CN108504767B - 大豆分子标记及其在检测大豆种子营养价值中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了大豆分子标记及其在检测大豆种子营养价值中的应用。本发明公开的大豆分子标记为A1)或A2)：A1)以大豆的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行扩增得到的DNA分子；所述A1由名称分别为A1‑F和A1‑R的两条单链DNA组成，所述A1‑F为与大豆基因组中序列1的第346位上游特异结合的单链DNA，所述A1‑R为与大豆基因组中序列1的第346位下游特异结合的单链DNA；A2)大豆基因组DNA中对应于序列表中序列1的第346位的核苷酸。实验证明，本发明的大豆分子标记与种子蛋白中11S/7S比值有关，可通过检测本发明的大豆分子标记和相应的基因型检测种子蛋白中11S/7S比值。

Description

大豆分子标记及其在检测大豆种子营养价值中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，大豆分子标记及其在检测大豆种子营养价值中的应用。
背景技术
大豆种子蛋白是重要的植物蛋白来源，具有丰富的营养价值。大豆是我国仅次于玉米、小麦和水稻的第四大作物，是我国主要的粮食和油料作物之一。由于大豆具有极高营养价值、高生理活性和广泛工业用途，世界对大豆的需求日益增加。
大豆种子中70％的贮藏蛋白是球蛋白和β-伴球蛋白。球蛋白和β-伴球蛋白又可称作为11S球蛋白和7S球蛋白，它们之间又是显著负相关关系。7S球蛋白的含硫氨基酸比11S球蛋白的含硫氨基酸要低3～4倍，而且大豆的营养价值和含硫氨基酸(蛋氨酸和半胱氨酸)的含量密切相关，含硫氨基酸的含量越高，营养价值越高。因此，研究11S球蛋白和7S球蛋白的比值以及含硫氨基酸的含量，对提高大豆营养价值具有重要的价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测大豆种子的营养价值，尤其是含硫氨基酸的含量，以及如何检测大豆种子中11S球蛋白和7S球蛋白的含量及二者的比值。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种大豆分子标记，所述大豆分子标记为A1)或A2)：
A1)以大豆的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行扩增得到的DNA分子；所述A1由名称分别为A1-F和A1-R的两条单链DNA组成，所述A1-F为与大豆基因组中序列1的第346位上游特异结合的单链DNA，所述A1-R为与大豆基因组中序列1的第346位下游特异结合的单链DNA；
A2)大豆基因组DNA中对应于序列表中序列1的第346位的核苷酸。所述大豆分子标记的多态性可为大豆基因组中对应于序列1的第346位为G或A。
所述A1-F可为序列1的第1-20位所示的单链DNA，所述A1-R可为与序列1的第1578-1598位反向互补的单链DNA。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定大豆基因型的方法，所述基因型为GG基因型、GA基因型和AA基因型，所述方法包括如下Ⅰ或Ⅱ或Ⅲ或Ⅳ：
Ⅰ、检测待测大豆基因组中对应于序列表中序列1的第346位的核苷酸，如所述待测大豆基因组中两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测大豆为GG基因型；如所述待测大豆基因组中两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测大豆为AA基因型；如所述待测大豆基因组中两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测大豆为GA基因型；
g1)对应于序列表中序列1的第346位的核苷酸为G；
g2)对应于序列表中序列1的第346位的核苷酸为A；
Ⅱ、如下K1)和K2)：
K1)以待测大豆基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
K2)检测步骤K1)得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物确定大豆基因型：
所述PCR产物对应于序列1的第346位为G的所述待测大豆的基因型为GG基因型；所述PCR产物对应于序列1的第346位为G和A的所述待测大豆的基因型为GA基因型；所述PCR产物对应于序列1的第346位为A的所述待测大豆的基因型为AA基因型；
Ⅲ、如下L1)和L2)：
L1)以待测大豆基因组DNA为模板，采用名称为A2的引物对进行PCR扩增得到PCR产物；所述A2由名称分别为A2-F和A2-R的两条单链DNA组成，所述A2-F和所述A2-R的序列分别为序列表中序列3和4；
L2)检测所述PCR产物，根据所述PCR产物确定大豆基因型：所述PCR产物对应于序列1的第346位为G的所述待测大豆的基因型为GG基因型；所述PCR产物对应于序列1的第346位为G和A的所述待测大豆的基因型为GA基因型；所述PCR产物对应于序列1的第346位为A的所述待测大豆的基因型为AA基因型；
Ⅳ、如下M1)和M2)：
M1)以待测大豆基因组DNA为模板，采用所述A2进行PCR扩增得到PCR产物，利用限制性内切酶Taq I对所述PCR产物进行酶切，得到酶切产物；
M2)检测所述酶切产物的大小，根据所述酶切产物的大小确定大豆基因型：如所述酶切产物的含有大小为158bp的条带，所述待测大豆为GG基因型大豆，如所述酶切产物含有大小分别为158、20和138bp的条带，所述待测大豆为GA基因型大豆，如所述酶切产物含有大小为20和138bp的条带，所述待测大豆为AA基因型大豆。
利用所述A1进行PCR扩增体系可为：DNA模板，4μl(30ng/μl)；KOD-Plus-Neo，0.4μl；10×Buffer，3.0μl；2.0mM dNTPs，3.0μl；25mM)MgSO4，1.8μl；10μM A1-F，1.0μl；10μMA1-R，1.0μl；ddH2O，15.8μl；总体积为30μl。其中，KOD-Plus-Neo和10×Buffer分别可为北京百灵克生物科技有限责任公司产品。
利用所述A1进行PCR扩增PCR反应程序可为：先94℃5min；然后94℃30S，55℃30S，72℃30S，36个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。
利用所述A2进行PCR扩增体系可为：DNA模板4μl(20ng/μl)；Easy Taq DNAPolymerase 0.3μl；10×Easy Taq Buffer 3μl；2.5mM dNTPs 2.5μl；A2-F 3.0μl(2μM)；A2-R 3.0μl(2μM)；ddH2O补足至30μl。其中，Easy Taq DNA Polymerase酶和10×Easy TaqBuffer均为北京全式金生物技术有限公司产品。
利用所述A2进行PCR扩增的反应程序可为：先94℃5min；然后94℃30S，55℃30S，72℃30S，36个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测大豆种子营养价值的方法，所述方法包括：利用所述鉴定大豆基因型的方法检测待测大豆的基因型，GG基因型大豆种子营养价值低于或候选低于GA基因型大豆；GG基因型大豆种子营养价值低于或候选低于AA基因型大豆；GA基因型大豆种子营养价值低于或候选低于AA基因型大豆。
上述方法中，所述大豆种子营养价值可体现在a1)、a2)、a3)或a4)上：
a1)大豆种子含硫氨酸的含量；
a2)大豆种子蛋白中11S球蛋白与7S球蛋白含量的比值；
a3)大豆种子蛋白中11S球蛋白含量；
a4)大豆种子蛋白中7S球蛋白含量。
含硫氨酸含量越高的大豆种子营养价值越高，含硫氨酸含量越低的大豆种子营养价值越低。GG基因型大豆种子的含硫氨酸含量低于或候选低于GA基因型大豆；GG基因型大豆种子的含硫氨酸含量低于或候选低于AA基因型大豆；GA基因型大豆种子的含硫氨酸含量低于或候选低于AA基因型大豆。
含硫氨酸的含量也可体现在大豆种子蛋白中11S球蛋白与7S球蛋白含量的比值上。将大豆种子蛋白中11S球蛋白与7S球蛋白含量的比值记为11S/7S比值。11S/7S比值越高的大豆种子含硫氨酸含量越高，11S/7S比值越低的大豆种子含硫氨酸含量越低；大豆种子蛋白中11S球蛋白含量越高含硫氨酸含量越高，大豆种子蛋白中11S球蛋白含量越低含硫氨酸含量越低；大豆种子蛋白中7S球蛋白含量越高含硫氨酸含量越低，大豆种子蛋白中7S球蛋白含量越低含硫氨酸含量越高。11S/7S比值越高的大豆种子营养价值越高，11S/7S比值越低的大豆种子营养价值越低；大豆种子蛋白中11S球蛋白含量越高营养价值越高，大豆种子蛋白中11S球蛋白含量越低营养价值越低；大豆种子蛋白中7S球蛋白含量越高营养价值越低，大豆种子蛋白中7S球蛋白含量越低营养价值越高。
GG基因型大豆种子的11S/7S比值低于或候选低于GA基因型大豆；GG基因型大豆种子的11S/7S比值低于或候选低于AA基因型大豆；GA基因型大豆种子的11S/7S比值低于或候选低于AA基因型大豆。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一产品：
H1)所述A1；
H2)所述A2；
H3)成套试剂，由所述A2和限制性内切酶Taq I组成。
所述产品的用途可为I1)-I5)中的任一种：
I1)检测大豆基因型；
I2)检测大豆种子营养价值；
I3)检测大豆种子含硫氨酸含量；
I4)检测大豆种子中11S球蛋白和/或7S球蛋白含量；
I5)检测大豆种子中11S球蛋白与7S球蛋白含量的比值。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
X1)所述大豆分子标记在检测大豆种子营养价值中的应用；
X2)所述大豆分子标记在检测大豆种子含硫氨酸含量中的应用；
X3)所述大豆分子标记在检测大豆种子中11S球蛋白和/或7S球蛋白含量中的应用；
X4)所述大豆分子标记在检测大豆种子中11S球蛋白与7S球蛋白含量的比值中的应用；
X5)所述大豆分子标记在大豆育种中的应用；
X6)所述鉴定大豆基因型的方法在检测大豆种子营养价值中的应用；
X7)所述鉴定大豆基因型的方法在制备检测大豆种子营养价值产品中的应用；
X8)所述鉴定大豆基因型的方法在检测大豆种子含硫氨酸含量中的应用；
X9)所述鉴定大豆基因型的方法在制备检测大豆种子含硫氨酸含量产品中的应用；
X10)所述鉴定大豆基因型的方法在检测大豆种子中11S球蛋白和/或7S球蛋白含量中的应用；
X11)所述鉴定大豆基因型的方法在制备检测大豆种子中11S球蛋白和/或7S球蛋白含量产品中的应用；
X12)所述鉴定大豆基因型的方法在检测大豆种子中11S球蛋白与7S球蛋白含量的比值中的应用；
X13)所述鉴定大豆基因型的方法在制备检测大豆种子中11S球蛋白与7S球蛋白含量的比值产品中的应用；
X14)所述鉴定大豆基因型的方法在大豆育种中的应用；
X15)所述产品在检测大豆基因型中的应用；
X16)所述产品在检测大豆种子营养价值中的应用；
X17)所述产品在检测大豆种子含硫氨酸含量中的应用；
X18)所述产品在检测大豆种子中11S球蛋白和/或7S球蛋白含量中的应用；
X19)所述产品在检测大豆种子中11S球蛋白与7S球蛋白含量的比值中的应用；
X20)所述产品在大豆育种中的应用。
本发明还提供了大豆育种方法，所述方法包括：按照所述鉴定大豆基因型的方法鉴定大豆的基因型，选择AA或GA基因型的大豆作为亲本进行育种。
本发明中，所述含硫氨酸可为蛋氨酸和/或半胱氨酸。
本发明中，所述大豆可选自中黄608与其他大豆的杂种后代中的F2及其以后世代的家系。
所述其他大豆可为登科1号。
本发明中，所述7S球蛋白含量可为α、α'和β三个亚基的含量。所述11S球蛋白含量可为A3、Acidic和Basic三个亚基的含量。所述11S/7S比值可为A3、Acidic和Basic三个亚基的含量与α、α'和β三个亚基的含量的比值。
实验证明，大豆种子蛋白中，GG基因型11S/7S比值均为1.76，GA基因型大豆11S/7S比值平均为1.91，AA基因型大豆11S/7S比值平均为2.46，GG基因型大豆种子蛋白中11S/7S比值均显著低于GA基因型和AA基因型，GA基因型大豆种子蛋白中11S/7S比值显著低于AA基因型。表明，大豆的这三种基因型与种子蛋白中11S/7S比值有关，可通过检测本发明的大豆分子标记和相应的基因型检测种子蛋白中11S/7S比值。前人研究表明大豆7S球蛋白和11S球蛋白呈显著负相关关系，当7S球蛋白含量的降低时，11S球蛋白含量增加，进而含硫氨基酸含量增加，所以利用本发明的大豆分子标记还可以有效鉴定7S球蛋白含量低和含硫氨基酸含量高的材料。在育种中，检测11S/7S比值可以有助于筛选含硫氨基酸含量高的材料，以提高大豆的营养价值。
附图说明
图1为中品661和中黄608种子总蛋白的SDS-PAGE电泳结果。
图2为F2代中部分植株的结果。
图3为F2代中部分植株的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的大豆中黄608在国家农作物种质库(网址：http://www.cgris.net)的统一编号为ZDD27366。
下述实施例中的大豆登科1号是由2009年国家审定品种，品种审定编号：国审豆2009001。
实施例1、大豆种子中含硫氨基酸含量的检测
本实施例利用大豆分子标记检测大豆种子含硫氨基酸含量，该大豆分子标记为以大豆的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行扩增得到的DNA分子；A1由名称分别为A1-F和A1-R的两条单链DNA组成，A1-F为序列1的第1-20位所示的单链DNA，A1-R为与序列1的第1578-1598位反向互补的单链DNA。该大豆分子标记的多态性为大豆基因组中对应于序列1的序列为序列1或序列2，序列1的第346位为G，序列2的第346位为A，序列1和序列2除第346位不同外，其余序列均相同。
据此，将大豆分为不同的基因型，如大豆基因组中两条染色体均为下述g1)的染色体，大豆为GG基因型；如大豆基因组中两条染色体均为下述g2)的染色体，大豆为AA基因型；如大豆基因组中两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，大豆为GA基因型；
g1)对应于序列表中序列1的第346位的核苷酸为G；
g2)对应于序列表中序列1的第346位的核苷酸为A。
1、待测大豆：
大豆中品661；大豆中黄608；大豆登科1号；大豆中黄608与大豆登科1号的F2代(大豆中黄608与大豆登科1号杂交得到F1代，F1代自交得到F2代)中随机选取的200个单株。
2、基因型的检测
提取各待测大豆种子的基因组DNA，利用如下方法检测基因型：
2.1利用引物对A1检测待测大豆的基因型
利用引物对A1对待测大豆的基因组DNA进行PCR扩增，检测待测大豆的基因型。
PCR扩增体系为：DNA模板，4μl(30ng/μl)；KOD-Plus-Neo，0.4μl；10×Buffer，3.0μl；2.0mM dNTPs，3.0μl；25mM MgSO4，1.8μl；10μM A1-F，1.0μl；10μM A1-R，1.0μl；ddH2O，15.8μl；总体积为30μl。其中，KOD-Plus-Neo和10×Buffer分别为北京百灵克生物科技有限责任公司产品。
PCR反应程序：先94℃5min；然后94℃30S，55℃30S，72℃30S，36个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。
PCR结束后，将各待测大豆的PCR产物进行测序，确定各待测大豆的基因型，结果如表2所示。
2.2利用引物对A2和限制性内切酶Taq I检测待测大豆的基因型
根据大豆分子标记设计引物对A2，A2由名称分别为A2-F(序列为5'-TCTCATTTGGCATTGCGTATCG-3'，序列表中序列3)和A2-R(序列为5'-TTGACCTTCTTCGCATTC-3'，序列表中序列4)的两条单链DNA组成。当利用引物对A2对GG基因型大豆进行扩增时，得到的PCR产物的序列不含有限制性内切酶Taq I的识别序列(T↓CGA，下划线处为突变碱基，↓表示酶切位置)，不能被Taq I切开；而为T(突变型2)可以形成限制性内切酶Taq I的识别序列，因此可以被Taq I切开。
利用上述原理先用引物对A1对待测大豆的基因组DNA进行PCR扩增，然后利用限制性内切酶Taq I对PCR扩增的产物进行酶切，并对酶切产物进行检测，如酶切产物的含有大小为158bp的条带，待测大豆为GG基因型大豆，如酶切产物含有大小分别为158、20和138bp的条带，待测大豆为GA基因型大豆，如酶切产物含有大小为20和138bp的条带，待测大豆为AA基因型大豆。
PCR反应扩增体系：DNA模板4μl(20ng/μl)；Easy Taq DNA Polymerase 0.3μl；10×Easy Taq Buffer 3μl；2.5mM dNTPs 2.5μl；A2-F 3.0μl(2μM)；A2-R 3.0μl(2μM)；ddH2O补足至30μl。其中，Easy Taq酶和10×Easy Taq Buffer均为北京全式金生物技术有限公司产品。。
PCR反应程序：先94℃5min；然后94℃30S，55℃30S，72℃30S，36个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。
酶切体系：PCR扩增产物1μg；限制性内切酶Taq I 1μl；10×NEBuffer 5μl；ddH2O补至总体积为50μl。与待酶切的DNA量相比，确保酶切体系中Taq I酶的用量充足。酶切条件：65℃温浴1h；反应结束后，80℃温浴20min终止酶切反应。
将酶切产物再次进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，然后根据电泳结果确定待测大豆的基因型，结果发现，利用该方法确定的待测大豆的基因型与步骤2.1的结果完全相同。
3、大豆种子7S球蛋白含量的检测
提取各待测大豆种子总蛋白，然后将得到的总蛋白进行SDS-PAGE(图1-3)，然后利用Quantity One软件定量分析SDS-PAGE结果中的目的条带以确定种子中7S球蛋白亚基α、α'、β以及11S球蛋白亚基A3、Acidic、Basic的含量(表1)，计算11S/7S比值(表2)，11S/7S比值＝(α的含量+α'的含量+β的含量)/(A3的含量+Acidic的含量+Basic的含量)。利用Band分析，数据单位为OD*mm。
表2、11S球蛋白三个蛋白亚基和7S球蛋白三个蛋白亚基的检测结果(OD*mm)
Figure GDA0003295445280000071
Figure GDA0003295445280000081
根据表2可得到，大豆种子蛋白中，GG基因型11S/7S比值平均为1.76，GA基因型大豆11S/7S比值平均为1.91，AA基因型大豆11S/7S比值平均为2.46。结果显示，GG基因型大豆种子蛋白中11S/7S比值均显著低于GA基因型和AA基因型，GA基因型大豆种子蛋白中11S/7S比值显著低于AA基因型。表明，大豆的这三种基因型与种子蛋白中11S/7S比值有关，可通过检测本发明的大豆分子标记和相应的基因型检测种子蛋白中11S/7S比值。前人研究表明大豆7S球蛋白和11S球蛋白呈显著负相关关系，当7S球蛋白含量的降低时，11S球蛋白含量增加，进而含硫氨基酸含量增加，所以利用本发明的大豆分子标记还可以有效鉴定7S球蛋白含量低和含硫氨基酸含量高的材料。在育种中，检测11S/7S比值可以有助于筛选含硫氨基酸含量高的材料，以提高大豆的营养价值。
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 大豆分子标记及其在检测大豆种子营养价值中的应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1598
<212> DNA
<213> 大豆
<400> 1
agcccaaaac attcaccaac tcaacccatc atgagcccac acatttgttg tttctaaccc 60
aacctcaaac tcgtattctc ttccgccacc tcatttttgt ttatttcaac acccgtcaaa 120
ctgcatgcca ccccgtggcc aaatgtccat gcatgttaac aagacctatg actataaata 180
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attaaagaat ttaagatata ctatgatgag agcgcggttc ccattactgt tgctgggagt 300
tgttttcctg gcatcagttt ctgtctcatt tggcattgcg tattgggaaa agcagaaccc 360
cagtcacaac aagtgcctcc gaagttgcaa tagcgagaaa gactcctaca ggaaccaagc 420
atgccacgct cgttgcaacc tccttaaggt ggaggaagaa gaagaatgcg aagaaggtca 480
aattccacga ccacgaccac aacacccgga gagggaacgt cagcaacacg gtgagaagga 540
ggaagacgaa ggtgagcagc cacgtccatt cccattccca cgcccacgcc aacctcatca 600
agaggaagag cacgagcaga aggaggaaca cgaatggcat cgcaaggagg aaaaacacgg 660
aggaaaggga agtgaagagg aacaagatga acgtgaacac ccacgcccac accaacctca 720
tcaaaaggaa gaggaaaagc acgaatggca acacaagcag gaaaagcacc aaggaaagga 780
aagtgaagaa gaagaagaag accaagacga ggatgaggag caagacaaag agagccaaga 840
aagtgaaggt tctgagtctc aaagagaacc acgaagacat aagaataaga acccttttca 900
cttcaactct aaaaggttcc aaactctctt caaaaaccaa tatggccacg ttcgcgtcct 960
ccagaggttc aacaaacgct cccaacagct tcagaatctc cgagactacc gcattttgga 1020
gttcaactcc aaacccaaca cccttcttct cccccaccat gctgacgctg attacctcat 1080
cgttatcctt aacggttagt attcctttcc tctcaaaata aaataaatgt cattatttta 1140
tgcggattaa gaaaaattat taaataaata aaaacaaaac caacaatttt ataaaaacta 1200
atcttactat gacacttatt taattaatta ataaacatca tcacatgctt ttacttctca 1260
taaaattatg ttattgaatt tgttttgtta attacaggga ctgccattct taccttggtg 1320
aacaacgacg accgagactc ttacaacctt caatctggcg atgccctaag agtccctgca 1380
ggaaccacat actatgtggt taaccctgac aacgacgaga atctcagaat gataacactc 1440
gccatacccg ttaacaaacc cggtagattt gaggtactac ttattcttta taactaatta 1500
attaattatt attctaattt gtttccaaat cttaagatca atctttttct tttctctgca 1560
gagtttcttc ctatctagca ctcaagctca acagtcct 1598
<210> 2
<211> 1598
<212> DNA
<213> 大豆
<400> 2
agcccaaaac attcaccaac tcaacccatc atgagcccac acatttgttg tttctaaccc 60
aacctcaaac tcgtattctc ttccgccacc tcatttttgt ttatttcaac acccgtcaaa 120
ctgcatgcca ccccgtggcc aaatgtccat gcatgttaac aagacctatg actataaata 180
tctgcaatct cggcccaggt tttcatcatc aagaaccagt tcaatatcct agtacaccgt 240
attaaagaat ttaagatata ctatgatgag agcgcggttc ccattactgt tgctgggagt 300
tgttttcctg gcatcagttt ctgtctcatt tggcattgcg tattgagaaa agcagaaccc 360
cagtcacaac aagtgcctcc gaagttgcaa tagcgagaaa gactcctaca ggaaccaagc 420
atgccacgct cgttgcaacc tccttaaggt ggaggaagaa gaagaatgcg aagaaggtca 480
aattccacga ccacgaccac aacacccgga gagggaacgt cagcaacacg gtgagaagga 540
ggaagacgaa ggtgagcagc cacgtccatt cccattccca cgcccacgcc aacctcatca 600
agaggaagag cacgagcaga aggaggaaca cgaatggcat cgcaaggagg aaaaacacgg 660
aggaaaggga agtgaagagg aacaagatga acgtgaacac ccacgcccac accaacctca 720
tcaaaaggaa gaggaaaagc acgaatggca acacaagcag gaaaagcacc aaggaaagga 780
aagtgaagaa gaagaagaag accaagacga ggatgaggag caagacaaag agagccaaga 840
aagtgaaggt tctgagtctc aaagagaacc acgaagacat aagaataaga acccttttca 900
cttcaactct aaaaggttcc aaactctctt caaaaaccaa tatggccacg ttcgcgtcct 960
ccagaggttc aacaaacgct cccaacagct tcagaatctc cgagactacc gcattttgga 1020
gttcaactcc aaacccaaca cccttcttct cccccaccat gctgacgctg attacctcat 1080
cgttatcctt aacggttagt attcctttcc tctcaaaata aaataaatgt cattatttta 1140
tgcggattaa gaaaaattat taaataaata aaaacaaaac caacaatttt ataaaaacta 1200
atcttactat gacacttatt taattaatta ataaacatca tcacatgctt ttacttctca 1260
taaaattatg ttattgaatt tgttttgtta attacaggga ctgccattct taccttggtg 1320
aacaacgacg accgagactc ttacaacctt caatctggcg atgccctaag agtccctgca 1380
ggaaccacat actatgtggt taaccctgac aacgacgaga atctcagaat gataacactc 1440
gccatacccg ttaacaaacc cggtagattt gaggtactac ttattcttta taactaatta 1500
attaattatt attctaattt gtttccaaat cttaagatca atctttttct tttctctgca 1560
gagtttcttc ctatctagca ctcaagctca acagtcct 1598
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
tctcatttgg cattgcgtat cg 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
ttgaccttct tcgcattc 18

Claims (14)

1.大豆分子标记，以大豆的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行扩增得到的DNA分子，其序列为序列1或序列2；所述A1由名称分别为A1-F和A1-R的两条单链DNA组成，所述A1-F为与大豆基因组中序列1的第346位上游特异结合的单链DNA，所述A1-R为与大豆基因组中序列1的第346位下游特异结合的单链DNA。
2.根据权利要求1所述的大豆分子标记，其特征在于：所述A1-F为序列1的第1-20位所示的单链DNA，所述A1-R为与序列1的第1578-1598位反向互补的单链DNA。
3.根据权利要求1或2所述大豆分子标记，其特征在于：所述大豆选自中黄608与其他大豆的杂种后代中的F2及其以后世代的家系。
4.鉴定大豆基因型的方法，所述基因型为GG基因型、GA基因型和AA基因型，所述方法包括如下Ⅰ或Ⅱ或Ⅲ或Ⅳ：
Ⅰ、检测待测大豆基因组中对应于序列表中序列1的第346位的核苷酸，如所述待测大豆基因组中两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测大豆为GG基因型；如所述待测大豆基因组中两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测大豆为AA基因型；如所述待测大豆基因组中两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测大豆为GA基因型；
g1)对应于序列表中序列1的第346位的核苷酸为G；
g2)对应于序列表中序列1的第346位的核苷酸为A；
Ⅱ、如下K1)和K2)：
K1)以待测大豆基因组DNA为模板，采用引物对A1进行PCR扩增得到PCR产物；所述引物对A1由名称分别为A1-F和A1-R的两条单链DNA组成，所述A1-F为序列1的第1-20位所示的单链DNA，所述A1-R为与序列1的第1578-1598位反向互补的单链DNA；
K2)检测步骤K1)得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物确定大豆基因型：
所述PCR产物对应于序列1的第346位为G的所述待测大豆的基因型为GG基因型；所述PCR产物对应于序列1的第346位为G和A的所述待测大豆的基因型为GA基因型；所述PCR产物对应于序列1的第346位为A的所述待测大豆的基因型为AA基因型；
Ⅲ、如下L1)和L2)：
L1)以待测大豆基因组DNA为模板，采用名称为A2的引物对进行PCR扩增得到PCR产物；所述A2由名称分别为A2-F和A2-R的两条单链DNA组成，所述A2-F和所述A2-R的序列分别为序列表中序列3和4；
L2)检测所述PCR产物，根据所述PCR产物确定大豆基因型：所述PCR产物对应于序列1的第346位为G的所述待测大豆的基因型为GG基因型；所述PCR产物对应于序列1的第346位为G和A的所述待测大豆的基因型为GA基因型；所述PCR产物对应于序列1的第346位为A的所述待测大豆的基因型为AA基因型；
Ⅳ、如下M1)和M2)：
M1)以待测大豆基因组DNA为模板，采用所述A2进行PCR扩增得到PCR产物，利用限制性内切酶Taq I对所述PCR产物进行酶切，得到酶切产物；
M2)检测所述酶切产物的大小，根据所述酶切产物的大小确定大豆基因型：如所述酶切产物的含有大小为158bp的条带，所述待测大豆为GG基因型大豆，如所述酶切产物含有大小分别为158、20和138bp的条带，所述待测大豆为GA基因型大豆，如所述酶切产物含有大小为20和138bp的条带，所述待测大豆为AA基因型大豆。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于：所述大豆选自中黄608与其他大豆的杂种后代中的F2及其以后世代的家系。
6.检测大豆种子营养价值的方法，包括：利用权利要求4所述的方法检测待测大豆的基因型，GG基因型大豆种子营养价值低于或候选低于GA基因型大豆；GG基因型大豆种子营养价值低于或候选低于AA基因型大豆；GA基因型大豆种子营养价值低于或候选低于AA基因型大豆。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述大豆种子营养价值体现在a1)、a2)、a3)或a4)上：
a1)大豆种子含硫氨酸的含量；
a1)大豆种子蛋白中11S球蛋白与7S球蛋白含量的比值；
a2)大豆种子蛋白中11S球蛋白含量；
a3)大豆种子蛋白中7S球蛋白含量。
8.根据权利要求6或7所述方法，其特征在于：所述大豆选自中黄608与其他大豆的杂种后代中的F2及其以后世代的家系。
9.下述任一应用：
X1)权利要求1或2所述大豆分子标记在检测大豆种子营养价值中的应用；
X2)权利要求1或2所述大豆分子标记在检测大豆种子含硫氨酸含量中的应用；
X3)权利要求1或2所述大豆分子标记在检测大豆种子中11S球蛋白和/或7S球蛋白含量中的应用；
X4)权利要求1或2所述大豆分子标记在检测大豆种子中11S球蛋白与7S球蛋白含量的比值中的应用；
X5)权利要求1或2所述大豆分子标记在大豆育种中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于：所述大豆选自中黄608与其他大豆的杂种后代中的F2及其以后世代的家系。
11.下述任一应用：
X6)权利要求4所述方法在检测大豆种子营养价值中的应用；
X7)权利要求4所述方法在制备检测大豆种子营养价值产品中的应用；
X8)权利要求4所述方法在检测大豆种子含硫氨酸含量中的应用；
X9)权利要求4所述方法在制备检测大豆种子含硫氨酸含量产品中的应用；
X10)权利要求4所述方法在检测大豆种子中11S球蛋白和/或7S球蛋白含量中的应用；
X11)权利要求4所述方法在制备检测大豆种子中11S球蛋白和/或7S球蛋白含量产品中的应用；
X12)权利要求4所述方法在检测大豆种子中11S球蛋白与7S球蛋白含量的比值中的应用；
X13)权利要求4所述方法在制备检测大豆种子中11S球蛋白与7S球蛋白含量的比值产品中的应用；
X14)权利要求4所述方法在大豆育种中的应用。
12.根据权利要求11所述应用，其特征在于：所述大豆选自中黄608与其他大豆的杂种后代中的F2及其以后世代的家系。
13.大豆育种方法，包括：按照权利要求4所述的方法鉴定大豆的基因型，选择AA或GA基因型的大豆作为亲本进行育种。
14.根据权利要求13所述方法，其特征在于：所述大豆选自中黄608与其他大豆的杂种后代中的F2及其以后世代的家系。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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大豆蛋白质相关基因SNP的开发和遗传定位;蔡春梅 等;《延边大学农学学报》;20090630;第31卷(第2期);第77-83页 *

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