CN108513908B - 一种四倍体不结球白菜的培育方法 - Google Patents

一种四倍体不结球白菜的培育方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种四倍体不结球白菜的培育方法，采用细胞微管抑制剂氨磺灵混合水溶液点滴不结球白菜幼苗的生长点，使细胞染色体加倍，苗期进行气孔鉴定，开花期进行花粉鉴定，再通过流式细胞仪鉴定，筛选获得四倍体植株。同时在氨磺灵水溶液中加入吐温80和Silwet L‑77，吐温80能够增强氨磺灵的溶解性，并提高了氨磺灵水溶液的稳定性，而Silwet L‑77能极大降低水的表面张力，利于溶液与叶面的附着，从而提高了四倍体诱变率。该方法利用氨磺灵混合水溶液抑制细胞有丝***后期纺锤丝的形成，从而实现染色体加倍，为创造丰富的不结球白菜四倍体新种质和培育四倍体新品种提供了技术支持。

Description

一种四倍体不结球白菜的培育方法
技术领域
本发明属于遗传育种技术领域，具体涉及一种四倍体不结球白菜的培育方法。
背景技术
不结球白菜（Brassica cappestris ssp.chinensis），又名小白菜，是十字花科芸薹属植物，为一、二年生草本植物。植株较矮小，浅根系，须根发达。不结球白菜起源自我国，含有丰富矿物质和维生素。通过倍性育种可使植物基因组多倍化获得生长势旺盛、适应性强、抗逆性好的品种。四倍体是指体细胞中含有四个染色体组，经过人工诱导选育栽培，可获得优质、高产、高抗的四倍体植株。
细胞微管抑制剂氨磺灵（Oryzalin）作为秋水仙素的代替品，可以抑制有丝***后期纺锤丝的形成，实现染色体加倍，弥补了秋水仙素诱导存在的毒性大的弊端。但氨磺灵直接使用水溶性低，难以在叶面停留。因此有必要建立一套氨磺灵诱导不结球白菜的技术方法，为四倍体新品种的选育培育提供丰富的四倍体新种质。
发明内容
本发明的目的是提供一种四倍体不结球白菜的培育方法，采用润湿分散剂与氨磺灵配合使用，操作简便、低毒高效。
为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
一种四倍体不结球白菜的培育方法，包括以下步骤：
步骤1，选择当年采收的饱满不结球白菜种子，按常规技术播种育苗；
步骤2，当幼苗子叶完全展开时，用氨磺灵混合水溶液早晚各点滴幼苗生长点，连续处理5次，以点滴蒸馏水作为对照；
步骤3，成株后，先进行形态学鉴定，取疑似株第5～10片真叶的下表皮，进行气孔鉴定，选择气孔显著变大的植株作为四倍体变异初选植株；
步骤4，进入开花期，取四倍体变异初选植株进行花粉鉴定，进一步筛选获得花粉显著增大变形的植株作为四倍体变异疑似株；
步骤5，取四倍体变异疑似株嫩叶进行核DNA含量流式细胞光度分析，最终确认获得四倍体植株；
所述氨磺灵混合水溶液是氨磺灵、吐温 80和有机硅表面活性剂Silwet L-77的混合水溶液。
进一步地，所述氨磺灵混合水溶液中氨磺灵的浓度为0.06-0.10mmol·L-1。
进一步地，所述氨磺灵混合水溶液中吐温 80的浓度为0.02% v/v，有机硅表面活性剂Silwet L-77的浓度为0.02% v/v。两者浓度过低，处理效果甚微，浓度过高，则会对植株产生毒害。
进一步地，所述氨磺灵混合水溶液的配置过程如下：采用15ml乙醇溶解氨磺灵，将溶液滴加入蒸馏水中，滴加过程中不断摇匀蒸馏水，保证无药剂析出，制得浓度0.06-0.10mmol·L-1的氨磺灵水溶液，再加入吐温 80和Silwet L-77，摇匀即得。
进一步地，步骤3中形态学鉴定，以叶片长度与宽度、叶面是否扭曲、茎粗、株高、冠幅为指标进行筛选鉴定。
进一步地，步骤3中进行气孔鉴定的过程如下：显微镜下测定气孔的长和宽，并依据椭圆周长公式，计算气孔的周长，每一植株测定30-50个气孔；采用统计学T检验方法测定该植株气孔周长与对照植株气孔是否存在差异，其中气孔极显著大于对照的植株为四倍体初选变异植株。
进一步地，步骤4中进行花粉鉴定的过程如下：显微镜下比较花粉粒的大小和形状，测定该植株花粉粒形状与对照植株花粉粒是否存在差异，其中花粉粒呈现出明显的不同于二倍体植株的不规则状为四倍体初选变异疑似株。
吐温 80是非离子型表面活性剂，通常被认作是无毒、无刺激性的材料，可作为增溶剂，润湿剂，分散剂和稳定剂使用，提高氨磺灵在水中的溶解性，增强生理活性，增大吸收，提高水溶液的稳定性。Silwet-L77能够极大的降低水的表面张力，使溶液可轻易湿润几乎所有种类的叶面, 具有极强的耐水冲刷及渗透能力。
本发明的方法以人工栽培收获的不结球白菜种子为材料，采用细胞微管抑制剂氨磺灵（Oryzalin）点滴植株子叶生长点，并通过复配吐温 80和Silwet-L77提高了氨磺灵水溶液的稳定性、附着力和渗透性，更好的抑制了有丝***后期纺锤丝的形成，实现染色体加倍，产生四倍体变异植株。该方法为创造丰富的不结球白菜四倍体新种质和新品种提供了技术支持。
附图说明
图1（a）为实施例1中二倍体植株气孔电镜图，图1（b）为实施例1中四倍体变异植株气孔电镜图。
图2（a）为实施例1中二倍体植株花粉电镜图，图2（b）为实施例1中四倍体变异植株花粉电镜。
图3实施例1中不同倍性不结球白菜植株及其倍性鉴定，左上为二倍体植株照片，右上为二倍体核DNA流式细胞光度分析，左下为四倍体植株照片，右下为四倍体变异植株核DNA流式细胞光度分析。
具体实施方式
实施例1
步骤1，挑选当年采收的不结球白菜饱满种子216粒。
步骤2，将种子进行催芽处理，露白后拨入穴盘。当幼苗子叶完全展开时，氨磺灵混合水溶液（氨磺灵浓度为0.06mmol·L-1，吐温 80浓度为0.02% v/v，Silwet L-77浓度为0.02% v/v）早晚点滴幼苗生长点，处理5次。
步骤3，成株后先根据第5～10片真叶长度与宽度、叶面扭曲程度、主茎粗、株高筛选四倍体植株。再通过解剖学中气孔鉴定，确定四倍体变异初选植株，变异率达到4.63%。
步骤4，进入开花期，将四倍体变异初选植株进行花粉鉴定，将花粉显著增大变形的植株作为四倍体变异疑似株，占初选变异植株数目的50%。
步骤5，取四倍体变异疑似株的嫩叶进行核DNA含量流式细胞光度分析，最终确认获得四倍体植株。
解剖学中气孔鉴定为：
用尖头镊子将叶片背面表皮撕下，放置于载玻片上，滴1～2滴清水后盖上盖玻片，在20或40倍显微镜下用具有显微测微标尺的目镜测量气孔长与宽度，选择长、宽度显著大于对照二倍体的植株为四倍体变异初选植株。
如图1所示，四倍体变异植株气孔大于对照用二倍体植株气孔。
花粉鉴定为：
取花粉饱满的雄蕊，将花粉均匀抖落在载玻片上，在20或40倍显微镜下用具有显微测微标尺的目镜观察花粉的形状和大小，选择花粉粒呈不规则状，明显不同于二倍体的植株为四倍体变异疑似株。
如图2所示，四倍体变异植株花粉呈不规则状，明显不同于二倍体植株花粉。
上述农艺性状为：
叶色加深、叶片增厚、叶片长宽比变小、生长势缓慢。
如图3中1、3所示，四倍体变异植株对比对照用二倍体植株，叶色加深、叶片增厚、叶片长宽比变小、生长势缓慢。
流式细胞仪测定DNA含量方法为：
取50mg不结球白菜叶片加入1mL Tris-HCl缓冲液，用刀片将叶片快速切碎，40μm过滤器过滤至1.5 mL离心管，冰上孵育5～10 min，1000r·min-1低温离心5min，弃上清液，再加入1mL 预冷Tris-HCl缓冲液，1000r·min-1低温离心5 min，弃上清液，加入500μL预冷的Tris-HCl缓冲液，加入核糖核酸酶和荧光染料碘化丙啶(PI)。添加RNAsa酶10μL(10mg/mL)，添加PI染色剂7μL(10mg/mL)，混匀避光染色15 min后上机检测。
如图3中2、4所示，图中横坐标峰值位置显示为被测植株的DNA荧光强度，四倍体变异植株DNA荧光强度大约是对照用二倍体植株DNA荧光强度的二倍。
实施例2
步骤1，挑选当年采收的不结球白菜饱满种子212粒。
步骤2，将种子进行催芽处理，露白后拨入穴盘。当幼苗子叶完全展开时，氨磺灵混合水溶液（氨磺灵浓度为0.08mmol·L-1，吐温 80浓度为0.02% v/v，Silwet L-77浓度为0.02% v/v）早晚点滴幼苗生长点，处理5次。
步骤3，成株后先根据第5～10片真叶长度与宽度、叶面扭曲程度、主茎粗、株高筛选四倍体植株。再通过解剖学中气孔鉴定，确定四倍体变异初选植株，变异率达到9.91%。
步骤4，进入开花期，将四倍体变异初选植株进行花粉鉴定，将花粉显著增大变形的植株作为四倍体变异疑似株，占初选变异植株数目的66.7%。
步骤5，取四倍体变异疑似株的嫩叶进行核DNA含量流式细胞光度分析，最终确认获得四倍体植株。
解剖学中气孔鉴定为：
用尖头镊子将叶片背面表皮撕下，放置于载玻片上，滴1～2滴清水后盖上盖玻片，在20或40倍显微镜下用具有显微测微标尺的目镜测量气孔长与宽度，选择长、宽度显著大于对照二倍体的植株为四倍体变异初选植株。
花粉鉴定为：
取花粉饱满的雄蕊，将花粉均匀抖落在载玻片上，在20或40倍显微镜下用具有显微测微标尺的目镜观察花粉的形状和大小，选择花粉粒呈不规则状，明显不同于二倍体的植株为四倍体变异疑似株。
上述农艺性状为：
叶色加深、叶片增厚、叶片长宽比变小、生长势缓慢。四倍体变异植株对比对照用二倍体植株，叶色加深、叶片增厚、叶片长宽比变小、生长势缓慢。
经流式细胞仪测定DNA含量，四倍体变异植株DNA荧光强度大约是对照用二倍体植株DNA荧光强度的二倍。
实施例3
步骤1，挑选当年采收的不结球白菜饱满种子199粒。
步骤2，将种子进行催芽处理，露白后拨入穴盘。当幼苗子叶完全展开时，氨磺灵混合水溶液（氨磺灵浓度为0.1mmol·L-1，吐温 80浓度为0.02% v/v，Silwet L-77浓度为0.02% v/v）早晚点滴幼苗生长点，处理5次。
步骤3，成株后先根据第5～10片真叶长度与宽度、叶面扭曲程度、主茎粗、株高筛选四倍体植株。再通过解剖学中气孔鉴定，确定四倍体变异初选植株，变异率达到8.04%。
步骤4，进入开花期，将四倍体变异初选植株进行花粉鉴定，将花粉显著增大变形的植株作为四倍体变异疑似株，占初选变异植株数目的62.5%。
步骤5，取四倍体变异疑似株的嫩叶进行核DNA含量流式细胞光度分析，最终确认获得四倍体植株。
解剖学中气孔鉴定为：
用尖头镊子将叶片背面表皮撕下，放置于载玻片上，滴1～2滴清水后盖上盖玻片，在20或40倍显微镜下用具有显微测微标尺的目镜测量气孔长与宽度，选择长、宽度显著大于对照二倍体的植株为四倍体变异初选植株。
花粉鉴定为：
取花粉饱满的雄蕊，将花粉均匀抖落在载玻片上，在20或40倍显微镜下用具有显微测微标尺的目镜观察花粉的形状和大小，选择花粉粒呈不规则状，明显不同于二倍体的植株为四倍体变异疑似株。
上述农艺性状为：
叶色加深、叶片增厚、叶片长宽比变小、生长势缓慢。四倍体变异植株对比对照用二倍体植株，叶色加深、叶片增厚、叶片长宽比变小、生长势缓慢。
经流式细胞仪测定DNA含量，四倍体变异植株DNA荧光强度大约是对照用二倍体植株DNA荧光强度的二倍。

Claims (5)

1.一种四倍体不结球白菜的培育方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，选择当年采收的饱满不结球白菜种子，按常规技术播种育苗；
步骤2，当幼苗子叶完全展开时，用氨磺灵混合水溶液早晚各点滴幼苗生长点，连续处理5次，以点滴蒸馏水作为对照；
步骤3，成株后，先进行形态学鉴定，取疑似株第5～10片真叶的下表皮，进行气孔鉴定，选择气孔显著变大的植株作为四倍体变异初选植株；
步骤4，进入开花期，取四倍体变异初选植株进行花粉鉴定，进一步筛选获得花粉显著增大变形的植株作为四倍体变异疑似株；
步骤5，取四倍体变异疑似株嫩叶进行核DNA含量流式细胞光度分析，最终确认获得四倍体植株；
所述氨磺灵混合水溶液是氨磺灵、吐温 80和有机硅表面活性剂Silwet L-77的混合水溶液，氨磺灵的浓度为0.08-0.10mmol·L-1，吐温 80的浓度为0.02% v/v，有机硅表面活性剂Silwet L-77的浓度为0.02% v/v。
2.根据权利要求1所述的四倍体不结球白菜的培育方法，其特征在于：所述氨磺灵混合水溶液的配置过程如下：采用15mL乙醇溶解氨磺灵，将溶液滴加入蒸馏水中，滴加过程中不断摇匀蒸馏水，保证无药剂析出，制得浓度为0.08-0.10mmol·L-1的氨磺灵水溶液，再加入吐温 80和Silwet L-77，摇匀，即得。
3.根据权利要求1所述的四倍体不结球白菜的培育方法，其特征在于：步骤3中形态学鉴定，以叶片长度与宽度、叶面是否扭曲、茎粗、株高、冠幅为指标进行筛选鉴定。
4.根据权利要求1所述的四倍体不结球白菜的培育方法，其特征在于：步骤3中进行气孔鉴定的过程如下：显微镜下测定气孔的长和宽，并依据椭圆周长公式，计算气孔的周长，每一植株测定30-50个气孔；采用统计学T检验方法测定该植株气孔周长与对照植株气孔是否存在差异，其中气孔极显著大于对照的植株为四倍体初选变异植株。
5.根据权利要求1所述的四倍体不结球白菜的培育方法，其特征在于：步骤4中进行花粉鉴定的过程如下：显微镜下比较花粉粒的大小和形状，测定该植株花粉粒形状与对照植株花粉粒是否存在差异，其中花粉粒呈现出明显的不同于二倍体植株的不规则状为四倍体初选变异疑似株。
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