CN108524939B - 线粒体复合物i可逆性抑制剂与活性氧清除剂联合制备缺血再灌注损伤保护药物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了线粒体复合物I可逆性抑制剂与活性氧清除剂联合制备缺血再灌注损伤保护药物的用途。本发明发现，线粒体复合物I可逆性抑制剂可以发挥与缺血预适应现象类似的保护作用，可以用作缺血预适应药物；将其与活性氧清除剂联合，缺血前给予线粒体复合物I可逆性抑制剂，再灌注前给予活性氧清除剂，可以显著提高缺血再灌注的治疗效果。本发明提供的二元释药双层片，缺血前服用，外层含有线粒体复合物I可逆性抑制剂的速释层迅速释放发挥缺血预适应作用，内层含有活性氧清除剂的缓释层缓慢释放并于再灌注前达到最大血药浓度，从而提高缺血再灌注的治疗疗效，有效、便捷。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及线粒体复合物I可逆性抑制剂与活性氧清除剂联合制备缺血再灌注损伤保护药物的用途。
背景技术
目前，心肌缺血已成为百姓口中的流行语，其主要原因是由于近年来心肌缺血的发生率不断上升，死亡率也明显上升。近年来，随着临床诊治水平的提高，使得心肌缺血后得到血液再灌注治疗的患者比例上升。但有时心肌缺血再灌注往往会导致一系列心脏不良事件发生，从而部分抵消对心脏的有益作用，称为再灌注损伤。其表现为心肌细胞凋亡、氧自由基增多、去甲肾上腺素分泌增多，并导致恶性心脏不良事件的发生。心肌缺血再灌注损伤现象己成为阻碍再灌注治疗的一大难题，因而，减轻MIRI成为治疗心肌缺血的行之有效途径(参考文献：心肌缺血预适应的研究综述，陇东学院学报，2017年5月第28卷第3期)。
再灌注阶段再给予抗氧化剂(如N乙酰半胱氨酸，维生素E等药物)治疗的疗效不明显。心肌等器官缺血再灌注损伤过程中，多种因素参与再灌注损害，但活性氧ROS的爆发是最明显的现象。理论上抗氧化剂可对抗再灌注损伤，但临床效果不理想，可能是因为再灌注很短时间(10-20分钟)即出现ROS爆发，而抗氧化剂提供的还原当量不足以灭活ROS；此外，在还原/氧化反应中，抗氧化剂本身作为还原剂，在还原ROS时，自身被氧化，从而有可能成为新的活性氧分子。
缺血预适应(IPC)可以有效提高再灌注阶段的治疗疗效。研究发现，预先一次或反复多次短时间内缺血可使心肌细胞在其后较长时间的缺血中得以保护，从而延缓细胞凋亡，临床中将这种现象称为心肌IPC。随着研究的深入，学者们发现，化学损伤、药物等也可引起患者机体普遍预适应现象，从而发挥与IPC现象类似的保护作用(参考文献：心肌缺血预适应的研究综述，陇东学院学报，2017年5月第28卷第3期)。
我们将可以发挥与IPC现象类似保护作用的药物称为缺血预适应药物。
目前尚未见线粒体复合物I可逆性抑制剂用作缺血预适应药物的报道，更未见其与活性氧清除剂联合用于缺血再灌注损伤保护的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供线粒体复合物I可逆性抑制剂与活性氧清除剂联合制备缺血再灌注损伤保护药物的用途。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
线粒体复合物I可逆性抑制剂与活性氧清除剂联合制备缺血再灌注损伤保护药物的用途。
优选地，所述线粒体复合物I可逆性抑制剂为二甲双胍或二氢丹参酮I。
优选地，所述活性氧清除剂为维生素E、原儿茶醛或N-乙酰半胱氨酸。
线粒体复合物I可逆性抑制剂用作缺血预适应药物的用途。
优选地，所述线粒体复合物I可逆性抑制剂为二甲双胍或二氢丹参酮I。
二甲双胍或二氢丹参酮I用作线粒体复合物I可逆性抑制剂的用途。
一种二元缓控释制剂，包括速释组分和缓释组分，速释组分包括线粒体复合物I可逆性抑制剂；缓释组分包括活性氧清除剂。
优选地，该制剂为一种二元释药双层片，包括外层和内层；外层为速释层，其中含有活性成分线粒体复合物I可逆性抑制剂；内层为缓释层，其中含有活性成分活性氧清除剂。
优选地，所述线粒体复合物I可逆性抑制剂为二甲双胍或二氢丹参酮I。
优选地，所述活性氧清除剂为维生素E、原儿茶醛或N-乙酰半胱氨酸。
有益效果：
1、本发明发现，线粒体复合物I可逆性抑制剂可以发挥与缺血预适应现象类似的保护作用，可以用作缺血预适应药物；将其与活性氧清除剂联合，缺血前给予线粒体复合物I可逆性抑制剂，再灌注前给予活性氧清除剂，可以显著提高缺血再灌注的治疗效果；
2、本发明提供的二元释药双层片，缺血前服用，外层含有线粒体复合物I可逆性抑制剂的速释层迅速释放发挥缺血预适应作用，内层含有活性氧清除剂的缓释层缓慢释放并于再灌注前达到最大血药浓度，从而提高缺血再灌注的治疗疗效，有效、便捷。
附图说明
图1为二氢丹参酮I对线粒体复合物I的可逆抑制作用；
图2为各组心肌细胞存活率(P：原儿茶醛；D：二氢丹参酮I；X：不给药)；
图3为二氢丹参酮I和/或原儿茶醛对急性心肌梗死模型中大鼠心肌梗死面积的影响；
图4为二甲双胍和/或维生素E对急性心肌梗死模型中大鼠心肌梗死面积的影响；
图5为各组神经细胞存活率(P：原儿茶醛；D：二氢丹参酮I；X：不给药)；
图6为各组肾上皮细胞存活率(P：原儿茶醛；D：二氢丹参酮I；X：不给药)；
图7为各组心肌细胞存活率(NAC：N-乙酰半胱氨酸；D：二氢丹参酮I；X：不给药)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：对心肌缺血再灌注的治疗效果
一、实验材料
H9c2细胞，N2a细胞，HK-2细胞：购自ATCC公司，由本实验室保存。DMEM高糖培养基、胎牛血清、0.25％胰酶、100×青霉素和链霉素、CalceinAM(美国Thermo Fisher公司)， PBS(北京博奥森生物技术有限公司)，CoCl2、过氧化氢(美国Sigma公司)，PhosSTOP、 completeULTRATablets，Mini EASYpack(Roche公司)，CCK8、Fluo-4AM、Rhod-2AM(上海东仁化学科技有限公司)，RIPA裂解液、LY294002(上海碧云天生物技术有限公司)， AKT、p-AKT、p-GSK3、β-actin(美国Cell Signaling Technology)。超净台(美国Thermo 公司，ThermoScientific 1300A2型)，多功能酶标仪FLUOstar Omega(德国BMG LABTECH 公司)，激光共聚焦(德国卡尔蔡司公司)，电热恒温水浴锅(国华电器有限公司，HH-4数显恒温水浴锅)，CO2培养箱、离心机(美国Thermo Fisher公司)，天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司，BT224S)，细胞培养耗材、微量移液器(德国Eppendorff公司)，垂直电泳仪(美国Bio-RAD公司)，Tanon全自动化学发光成像***(上海天能科技有限公司)。
标准品：原儿茶醛，二氢丹参酮I，二甲双胍，维生素E，N-乙酰半胱氨酸纯度不低于98％。动物来源：Sprage-Dawley大鼠购置于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
二、实验方法
1、心肌细胞培养与传代
(1)心肌细胞复苏
取出冻存于液氮罐中的大鼠心肌细胞(H9c2细胞)，放入预热至37℃的水浴锅中迅速解冻，将细胞在无菌条件下移至9ml含10％血清的DMEM培养基的离心管中，1000rmp离心4min。弃去上清液，使细胞重悬于1mL上述培养基中，再转移至含新培养基的培养皿中，用移液枪轻轻吹散细胞使其均匀分布于培养皿，置于37℃、5％CO2条件培养，24h后换液。
(2)细胞消化
弃去培养皿中的培养基，用PBS溶液洗涤一次，加入1ml胰酶后，将培养皿置于细胞培养箱中2min，待细胞收缩变圆时，加入2ml培养基终止消化，用移液枪将贴壁生长的细胞吹散至完全脱落，使其悬于培养基，待后续试验使用。
(3)细胞传代
培养皿置于显微镜下观察，当细胞生长至融合80％～90％时，将细胞消化后，转移至离心管中，1000rmp离心4min，弃去上清液，将细胞重悬于新的培养基中，按1:3比例分配至含新培养基的培养皿中，置于37℃、含5％CO2的细胞培养箱中培养。
2、心肌细胞缺氧复氧模型的建立方法及药物干预
心肌细胞细胞贴壁后用含2％血清的培养基饥饿12h，后换缺氧液，置于缺氧箱中，控制缺氧箱O2浓度1％、CO2浓度5％，缺氧8h后，换成2％血清的正常培养液，继续培养8h。
实验分组如下：
control组(对照组，Ctrl)：心肌细胞贴壁后全程用2％血清的正常培养液正常培养；
缺氧复氧组(模型组，H/R)：按上述缺氧复氧模型的建立方法进行造模培养；
丹参酮-原儿茶醛组(D-P)：用含2％血清、1μM二氢丹参酮I的培养基饥饿12h，后缺氧培养8h，换成含2％血清、40μM原儿茶醛的正常培养液继续培养8h；
原儿茶醛-丹参酮组(P-D)：用含2％血清、40μM原儿茶醛的培养基饥饿12h，后缺氧培养8h，换成含2％血清、1μM二氢丹参酮I的正常培养液继续培养8h；
丹参酮组(D)：用含2％血清、1μM二氢丹参酮I的培养基饥饿12h，后缺氧培养8h，换成含2％血清的正常培养液继续培养8h；
丹参酮-丹参酮组(D-D)：用含2％血清、1μM二氢丹参酮I的培养基饥饿12h，后缺氧培养8h，换成含2％血清、1μM二氢丹参酮I的正常培养液继续培养8h；
原儿茶醛组(P)：用含2％血清的培养基饥饿12h，后缺氧培养8h，换成含2％血清、40μM原儿茶醛的正常培养液继续培养8h；
原儿茶醛-原儿茶醛组(P-P)：用含2％血清、40μM原儿茶醛的培养基饥饿12h，后缺氧培养8h，换成含2％血清、40μM原儿茶醛的正常培养液继续培养8h。
3、大鼠急性心肌梗死模型的建立方法及药物干预
本实验采用冠脉左前降支结扎法制作大鼠急性心肌梗死再灌模型[A novel andefficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in themouse,Circ Res.2010； 107(12):1445-53]。方法为：取健康SD大鼠，体重250-280g，测定大鼠肢导联II导心电图，取心电图正常的大鼠进行手术。设定呼吸机参数为：呼吸频率为80次/min，潮气量为10ml/kg 体重，呼吸比为2:1。大鼠采用3％戊巴比妥钠腹腔注射(45mg/kg)麻醉后，气管切开连呼吸机行人工呼吸，开胸并暴露心脏上左冠状动脉前降支(Leftanterior descending，LAD)的结扎点，于左心耳下缘2mm处用3/8弧3×6无菌带线眼科缝合针(6-0丝线)穿过心肌浅层，结扎LAD，以心电图ST段明显上抬且结扎线以下心肌颜色变暗为心肌缺血标志，结扎后，关胸，逐层缝合肋骨、肌肉和皮肤；伪手术组开胸后，在造模对等位置仅穿线不结扎。
再灌注：缺血30min后，开胸解开结扎恢复供血，关胸，逐层缝合肋骨、肌肉和皮肤。
实验分组如下，每组6只大鼠：
伪手术组(对照组，Sham)：按上述方法开胸、不结扎；
缺血再灌注组(模型组，H/R)：按上述模型建立方法进行缺血再灌注；
丹参酮-原儿茶醛组(D-P)：开胸结扎缺血前48h灌胃给予0.1mg/kg二氢丹参酮I，再灌注前腹腔注射(或尾静脉，下同)给予4mg/kg原儿茶醛；
原儿茶醛-丹参酮组(P-D)：开胸结扎缺血前48h灌胃给予4mg/kg原儿茶醛，再灌注前腹腔注射给予0.1mg/kg二氢丹参酮I；
丹参酮-丹参酮组(D-D)：开胸结扎缺血前48h灌胃给予0.1mg/kg二氢丹参酮I，再灌注前腹腔注射给予0.1mg/kg二氢丹参酮I；
原儿茶醛-原儿茶醛组(P-P)：开胸结扎缺血前48h灌胃给予4mg/kg原儿茶醛，再灌注前腹腔注射给予4mg/kg原儿茶醛；
二甲双胍-维生素E组(M-V)：开胸结扎缺血前48h灌胃给予6.5mg/kg二甲双胍，再灌注前腹腔注射(或尾静脉，下同)给予20mg/kg维生素E；
维生素E-二甲双胍组(V-M)：开胸结扎缺血前48h灌胃给予20mg/kg维生素E，再灌注前腹腔注射给予6.5mg/kg二甲双胍；
二甲双胍-二甲双胍组(M-M)：开胸结扎缺血前48h灌胃给予6.5mg/kg二甲双胍，再灌注前腹腔注射给予6.5mg/kg二甲双胍；
维生素E-维生素E组(V-V)：开胸结扎缺血前48h灌胃给予20mg/kg维生素E，再灌注前腹腔注射给予20mg/kg维生素E。
4、CCK8法测定心肌细胞缺氧复氧模型中各组心肌细胞的存活率
细胞接种到96孔板中，每孔5000个细胞，经培养、给药及缺氧/复氧处理后，每孔加入 10μL(培养液体积的1/10)CCK-8溶液，以不含细胞的培养液做空白组，每组设6个复孔，置37℃，5％CO2培养箱中孵育2～4h后，用酶标仪在450nm处检测各孔的吸光度(OD值)。根据所测OD值计算细胞存活率，细胞存活率＝(实验组OD值-空白组OD值)(对照/组OD 值-空白组OD值)×100％。以control组存活率为100％。
5、大鼠急性心肌梗死模型中各组大鼠心肌梗死面积的测定
大鼠称重，20％乌拉坦(1g/kg)麻醉，迅速开胸摘取心脏，剪去周围***，用冰生理盐水清洗，滤纸吸干水分后快速过液氮速冻，心脏组织均匀切为1～2mm的薄片，置于1％TTC染色液中37℃水浴染色10min。经TTC染色后，正常心肌组织呈玫瑰红色，梗死组织呈白色。用数码相机拍摄照片后输入电脑，用Image-ProPlus6图像分析软件计算梗死面积百分比，计算公式为：梗死部分面积/左心室面积×100％。
6、二氢丹参酮I对线粒体复合物I的可逆性抑制作用
Seahorse XF实验流程
实验前一天
(1)接种细胞：将细胞接种到Seahorse XF细胞培养板中，在生长培养基中过夜培养。注：细胞接种时间和培养时间可根据细胞处理要求进行选择。
(2)预热仪器：打开Seahorse仪器和电脑，打开软件，使仪器升温至37℃，过夜预热。
(3)水化探针：在Utility Plate中加入Seahorse XF校准液，将测试板放回Utility Plate 上，置于37℃无CO2培养箱中过夜水化探针。
实验当天
(1)准备检测液：用Seahorse XF Base Medium配制检测液，加入所需要的底物，将溶液加热至37℃，用NaOH调pH值至7.4，过滤，置37℃水浴中备用。注：检测液中所需要添加的底物及浓度取决于细胞类型和实验设计，或者与生长培养基保持一致。
(2)观察细胞：将细胞板从CO2培养箱中取出，在显微镜下观察细胞状态。
(3)细胞换液：将生长培养基换为检测液，然后将细胞放置在37℃无CO2培养箱中1h。
(4)配药：根据试剂盒说明书，配制并稀释药物至所需浓度。
(5)加药：将稀释好的药物分别加入测试板上的A、B、C、D四个加药孔中。注：根据实验设计选择所用加药孔数量。
(6)设计实验模板：用软件记录实验条件和设计实验程序。
(7)上机：开始运行实验程序，将加过药的测试板和装有校准液的Utility Plate一起放置到仪器托板上。
(8)仪器自动校准探针。
(9)换细胞板：当软件出现提示信息时，将Utility Plate换为细胞板。
(10)实验完成时根据软件提示信息退出测试板和细胞板，并在显微镜下观察细胞状态。
(11)数据分析：采用wave软件和report generator对实验数据进行分析。
7、统计学方法
实验结果以均数±标准偏差(X±SD)表示。样本均数的两两比较，采用GraphPadPrism 6 软件进行Two-wayANOVA检验，P＜0.05认为差异显著。
三、实验结果
1、二氢丹参酮I对线粒体复合物I的可逆性抑制作用
将二氢丹参酮I用wash的方法将其洗去可以逆转其对线粒体复合物I抑制作用，根据时间轴，0-16min，在没有加底物的情况下，所有组别氧耗最低；16-24min，在加入线粒体复合物I底物Mal/Pyr或复合物II底物Suc/Rot后，所有组别均开始产生氧耗，并上升至最高点 (24min左右)，然后所有组别逐渐有缓慢降低(24-40min)，在40min此刻开始，含复合物I底物组别的二氢丹参酮I DT组(黑色框)相对于对照组(白色框)有明显下降，说明 DT可以抑制复合物I活性，但是含有复合物II组别的DT组(黑色圈)相对于对照组(白色圈)之间变化不明显，故对复合物II的活性影响较小。但是线粒体复合物I的抑制剂阳性药鱼藤酮用wash的方法洗去不能逆转，说明二氢丹参酮I是不同于鱼藤酮的一种线粒体复合物 I可逆性抑制剂。可见二氢丹参酮I与已经报道的线粒体复合物I可逆性抑制剂二甲双胍具有一样的线粒体复合物抑制特性(参考文献：Metformin inhibits mitochondrial complex Iofcancer cells to reduce tumorigenesis,Elife.2014)。
2、心肌细胞缺氧复氧模型中各组心肌细胞的存活率
各组心肌细胞存活率如图2所示，丹参酮-原儿茶醛组(D-P)组心肌细胞存活率最高，说明缺氧前给予二氢丹参酮I、复氧前给于原儿茶醛对缺血再灌注心肌细胞的保护作用最优。
3、大鼠急性心肌梗死模型中各组大鼠心肌梗死面积
如图3所示，与缺血再灌注组相比，丹参酮-原儿茶醛组大鼠心肌梗死面积最小，且显著优于原儿茶醛-丹参酮组、丹参酮-丹参酮组、原儿茶醛-原儿茶醛组(P＜0.05)。
如图4所示，与缺血再灌注组相比，二甲双胍-维生素E组大鼠心肌梗死面积最小，且显著优于维生素E-二甲双胍组、二甲双胍-二甲双胍组、维生素E-维生素E组(P＜0.05)。
原儿茶醛和维生素E为已知的活性氧清除剂。
上述结果表明，缺氧前给予线粒体复合物I二氢丹参酮I或二甲双胍、复氧前给于活性氧清除剂原儿茶醛或维生素E对缺血再灌注心肌细胞的保护作用最优。
实施例2：对脑缺血再灌注的治疗效果
一、实验方法
1、神经细胞培养与传代
(1)神经细胞复苏
取出冻存于液氮罐中的神经细胞(N2a细胞)，放入预热至37℃的水浴锅中迅速解冻，将细胞在无菌条件下移至9ml含10％血清的DMEM培养基的离心管中，1000rmp离心4min。弃去上清液，使细胞重悬于1mL上述培养基中，再转移至含新培养基的培养皿中，用移液枪轻轻吹散细胞使其均匀分布于培养皿，置于37℃、5％CO2条件培养，24h后换液。
(2)细胞消化
弃去培养皿中的培养基，用PBS溶液洗涤一次，加入1ml胰酶后，将培养皿置于细胞培养箱中1min，待细胞收缩变圆时，加入2ml培养基终止消化，用移液枪将贴壁生长的细胞吹散至完全脱落，使其悬于培养基，待后续试验使用。
(3)细胞传代
培养皿置于显微镜下观察，当细胞生长至融合80％～90％时，将细胞消化后，转移至离心管中，1000rmp离心4min，弃去上清液，将细胞重悬于新的培养基中，按1:3比例分配至含新培养基的培养皿中，置于37℃、含5％CO2的细胞培养箱中培养。
2、神经细胞缺氧复氧模型的建立方法及药物干预
神经细胞细胞贴壁后用含2％血清的培养基饥饿12h，后换缺氧液，置于缺氧箱中，控制缺氧箱O2浓度1％、CO2浓度5％，缺氧4h后，换成2％血清的正常培养液，继续培养8h。
control组(对照组，Ctrl)：神经细胞贴壁后全程用2％血清的正常培养液正常培养；
缺氧复氧组(模型组，H/R)：按上述缺氧复氧模型的建立方法进行造模培养；
丹参酮-原儿茶醛组(D-P)：用含2％血清、1μM二氢丹参酮I的培养基饥饿12h，后缺氧培养4h，换成含2％血清、40μM原儿茶醛的正常培养液继续培养8h；
原儿茶醛-丹参酮组(P-D)：用含2％血清、40μM原儿茶醛的培养基饥饿12h，后缺氧培养4h，换成含2％血清、1μM二氢丹参酮I的正常培养液继续培养8h；
丹参酮组(D)：用含2％血清、1μM二氢丹参酮I的培养基饥饿12h，后缺氧培养4h，换成含2％血清的正常培养液继续培养8h；
丹参酮-丹参酮组(D-D)：用含2％血清、1μM二氢丹参酮I的培养基饥饿12h，后缺氧培养4h，换成含2％血清、1μM二氢丹参酮I的正常培养液继续培养8h；
原儿茶醛组(P)：用含2％血清的培养基饥饿12h，后缺氧培养4h，换成含2％血清、40μM原儿茶醛的正常培养液继续培养8h；
原儿茶醛-原儿茶醛组(P-P)：用含2％血清、40μM原儿茶醛的培养基饥饿12h，后缺氧培养4h，换成含2％血清、40μM原儿茶醛的正常培养液继续培养8h。
3、CCK8法测定神经细胞缺氧复氧模型中各组神经细胞的存活率
细胞接种到96孔板中，每孔5000个细胞，经培养、给药及缺氧/复氧处理后，每孔加入 10μL(培养液体积的1/10)CCK-8溶液，以不含细胞的培养液做空白组，每组设6个复孔，置37℃，5％CO2培养箱中孵育2～4h后，用酶标仪在450nm处检测各孔的吸光度(OD值)。根据所测OD值计算细胞存活率，细胞存活率＝(实验组OD值-空白组OD值)(对照/组OD 值-空白组OD值)×100％。以control组存活率为100％。
二、实验结果
神经细胞存活率如图5，丹参酮-原儿茶醛组(D-P)组心肌细胞存活率最高，说明缺氧前给予二氢丹参酮I、复氧前给于原儿茶醛对脑缺血再灌注损伤神经细胞的保护作用最优。
实施例3：对肾缺血再灌注的治疗效果
一、实验方法
1、肾上皮细胞培养与传代
(1)肾上皮细胞复苏
取出冻存于液氮罐中的肾上皮细胞(HK2细胞)，放入预热至37℃的水浴锅中迅速解冻，将细胞在无菌条件下移至9ml含10％血清的DMEM培养基的离心管中，1000rmp离心4min。弃去上清液，使细胞重悬于1mL上述培养基中，再转移至含新培养基的培养皿中，用移液枪轻轻吹散细胞使其均匀分布于培养皿，置于37℃、5％CO2条件培养，24h后换液。
(2)细胞消化
弃去培养皿中的培养基，用PBS溶液洗涤一次，加入1ml胰酶后，将培养皿置于细胞培养箱中1min，待细胞收缩变圆时，加入2ml培养基终止消化，用移液枪将贴壁生长的细胞吹散至完全脱落，使其悬于培养基，待后续试验使用。
(3)细胞传代
培养皿置于显微镜下观察，当细胞生长至融合80％～90％时，将细胞消化后，转移至离心管中，1000rmp离心4min，弃去上清液，将细胞重悬于新的培养基中，按1:3比例分配至含新培养基的培养皿中，置于37℃、含5％CO2的细胞培养箱中培养。
2、肾上皮细胞缺氧复氧模型的建立方法及药物干预
肾上皮细胞细胞贴壁后用含2％血清的培养基饥饿12h，后换缺氧液，置于缺氧箱中，控制缺氧箱O2浓度1％、CO2浓度5％，缺氧12h后，换成2％血清的正常培养液，继续培养8h。
control组(对照组，Ctrl)：肾上皮细胞贴壁后全程用2％血清的正常培养液正常培养；
缺氧复氧组(模型组，H/R)：按上述缺氧复氧模型的建立方法进行造模培养；
丹参酮-原儿茶醛组(D-P)：用含2％血清、1μM二氢丹参酮I的培养基饥饿12h，后缺氧培养12h，换成含2％血清、40μM原儿茶醛的正常培养液继续培养8h；
原儿茶醛-丹参酮组(P-D)：用含2％血清、40μM原儿茶醛的培养基饥饿12h，后缺氧培养12h，换成含2％血清、1μM二氢丹参酮I的正常培养液继续培养8h；
丹参酮组(D)：用含2％血清、1μM二氢丹参酮I的培养基饥饿12h，后缺氧培养12h，换成含2％血清的正常培养液继续培养8h；
丹参酮-丹参酮组(D-D)：用含2％血清、1μM二氢丹参酮I的培养基饥饿12h，后缺氧培养12h，换成含2％血清、1μM二氢丹参酮I的正常培养液继续培养8h；
原儿茶醛组(P)：用含2％血清的培养基饥饿12h，后缺氧培养12h，换成含2％血清、40μM原儿茶醛的正常培养液继续培养8h；
原儿茶醛-原儿茶醛组(P-P)：用含2％血清、40μM原儿茶醛的培养基饥饿12h，后缺氧培养12h，换成含2％血清、40μM原儿茶醛的正常培养液继续培养8h。
3、CCK8法测定神经细胞缺氧复氧模型中各组神经细胞的存活率
细胞接种到96孔板中，每孔5000个细胞，经培养、给药及缺氧/复氧处理后，每孔加入10μL(培养液体积的1/10)CCK-8溶液，以不含细胞的培养液做空白组，每组设6个复孔，置37℃，5％CO2培养箱中孵育2～4h后，用酶标仪在450nm处检测各孔的吸光度(OD值)。根据所测OD值计算细胞存活率，细胞存活率＝(实验组OD值-空白组OD值)(对照/组OD 值-空白组OD值)×100％。以control组存活率为100％。
二、实验结果
肾上皮细胞存活率如图6，丹参酮-原儿茶醛组(D-P)组心肌细胞存活率最高，说明缺氧前给予二氢丹参酮I、复氧前给于原儿茶醛对肾上皮细胞缺血再灌注损伤的保护作用最优。
实施例4：二氢丹参酮I和N-乙酰半胱氨酸对心肌缺血再灌注的治疗效果
一、实验方法
1、心肌细胞培养与传代
(1)心肌细胞复苏
取出冻存于液氮罐中的大鼠心肌细胞(H9c2细胞)，放入预热至37℃的水浴锅中迅速解冻，将细胞在无菌条件下移至9ml含10％血清的DMEM培养基的离心管中，1000rmp离心4min。弃去上清液，使细胞重悬于1mL上述培养基中，再转移至含新培养基的培养皿中，用移液枪轻轻吹散细胞使其均匀分布于培养皿，置于37℃、5％CO2条件培养，24h后换液。
(2)细胞消化
弃去培养皿中的培养基，用PBS溶液洗涤一次，加入1ml胰酶后，将培养皿置于细胞培养箱中2min，待细胞收缩变圆时，加入2ml培养基终止消化，用移液枪将贴壁生长的细胞吹散至完全脱落，使其悬于培养基，待后续试验使用。
(3)细胞传代
培养皿置于显微镜下观察，当细胞生长至融合80％～90％时，将细胞消化后，转移至离心管中，1000rmp离心4min，弃去上清液，将细胞重悬于新的培养基中，按1:3比例分配至含新培养基的培养皿中，置于37℃、含5％CO2的细胞培养箱中培养。
2、心肌细胞缺氧复氧模型的建立方法及药物干预
心肌细胞细胞贴壁后用含2％血清的培养基饥饿12h，后换缺氧液，置于缺氧箱中，控制缺氧箱O2浓度1％、CO2浓度5％，缺氧8h后，换成2％血清的正常培养液，继续培养8h。
实验分组如下：
control组(对照组，Ctrl)：心肌细胞贴壁后全程用2％血清的正常培养液正常培养；
缺氧复氧组(模型组，H/R)：按上述缺氧复氧模型的建立方法进行造模培养；
丹参酮-N-乙酰半胱氨酸组(D-NAC)：用含2％血清、1μM二氢丹参酮I的培养基饥饿12h，后缺氧培养8h，换成含2％血清、500μM N-乙酰半胱氨酸的正常培养液继续培养8h；
N-乙酰半胱氨酸-丹参酮组(NAC-D)：用含2％血清、500μM N-乙酰半胱氨酸的培养基饥饿12h，后缺氧培养8h，换成含2％血清、1μM二氢丹参酮I的正常培养液继续培养8h；
丹参酮组(D)：用含2％血清、1μM二氢丹参酮I的培养基饥饿12h，后缺氧培养8h，换成含2％血清的正常培养液继续培养8h；
丹参酮-丹参酮组(D-D)：用含2％血清、1μM二氢丹参酮I的培养基饥饿12h，后缺氧培养8h，换成含2％血清、1μM二氢丹参酮I的正常培养液继续培养8h；
N-乙酰半胱氨酸组(NAC)：用含2％血清的培养基饥饿12h，后缺氧培养8h，换成含2％血清、500μM N-乙酰半胱氨酸的正常培养液继续培养8h；
N-乙酰半胱氨酸-N-乙酰半胱氨酸组(NAC-NAC)：用含2％血清、500μM N-乙酰半胱氨酸的培养基饥饿12h，后缺氧培养8h，换成含2％血清、500μM N-乙酰半胱氨酸的正常培养液继续培养8h。
3、CCK8法测定心肌细胞缺氧复氧模型中各组心肌细胞的存活率
细胞接种到96孔板中，每孔5000个细胞，经培养、给药及缺氧/复氧处理后，每孔加入 10μL(培养液体积的1/10)CCK-8溶液，以不含细胞的培养液做空白组，每组设6个复孔，置37℃，5％CO2培养箱中孵育2～4h后，用酶标仪在450nm处检测各孔的吸光度(OD值)。根据所测OD值计算细胞存活率，细胞存活率＝(实验组OD值-空白组OD值)(对照/组OD 值-空白组OD值)×100％。以control组存活率为100％。
二、实验结果
各组神经细胞存活率如图7所示，丹参酮-N-乙酰半胱氨酸组(D-NAC)组心肌细胞存活率最高，说明缺氧前给予二氢丹参酮I、复氧前给于N-乙酰半胱氨酸对脑缺血再灌注损伤神经细胞的保护作用最优。N-乙酰半胱氨酸为已知的活性氧清除剂。
实施例5：二元释药双层片
一、实验仪器和材料
DP30A单冲压片机；YD-20智能硬度仪；ZB-1C智能崩解仪；FT-2000脆碎度检查仪；ZRS-8G智能溶出试验仪；Agilent-1200高效液相色谱仪。
原儿茶醛、二氢丹参酮I、二甲双胍、维生素E纯度不低于98％。
辅料均为市场可以购买到的常规辅料。
二、实验方法
1、双层片的制备
(1)二氢丹参酮I-原儿茶醛二元释药双层片
A速释层处方：
PVP-K30用50％乙醇配制成黏合剂。称取处方量的二氢丹参酮I、十二烷基硫酸钠、PVPP 以及适量预胶化淀粉混合均匀，用黏合剂制软材。过14目尼龙筛，湿颗粒于50℃干燥。干颗粒过14目尼龙筛，整粒后，加入适量硬脂酸镁混合均匀。200mg原辅料中含有50mg二氢丹参酮I，PVP-K30、PVPP及十二烷基硫酸钠的重量比为20:1:1.5。
B缓释层处方：
取原儿茶醛、HPMC(羟丙基甲基纤维素)、MCC(微晶纤维素)，过100目筛，混匀，用95％乙醇适量润湿，制成软材，过20目筛制粒，50℃干燥，过18目筛整粒，加适量硬脂酸镁混匀。200mg原辅料中含有100mg原儿茶醛，HPMC与MCC的重量比为1:1。
C压片
将上述速释层和缓释层进行压片，先压缓释层，后压速释层。每片缓释层中原儿茶醛的重量为速释层中二氢丹参酮I重量的40倍。每片片重840mg。
(2)二甲双胍-维生素E二元释药双层片
A速释层处方：
PVP-K30用50％乙醇配制成黏合剂。称取处方量的二甲双胍、十二烷基硫酸钠、PVPP 以及适量预胶化淀粉混合均匀，用黏合剂制软材。过14目尼龙筛，湿颗粒于50℃干燥。干颗粒过14目尼龙筛，整粒后，加入适量硬脂酸镁混合均匀。200mg原辅料中含有50mg二甲双胍，PVP-K30、PVPP及十二烷基硫酸钠的重量比为20:1:1.5。
B缓释层处方：
取维生素E、HPMC(羟丙基甲基纤维素)、MCC(微晶纤维素)，过100目筛，混匀，用95％乙醇适量润湿，制成软材，过20目筛制粒，50℃干燥，过18目筛整粒，加适量硬脂酸镁混匀。200mg原辅料中含有100mg维生素E，HPMC与MCC的重量比为1:1。
C压片
将上述速释层和缓释层进行压片，先压缓释层，后压速释层。每片缓释层中维生素E的重量为速释层中二甲双胍重量的3倍。每片片重500mg。
2、体外释放度测定
分别取上述双层片，按释放度测定方法考察速释层和缓释层指标成分的体外释放度。
释放度测定方法：参考中国药典2015版第二部附录溶出度与释放度测定法，采用篮法，转速为100r/min，以900mL脱气水为释放介质，温度为(37±0.5)℃，依法操作。于不同时间点各取样5mL，用0.45μm滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；另分别取二氢丹参酮I、原儿茶醛、二甲双胍、维生素E对照品溶液，分别按拟定的色谱条件测定，计算各取样时间点速释层、缓释层指标成分的累积释放度。
三、实验结果
释放度测定结果显示，上述二元释药双层片中，速释层15min累计释放度均在99％以上；缓释层1h累计释放度不超过15％，8h累计释放度不超过55％，12h累计释放度约70％。通过优化处方，可以进一步控制速释层、缓释层的释放时间。结合实施例1～3的药效实验可知，可以在缺血前服用该二元释药双层片，含有线粒体复合物I可逆性抑制剂二氢丹参酮I或二甲双胍的速释层迅速释放发挥缺血预适应作用，含有活性氧清除剂的缓释层缓慢释放并于再灌注前达到最大血药浓度，从而提高缺血再灌注的治疗疗效，有效、便捷。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
Claims (1)
1.一种缺血前服用、用于缺血再灌注损伤保护的二元释药双层片，其特征在于：包括外层和内层；外层为迅速释放发挥缺血预适应作用的速释层，其中含有活性成分线粒体复合物I可逆性抑制剂，所述线粒体复合物I可逆性抑制剂为二氢丹参酮I；内层为缓慢释放并于再灌注前达到最大血药浓度的缓释层，其中含有活性成分活性氧清除剂，所述活性氧清除剂为原儿茶醛。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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