CN108504688A - 调控***基因在肝脏肿瘤细胞中特异性表达的操纵*** - Google Patents

调控***基因在肝脏肿瘤细胞中特异性表达的操纵*** Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术，具体公开了一种调控***基因在肝脏肿瘤细胞中特异性表达的操纵***，包括：(1)由AFP启动子驱动表达的Cre重组酶基因；(2)由SURV启动子驱动表达的***基因；所述SURV启动子与所述***基因之间***一段LoxP‑Stop‑LoxP序列，Stop为转录终止序列，LoxP为Cre重组酶的特异性识别序列。本发明利用了AFP启动子在肝癌HepG2细胞里驱动Cre重组酶的表达，Cre重组酶将两个LoxP之间的转录终止序列Stop剪切出去，使得肿瘤特异性的SURV启动子可以直接驱动TK/GCV的表达，特异性诱导肝脏肿瘤细胞凋亡而不损伤体内其他任何别的类型的细胞。

Description

调控***基因在肝脏肿瘤细胞中特异性表达的操纵***
技术领域
本发明属于生物技术，具体地说，涉及一种调控***基因在肝脏肿瘤细胞中高效特异性表达的操纵***。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的发病率和疾病相关的死亡率分别位列全球癌症调查的第6位和第3位，每年全球70万新发肝癌病例中有超过55％在我国，未经治疗的患者通常在明确诊断后3～6个月内死亡。肝切除和肝移植是目前最主要的HCC根治性治疗手段，然而，切缘阴性的肝切除患者仍有40％会在手术后一年内复发；即使遵循最严格的选择标准(即米兰标准：单发肿瘤直径≤5cm，或多发肿瘤数目≤3个且最大直径≤3cm，无大血管浸润或肝外转移)仍有超过10％患者在手术后1年内复发，并继而导致几乎所有复发患者的死亡。当肿瘤体积较大、侵犯血管或多发转移，超出外科有效根治标准时，非手术治疗也不尽人意；化学治疗联合立体定向放疗在过去几年内虽有所成效，但因不能精确控制放疗剂量，增加了肝脏和黏膜组织伤害，远难达到根治效果。
近10年来，随着分子生物学和基因工程技术进展，基因治疗开启肿瘤治疗领域研究的新热点，成为恶性肿瘤非手术治疗的主导方向。其中，以腺病毒为载体的胸苷激酶***基因***(Thymidine kinase/Ganciclovir,TK/GCV)研究开展的最早也最为广泛，多项动物实验和临床研究表明该***有望成为肝癌治疗的有效选择。但是，腺病毒的自我复制特性和靶向细胞的不可控性，却限制了该体系在临床中的有效应用。
不仅如此，肝癌***基因治疗多数处于动物和临床试验阶段，制约其推广的主要问题在于安全性和有效性，包括治疗基因表达的选择性不高，针对肝癌细胞的靶向性不强，***基因或载体本身对正常肝细胞会产生毒副作用等。
因此，急需开发一种可特异性靶向肝癌细胞并可高效调控***基因表达的操纵***。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种调控***基因在肝脏肿瘤细胞中特异性表达的操纵***。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种调控***基因在肝脏肿瘤细胞中特异性表达的操纵***，所述***包括：
(1)由AFP(甲胎蛋白)启动子驱动表达的Cre重组酶基因；
(2)由SURV(生存素，Survivin)启动子驱动表达的***基因；所述SURV启动子与所述***基因之间***一段LoxP-Stop-LoxP序列，LoxP为Cre重组酶的特异性识别序列，Stop为一种转录终止序列(也可称为终止码)，当其被SURV启动子驱动表达时，其将阻遏其下游的***基因表达。
当在Cre重组酶作用下，通过同源重组机制删除其特异性识别位点之间的转录终止序列Stop，从而解除Stop序列对SURV启动子驱动的转录过程的阻遏作用，可使其下游的***基因在SURV启动子的驱动下，在肝脏肿瘤细胞中特异性高效表达。
作为优选，本发明采用TK基因作为所述***基因。
本发明所述的AFP启动子、Cre重组酶基因、SURV启动子、LoxP、Stop、TK基因均为本领域已知的基因元件。本发明对现有技术的贡献并不在于改变了这些元件本身的序列或性质，而是提出了一种新的组装策略，得到了一种高特异性靶向肝癌细胞，并可实现精准调控的操纵***。
需要说明的是，所述***可以多种形式体现，例如，以载体组合的形式体现。
具体地说，所述***包括两个rAAV(重组腺相关病毒)载体：
其一，含有HCC特异性表达的AFP启动子元件，以及可被AFP启动子驱动表达的Cre重组酶基因；命名为rAAV-AFP-Cre；
其二，含有SURV启动子元件，以及可被SURV启动子驱动表达的LoxP-Stop-LoxP-TK/GCV表达框，其中，LoxP-Stop-LoxP位于TK/GCV的上游，命名为rAAV-SURV-LoxP-Stop-LoxP-TK。
所述载体均以AAV(腺相关病毒)作为出发载体，采用基因工程的常规技术手段将所述元件/表达框***其中。
本发明通过流式细胞技术验证上述两种rAAV载体共同处理的体外培养HepG2细胞凋亡率和细胞毒性，研究发现当rAAV-AFP-Cre和rAAV-SURV-LoxP-Stop-LoxP-TK同时感染GCV处理的HepG2细胞时，由于AFP启动子在肝癌HepG2细胞里驱动Cre重组酶的表达，Cre的表达将两个LoxP之间的转录终止序列Stop剪切出去，使得肿瘤特异性的SURV启动子可以直接驱动TK/GCV的表达，特异性诱导肝脏肿瘤细胞凋亡而不损伤体内其他任何别的类型的细胞，初步证实了转染高效、方法稳定、可操作、可重复。
进一步地，本发明通过建立人HCC皮下种植瘤裸鼠模型，并由尾静脉注射两种rAVV载体***，进一步研究其对实验模型HCC种植瘤的凋亡率、抑瘤率和模型生存状况、以及正常细胞和组织的损害程度，进一步验证该***的稳定性、有效性和安全性，为实现转化医学及HCC精准***基因治疗提供理论依据和应用基础研究。
第二方面，基于上述研究发现，本发明提供了前述***在制备***药物方面的应用。
所述肿瘤优选为肝癌；所述药物特异性靶向肝癌HepG2细胞，因此针对肝癌HepG2细胞具有格外明显的促细胞凋亡效果。
第三方面，本发明提供了含有上述***的药物、试剂和试剂盒。
即利用了上述***的高特异性靶向肝癌细胞的特点，以及利用了上述***的高效调控TK基因的表达的特点，而以药物、试剂或试剂盒的形式生产得到的产品，均属于本发明的保护范围。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
本发明的有益效果至少在于：
本发明与以往肝细胞癌***基因治疗比较，眼于临床肝癌治疗效果不佳和晚期肝癌治疗方法匮乏，原创性整合现有成熟的病毒载体、基因敲除体系、特异性启动子驱动诱导肝癌细胞凋亡和模型动物抗癌效应。
本发明利用rAAV缺乏自我复制能力和嗜肝细胞的特性，设计携载***基因***的rAAV载体防范***基因治疗泛化；利用肝癌特异性启动子驱动Cre重组酶精准敲除，剪接LoxP序列中***的Stop序列，调节下游TK基因表达，控制其高度选择性表达。
本发明在既往肿瘤***基因理论基础上，将***基因置于含由转录终止序列的LoxP阅读窗的下游，依赖AFP驱动的Cre重组酶剪接方能转录表达、发挥抗癌效应，是***基因理论在特异性、调控性方面的创新进展。
本发明与现有肿瘤基因治疗和细胞治疗等技术比较，利用分子生物学、细胞生物学和基因工程技术采用AFP、SURV双启动子分别驱动Cre-LoxP内切酶***，高效性、特异性、可控性、安全性指导HCC治疗，是典型的细胞生物学和基因工程的的交叉学科研究，是转化医学的前期研究，也为肝细胞癌个体化精准医疗及临床肝癌治疗提供理论依据。
附图说明
图1为实施例1中所述的载体图谱，其中，A为rAAV-Survivin-LoxP-Stop-LoxP-TK载体；B为rAAV-AFP-Cre载体。
图2为rAAV-AFP-Cre和rAAV-SURV-LoxP-Stop-LoxP-TK操纵***能驱动TK的表达。
图3为rAAV-AFP-Cre和rAAV-SURV-LoxP-Stop-LoxP-TK操纵***能驱动TK的表达。
图4为rAAV-AFP-Cre/rAAV-SURV-LoxP-Stop-LoxP-TK及对照AOV032分别感染Huh7细胞后，检测TK/GCV的杀伤情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例用于说明本发明所述***的构建。
1、rAAV-Survivin-LoxP-Stop-LoxP-TK载体的构建
根据NCBI公开的信息合成TK基因序列(Gene ID：7083)，并根据SEQ ID NO.1所示序列合成SURV启动子(Survivin)。
分别利用限制性内切酶XbaI和KpnI、与限制性内切酶BamHI和HindIII将SURV启动子和TK基因构建入质粒CN1005(购自和元生物技术(上海)股份有限公司)中，得到rAAV-Survivin-LoxP-Stop-LoxP-TK载体，图谱如图1A所示。
所述酶切及连接方法采用本领域常规手段和条件即可。
2、rAAV-AFP-Cre载体的构建
根据NCBI公开的信息合成AFP启动子(Gene ID：174)和Cre基因序列(Gene ID：2777477)，分别利用限制性内切酶XbaI和BamHI、与限制性内切酶BamH1和Hind3将AFP启动子和Cre基因构建入质粒AOV-021(购自和元生物技术(上海)股份有限公司)中，得到rAAV-AFP-Cre载体，图谱如图1B所示。
实施例2
本实施例用于说明，基于Cre-LoxP重组***原理，rAAV的AFP启动子驱动的Cre重组酶，发挥定点可控性敲除Survivin启动子驱动携载TK***基因中***LoxP开放阅读框的STOP内含子，可以驱使下游***基因TK的表达。
1、将不同MOI的rAAV-AFP-Cre(也称H5312)和rAAV-SURV-LoxP-Stop-LoxP-TK(也称H5315)共同感染HpG2细胞和Huh7细胞，检测TK基因的表达情况。病毒用量如下：1#MOI 1*105，即H5312和H5315病毒各用0.5*105；2#MOI 2*105，即H5312和H5315病毒各用1*105；3#MOI 1*106，即H5312和H5315病毒各用5*105。结果如图2所示，rAAV-AFP-Cre和rAAV-SURV-LoxP-Stop-LoxP-TK操纵***能驱动TK的表达，且表达量与病毒用量呈现依赖关系。
2、将rAAV-AFP-Cre(H5312)、rAAV-SURV-LoxP-Stop-LoxP-TK(H5315)分别感染Huh7细胞。
第一组：单独感染病毒rAAV-AFP-Cre(H5312)，MOI 1*106；第二组：单独感染病毒rAAV-SURV-LoxP-Stop-LoxP-TK(H5315)，MOI 1*106；第三组：共同感染病毒rAAV-AFP-Cre(H5312)和rAAV-SURV-LoxP-Stop-LoxP-TK(H5315)，MOI 1*106即rAAV-AFP-Cre(H5312)和rAAV-SURV-LoxP-Stop-LoxP-TK(H5315)病毒各用5*105；检测TK基因的表达情况。结果如图3所示，rAAV-AFP-Cre和rAAV-SURV-LoxP-Stop-LoxP-TK操纵***能驱动TK的表达。
实施例3
将rAAV-AFP-Cre/rAAV-SURV-LoxP-Stop-LoxP-TK及对照AOV032(购自和元生物技术(上海)股份有限公司)分别感染Huh7细胞，检测TK/GCV的杀伤情况，病毒用量为MOI 5*106，rAAV-AFP-Cre和rAAV-SURV-LoxP-Stop-LoxP-TK病毒各用2.5*106。结果如图4所示，在Huh7细胞中，感染病毒后，在GCV的作用下，细胞存活率随着GCV药物浓度的增加逐渐降低，呈现剂量-效应依赖关系，在GCV2ug/ml和10ug/ml药物浓度作用组，p值小于0.05，具有统计学意义。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 邹卫龙
<120> 调控***基因在肝脏肿瘤细胞中特异性表达的操纵***
<141> 2018-03-02
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3267
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccatattggc caggctggtc tcgaactcct gaccttgtga tctgcccacc tcagcctccc 60
aaagtcctgg gattacaggc gtgagccacc gtgcccagcc tgacccctct gccctttcaa 120
aaactatgtt cgttctctca cagccttctc ttgtcatatt aagtccacac cgcaggccta 180
atttgtccag tgaatgctat gcaaatattt catgcacctg ctgatcgcag gaatgatatg 240
tacttggtac gcactgatcg tacctcgggg tgggagaaga gagggcaagg aagcaaagaa 300
tagccccctc ctttcctggt gcaccttcag atgtgccgat ggggcccagg ctcgctgcag 360
atggccccct tcccagagac aggggaggat cctccaccca ctccccagcc tccaggacca 420
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tgggcacagc acagcagccc caccccaggc agcttgaaat cagagctggg gtccaaaggg 540
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atgcctgtaa tcccagcact ttgggaggct gaggcgggtg gatcacgagg tcaggagttc 960
aataccagcc tggccaagat ggtgaaaccc cgtctctact aaaaatacaa aaaaattagc 1020
cgggcatggt ggcgggcgca tgtaatccca gctactgggg gggctgaggc agagaattgc 1080
tggaacccag gagatggagg ttgcagtgag ccaagattgt gccactgcac tgcactccag 1140
cctggcgaca gagcaagact ctgtctcaaa aaaaaaaaaa aaaagtgaaa aggagttgtt 1200
cctttcctcc ctcctgaggg caggcaactg ctgcggttgc cagtggaggt ggtgcgtcct 1260
tggtctgtgc ctgggggcca ccccagcaga ggccatggtg gtgccagggc ccggttagcg 1320
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gaagttaagt ttcctgattt tgatgattgt gttgtggttg tgtaagagaa tgaagtattt 1440
cggggtagta tggtaatgcc ttcaacttac aaacggttca ggtaaaccac ccatatacat 1500
acatatacat gcatgtgata tatacacata cagggatgtg tgtgtgttca catatatgag 1560
gggagagaga ctaggggaga gaaagtaggt tggggagagg gagagagaaa ggaaaacagg 1620
agacagagag agagcgggga gtagagagag ggaaggggta agagagggag aggaggagag 1680
aaagggagga agaagcagag agtgaatgtt aaaggaaaca ggcaaaacat aaacagaaaa 1740
tctgggtgaa gggtatatga gtattctttg tactattctt gcaattatct tttatttaaa 1800
ttgacatcgg gccgggcgca gtggctcaca tctgtaatcc cagcactttg ggaggccgag 1860
gcaggcagat cacttgaggt caggagtttg agaccagcct ggcaaacatg gtgaaacccc 1920
atctctacta aaaatacaaa aattagcctg gtgtggtggt gcatgccttt aatctcagct 1980
actcgggagg ctgaggcagg agaatcgctt gaacccgtgg cggggaggag gttgcagtga 2040
gctgagatca tgccactgca ctccagcctg ggcgatagag cgagactcag tttcaaataa 2100
ataaataaac atcaaaataa aaagttactg tattaaagaa tgggggcggg gtgggagggg 2160
tggggagagg ttgcaaaaat aaataaataa ataaataaac cccaaaatga aaaagacagt 2220
ggaggcacca ggcctgcgtg gggctggagg gctaataagg ccaggcctct tatctctggc 2280
catagaacca gagaagtgag tggatgtgat gcccagctcc agaagtgact ccagaacacc 2340
ctgttccaaa gcagaggaca cactgatttt ttttttaata ggctgcagga cttactgttg 2400
gtgggacgcc ctgctttgcg aagggaaagg aggagtttgc cctgagcaca ggcccccacc 2460
ctccactggg ctttccccag ctcccttgtc ttcttatcac ggtagtggcc cagtccctgg 2520
cccctgactc cagaaggtgg ccctcctgga aacccaggtc gtgcagtcaa cgatgtactc 2580
gccgggacag cgatgtctgc tgcactccat ccctcccctg ttcatttgtc cttcatgccc 2640
gtctggagta gatgcttttt gcagaggtgg caccctgtaa agctctcctg tctgactttt 2700
tttttttttt tagactgagt tttgctcttg ttgcctaggc tggagtgcaa tggcacaatc 2760
tcagctcact gcaccctctg cctcccgggt tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcccga 2820
gtagttggga ttacaggcat gcaccaccac gcccagctaa tttttgtatt tttagtagag 2880
acaaggtttc accgtgatgg ccaggctggt cttgaactcc aggactcaag tgatgctcct 2940
gcctaggcct ctcaaagtgt tgggattaca ggcgtgagcc actgcacccg gcctgcacgc 3000
gttctttgaa agcagtcgag ggggcgctag gtgtgggcag ggacgagctg gcgcggcgtc 3060
gctgggtgca ccgcgaccac gggcagagcc acgcggcggg aggactacaa ctcccggcac 3120
accccgcgcc gccccgcctc tactcccaga aggccgcggg gggtggaccg cctaagaggg 3180
cgtgcgctcc cgacatgccc cgcggcgcgc cattaaccgc cagatttgaa tcgcgggacc 3240
cgttggcaga ggtggcggcg gcggcat 3267

Claims (9)

1.一种调控***基因在肝脏肿瘤细胞中特异性表达的操纵***，其特征在于，所述***包括：
(1)由AFP启动子驱动表达的Cre重组酶基因；
(2)由SURV启动子驱动表达的***基因；所述SURV启动子与所述***基因之间***一段LoxP-Stop-LoxP序列，Stop为转录终止序列，LoxP为Cre重组酶的特异性识别序列。
2.根据权利要求1所述的***，其特征在于，所述***基因为TK基因。
3.根据权利要求1或2所述的***，其特征在于，所述***包括两个rAAV载体：
其一，含有HCC特异性表达的AFP启动子元件，以及可被AFP启动子驱动表达的Cre重组酶基因；
其二，含有SURV启动子元件，以及可被SURV启动子驱动表达的LoxP-Stop-LoxP-TK/GCV表达框，其中，LoxP-Stop-LoxP位于TK/GCV的上游。
4.权利要求1～3任一项所述的***在制备***药物方面的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物特异性靶向肝癌HepG2细胞。
7.含有权利要求1～3任一项所述***的药物。
8.含有权利要求1～3任一项所述***的试剂。
9.含有权利要求1～3任一项所述***的试剂盒。
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