苔的健壮植株作为浸染材料，而其它生长期稍为偏长的植株常弃之不用，植株利用率低；由于使用浸泡方法进行浸染，配制转化介质即浸染溶液一般在1-2升，将去掉果荚和已授粉的总状花序全部浸泡于介质中，处理好后转化介质即不再使用，转化介质利用率低；用该方法获得种子，每0.1毫升仅获得10株左右的阳性植株，转化效率偏低。因此，提供一种可重复实现提高拟南芥植株和转化介质的利用率、提高拟南芥植株转化效率的方法十分必要。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种优化拟南芥转基因效率的方法，其利用转化介质浸染不同时期拟南芥植株上的花序，并将每株拟南芥植株用保鲜膜包裹，以提高植株和转化介质的利用率以及拟南芥转基因的效率。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种优化拟南芥转基因效率的方法，利用转化介质浸染拟南芥植株上的花序，并将每株拟南芥植株用保鲜膜包裹，培养植株，收取种子。
优选的是，转化介质的具体配置方法为：
S1、配置含50毫克/升利福平和100毫克/升卡那霉素的YEP培养基培养液，取1体积份的含有目的基因pBI121载体的农杆菌与500体积份的YEP培养基培养液混合，于160转/分钟、28℃的恒温摇床中活化培养18-24小时，取1体积份的活化的含有目的基因pBI121载体的农杆菌与100体积份的YEP培养基培养液混合，于160转/分钟、28℃的恒温摇床上培养12-16小时至OD600值为1.8-2.0，离心分离收集农杆菌；
S2、将农杆菌重悬于1/2MS溶液，并稀释OD600值至0.8，该溶液即为转化介质。1/2MS溶液包括200质量份的1/2MS培养基、1质量份的Silwet-L77、50质量份的质量分数为5.0％的蔗糖无菌水溶液，其中，1/2MS溶液PH值为5.7。
优选的是，保鲜膜包裹具体方法为：将拟南芥植株平放于一张保鲜膜上，再用另一张保鲜膜盖于植株上面，压平两张保鲜膜，并按植株大小将保鲜膜折好，使植株完全包裹在保鲜膜内。
优选的是，培养植株具体为：黑暗条件下培养24小时，去掉保鲜膜，再转到光周期24小时、湿度60-70％、22℃条件下培养，2天后，用清水喷洒植株，清洗表面浸染转化介质，继续在光周期24小时、湿度60-70％、22℃条件下培养，去掉浸染后新长出的花序，果荚变黄干枯时剪下，其中，光周期24小时为16小时光照及8小时黑暗。
优选的是，步骤S1中，离心分离具体为在4℃的低温离心机中以5000转/分钟的转速离心5-10分钟，取管底农杆菌。
优选的是，步骤S2中，1/2MS溶液还包括10质量份的5.5毫克/升的硒蛋氨酸、8质量份的0.75毫克/升的植酸酶、5质量份的0.2毫克/升维生素C、2质量份的0.5毫克/升的乙酰丁香酮、2质量份的0.2毫克/升的泛酸钙、以及3质量份的甘油。
优选的是，被浸染拟南芥植株上花序的具体获得方法为：将拟南芥种子在无菌环境中依次用质量分数为25％的石灰水浸泡10分钟、质量分数为1％的高锰酸钾溶液浸泡3分钟、质量分数为0.1％的洗涤剂浸泡10分钟、无菌水清洗5-6次，置于4℃冰箱进行春化处理3天，于40℃水浴温度下超声波处理3-5分钟，超声波处理频率为30-40千赫兹，于28℃水浴温度、超声波处理频率为10千赫兹的黑暗条件下培养24-36小时，之后将拟南芥种子点播于装好培养土的穴盘上，在光周期24小时、湿度60-70％、22℃的光照培养箱中培养至长出拟南芥花序，其中，光周期24小时为16小时光照及8小时黑暗。
优选的是，浸染方法具体为：用0.1％的氯化钠水溶液喷洒拟南芥花序，每隔1小时喷洒一次，共喷洒3次，将转化介质置于培养皿中，使拟南芥花序与转化介质完全接触3-4分钟。
优选的是，黑暗条件下培养，具体为将保鲜膜包裹的拟南芥植株置于28℃、压力为0.5个大气压的不透光真空容器中培养。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、采用浸染和保鲜膜包裹单株拟南芥植株的方法，一般仅需200毫升浸染介质即可，较常规所用1-2升浸染介质浸泡、批量空间封闭而非单株包裹保湿的方法用量少、操作简单，提高了转化介质的利用率，采用保鲜膜包裹单株拟南芥植株，可较长时间保持拟南芥植株花序浸染后的湿度，延长农杆菌转化的时间，提高拟南芥转基因的转化效率；
第二、配置转化介质时使用的1/2MS溶液中加入了其它化学成分，增加1/2MS溶液的营养成分，促进转化介质的侵染效率；
第三、对拟南芥种子进行处理后再培养，充分利用不同苗龄的拟南芥植株，提高植株利用率，常规的浸染操作通常只使用拟南芥植株的花序形成至初花期的健壮植株，而将其它苗龄的拟南芥植株大多不作浸染使用，本发明以使用七周左右苗龄的拟南芥植株为主，使用四周左右花期的植株为辅，不仅提高了植株的利用率，而且使用高苗龄的拟南芥植株作为转化材料的转化效率也有所提高。
第四、用0.1％的氯化钠水溶液喷洒拟南芥花序，将拟南芥植株置于28℃、压力为0.5个大气压的真空容器中黑暗处理，有利于农杆菌浸入拟南芥植株细胞中。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
优化拟南芥转基因效率的方法，利用转化介质浸染培养4周的拟南芥植株上的花序，并将每株拟南芥植株用保鲜膜包裹，培养植株，收取种子。
其中，转化介质的具体配置方法为：
S1、配置含50毫克/升利福平和100毫克/升卡那霉素的YEP培养基培养液，取1体积份的含有目的基因pBI121载体的农杆菌与500体积份的YEP培养基培养液混合，于160转/分钟、28℃的恒温摇床中活化培养18小时，取1体积份的活化的含有目的基因pBI121载体与100体积份的YEP培养基培养液混合，于160转/分钟、28℃的恒温摇床上培养12小时至OD600值为1.8，离心分离收集农杆菌；
S2、将农杆菌重悬于1/2MS溶液，并稀释OD600值至0.8，该溶液即为转化介质，1/2MS溶液包括200质量份的1/2MS培养基、1质量份的Silwet-L77、50质量份的质量分数为5.0％的蔗糖无菌水溶液，其中，1/2MS溶液PH值为5.7。
保鲜膜包裹具体方法为：将拟南芥植株平放于一张保鲜膜上，再用另一张保鲜膜盖于植株上面，压平两张保鲜膜，并按植株大小将保鲜膜折好，使植株完全包裹在保鲜膜内。
培养植株具体为：黑暗条件下培养24小时，去掉保鲜膜，再转到光周期24小时、湿度60％、22℃条件下培养，2天后，用清水喷洒植株，清洗表面浸染转化介质，继续在光周期24小时、湿度60％、22℃条件下培养，去掉浸染后新长出的花序，果荚变黄干枯时剪下，其中，光周期24小时为16小时光照及8小时黑暗。
步骤S1中，离心分离具体为在4℃的低温离心机中以5000转/分钟的转速离心5分钟，取管底农杆菌。
<实施例2>
优化拟南芥转基因效率的方法，利用转化介质浸染培养4周的拟南芥植株上的花序，并将每株拟南芥植株用保鲜膜包裹，培养植株，收取种子。
其中，转化介质的具体配置方法：
S1、配置含50毫克/升利福平和100毫克/升卡那霉素的YEP培养基培养液，取1体积份的含有目的基因pBI121载体的农杆菌与500体积份的YEP培养基培养液混合，于160转/分钟、28℃的恒温摇床中活化培养24小时，取1体积份的活化的含有目的基因pBI121载体的农杆菌与100体积份的YEP培养基培养液混合，于160转/分钟、28℃的恒温摇床上培养16小时至OD600值为2.0，离心分离收集农杆菌；
S2、将农杆菌重悬于1/2MS溶液，并稀释OD600值至0.8，该溶液即为转化介质，1/2MS溶液包括200质量份的1/2MS培养基、1质量份的Silwet-L77、50质量份的质量分数为5.0％的蔗糖无菌水溶液，其中，1/2MS溶液PH值为5.7。
保鲜膜包裹具体方法为：将拟南芥植株平放于一张保鲜膜上，再用另一张保鲜膜盖于植株上面，压平两张保鲜膜，并按植株大小将保鲜膜折好，使植株完全包裹在保鲜膜内。
培养植株具体为：黑暗条件下培养24小时，去掉保鲜膜，再转到光周期24小时、湿度70％、22℃条件下培养，2天后，用清水喷洒植株，清洗表面浸染转化介质，继续在光周期24小时、湿度70％、22℃条件下培养，去掉浸染后新长出的花序，果荚变黄干枯时剪下，其中，光周期24小时为16小时光照及8小时黑暗。
步骤S1中，离心分离具体为在4℃的低温离心机中以5000转/分钟的转速离心10分钟，取管底农杆菌。
<实施例3>
优化拟南芥转基因效率的方法，利用转化介质浸染培养4周的拟南芥植株上的花序，并将每株拟南芥植株用保鲜膜包裹，培养植株，收取种子。
其中，转化介质的具体配置方法：
S1、配置含50毫克/升利福平和100毫克/升卡那霉素的YEP培养基培养液，取1体积份的含有目的基因pBI121载体的农杆菌与500体积份的YEP培养基培养液混合，于160转/分钟、28℃的恒温摇床中活化培养20小时，取1体积份的活化的含有目的基因pBI121载体的农杆菌与100体积份的YEP培养基培养液混合，于160转/分钟、28℃的恒温摇床上培养14小时至OD600值为1.9，离心分离收集农杆菌；
S2、将农杆菌重悬于1/2MS溶液，并稀释OD600值至0.8，该溶液即为转化介质，1/2MS溶液包括200质量份的1/2MS培养基、1质量份的Silwet-L77、50质量份的质量分数为5.0％的蔗糖无菌水溶液，其中，1/2MS溶液PH值为5.7。
保鲜膜包裹具体方法为：将拟南芥植株平放于一张保鲜膜上，再用另一张保鲜膜盖于植株上面，压平两张保鲜膜，并按植株大小将保鲜膜折好，使植株完全包裹在保鲜膜内。
培养植株具体为：黑暗条件下培养24小时，去掉保鲜膜，再转到光周期24小时、湿度65％、22℃条件下培养，2天后，用清水喷洒植株，清洗表面浸染转化介质，继续在光周期24小时、湿度65％、22℃条件下培养，去掉浸染后新长出的花序，果荚变黄干枯时剪下，其中，光周期24小时为16小时光照及8小时黑暗。
步骤S1中，离心分离具体为在4℃的低温离心机中以5000转/分钟的转速离心8分钟，取管底农杆菌。
<实施例4>
优化拟南芥转基因效率的方法，利用转化介质浸染培养4周的拟南芥植株上的花序，并将每株拟南芥植株用保鲜膜包裹，培养植株，收取种子。
其中，转化介质的具体配置方法为：
S1、配置含50毫克/升利福平和100毫克/升卡那霉素的YEP培养基培养液，取1体积份的含有目的基因pBI121载体的农杆菌与500体积份的YEP培养基培养液混合，于160转/分钟、28℃的恒温摇床中活化培养18小时，取1体积份的活化的含有目的基因pBI121载体的农杆菌与100体积份的YEP培养基培养液混合，于160转/分钟、28℃的恒温摇床上培养12小时至OD600值为1.8，离心分离收集农杆菌；
S2、将农杆菌重悬于1/2MS溶液，并稀释OD600值至0.8，该溶液即为转化介质，1/2MS溶液包括200质量份的1/2MS培养基、1质量份的Silwet-L77、50质量份的质量分数为5.0％的蔗糖无菌水溶液，其中，1/2MS溶液PH值为5.7。
保鲜膜包裹具体方法为：将拟南芥植株平放于一张保鲜膜上，再用另一张保鲜膜盖于植株上面，压平两张保鲜膜，并按植株大小将保鲜膜折好，使植株完全包裹在保鲜膜内。
培养植株具体为：黑暗条件下培养24小时，去掉保鲜膜，再转到光周期24小时、湿度60％、22℃条件下培养，2天后，用清水喷洒植株，清洗表面浸染转化介质，继续在光周期24小时、湿度60％、22℃条件下培养，去掉浸染后新长出的花序，果荚变黄干枯时剪下，其中，光周期24小时为16小时光照及8小时黑暗。
步骤S1中，离心分离具体为在4℃的低温离心机中以5000转/分钟的转速离心5分钟，取管底农杆菌。
步骤S2中，1/2MS溶液还包括10质量份的5.5毫克/升的硒蛋氨酸、8质量份的0.75毫克/升的植酸酶、5质量份的0.2毫克/升的维生素C2、2质量份的0.5毫克/升的乙酰丁香酮、2质量份的0.2毫克/升的泛酸钙、以及3质量份的甘油。
被浸染拟南芥植株上花序的具体获得方法为：将拟南芥种子在无菌环境中依次用质量分数为25％的石灰水浸泡10分钟、质量分数为1％的高锰酸钾溶液浸泡3分钟、质量分数为0.1％的洗涤剂浸泡10分钟、无菌水清洗5次，置于4℃冰箱进行春化处理3天，于40℃水浴温度下超声波处理3分钟，超声波处理频率为30千赫兹，于28℃水浴温度、超声波处理频率为10千赫兹的黑暗条件下培养24小时，之后将拟南芥种子点播于装好培养土的穴盘上，在光周期24小时、湿度60％、22℃的光照培养箱中培养至长出拟南芥花序，其中，光周期24小时为16小时光照及8小时黑暗。
浸染方法具体为：用0.1％的氯化钠水溶液喷洒拟南芥花序，每隔1小时喷洒一次，共喷洒3次，将转化介质置于培养皿中，使拟南芥花序与转化介质完全接触3-4分钟。
黑暗条件下培养，具体为将保鲜膜包裹的拟南芥植株置于28℃、压力为0.5个大气压的不透光真空容器中培养。
<实施例5>
优化拟南芥转基因效率的方法，利用转化介质浸染培养5周的拟南芥植株上的花序，并将每株拟南芥植株用保鲜膜包裹，培养植株，收取种子。
其中，转化介质的具体配置方法：
S1、配置含50毫克/升利福平和100毫克/升卡那霉素的YEP培养基培养液，取1体积份的含有目的基因pBI121载体的农杆菌与500体积份的YEP培养基培养液混合，于160转/分钟、28℃的恒温摇床中活化培养24小时，取1体积份的活化的含有目的基因pBI121载体的农杆菌与100体积份的YEP培养基培养液混合，于160转/分钟、28℃的恒温摇床上培养16小时至OD600值为2.0，离心分离收集农杆菌；
S2、将农杆菌重悬于1/2MS溶液，并稀释OD600值至0.8，该溶液即为转化介质，1/2MS溶液包括200质量份的1/2MS培养基、1质量份的Silwet-L77、50质量份的质量分数为5.0％的蔗糖无菌水溶液，其中，1/2MS溶液PH值为5.7。
保鲜膜包裹具体方法为：将拟南芥植株平放于一张保鲜膜上，再用另一张保鲜膜盖于植株上面，压平两张保鲜膜，并按植株大小将保鲜膜折好，使植株完全包裹在保鲜膜内。
培养植株具体为：黑暗条件下培养24小时，去掉保鲜膜，再转到光周期24小时、湿度70％、22℃条件下培养，2天后，用清水喷洒植株，清洗表面浸染转化介质，继续在光周期24小时、湿度70％、22℃条件下培养，去掉浸染后新长出的花序，果荚变黄干枯时剪下，其中，光周期24小时为16小时光照及8小时黑暗。
步骤S1中，离心分离具体为在4℃的低温离心机中以5000转/分钟的转速离心10分钟，取管底农杆菌。
步骤S2中，1/2MS溶液还包括10质量份的5.5毫克/升的硒蛋氨酸、8质量份的0.75毫克/升的植酸酶、5质量份的0.2毫克/升维生素C2、2质量份的0.5毫克/升的乙酰丁香酮、2质量份的0.2毫克/升的泛酸钙、以及3质量份的甘油。
被浸染拟南芥植株上花序的具体获得方法为：将拟南芥种子在无菌环境中依次用质量分数为25％的石灰水浸泡10分钟、质量分数为1％的高锰酸钾溶液浸泡3分钟、质量分数为0.1％的洗涤剂浸泡10分钟、无菌水清洗6次，置于4℃冰箱进行春化处理3天，于40℃水浴温度下超声波处理5分钟，超声波处理频率为40千赫兹，于28℃水浴温度、超声波处理频率为10千赫兹的黑暗条件下培养36小时，之后将拟南芥种子点播于装好培养土的穴盘上，在光周期24小时、湿度70％、22℃的光照培养箱中培养至长出拟南芥花序，其中，光周期24小时为16小时光照及8小时黑暗。
浸染方法具体为：用0.1％的氯化钠水溶液喷洒拟南芥花序，每隔1小时喷洒一次，共喷洒3次，将转化介质置于培养皿中，使拟南芥花序与转化介质完全接触4分钟。
黑暗条件下培养，具体为将保鲜膜包裹的拟南芥植株置于28℃、压力为0.5个大气压的不透光真空容器中培养。
<实施例6>
优化拟南芥转基因效率的方法，利用转化介质浸染培养7周的拟南芥植株上的花序，并将每株拟南芥植株用保鲜膜包裹，培养植株，收取种子。
其中，转化介质的具体配置方法：
S1、配置含50毫克/升利福平和100毫克/升卡那霉素的YEP培养基培养液，取1体积份的含有目的基因pBI121载体的农杆菌与500体积份的YEP培养基培养液混合，于160转/分钟、28℃的恒温摇床中活化培养20小时，取1体积份的活化的含有目的基因pBI121载体的农杆菌与100体积份的YEP培养基培养液混合，于160转/分钟、28℃的恒温摇床上培养14小时至OD600值为1.9，离心分离收集农杆菌；
S2、将农杆菌重悬于1/2MS溶液，并稀释OD600值至0.8，该溶液即为转化介质，1/2MS溶液包括200质量份的1/2MS固体培养基、1质量份的Silwet-L77、50质量份的质量分数为5.0％的蔗糖无菌水溶液，其中，1/2MS溶液PH值为5.7。
保鲜膜包裹具体方法为：将拟南芥植株平放于一张保鲜膜上，再用另一张保鲜膜盖于植株上面，压平两张保鲜膜，并按植株大小将保鲜膜折好，使植株完全包裹在保鲜膜内。
培养植株具体为：黑暗条件下培养24小时，去掉保鲜膜，再转到光周期24小时、湿度65％、22℃条件下培养，2天后，用清水喷洒植株，清洗表面浸染转化介质，继续在光周期24小时、湿度65％、22℃条件下培养，去掉浸染后新长出的花序，果荚变黄干枯时剪下，其中，光周期24小时为16小时光照及8小时黑暗。
步骤S1中，离心分离具体为在4℃的低温离心机中以5000转/分钟的转速离心8分钟，取管底农杆菌。
步骤S2中，1/2MS溶液还包括10质量份的5.5毫克/升的硒蛋氨酸、8质量份的0.75毫克/升的植酸酶、5质量份的0.2毫克/升维生素C2、2质量份的0.5毫克/升的乙酰丁香酮、2质量份的0.2毫克/升的泛酸钙、以及3质量份的甘油。
被浸染拟南芥植株上花序的具体获得方法为：将拟南芥种子在无菌环境中依次用质量分数为25％的石灰水浸泡10分钟、质量分数为1％的高锰酸钾溶液浸泡3分钟、质量分数为0.1％的洗涤剂浸泡10分钟、再用无菌水清洗6次，置于4℃冰箱进行春化处理3天，于40℃水浴温度下超声波处理4分钟，超声波处理频率为35千赫兹，于28℃水浴温度、超声波处理频率为10千赫兹的黑暗条件下培养30小时，之后将拟南芥种子点播于装好培养土的穴盘上，在光周期24小时、湿度65％、22℃的光照培养箱中培养至长出拟南芥花序，其中，光周期24小时为16小时光照及8小时黑暗。
浸染方法具体为：用0.1％的氯化钠水溶液喷洒拟南芥花序，每隔1小时喷洒一次，共喷洒3次，将转化介质置于培养皿中，使拟南芥花序与转化介质完全接触3-4分钟。
黑暗条件下培养，具体为将保鲜膜包裹的拟南芥植株置于28℃、压力为0.5个大气压的不透光真空容器中培养。
<对比例1>
优化拟南芥转基因效率的方法同实施例3，其中，不同的是，未对拟南芥植株用保鲜膜进行单株包裹，而是将拟南芥植株的花序浸染于转化介质后取出平放于适宜大小的托盘上，当拟南芥植株放满托盘时，用保鲜膜将托盘包裹好。
<对比例2>
优化拟南芥转基因效率的方法同实施例6，其中，不同的是，步骤S2中，1/2MS溶液未加入10质量份的5.5毫克/升的硒蛋氨酸、8质量份的0.75毫克/升的植酸酶、5质量份的0.2毫克/升维生素C2、2质量份的0.5毫克/升的乙酰丁香酮、2质量份的0.2毫克/升的泛酸钙、以及3质量份的甘油。
<对比例3>
优化拟南芥转基因效率的方法同实施例6，其中，不同的是，将拟南芥种子依次用75％的乙醇消毒1分钟，10％次氯酸钠消毒10分钟，用无菌水彻底清洗5次后，将拟南芥种子点播于装好培养土的穴盘上，在光周期24小时、湿度65％、22℃的光照培养箱中培养至长出拟南芥花序，取第四周的拟南芥花序进行浸染实验，其中，光周期24小时为16小时光照及8小时黑暗。
<对比例4>
优化拟南芥转基因效率的方法同实施例6，其中，不同的是，将拟南芥种子依次用75％的乙醇消毒1分钟，10％次氯酸钠消毒10分钟，用无菌水彻底清洗5次后，将拟南芥种子点播于装好培养土的穴盘上，在光周期24小时、湿度65％、25℃的光照培养箱中培养至长出拟南芥花序，取第七周的拟南芥花序进行浸染实验，其中，光周期24小时为16小时光照及8小时黑暗。
<对比例5>
优化拟南芥转基因效率的方法同实施例6，其中，不同的是，未对拟南芥花序用0.1％的氯化钠水溶液喷洒，将拟南芥花序直接进行浸染。
<对比例6>
优化拟南芥转基因效率的方法同实施例6，其中，不同的是，未置于28℃、压力为0.5个大气压的不透光真空容器中培养，直接置于黑暗密闭箱中培养。
<转基因效率评价>
对采收种子进行消毒后，播种于含100毫克/升卡那霉素的1/2MS固体培养基上，统计每0.1毫升种子长出的阳性植株数量。
表1转化基因效率的比较
表中数据为平均值±标准误
实施例1-3中每0.1毫升种子长出的阳性植株数量接近，步骤S1中，改变含有目的基因的pBI121载体的农杆菌的恒温摇床中活化时间、恒温摇床培养时间、以及培养湿度对转化效率影响效果不明显。
实施例4-6中每0.1毫升种子长出的阳性植株数量逐渐增加，由此可推出，权利要求6-9对拟南芥植株转基因效率的提高起到了较大的促进作用。
对比例1与实施例3进行比较，对比例1中0.1毫升种子长出的阳性植株数量明显低于实施例3中的长出阳性植株数量，由此得出，采取包裹单株拟南芥植株花序对提高拟南芥转基因效率有显著作用。
对比例2中每0.1毫升种子长出的阳性植株数量低于实施例6，由此得出，1/2MS溶液中添加的营养成分对转基因效率的提高有积极的影响，影响效果不明显。
对比例3每0.1毫升种子长出的阳性植株数量与实施例6相近，对比例4中每0.1毫升种子长出的阳性植株数量明显低于实施例6，由此得出，拟南芥种子经处理后培养可以扩宽使用不同苗龄的拟南芥植株花序，使拟南芥植株得到了充分利用。
对比例5及对比例6中每0.1毫升种子长出的阳性植株数量低于实施例6，由此得出，在减压的情况下，农杆菌在转化介质的帮助下更容易穿透细胞壁及质膜，侵染雌配子体，利于拟南芥植株的转化。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (9)
1.优化拟南芥转基因效率的方法，其特征在于，利用转化介质浸染拟南芥植株上的花序，并将每株拟南芥植株用保鲜膜包裹，培养植株，收取种子。
2.如权利要求1所述的优化拟南芥转基因效率的方法，其特征在于，转化介质的具体配置方法为：
S1、配置含50毫克/升利福平和100毫克/升卡那霉素的YEP培养基培养液，取1体积份的含有目的基因pBI121载体的农杆菌与500体积份的YEP培养基培养液混合，于160转/分钟、28℃的恒温摇床中活化培养18-24小时，取1体积份的活化的含有目的基因pBI121载体的农杆菌与100体积份的YEP培养基培养液混合，于160转/分钟、28℃的恒温摇床上培养12-16小时至OD600值为1.8-2.0，离心分离收集农杆菌；
S2、将农杆菌重悬于1/2MS溶液，并稀释OD600值至0.8，该溶液即为转化介质。1/2MS溶液包括200质量份的1/2MS培养基、1质量份的Silwet-L77、50质量份的质量分数为5.0％的蔗糖无菌水溶液，其中，1/2MS溶液PH值为5.7。
3.如权利要求1所述的优化拟南芥转基因效率的方法，其特征在于，保鲜膜包裹具体方法为：将拟南芥植株平放于一张保鲜膜上，再用另一张保鲜膜盖于植株上面，压平两张保鲜膜，并按植株大小将保鲜膜折好，使植株完全包裹在保鲜膜内。
4.如权利要求1所述的优化拟南芥转基因效率的方法，其特征在于，培养植株具体为：黑暗条件下培养24小时，去掉保鲜膜，再转到光周期24小时、湿度60-70％、22℃条件下培养，2天后，用清水喷洒植株，清洗表面浸染转化介质，继续在光周期24小时、湿度60-70％、22℃条件下培养，去掉浸染后新长出的花序，果荚变黄干枯时剪下，其中，光周期24小时为16小时光照及8小时黑暗。
5.如权利要求2所述的优化拟南芥转基因效率的方法，其特征在于，步骤S1中，离心分离具体为在4℃的低温离心机中以5000转/分钟的转速离心5-10分钟，取管底农杆菌。
6.如权利要求2所述的优化拟南芥转基因效率的方法，其特征在于，步骤S2中，1/2MS溶液还包括10质量份的5.5毫克/升的硒蛋氨酸、8质量份的0.75毫克/升的植酸酶、5质量份的0.2毫克/升的维生素C、2质量份的0.5毫克/升的乙酰丁香酮、2质量份的0.2毫克/升的泛酸钙、以及3质量份的甘油。
7.如权利要求1所述的优化拟南芥转基因效率的方法，其特征在于，被浸染拟南芥植株上花序的具体获得方法为：将拟南芥种子在无菌环境中依次用质量分数为25％的石灰水浸泡10分钟、质量分数为1％的高锰酸钾溶液浸泡3分钟、质量分数为0.1％的洗涤剂浸泡10分钟、无菌水清洗5-6次，置于4℃冰箱进行春化处理3天，于40℃水浴温度下超声波处理3-5分钟，超声波处理频率为30-40千赫兹，于28℃水浴温度、超声波处理频率为10千赫兹的黑暗条件下培养24-36小时，之后将拟南芥种子点播于装好培养土的穴盘上，在光周期24小时、湿度60-70％、22℃的光照培养箱中培养至长出拟南芥花序，其中，光周期24小时为16小时光照及8小时黑暗。
8.如权利要求1所述的优化拟南芥转基因效率的方法，其特征在于，浸染方法具体为：用0.1％的氯化钠水溶液喷洒拟南芥花序，每隔1小时喷洒一次，共喷洒3次，将转化介质置于培养皿中，使拟南芥花序与转化介质完全接触3-4分钟。
9.如权利要求4所述的优化拟南芥转基因效率的方法，其特征在于，黑暗条件下培养，具体为将保鲜膜包裹的拟南芥植株置于28℃、压力为0.5个大气压的不透光真空容器中培养。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109566402A (zh) * | 2019-01-14 | 2019-04-05 | 安徽农业大学 | 一种快速同步获得乌菜雄性不育与保持系转基因植株方法 |
| CN109566402B (zh) * | 2019-01-14 | 2021-09-14 | 安徽农业大学 | 一种快速同步获得乌菜雄性不育与保持系转基因植株方法 |
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|---|---|
| CN108531503B (zh) | 2021-05-25 |
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Application publication date: 20180914 Assignee: Bobai Dayu agriculture and animal husbandry Co.,Ltd. Assignor: GUANGXI BOTANICAL GARDEN OF MEDICINAL PLANTS Contract record no.: X2023980045130 Denomination of invention: Method for optimizing the efficiency of transgenic Arabidopsis thaliana Granted publication date: 20210525 License type: Common License Record date: 20231101 |
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Application publication date: 20180914 Assignee: Bobai Dayu agriculture and animal husbandry Co.,Ltd. Assignor: GUANGXI BOTANICAL GARDEN OF MEDICINAL PLANTS Contract record no.: X2023980046539 Denomination of invention: Method for optimizing the efficiency of transgenic Arabidopsis thaliana Granted publication date: 20210525 License type: Common License Record date: 20231108 |