CN108504670B

CN108504670B - 一种大肠杆菌冷休克助溶型表达质粒的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN108504670B
Application number: CN201810163346.1A
Authority: CN
Inventors: 庞一林; 谭国强; 吕建新; 李江辉; 杜璟; 张涛; 孙倩倩; 韩琴霞
Original assignee: Wenzhou Medical University
Current assignee: Hunan Xiangnong Animal Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2018-02-27
Filing date: 2018-02-27
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2038-02-27
Also published as: CN108504670A

Abstract

本发明涉及一种大肠杆菌助溶型表达质粒的构建方案及应用其制备水溶性异源多肽的方法。所述利用无缝克隆技术构建一类由冷休克基因的启动子控制小分子泛素相关修饰蛋白(SUMO)与外源基因融合表达的冷休克助溶型表达质粒。将一种嵌合型半胱氨酸脱硫酶克隆至本发明所述质粒，相对公知的pCold I和pET28系列质粒，重组蛋白的水溶性、稳定性及酶活性明显提高。而相对公知的pCold TF质粒，SUMO不会影响目的蛋白空间构象。按Ulp1蛋白酶与重组蛋白为1U:0.5‑1mg的比例，在25℃，酶切1h，SUMO标签的切割效率大于95％，非常适用于生物工程制药业及结构生物学等研究领域制备具有天然N端的蛋白质。

Description

一种大肠杆菌冷休克助溶型表达质粒的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌冷休克助溶型表达质粒的构建方法及其应用的具体实施方案，属于生物工程技术领域。

背景技术

大肠杆菌表达***作为最常用的重组蛋白表达***，具有快速、技术成熟、经济实惠、高产量和菌株遗传背景清楚的特色。据统计，目前世界范围内，已发表文献中涉及重组蛋白表达的超过60％采用大肠杆菌进行表达，将近30％的药用蛋白采用大肠杆菌表达***生产。但是，采用大肠杆菌表达真核生物蛋白时，大概只有30％的克隆基因可以在大肠杆菌中以可溶性形式表达，其它的则容易被大肠杆菌蛋白酶降解、形成包涵体或无法表达。包涵体可采用体外复性方法使其变为可溶性蛋白，但该方法操作流程复杂、费时费力，额外增加了蛋白纯化成本。为了解决上述问题，目前科研工作者已摸索出了多种方法用于提高重组蛋白在大肠杆菌体内的可溶性表达。主要包括：

1、与分子伴侣、二硫键异构酶等共表达(详见表1)；

2、借助谷胱甘肽-S-转移酶、硫氧还蛋白和折叠酶等融合标签(详见表1)；

3、改变培养条件，比如冷休克表达(冷休克诱导的异源多肽的表达和生产.M·恩诺耶，S·普哈德塔雷，B·夏，G·晴，H·柯.ZL 03804917.1)、在培养基中添加一些有助于外源蛋白质正确构象折叠的成份(如甜菜碱、山梨醇等)或通过后期控制补料的供给速度来控制蛋白的合成速度(一种有效改善重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法.魏国祥，杨雪宁，郑春阳.ZL 201310517277.7)；

4、以分泌蛋白的方式提高目的蛋白的可溶性(SecB介导的翻译后靶向途径的功能构建及其应用.刁刘洋，周佳海，杨晟，罗兰·佛洛德尔.ZL 201110458204.6)；

5、采用定向进化技术筛选水溶性/折叠强的蛋白突变体(用于筛选蛋白可溶性表达的T载体及其构建方法和应用.范军，张宽亮，魏玲玲.ZL 201010204681.5)。

此外，随着无缝克隆和Gateway等高效分子克隆技术的发明，可以将一个目的基因同时***到多个表达载体中，然后从中筛选出表达该目的基因的最佳表达载体。

表1.常见的分子伴侣或助溶性标签融合型大肠杆菌表达质粒性能分析

当蛋白质实现可溶性表达时，在多数情况下，都需要切除重组蛋白的助溶标签，尤其是基因工程药用蛋白，最终纯化获得的蛋白必须是像天然蛋白质一样，而不能以融合蛋白形式使用。这可通过在助溶标签和目的蛋白之间***一段能被特异蛋白酶识别的氨基酸序列的方法实现。目前常用切除助溶标签的蛋白酶有肠激酶EK、凝血酶 Thrombin、凝血因子Factor Xa、烟草蚀斑病毒(TEV)蛋白酶、酿酒酵母的小分子泛素样特异性蛋白酶1(Ulp1)等。在这些蛋白酶中，Ulp1 是非常特异性的蛋白酶，并且它还具有以下几个优势：(1)与常见的蛋白酶相比，Ulp1不识别某一特定的氨基酸一级序列，而是特异性的识别SUMO融合蛋白中SUMO结构域的空间结构，并将其切除，切割后不会留下任何多余的氨基酸，非常适合于大规模制备具有天然 N端的重组蛋白；(2)Ulp1的切割效率非常高，通常可按酶与底物质量比1:1000作为起始反应条件，并可耐受高至2M的尿素；(3)采用大肠杆菌表达体系可制备高比活力的Ulp1蛋白酶。

尽管科研工作者已将多种技术应用于重组蛋白表达，但该领域还没有一种普遍适用于制备可溶的、具有天然N端的均质蛋白质的方法。因此，构建一种适用性强的外源蛋白可溶性表达质粒将具有较高的学术价值和广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的：一、针对现有技术存在的上述不足，构建一种新的冷休克助溶型表达质粒，该质粒能够提高重组蛋白质包涵体在胞内的溶解度、活性及稳定性；二、构建一种易于去除重组蛋白N端表达伴侣的冷休克助溶型表达质粒；三、将本发明所述冷休克助溶型表达质粒应用于制备高活性的半胱氨酸脱硫酶，为其将来应用于工业生产可溶性药用蛋白、酶制剂和抗原多肽等有用蛋白质提供参考典范。

发明内容之一：提供一种大肠杆菌冷休克助溶型表达质粒的构建方法

本发明所述大肠杆菌冷休克助溶型表达质粒pCold-SUMOa和 pCold-SUMOb的构建方法如下：

构建氨苄抗性pCold-SUMOa质粒：

以pE-SUMOpro Kan质粒为模板，采用SUMO-F(序列如SEQ ID N0.5所示)和SUMO-R(序列如SEQ ID N0.6所示)引物扩增获得小分子泛素相关修饰蛋白(SUMO)基因编码框片段。以Sal I单酶切消化后的pCold TF质粒为模板，采用pCold-F(序列如SEQ ID N0.3所示)和 pCold-R(序列如SEQ ID N0.4所示)引物扩增获得不含TF(Trigger factor)分子伴侣的pCold质粒骨架片段。其中引物SUMO-F和引物 pCold-R的5′端含有19bp相同的同源臂，引物SUMO-R和引物 pCold-F的5′端含有15bp相同的同源臂。采用无缝克隆技术将上述两个片段连接获得重组质粒，命名为pCold-SUMOa。识别 pCold-SUMOa质粒多克隆位点(multiplecloning site,MCS)中单一酶切位点的限制性内切酶依次为Nde I,Sac I,Kpn I,Xho I,BamH I,Hind III,Sal I,Xba I。

构建卡那抗性pCold-SUMOb质粒：

以pCold-SUMOa质粒为模板，采用pCold-SUMO-F(序列如SEQ ID N0.34所示)和pCold-SUMO-R(序列如SEQ ID N0.35所示)引物扩增获得质粒骨架片段。以pET-28b质粒为模板，采用Kana-F(序列如 SEQ ID N0.36所示)和Kana-R(序列如SEQ ID N0.37所示)引物扩增获得卡那抗性基因片段。然后采用无缝克隆技术将上述两个片段连接获得重组质粒，命名为pCold-SUMOb。

发明内容之二：提供一种采用本发明所述冷休克助溶型表达质粒制备高活性和稳定性强的半胱氨酸脱硫酶的应用实施方案

本发明所述制备高活性和稳定性强的半胱氨酸脱硫酶的应用实施方案如下：

1.构建表达大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶(IscS)、人源半胱氨酸脱硫酶(NFS1)和嵌合型半胱氨酸脱硫酶(EH-IscS)的重组质粒。

2.采用氯化钙转化法将上述重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中构建表达菌株，采用冷休克(15℃低温)和IPTG诱导半胱氨酸脱硫酶表达。

3.采用镍柱亲和层析纯化半胱氨酸脱硫酶。

4.采用日立公司U3900紫外-可见光分光光度计分析纯化后半胱氨酸脱硫酶活性及其稳定性。

本发明所述一种大肠杆菌冷休克助溶型表达质粒的构建方法及应用其制备高活性半胱氨酸脱硫酶的方法，具备以下创新点和技术优势：

1.本发明提供了一种基于无缝克隆技术，将公知的或新发现的大肠杆菌表达质粒启动子和公知的或新发现的助溶标签等有利于蛋白质可溶性表达及切割其融合标签的质粒元件进行任意组合的方法，从而为构建一种或一系列普遍适用于外源蛋白可溶性表达的质粒提供参考方案。

2.本发明运用无缝克隆技术将冷休克基因之一的cspA基因启动子与小分子泛素相关修饰蛋白(SUMO)基因编码框融合，构建一种新的大肠杆菌冷休克助溶型表达质粒，该质粒具备以下技术优势：

2.1 pCold-SUMOa和pCold-SUMOb质粒携带cspA基因启动子及相关元件，当大肠杆菌在15℃低温培养时，低温会抑制细胞蛋白质表达和抑制菌体的生长。但是cspA启动子在低温下转录活性不下降， 5′UTR在低温下结构稳定，核糖体具有捕获现象，低温下蛋白质仍可有效表达。因此相对已经商业化、采用37℃诱导培养的 pET28a-SUMO质粒，这一过程可实现目的蛋白高产量(高达60％及以上的细胞蛋白)和更高纯度的表达。

2.2 小分子泛素样特异性蛋白酶1(Ulp1)是SUMO特异的蛋白酶，能够特异性的识别SUMO融合蛋白中SUMO结构域的空间结构，并将其100％切除，其中SUMO蛋白和Ulp1蛋白酶都带有6×His标签，酶切反应后可采用镍柱亲和层析纯化除去。因此，本发明所述质粒适合于大规模制备具有天然N端的重组蛋白。

3.本发明提供的嵌合型半胱氨酸脱硫酶的制备方法，尚属首次报道，该嵌合型半胱氨酸脱硫酶相对大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶具有活性高的特色，相对人源半胱氨酸脱硫酶具有可溶性好和活性高的特色，此外，嵌合型半胱氨酸脱硫酶也不会像人源半胱氨酸脱硫酶一样在体外发生自我凝集现象，因此具有稳定性好的特色。

技术效果

1.构建的冷休克助溶型表达质粒(pCold-SUMOa和 pCold-SUMOb)能够提高重组蛋白质包涵体在胞内的溶解度、活性及稳定性。

2.通过构建真核与原核同源蛋白的嵌合体蛋白的方式，在确保嵌合体蛋白具有与母体蛋白相同功能与活性的前提下，有效提高了真核蛋白在原核表达体系内的可溶性。

3.将嵌合型半胱氨酸脱硫酶基因克隆至本发明所述冷休克助溶型表达载体，相对公知的pET28b、pCold I和pCold-GST载体，可溶性蛋白表达量、稳定性及其活性明显提高，1L菌液经镍柱亲和层析一步纯化可获得10-20mg蛋白，纯度达95％以上，纯化所得嵌合型半胱氨酸脱硫酶可应用于含硫生物分子的工业合成、生物脱硫和体外制备功能性铁硫蛋白。

附图说明

图1.大肠杆菌冷休克助溶型表达质粒图谱：(A)pCold-SUMOa 质粒图谱；(B)pCold-SUMOb质粒图谱。

图2.SDS-PAGE分析重组半胱氨酸脱硫酶在不同载体中蛋白表达与纯化情况：(A)SDS-PAGE分析嵌合型半胱氨酸脱硫酶在pCold I, pCold-His-GST,pCold-SUMOa和pColdTF质粒中蛋白表达图谱， Lane1：未诱导全细胞裂解液上清；(B)SDS-PAGE分析嵌合型半胱氨酸脱硫酶在pET28b,pET28a-SUMO,pBAD-SUMO和pET-SUMO质粒中蛋白表达图谱；(C)SDS-PAGE分析人源半胱氨酸脱硫酶在pCold I,pCold-His-GST,pCold-SUMOa,pCold TF,pET28b,pET28a-SUMO 和pBAD-SUMO质粒中蛋白表达图谱；(D)SDS-PAGE分析重组型半胱氨酸脱硫酶纯度。泳道1:大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶IscS,泳道 2:嵌合型半胱氨酸脱硫酶EH-IscS,泳道3:GST-EH-IscS,泳道4: SUMO-EH-IscS,泳道5:TF-EH-IscS,泳道6:SUMO-NFS1(55-457), 泳道7:TF-NFS1(55-457)。M代表蛋白分子量标准，T代表诱导后的全细胞裂解液，S代表诱导后的全细胞裂解液上清。

图3.重组半胱氨酸脱硫酶的紫外-可见光分析图谱及其半胱氨酸脱硫酶活性分析：(A)紫外-可见光分光光度计分析纯化后大肠杆菌与嵌合型半胱氨酸脱硫酶光谱学性质图谱。光谱1：TF-EH-IscS；光谱2：IscS；光谱3：EH-IscS；光谱4：SUMO-EH-IscS；光谱5： GST-EH-IscS；(B)紫外-可见光分光光度计分析纯化后人源半胱氨酸脱硫酶光谱学性质图谱，光谱1：TF-NFS1(55-457)；光谱2： SUMO-NFS1(55-457)；(C)重组半胱氨酸脱硫酶的活性分析图谱。

图4.重组半胱氨酸脱硫酶的稳定性分析图谱：(A-B)助溶分子伴侣影响蛋白质稳定性的效果分析图谱。

图5.SDS-PAGE分析Ulp1蛋白酶切除SUMO-EH-IscS重组蛋白中SUMO标签的酶切效率图：M代表蛋白分子量标准；泳道1:镍柱纯化获得的SUMO-EH-IscS重组蛋白；泳道2-4:Ulp1(3.5μg)蛋白酶分别切割100μg、500μg和1000μg SUMO-EH-IscS重组蛋白的酶切产物；泳道5:经Ulp1酶切后纯化获得的EH-IscS蛋白；Lane-6:Ulp1 蛋白酶。

具体实施方式

下面结合附图及实施例描述本发明具体实施方式。

实施例1.大肠杆菌冷休克助溶型表达载体的构建

1.构建氨苄抗性pCold-SUMOa质粒

以LifeSensors公司的pE-SUMOpro Kan质粒为模板，采用引物 SUMO-F(序列如SEQID N0.3所示)和SUMO-R(序列如SEQ ID N0.4 所示)扩增获得Smt3融合蛋白序列(序列如SEQ ID N0.19所示)。同时以经Sal I单酶切后的pCold TF质粒为模板，采用引物pCold-F(序列如SEQ ID N0.1所示)和pCold-R(序列如SEQ ID N0.2所示)扩增获得 pCold质粒骨架片段。然后采用无缝克隆技术将上述两个片段连接获得重组质粒，命名为pCold-SUMOa(如图1所示)。因Smt3融合蛋白基因序列中含有EcoR I和Pst I两个酶切位点，所以选择以SalI单酶切后的pCold TF质粒为模板，并且通过引物设计避免pCold-SUMOa 重组质粒多克隆位点中含有这两个酶切位点。识别pCold-SUMOa质粒多克隆位点中单一酶切位点的限制性内切酶依次为Nde I,Sac I, Kpn I,Xho I,BamH I,Hind III,Sal I,Xba I。

2.构建卡那抗性pCold-SUMOb质粒

以pCold-SUMOa质粒为模板，采用pCold-SUMO-F(序列如SEQ ID N0.26所示)和pCold-SUMO-R(序列如SEQ ID N0.27所示)引物扩增获得质粒骨架片段。以pET-28b质粒为模板，采用Kana-F(序列如 SEQ ID N0.28所示)和Kana-R(序列如SEQ ID N0.29所示)引物扩增获得卡那抗性基因片段。然后采用无缝克隆技术将上述两个片段连接获得重组质粒，命名为pCold-SUMOb(如图1所示)。

将pCold-SUMOa质粒抗性由氨苄抗性改造为卡那抗性的目的：

氨苄青霉素是一种内酰胺类抗生素，干扰肽聚糖的交联从而抑制细胞壁的合成。革兰氏阴性菌株细胞壁肽聚糖含量低，对氨苄霉素不敏感，培养过夜后阳性克隆菌落周围易生长卫星菌落，不易挑取单菌落；卡那霉素是一种蛋白质生物合成抑制剂，对大肠杆菌抑菌效果好。

实施例2.表达半胱氨酸脱硫酶重组质粒的构建

1.构建表达大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶的重组质粒

以大肠杆菌E.coli MC4100基因组为模板，采用引物IscS-pCold-F (序列如SEQID N0.9所示)和IscS-pCold-R(序列如SEQ ID N0.10所示)扩增获得大肠杆菌IscS编码框基因。采用Kpn I单酶切pCold I质粒，并胶回收酶切后载体片段。然后采用无缝克隆试剂盒构建获得重组质粒IscS-pCold I，并将该重组质粒送至华大基因测序鉴定。

2.构建表达人源半胱氨酸脱硫酶的重组质粒

以NFS1(55-457)-pET28b质粒为模板，采用引物m-NFS1-pCold-F (序列如SEQ IDN0.11所示)/SUMO-m-NFS1-F(序列如SEQ ID N0.13 所示)和m-NFS1-pCold-R(序列如SEQID N0.12所示)/ SUMO-m-NFS1-F(序列如SEQ ID N0.24所示)扩增获得含有编码人源半胱氨酸脱硫酶55-457位氨基酸的基因序列，其中NFS1蛋白中的 1-54位氨基酸序列是介导其进入线粒体内的信号肽序列。采用Kpn I 单酶切pCold I、pCold-GST和pCold TF质粒，并胶回收酶切后载体片段。采用Nde I单酶切pCold-SUMOa质粒，并胶回收酶切后载体片段。然后采用无缝克隆试剂盒分别将NFS1基因连接至上述三个单酶切后载体片段中，获得NFS1(55-457)-pCold I, NFS1(55-457)-pCold-SUMOa,NFS1(55-457)-pCold-GST和 NFS1(55-457)-pCold TF重组质粒，并将三个重组质粒送至华大基因测序鉴定。

3.构建表达嵌合型半胱氨酸脱硫酶的重组质粒

3.1 扩增IscS蛋白N端结构域核酸序列

3.1.1 PCR扩增IscS蛋白N端结构域(1-263位氨基酸)核酸序列体系及条件如下：

95℃,3min；95℃,10sec,51.6℃,30sec,72℃,30sec,35个循环； 72℃,10min,4℃保存。

3.1.2 Dpn I消化甲基化的IscS-pCold I质粒模板

酶切体系及条件如下：

37℃孵育1小时或更长时间。

3.1.3 酶切产物的胶回收：

酶切反应后产物进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外灯下切割目的DNA片段，以TaKaRa

公司胶回收试剂盒进行回收。最后以Du-800核酸/蛋白分析仪对回收产物定量。

3.2 扩增NFS1蛋白C端结构域核酸序列

3.2.1 PCR扩增NFS1蛋白C端结构域(316-457位氨基酸)核酸序列体系及条件如下：

95℃,3min；95℃,10sec,52℃,15sec,72℃,30sec,35个循环； 72℃,10min,4℃保存。

3.2.2 Dpn I消化甲基化的NFS1(55-457)-pCold I质粒模板

酶切体系及条件如下：

37℃孵育1小时或更长时间。

3.2.3 酶切产物的胶回收：

酶切反应后产物进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外灯下切割目的DNA片段，以TaKaRa公司胶回收试剂盒进行回收。最后以Du-800核酸/蛋白分析仪对回收产物定量。

3.3 构建大肠杆菌与人源半胱氨酸脱硫酶嵌合体基因

3.3.1 PCR反应体系及条件如下：

95℃,3min；95℃,10sec,53℃,45sec,72℃,30sec,35个循环；72℃,10min,4℃保存。

3.3.2 PCR产物的胶回收：

将PCR产物进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外灯下切割目的DNA片段，以TaKaRa公司胶回收试剂盒进行回收。最后以 Du-800核酸/蛋白分析仪对回收产物定量。

3.4 构建表达EH-IscS的重组质粒

3.4.1 PCR扩增EH-IscS基因

PCR反应体系及条件如下：

95℃,3min；95℃,10sec,53℃,45sec,72℃,30sec,35个循环； 72℃,10min,4℃保存。

3.4.2 pCold I,pCold-GST,pCold TF,pCold-SUMOa, pET28a-SUMO,pET-SUMO和pBAD-SUMO线性化载体片段的制备

pET28a-SUMO,pET-SUMO和pBAD-SUMO质粒由温州医科大学酶工程与医学诊断研究所提供。

pCold I,pCold-GST和pCold TF质粒单酶切体系如下：

37℃，酶切2h。

pCold-SUMOa,pET-SUMO和pBAD-SUMO质粒单酶切体系如下：

37℃，酶切2h。

pET28a-SUMO质粒单酶切体系如下：

37℃，酶切2h。

酶切产物加入10×Loading buffer后进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外灯下切割目的载体片段，以TaKaRa公司胶回收试剂盒进行回收。最后以Du-800核酸/蛋白分析仪对回收产物定量。

3.5 采用无缝克隆试剂盒(和元生物科技有限公司)构建表达 EH-IscS的重组质粒

3.5.1 无缝克隆反应体系如下：

37℃孵育30min，然后转移到冰上放置5min。使用10μl上述反应液转化DH5α感受态细胞。

3.5.2转化：通过冷CaCl₂法将10μl上述无缝克隆反应液转化 DH5感受态细胞。

3.5.3 菌落PCR鉴定阳性克隆

用接种针挑取上述LB/Amp⁺平板上生长的单菌落少许分别划线接种于一个无菌LB/Amp⁺或LB/Kana⁺平板上，37℃恒温培养箱中倒置培养10h。然后，用无菌枪头分别挑取该平板上各小格中生长的菌体少许，混于含50μl无菌水的EP管中，沸水煮10min，12000rpm、离心5min后，取上清9.2μl加入200μl PCR反应管中作为PCR鉴定模板。并取以下体系加入该管中，混匀。

94℃,5min；94℃,30sec,50.3℃,30sec,72℃,1min 30sec,25个循环；72℃,10min,4℃保存。取5μl PCR产物以1.0％的Agarose 凝胶电泳鉴定。挑选鉴定正确的两个阳性克隆送至华大基因测序鉴定。

实施例3.半胱氨酸脱硫酶的诱导与表达条件优化

将上述构建好的重组质粒通过冷CaCl₂法转化到BL21(DE3)感受态细胞中。本发明所述重组半胱氨酸脱硫酶的诱导与表达，除特别声明，都按以下实验步骤进行操作：

(1)将筛选的转化子过夜菌按1:50的体积比接种至含有100 μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养；

(2)当菌液OD600值约为0.4-0.5时，立即将菌液置冰水浴中放置5min，然后移至15℃静置30min；

(3)添加IPTG至其终浓度为100μM/L，15℃、250rpm振荡培养24h。

(4)培养完成后，利用SDS-PAGE分析目的蛋白的有无、表达量与可溶性。

3.1 过夜菌起始接种量的优化

将筛选的转化子过夜菌分别按1:50,1:500,1:1000的体积比接种至含有100μg/mlAmp的LB液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养。后续实验步骤同实施例4所述。

3.2 IPTG诱导物浓度对重组蛋白表达量的影响

分别设置0、100、200、400、800μM/L五个IPTG诱导物浓度，其它实验步骤同实施例4所述。

3.3 实验结果：(1)过夜菌起始接种量在1:1000-1:50(v/v)范围内对重组半胱氨酸脱硫酶表达量没有显著影响，因此为了节省菌体培养时间，确定1:50为最佳接种量；(2)SDS-PAGE分析表明在100-800 μM/L范围内IPTG诱导物浓度对IscS蛋白表达量没有显著影响，因此为了节约成本，确定100μM/L IPTG为最佳诱导物浓度；(3)如图 2所示，人源半胱氨酸脱硫酶NFS1(55-457)在pET28b、pCold I、 pCold-GST和pBAD-SUMO质粒中表达都以包涵体形式存在。而与已经商业化的pET28a-SUMO质粒效果类似，pCold-SUMOa质粒可以小部分提高NFS1(55-457)蛋白的可溶性表达，而TF分子伴侣可以使NFS1(55-457)蛋白完全以可溶性形式表达。嵌合型半胱氨酸脱硫酶 EH-IscS使用pET28b质粒表达时，以包涵体形式存在，而pCold I、 pCold-GST、pCold-SUMOa/pET28a-SUMO/pET-SUMO/pBAD-SUMO 和pCold TF质粒可以依次提高EH-IscS蛋白的可溶性，并且 pCold-SUMOa质粒相对pET28a-SUMO,pET-SUMO和pBAD-SUMO 质粒，可以提高目的蛋白的产量及其占全细胞总蛋白量的比例，诱导蛋白表达后的全细胞可直接用于核磁共振分析。综上所述，本发明所述大肠杆菌冷休克助溶型表达载体在促进异源多肽可溶性表达方面具有很好的应用潜力。

实施例4.重组半胱氨酸脱硫酶的分离与纯化

4.1 采用镍柱亲和层析分离纯化重组半胱氨酸脱硫酶

本发明所述IscS,EH-IscS,SUMO-EH-IscS,GST-EH-IscS, TF-EH-IscS,SUMO-NFS1(55-457)TF-NFS1(55-457)蛋白采用镍柱亲和层析分离与纯化。具体实验步骤如下所述：

4.1.1 蛋白分离纯化缓冲液的配制：

A液：又称DB(Desalting Buffer)或Binding Buffer缓冲液， pH＝8.0，用于蛋白保存、纯化时结合层析柱的缓冲液，4℃保存。

B液：又称Ellution Buffer，用于洗脱层析柱上结合的蛋白，4℃避光保存。

4.1.2 4℃，6,000rpm离心6min，收集15℃培养24小时后菌体；

4.1.3 用Desalting Buffer重悬菌体并离心，重复清洗两次，再用 30ml预冷的Desalting Buffer重悬菌体；

4.1.4 细胞破碎：用高压细胞破碎仪在4℃，1000-1500w条件下破碎细胞4次，使破碎后终体积为35ml；

4.1.5 破碎后悬液于4℃，24,000rpm离心45min，上清用 0.45μM滤膜过滤后纯化。

4.1.6 开启电脑，蛋白纯化仪，启动运行程序，等待仪器与电脑连接；

4.1.7 ddH₂O清洗流经A泵和B泵的A1和B1管道，pump wash三次，并用A液和B液清洗A1和B1管道，

pump wash两次；

4.1.8 连接用于纯化的Ni柱，用100％Elution Buffer以3ml/min 的流速冲洗Ni柱3min，换用20个镍柱体积的A液以3ml/min的流速平衡Ni柱约10-15min，使基线稳定，ddH₂O清洗上样柱；

4.1.9 将过滤好的蛋白上清注入上样柱内，启动镍柱亲和层析纯化程序，等待仪器自动完成蛋白纯化

过程，即平衡、上样、洗脱和收集。

镍柱亲和层析纯化程序具体参数如下：

进样：35ml样品，3ml/min，2％Elution Buffer

洗脱：洗脱杂蛋白10cv 3ml/min，6％Elution Buffer

洗脱目的蛋白：15cv 3ml/min，100％Elution Buffer

收集：按照程序上显示的蛋白吸收峰对应的样品管收集目的蛋白 2ml；

4.1.10 蛋白脱盐：蛋白纯化完成后，换上脱盐柱Desalting tube，待柱子平衡后，将镍柱纯化蛋白样

品依次进行脱盐。

收集：按照程序上显示的蛋白吸收峰对应的样品管收集目的蛋白 2ml，冰上放置。

4.1.11 蛋白浓度的测定

用紫外可见分光光度计(U3900)对蛋白进行250-700nm全波长扫描。由于蛋白在280nm处具有特异性吸收峰，因此通过其在280 nm处特定的消光系数(各蛋白消光系数由所含的氨基酸计算得出)，按以下公式计算相应蛋白的浓度。

蛋白浓度计算公式：C_pro＝(OD₂₈₀-OD₇₀₀)*1000/消光系数(单位：μM)

4.2 实验结果：(1)经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定分析纯化获得的重组半胱氨酸脱硫酶的蛋白纯度都高于90％，可直接用于后续酶学实验分析(如图2所示)；(2)对纯化后的蛋白进行全波长扫描分析，可以发现嵌合型EH-IscS、GST-EH-IscS、SUMO-EH-IscS与大肠杆菌IscS一致，在395nm处出现半胱氨酸脱硫酶辅基磷酸吡哆醛 (PLP)特征性吸收峰，蛋白均呈淡黄色或黄色。人源半胱氨酸脱硫酶 NFS1(55-457)与SUMO-NFS1(55-457)在420nm处出现PLP特征性吸收峰，蛋白同样呈淡黄色或黄色。纯化后TF-EH-IscS呈淡黄色，但是其半胱氨酸脱硫酶活性非常弱。纯化后TF-NFS1(55-457)蛋白无颜色，且在420nm处的特征性吸收峰非常微弱，说明目的蛋白未结合 PLP，这是由于Trigger factor标签太大(52kDa)可能会影响目的蛋白空间结构，而SUMO标签相对较小(16kDa)，其作为分子伴侣有助于目的蛋白的正确折叠，且不会影响目的蛋白空间结构(如图3所示)。

实施例5.半胱氨酸脱硫酶活性的测定

5.1 Nth蛋白样品中铁、硫含量的测定

5.1.1 Nth蛋白样品中铁含量的测定

蛋白样品中铁含量的测定采用啡洛嗪法，其基本原理是：在L-cysteine的作用下，蛋白样品中的铁释放出来，并与啡洛嗪(Ferrozine) 结合，形成Fe-Ferrozine络合物。该络合物在564nm处具有特定的吸收峰，其消光系数为27.9mM^-1cm^-1，通过测定该吸收峰的值，即可利用公式计算出蛋白中铁的含量。

按上表加好体系后，置于85℃加热20min，室温放置30min，12,000 rpm离心5min，取上清进行450-700nm全波长扫描，并以Desalting Buffer作为阴性对照。

根据公式计算铁含量：C_Fe＝(OD₅₆₄-OD₇₀₀)*1000/27.9(单位：μM)

5.1.2 Nth蛋白样品中硫含量的测定

蛋白样品中硫含量的测定采用DPD法，其基本原理是：硫化物与 FeCl₃相互作用，DPD作为显色剂，可在669nm处形成特征性吸收峰，利用公式及硫的消光系数即可算得蛋白中的硫含量。

按上表加好体系后，室温放置30min，12,000rpm离心5min，取上清进行450-800nm全波长扫描，以Desalting Buffer作为阴性对照，并以Nth计算硫的消光系数。

根据公式计算硫含量：C_S＝(OD₆₆₉-OD₈₀₀)*1000/S消光系数(单位：μM)

S消光系数＝(OD₆₆₉-OD₈₀₀)*1000/Nth C_S

Nth C_S＝Nth C_Fe＝(OD₅₆₄-OD₇₀₀)*1000/27.9

5.2 IscS,EH-IscS,GST-EH-IscS,SUMO-EH-IscS,TF-EH-IscS, SUMO-NFS1(55-457)和TF-NFS1(55-457)蛋白样品半胱氨酸脱硫酶活性的测定

活性测定前配制1ml的反应体系：取已知浓度的蛋白，用A液(DB) 稀释至终浓度为10μM，加入1M DTT 3μL(终浓度为3mM)，混匀后37℃孵育5min，并立即加入20μl 0.1M的L-cysteine(终浓度为2mM)，颠倒混匀后立即取160μL测定此时的硫含量，并将此时刻定义为0min，之后每隔5min取一次样(160μL)测硫含量，到 15min时终止，共4次。

催化反应体系如下：

上述体系混匀后37℃孵育5min，加入20μl 0.1M L-cysteine，取 160μL测此时刻的硫含量，此后每隔10min测一次。

硫含量测定体系：

将上述测硫体系静置于37℃干式恒温器上加热20min，12,000 rpm离心5min后，用U3900进行500nm-800nm全波长扫描，可以看到在669nm处的特征性吸收峰。

根据公式C_S＝(OD₆₆₉-OD₈₀₀)/S的消光系数*1000(单位：μM)计算硫含量，硫含量的多少直接反应IscS蛋白酶活性的大小。以DB作为阴性对照，蛋白Nth(一种很稳定的[4Fe-4S])作为阳性对照，硫的消光系数由阳性对照Nth中铁的含量进行计算。(注：Nth中Fe、S 含量测定方法同5.1所述)

测定完成后绘制时间-硫含量曲线图：根据计算出的硫含量的多少绘制时间-硫含量曲线图，分析各蛋白的酶活性的大小。

5.3 实验结果：(1)如图3C所示，SUMO-EH-IscS蛋白半胱氨酸脱硫酶活性最高，并且高于大肠杆菌IscS蛋白活性，而EH-IscS蛋白半胱氨酸脱硫酶活性低于IscS蛋白，说明SUMO分子伴侣一方面可以提高EH-IscS蛋白可溶性，另一方面可以显著提高EH-IscS蛋白活性，原因可能与SUMO分子伴侣可以增强EH-IscS蛋白稳定性，阻止其发生自我凝集有关，其具体分子机制有待进一步研究；(2) TF-EH-IscS蛋白具有微弱的半胱氨酸脱硫酶活性，这是由于Trigger factor标签太大(52kDa)，可能会影响目的蛋白空间结构，与前述分析结果一致；(3)人源半胱氨酸脱硫酶NFS1需要与ISD11结合才具有活性，因此，单独检测SUMO-NFS1(55-457)和TF-NFS1(55-457)蛋白时，都不具有半胱氨酸脱硫酶活性。

实施例6.不同助溶标签对重组半胱氨酸脱硫酶稳定性的影响

使用DB将纯化好的IscS,EH-IscS,GST-EH-IscS,SUMO-EH-IscS 和TF-EH-IscS蛋白浓度分别稀释为1μM，然后在37℃孵育30min，每隔5min测定蛋白样品在320nm处的吸光值。如果蛋白样品会发生自我凝集，320nm处吸光值就会随着时间的延长而递增。以时间为横轴，320nm处吸光值为纵轴作图。如图4所示：(1)嵌合型半胱氨酸脱硫酶EH-IscS虽具有较好的半胱氨酸脱硫酶活性，但该蛋白稳定性较差，并且蛋白浓度越高，自我凝集现象越明显；(2)EH-IscS与 SUMO和TF标签融合之后表达的重组蛋白，具有很好的稳定性。另据文献报道，NFS1是一个很容易发生自我凝集的蛋白质，但本实验中SUMO-NFS1(55-457)和TF-NFS1(55-457)蛋白具有很好的稳定性，说明助溶标签除了具有增强蛋白质的可溶性之外，还可以阻止蛋白质的自我凝集。

实施例7.表达Ulp1蛋白酶重组质粒的构建

7.1 Ulp1蛋白酶的表达与纯化

以酿酒酵母BY4743的cDNA为模板，采用PCR技术扩增酿酒酵母的小分子泛素样特异性蛋白酶1的404-621位活性片段，并利用无缝克隆技术将其克隆至pET28b质粒的Nde I酶切位点中，构建 Ulp1-pET28b重组质粒。

采用氯化钙法将Ulp1-pET28b重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中，构建E.coli Ulp1-pET28b/BL21基因工程菌株。

实施例8.Ulp1蛋白酶的制备

8.1 Ulp1蛋白酶的表达与纯化

用移液枪取5μl于-30℃保存的E.coli Ulp1-pET28b/BL21菌株接种到含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃,250rpm振荡培养过夜。扩大培养至OD₆₀₀接近1.0，加入IPTG至终浓度为200μM，37℃， 250rpm振荡培养3小时后收菌。

Ulp1蛋白酶的分离与纯化同本发明实施例4中所述。

8.2 Ulp1蛋白酶的酶活性定义

在50mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl中，25℃反应1h， 100μg对照蛋白有超过95％被切割所需Ulp1的酶量定义为1U。

8.3 Ulp1蛋白酶的试剂配方

3.5mg/ml Ulp1蛋白酶保存于包含50mM Tris-HCl pH 7.5,150 mM NaCl,20％甘油,1mM苯甲脒,0.2mM苯甲基磺酰氟,0.1mM 乙二醇双四乙酸,0.1％2-巯基乙醇,0.03％十二烷基聚乙二醇醚的生物试剂中。

8.4 Ulp1蛋白酶的储存及其稳定性

采用本发明中8.3所述生物试剂保存的Ulp1蛋白酶，从生产日期开始计算，可于-70℃保存1年时间。

实施例9.重组蛋白中SUMO标签的去除

9.1 采用Ulp1蛋白酶制备具有天然N端的重组蛋白

按照1U：500-1000μg蛋白的比例，在25℃水浴锅中酶切1-2h，进行酶切预实验。选取切割效率大于90％的酶切比例，进行大规模制备具有天然N端的重组蛋白。其中SUMO蛋白和Ulp1蛋白酶都带有 6×His标签，酶切反应后采用镍柱亲和层析纯化除去。Ulp1蛋白酶的酶切效率如图5所示。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。

<110> 温州医科大学

<120> 一种大肠杆菌冷休克助溶型表达质粒的构建方法及其应用

<160> 32

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 55

<212> DNA

<213> pCold-F

<400> 1

cctcgaggga tccaagcttg tcgactctag ataggtaatc tctgcttaaa agcac 55

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> pCold-R

<400> 2

gtgatgatga tgatgatgca ctttgtg 27

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> SUMO-F

<400> 3

gcatcatcat catcatcacg ggtccctgca ggactcag 38

<210> 4

<211> 55

<212> DNA

<213> SUMO-R

<400> 4

ttggatccct cgagggtacc gagctccata tgacctccaa tctgttcgcg gtgag 55

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Chimeric IscS-F

<400> 5

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<210> 6

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<212> DNA

<213> Chimeric IscS-R

<400> 6

gattcgcttg tggtcatact ccatctcttc ttttgcgatg 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> Chimeric NFS1-F

<400> 7

catcgcaaaa gaagagatgg agtatgacca caagcgaatc 40

<210> 8

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<212> DNA

<213> Chimeric NFS1-R

<400> 8

ctagtgttgg gtccacttg 19

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> IscS-pCold-F

<400> 9

aggcatatgg agctcatgaa attaccgatt tatctcgact actccg 46

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> IscS-pCold-R

<400> 10

attcggatcc ctcgagttaa tgatgagccc attcgatgct gttc 44

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> m-NFS1-pCold-F

<400> 11

aggcatatgg agctcgtgct gcgacctctc tatatggatg 40

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> m-NFS1-pCold-R

<400> 12

attcggatcc ctcgagctag tgttgggtcc acttgatgct c 41

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> SUMO-m-NFS1-F

<400> 13

cgaacagatt ggaggtgtgc tgcgacctct ctatatggat g 41

<210> 14

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<212> DNA

<213> SUMO-m-NFS1-R

<400> 14

tcgagggtac cgagctccta gtgttgggtc cacttgatgc tc 42

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<212> DNA

<213> EH-IscS-pCold-F

<400> 15

aggcatatgg agctcatgaa attaccgatt tatctcgact actccg 46

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> EH-IscS-pCold-R

<400> 16

attcggatcc ctcgagctag tgttgggtcc acttgatgc 39

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<211> 47

<212> DNA

<213> SUMO-EH-IscS-F

<400> 17

cgaacagatt ggaggtatga aattaccgat ttatctcgac tactccg 47

<210> 18

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<212> DNA

<213> SUMO-EH-IscS-R

<400> 18

tcgagggtac cgagctccta gtgttgggtc cacttgatgc 40

<210> 19

<211> 306

<212> DNA

<213> Smt3 Fusion Protein

<400> 19

atggggtccc tgcaggactc agaagtcaat caagaagcta agccagaggt caagccagaa 60

gtcaagcctg agactcacat caatttaaag gtgtccgatg gatcttcaga gatcttcttc 120

aagatcaaaa agaccactcc tttaagaagg ctgatggaag cgttcgctaa aagacagggt 180

aaggaaatgg actccttaag attcttgtac gacggtatta gaattcaagc tgatcaggcc 240

cctgaagatt tggacatgga ggataacgat attattgagg ctcaccgcga acagattgga 300

ggttag 306

<210> 20

<211> 4683

<212> DNA

<213> pCold-SUMOa

<400> 20

aaggaatggt gtggccgatt aatcataaat atgaaaaata attgttgcat cacccgccaa 60

tgcgtggctt aatgcacatc aaattgtgag cggataacaa tttgatgtgc tagcgcatat 120

ccagtgtagt aaggcaagtc ccttcaagag ttatcgttga tacccctcgt agtgcacatt 180

cctttaacgc ttcaaaatct gtaaagcacg ccatatcgcc gaaaggcaca cttaattatt 240

aagaggtaat acaccatgaa tcacaaagtg catcatcatc atcatcacgg gtccctgcag 300

gactcagaag tcaatcaaga agctaagcca gaggtcaagc cagaagtcaa gcctgagact 360

cacatcaatt taaaggtgtc cgatggatct tcagagatct tcttcaagat caaaaagacc 420

actcctttaa gaaggctgat ggaagcgttc gctaaaagac agggtaagga aatggactcc 480

ttaagattct tgtacgacgg tattagaatt caagctgatc aggcccctga agatttggac 540

atggaggata acgatattat tgaggctcac cgcgaacaga ttggaggtca tatggagctc 600

ggtaccctcg agggatccaa gcttgtcgac tctagatagg taatctctgc ttaaaagcac 660

agaatctaag atccctgcca tttggcgggg atttttttat ttgttttcag gaaataaata 720

atcgatcgcg taataaaatc tattattatt tttgtgaaga ataaatttgg gtgcaatgag 780

aatgcgcagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat 840

gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg 900

tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga 960

gcagattgta ctgagagtgc accataaaat tgtaaacgtt aatattttgt taaaattcgc 1020

gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc 1080

ttataaatca aaagaatagc ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag 1140

tccactatta aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga 1200

tggcccacta cgtgaaccat cacccaaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc 1260

actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa 1320

cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt 1380

agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc 1440

gtactatggt tgctttgacg tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 1500

taccgcatca ggcgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt 1560

tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc 1620

ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc 1680

ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa 1740

aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg 1800

gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag 1860

ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc 1920

gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta 1980

cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg 2040

cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca 2100

acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac 2160

caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat 2220

taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg 2280

ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata 2340

aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta 2400

agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa 2460

atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag 2520

tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg 2580

tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 2640

gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 2700

taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 2760

aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 2820

ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 2880

catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 2940

ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 3000

ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 3060

agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 3120

taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 3180

atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 3240

cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 3300

ccttttgctg gccttttgct cacatagtca tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg 3360

ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag atcccggtgc ctaatgagtg agctaactta 3420

cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 3480

attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt 3540

tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag 3600

agttgcagca agcggtccac gctggtttgc cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg 3660

gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt cgtatcccac taccgagata 3720

tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga 3780

tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat tcagcatttg catggtttgt 3840

tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg 3900

cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg 3960

cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca gatgctccac gcccagtcgc 4020

gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga 4080

aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc 4140

ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta 4200

caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg 4260

gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt gcagggccag actggaggtg 4320

gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt gtgccacgcg gttgggaatg 4380

taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg ttttcgcaga aacgtggctg 4440

gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac cggcatactc tgcgacatcg 4500

tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat 4560

gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt 4620

atgcgactcc tgcattagga agcagcccag tagtaggttg aggccgttga gcaccgccgc 4680

cgc 4683

<210> 21

<211> 4690

<212> DNA

<213> pCold-SUMOb

<400> 21

aaggaatggt gtggccgatt aatcataaat atgaaaaata attgttgcat cacccgccaa 60

tgcgtggctt aatgcacatc aaattgtgag cggataacaa tttgatgtgc tagcgcatat 120

ccagtgtagt aaggcaagtc ccttcaagag ttatcgttga tacccctcgt agtgcacatt 180

cctttaacgc ttcaaaatct gtaaagcacg ccatatcgcc gaaaggcaca cttaattatt 240

aagaggtaat acaccatgaa tcacaaagtg catcatcatc atcatcacgg gtccctgcag 300

gactcagaag tcaatcaaga agctaagcca gaggtcaagc cagaagtcaa gcctgagact 360

cacatcaatt taaaggtgtc cgatggatct tcagagatct tcttcaagat caaaaagacc 420

actcctttaa gaaggctgat ggaagcgttc gctaaaagac agggtaagga aatggactcc 480

ttaagattct tgtacgacgg tattagaatt caagctgatc aggcccctga agatttggac 540

atggaggata acgatattat tgaggctcac cgcgaacaga ttggaggtca tatggagctc 600

ggtaccctcg agggatccaa gcttgtcgac tctagatagg taatctctgc ttaaaagcac 660

agaatctaag atccctgcca tttggcgggg atttttttat ttgttttcag gaaataaata 720

atcgatcgcg taataaaatc tattattatt tttgtgaaga ataaatttgg gtgcaatgag 780

aatgcgcagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat 840

gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg 900

tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga 960

gcagattgta ctgagagtgc accataaaat tgtaaacgtt aatattttgt taaaattcgc 1020

gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc 1080

ttataaatca aaagaatagc ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag 1140

tccactatta aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga 1200

tggcccacta cgtgaaccat cacccaaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc 1260

actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa 1320

cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt 1380

agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc 1440

gtactatggt tgctttgacg tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 1500

taccgcatca ggcgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt 1560

gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 1620

catgaacaat aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata 1680

ttcaacggga aacgtcttgc tctaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat 1740

atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt 1800

atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg 1860

atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca 1920

tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga 1980

aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc 2040

tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg 2100

atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga 2160

gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata 2220

aacttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 2280

ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 2340

accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac 2400

agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc 2460

atttgatgct cgatgagttt ttctaagaat taattcatga gcggatacat atttgaatgt 2520

atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctggg 2580

atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 2640

ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 2700

ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 2760

ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 2820

ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 2880

ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 2940

tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 3000

tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 3060

tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 3120

tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 3180

gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 3240

tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 3300

ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atagtcatgc cccgcgccca ccggaaggag 3360

ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta atgagtgagc 3420

taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc 3480

cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgccag 3540

ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca ccgcctggcc 3600

ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa aatcctgttt 3660

gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt atcccactac 3720

cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg cgcccagcgc 3780

catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca gcatttgcat 3840

ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta tcggctgaat 3900

ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg agacagaact 3960

taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat gctccacgcc 4020

cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct ggtcagagac 4080

atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg catcctggtc 4140

atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat tgtgcaccgc 4200

cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc tggcacccag 4260

ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca gggccagact 4320

ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg ccacgcggtt 4380

gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt tcgcagaaac 4440

gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg catactctgc 4500

gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct cttccgggcg 4560

ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga tctcgacgct 4620

ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg ccgttgagca 4680

ccgccgccgc 4690

<210> 22

<211> 1215

<212> DNA

<213> IscS

<400> 22

atgaaattac cgatttatct cgactactcc gcaaccacgc cggtggaccc gcgtgttgcc 60

gagaaaatga tgcagtttat gacgatggac ggaacctttg gtaacccggc ctcccgttct 120

caccgtttcg gctggcaggc tgaagaagcg gtagatatcg cccgtaatca gattgccgat 180

ctggtcggcg ctgatccgcg tgaaatcgtc tttacctctg gtgcaaccga atctgacaac 240

ctggcgatca aaggtgcagc caacttttat cagaaaaaag gcaagcacat catcaccagc 300

aaaaccgaac acaaagcggt actggatacc tgccgtcagc tggagcgcga aggttttgaa 360

gtcacctacc tggcaccgca gcgtaacggc attatcgacc tgaaagaact tgaagcagcg 420

atgcgtgacg acaccatcct cgtgtccatc atgcacgtaa ataacgaaat cggcgtggtg 480

caggatatcg cggctatcgg cgaaatgtgc cgtgctcgtg gcattatcta tcacgttgat 540

gcaacccaga gcgtgggtaa actgcctatc gacctgagcc agttgaaagt tgacctgatg 600

tctttctccg gtcacaaaat ctatggcccg aaaggtatcg gtgcgctgta tgtacgtcgt 660

aaaccgcgcg tacgcatcga agcgcaaatg cacggcggcg gtcacgagcg cggtatgcgt 720

tccggcactc tgcctgttca ccagatcgtc ggaatgggcg aggcctatcg catcgcaaaa 780

gaagagatgg cgaccgagat ggaacgtctg cgcggcctgc gtaaccgtct gtggaacggc 840

atcaaagata tcgaagaagt ttacctgaac ggtgacctgg aacacggtgc gccgaacatt 900

ctcaacgtca gcttcaacta cgttgaaggt gagtcgctga ttatggcgct gaaagacctc 960

gcagtttctt caggttccgc ctgtacgtca gcaagcctcg aaccgtccta cgtgctgcgc 1020

gcgctggggc tgaacgacga gctggcacat agctctatcc gtttctcttt aggtcgtttt 1080

actactgaag aagagatcga ctacaccatc gagttagttc gtaaatccat cggtcgtctg 1140

cgtgaccttt ctccgctgtg ggaaatgtac aagcagggcg tggatctgaa cagcatcgaa 1200

tgggctcatc attaa 1215

<210> 23

<211> 1374

<212> DNA

<213> NFS1

<400> 23

atgctgctcc gagtcgcttg gaggcgggcg gcagtggcgg tgacagcggc tccagggccg 60

aagcccgcgg cgcccactcg ggggctgcgc ctgcgcgttg gagaccgtgc tcctcagtct 120

gcggttcccg cagatacaac cgctgccccg gaggtggggc cagtgctgcg acctctctat 180

atggatgtgc aagctacaac tcctctggac ccccgggtgc ttgatgccat gctcccttac 240

ctaatcaact actatgggaa cccacactcc cggacacatg cttatggctg ggagagtgag 300

gcagccatgg aacgtgctcg tcagcaagta gcatctctga ttggagctga tcctcgtgag 360

atcattttta ctagtggtgc tactgaatcc aacaacatag caattaaggg ggtggcccga 420

ttctacaggt cacggaaaaa gcacttgatc accacccaga cagaacacaa atgtgtcttg 480

gactcctgcc gttcactgga agctgagggc tttcaggtca cctacctccc agtgcagaag 540

agtgggatca ttgacctaaa ggaactagag gctgctatcc agccagatac tagcctggtg 600

tcagtcatga ctgtgaacaa tgagattgga gtgaagcagc ctattgcaga aatagggcgg 660

atttgcagtt ccagaaaggt atatttccat actgatgcag cccaggctgt tggaaaaatc 720

ccacttgatg tcaatgacat gaaaattgat ctcatgagca ttagtggtca caaaatctac 780

ggtcccaaag gggttggtgc catctacatc cgtcgccggc cccgtgtgcg tgtggaggcc 840

ctgcagagtg gaggggggca ggagcggggt atgcggtctg ggacagtgcc cacaccctta 900

gtggtggggt tgggggctgc gtgtgaggtg gcacagcaag agatggagta tgaccacaag 960

cgaatctcaa agttgtcaga gcggctgata cagaatataa tgaagagcct tccagatgtg 1020

gtgatgaatg gggaccctaa gcaccattat cccggctgta tcaacctctc ctttgcatat 1080

gtggaagggg aaagtctgct gatggcactg aaggacgttg ccttatcctc agggagtgcc 1140

tgcacctctg catccctgga gccctcttat gtgcttagag caattggcac tgatgaggat 1200

ttagcgcact cttctatcag gtttggaatt ggcgctttca ctacagagga ggaagtggac 1260

tacacagtgg agaaatgcat tcagcatgtg aatcgtcttc gagaaatgag ccctctctgg 1320

gagatggttc aggatggcat tgacctcaag agcatcaagt ggacccaaca ctag 1374

<210> 24

<211> 276

<212> DNA

<213> ISD11

<400> 24

atggcagcct ccagtcgcgc acaagtgtta tctctgtacc gggcgatgct gagagagagc 60

aagcgtttca gcgcctacaa ttacagaaca tatgctgtca ggaggataag agatgccttc 120

agagaaaata aaaatgtaaa ggatcctgta gaaattcaaa ccctagtgaa taaagccaag 180

agagaccttg gagtaattcg tcgacaggtc cacattggcc aactgtattc aactgacaag 240

ctgatcattg agaatcgaga catgcccagg acctag 276

<210> 25

<211> 1218

<212> DNA

<213> Chimeric EH-IscS

<400> 25

atgaaattac cgatttatct cgactactcc gcaaccacgc cggtggaccc gcgtgttgcc 60

gagaaaatga tgcagtttat gacgatggac ggaacctttg gtaacccggc ctcccgttct 120

caccgtttcg gctggcaggc tgaagaagcg gtagatatcg cccgtaatca gattgccgat 180

ctggtcggcg ctgatccgcg tgaaatcgtc tttacctctg gtgcaaccga atctgacaac 240

ctggcgatca aaggtgcagc caacttttat cagaaaaaag gcaagcacat catcaccagc 300

aaaaccgaac acaaagcggt actggatacc tgccgtcagc tggagcgcga aggttttgaa 360

gtcacctacc tggcaccgca gcgtaacggc attatcgacc tgaaagaact tgaagcagcg 420

atgcgtgacg acaccatcct cgtgtccatc atgcacgtaa ataacgaaat cggcgtggtg 480

caggatatcg cggctatcgg cgaaatgtgc cgtgctcgtg gcattatcta tcacgttgat 540

gcaacccaga gcgtgggtaa actgcctatc gacctgagcc agttgaaagt tgacctgatg 600

tctttctccg gtcacaaaat ctatggcccg aaaggtatcg gtgcgctgta tgtacgtcgt 660

aaaccgcgcg tacgcatcga agcgcaaatg cacggcggcg gtcacgagcg cggtatgcgt 720

tccggcactc tgcctgttca ccagatcgtc ggaatgggcg aggcctatcg catcgcaaaa 780

gaagagatgg agtatgacca caagcgaatc tcaaagttgt cagagcggct gatacagaat 840

ataatgaaga gccttccaga tgtggtgatg aatggggacc ctaagcacca ttatcccggc 900

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gttgccttat cctcagggag tgcctgcacc tctgcatccc tggagccctc ttatgtgctt 1020

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cttcgagaaa tgagccctct ctgggagatg gttcaggatg gcattgacct caagagcatc 1200

aagtggaccc aacactag 1218

<210> 26

<211> 32

<212> DNA

<213> pCold-SUMO-F

<400> 26

ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tc 32

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> pCold-SUMO-R

<400> 27

aacaaatagg ggttccgcgc acatttc 27

<210> 28

<211> 41

<212> DNA

<213> Kana-F

<400> 28

cggaacccct atttgttgat cttttctacg gggtctgacg c 41

<210> 29

<211> 34

<212> DNA

<213> Kana-R

<400> 29

tcttcaccta gatcccaggt ggcacttttc gggg 34

<210> 30

<211> 5633

<212> DNA

<213> pET28a-SUMO

<400> 30

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

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cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

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catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

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aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac 5100

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caagaagcta agccagaggt caagccagaa gtcaagcctg agactcacat caatttaaag 5220

gtgtccgatg gatcttcaga gatcttcttc aagatcaaaa agaccactcc tttaagaagg 5280

ctgatggaag cgttcgctaa aagacagggt aaggaaatgg actccttaag attcttgtac 5340

gacggtatta gaattcaagc tgatcagacc cctgaagatt tggacatgga ggataacgat 5400

attattgagg ctcacagaga acagattggt ggatccgaat tcgagctccg tcgacaagct 5460

tgcggccgca ctcgagcacc accaccacca ccactgagat ccggctgcta acaaagcccg 5520

aaaggaagct gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac cccttggggc 5580

ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga actatatccg gat 5633

<210> 31

<211> 5603

<212> DNA

<213> pET-SUMO

<400> 31

agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 60

ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atataccatg ggtcatcacc 120

atcatcatca cgggtccctg caggactcag aagtcaatca agaagctaag ccagaggtca 180

agccagaagt caagcctgag actcacatca atttaaaggt gtccgatgga tcttcagaga 240

tcttcttcaa gatcaaaaag accactcctt taagaaggct gatggaagcg ttcgctaaaa 300

gacagggtaa ggaaatggac tccttaagat tcttgtacga cggtattaga attcaagctg 360

atcaggcccc tgaagatttg gacatggagg ataacgatat tattgaggct caccgcgaac 420

agattggagg tcatatggga tccgaattcg agctccgtcg acaagcttgc ggccgcactc 480

gagcaccacc accaccacca ctgagatccg gctgctaaca aagcccgaaa ggaagctgag 540

ttggctgctg ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc 600

ttgaggggtt ttttgctgaa aggaggaact atatccggat tggcgaatgg gacgcgccct 660

gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 720

ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 780

gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac 840

ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 900

gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 960

tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt 1020

tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 1080

ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 1140

cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg aattaattct 1200

tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata 1260

ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat 1320

aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct 1380

attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact 1440

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ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat tcgtgattgc 1560

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ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt taatcgcggc 1980

ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt actgtttatg 2040

taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 2100

agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 2160

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taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 2460

gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 2520

gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 2580

aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 2640

tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 2700

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cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 2820

ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 2880

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gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca 3000

tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg ggtcatggct gcgccccgac 3060

acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca 3120

gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga 3180

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ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag aagcgttaat gtctggcttc 3300

tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt ggtcactgat gcctccgtgt 3360

aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa acgagagagg atgctcacga 3420

tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg ttgtgagggt aaacaactgg 3480

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agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc gctccagcga aagcggtcct 3960

cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac gagttgcatg ataaagaaga 4020

cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca ccggaaggag ctgactgggt 4080

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ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga tctcgacgct ctcccttatg 5340

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<210> 32

<211> 4333

<212> DNA

<213> pBAD-SUMO

<400> 32

aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60

tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120

aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180

attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240

atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg ttttttgggc 300

taacaggagg aattaaccat gaatcacaaa gtgcatcatc atcatcatca cgggtccctg 360

caggactcag aagtcaatca agaagctaag ccagaggtca agccagaagt caagcctgag 420

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aactcgctcg ggctggcccc ggtgcatttt ttaaataccc gcgagaaata gagttgatcg 3540

tcaaaaccaa cattgcgacc gacggtggcg ataggcatcc gggtggtgct caaaagcagc 3600

ttcgcctggc tgatacgttg gtcctcgcgc cagcttaaga cgctaatccc taactgctgg 3660

cggaaaagat gtgacagacg cgacggcgac aagcaaacat gctgtgcgac gctggcgata 3720

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tccatcggtg gatggagcga ctcgttaatc gcttccatgc gccgcagtaa caattgctca 3840

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ttggcaaata ttgacggcca gttaagccat tcatgccagt aggcgcgcgg acgaaagtaa 4020

acccactggt gataccattc gcgagcctcc ggatgacgac cgtagtgatg aatctctcct 4080

ggcgggaaca gcaaaatatc acccggtcgg caaacaaatt ctcgtccctg atttttcacc 4140

accccctgac cgcgaatggt gagattgaga atataacctt tcattcccag cggtcggtcg 4200

ataaaaaaat cgagataacc gttggcctca atcggcgtta aacccgccac cagatgggca 4260

ttaaacgagt atcccggcag caggggatca ttttgcgctt cagccatact tttcatactc 4320

ccgccattca gag 4333

Claims

1.一种外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其特征在于：采用交叉PCR技术，将大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶 IscS 蛋白的 N 端第1-263 位氨基酸的核酸编码序列与人源半胱氨酸脱硫酶 NFS1蛋白C端第316-457位氨基酸的核酸编码序列进行融合，构建得到序列如SEQ ID NO.25所示的嵌合型半胱氨酸脱硫酶表达基因；将所述嵌合型半胱氨酸脱硫酶表达基因通过无缝克隆技术连接到pCold-SUMOa质粒获得重组质粒并进行表达；所述pCold-SUMOa质粒的构建方法如下：以pE-SUMOpro Kan质粒为模板，采用序列如SEQ ID N0.3所示的引物SUMO-F和序列如SEQ ID N0.4所示的引物SUMO-R扩增获得序列如SEQ ID N0.19所示Smt3融合蛋白序列，同时以经Sal I单酶切后的pCold TF质粒为模板，采用序列如SEQ IDN0.1所示的引物pCold-F和序列如SEQ ID N0.2所示的pCold-R扩增获得pCold质粒骨架片段，然后采用无缝克隆技术将上述两个片段连接获得重组质粒，命名为pCold-SUMOa。

2.根据权利要求1所述方法构建的嵌合型半胱氨酸脱硫酶，其特征在于：嵌合型半胱氨酸脱硫酶的稳定性高于人源半胱氨酸脱硫酶，其活性略低于大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶。