附图说明
图1显示本申请的抗CD47单抗与hCD172a竞争结合hCD47的结果。
图2显示基于血凝实验分析本申请的抗CD47单抗的致红细胞凝集效应。
图3显示通过流式细胞术,分析本申请的抗CD47单抗促巨噬细胞吞噬Daudi细胞的效果。
图4显示本申请的抗CD47单抗促进巨噬细胞对Daudi细胞的吞噬率。
图5显示本申请的人源化抗CD47单抗抑制hCD47与hCD172a结合的效果。
图6显示hS2C3及其变体抑制hCD47和hCD172a-D1M1结合的效果。
图7显示本申请的抗CD47单抗致红细胞凝集程度的效果。
图8显示本申请的抗CD47单抗促进巨噬细胞对Daudi细胞的吞噬率。
图9显示本申请的抗CD47单抗抑制小鼠体内肿瘤生长的效果。
图10显示本申请的抗CD47单抗抑制NOD-SCID小鼠体内异种移植人骨髓瘤RPMI8226肿瘤生长的效果。
图11显示了本申请测试得到的CD47-Fab复合物结构,其中A图显示CD47-Fab复合物整体结构;B图显示CD47-Fab复合物结合表面,参与蛋白相互作用的氨基酸残基用棍棒模型表示,两个主要的结合区域用虚线标注,C图显示B图中区域I相互作用的细节;D图显示B图中区域II相互作用的细节。
序列说明
SEQ ID NO:1显示人(homo sapiens)CD47胞外区D1(hCD47)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2显示小鼠(mus musculus)CD47胞外区D1(mCD47)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3显示猕猴(Macaca mulatta)CD47胞外区D1(mmCD47)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4显示人CD172a胞外区免疫球蛋白样结构域的高亲和力突变体(hCD172a-D1M1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5显示His标签(His)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6显示人抗体IgG1的Fc段(Fc)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7显示鼠抗体IgG2a的Fc段(mFc)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8显示人IgG1亚型重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9显示人IgG2亚型重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10显示人IgG4亚型重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11显示鼠IgG1亚型重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12显示鼠IgG2a亚型重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13显示人κ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14显示人λ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15显示鼠κ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16显示鼠λ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18分别显示人源化抗CD47单抗Hu5F9-G4的VH序列和VK序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19显示鼠单链抗体S4D12的全长氨基酸序列,SEQ ID NO:20和21分别显示其VH和VK序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22显示鼠单链抗体S2H2的全长氨基酸序列,SEQ ID NO:23和24分别显示其VH和VK序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25显示鼠单链抗体S2C3的全长氨基酸序列,SEQ ID NO:26和27分别显示其VH和VK序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28和29分别显示人源化S4D12(hS4D12)的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列。
SEQ ID NO:30和31分别显示人源化S2C3(hS2C3)的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列。
SEQ ID NO:32显示重链可变区突变体H10C7的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33显示重链可变区突变体H11E5的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34显示轻链可变区突变体L25B8的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35显示轻链可变区突变体L26A6的氨基酸序列。
发明详细描述
本申请的发明人通过抗体工程技术得到了新的抗人CD47抗体。在本申请的多个方面,提供了新的抗人CD47抗体或其抗原结合片段,编码该抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、制备和纯化该抗体的方法及所述抗体或其抗原结合片段的医学和生物学应用。根据本申请提供的抗体的可变区的序列,可构建全长的抗体分子作为药物用于治疗临床上由CD47介导的疾病。
除非另外指明,本发明的实施采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。
除非另外指明,本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
定义
如本文所用术语“抗体”,是指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合到标靶的免疫球蛋白分子。标靶包括但不限于碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、多肽等。本文所使用的“抗体”不仅包括完整的(即全长的)抗体,而且还包括其抗原结合片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及任何其他包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修改配置,包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。
通常,完整或全长的抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链含有重链变异区(VH)和第一、第二及第三恒定区(CH1、CH2及CH3)。每个轻链含有轻链变异区(VL)和恒定区(CL)。全长的抗体可以是任何种类的抗体,例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或上述的子类),但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链的恒定域的抗体氨基酸序列,可以将免疫球蛋白指定为不同的类别。通常,免疫球蛋白有五种主要的类别:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM,而且这些类别中有几个可以再被进一步区分成子类(同型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构和三维结构是公知的。
如本文所用术语“抗原结合片段或抗原结合部分”,是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区域。抗原结合域可以包含重链变异区(VH)、轻链变异区(VL)或上述两者。VH和VL中的每个通常含有三个互补决定区CDR1、CDR2及CDR3。
本领域技术人员公知,互补决定区(CDR,通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式,即kabat定义和Chothia定义。(参阅例如Kabat,“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991);A1-Lazikani etal.,J.Mol.Biol.273:927-948(1997);以及Martin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989))。对于给定抗体的可变区序列,可以根据Kabat定义或者Chothia定义来确定VH和VL序列中CDR区序列。在本申请的实施方案中,利用Kabat定义CDR序列。
对于给定抗体的可变区序列,可以通过多种方式分析可变区序列中CDR区序列,例如可以利用在线软件Abysis确定(http://www.abysis.org/)。
抗原结合片段的实例包括但不限于:(1)Fab片段,其可以是具有VL-CL链和VH-CH1链的单价片段;(2)F(ab')2片段,其可以是具有两个Fab'片段的二价片段,该两个Fab'片段由铰链区的二硫桥(即Fab'的二聚物)连接;(3)具有抗体的单臂的VL和VH域的Fv片段;(4)单链Fv(scFv),其可以是由VH域和VL域经由胜肽连接符组成的单一多胜肽链;以及(5)(scFv)2,其可以包含两个由胜肽连接符连接的VH域和两个VL域,该两个VL域是经由二硫桥与该两个VH域组合。
如本文所用术语“特异性结合”,是指两个分子之间的非随机结合反应,例如抗体至抗原表位的结合。
本文所用术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体,即,除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外,组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体,其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源,而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源,并且还包括这样的抗体的片段,只要它们能表现出所期望的生物学活性(美国专利号4,816,567;和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
本文所用术语“肿瘤”指由异常细胞生长形成的赘生物或实体病变。肿瘤可以是良性的、恶变前的或恶性的。
“原发性肿瘤”是在个体中最初位点存在的肿瘤,可以与“转移性肿瘤”相区别,转移性肿瘤存在于个体中距原发性肿瘤的远距离部位。
本文所用术语“恶性肿瘤”是指或描述哺乳动物的生理条件,其典型的特征在于不受调控的细胞生长。示例性恶性肿瘤包括:癌、黑素瘤肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞瘤和胚细胞瘤。恶性肿瘤的更多具体实例包括:鳞状细胞癌(例如,鳞状上皮细胞癌),包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌的肺癌,腹膜癌,肝细胞癌,包括胃肠癌的胃癌,胰腺癌,成胶质细胞瘤,子***,卵巢癌,肝癌(liver cancer),膀胱癌,尿路癌,肝细胞瘤,乳腺癌,结肠癌,直肠癌,结肠直肠癌,子宫内膜或子宫癌,唾液腺癌,肾癌,***癌,外阴癌,甲状腺癌,肝癌(hepatic carcinoma),***癌,***癌,黑素瘤,多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤,脑癌及头颈癌以及相关转移灶。
本文所用术语“癌”指由变异的上皮细胞或具有未知的组织学发生、但具有与上皮细胞有关的特定分子学或组织学特征(如产生细胞角蛋白或细胞间桥)的变异细胞组成的侵袭性恶性肿瘤。本申请的示例性癌包括卵巢癌、***癌、子***、子宫癌、***癌、***癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、胰岛瘤、腺癌、腺鳞癌、神经内分泌肿瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、口腔癌、脑癌、成神经管细胞瘤、神经外胚层瘤、胶质瘤、垂体癌和骨癌。
本文所用术语“淋巴瘤”指免疫***的淋巴细胞的恶性肿瘤。淋巴瘤通常以实体瘤存在。示例性淋巴瘤包括:非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、原发性巨球蛋白血症(macroglobulinemia)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、结内边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性淋巴瘤、经典霍奇金淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤、结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、母细胞NK细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、赛谢综合征、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴增生病、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、非特指型外周T细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。经典霍奇金淋巴瘤的示例性形式包括:结节性硬化型、混合细胞型、淋巴细胞富集型和淋巴细胞消减型或非消减型。
本文所用术语“肉瘤”为来自由胚胎中胚层发育的多种组织之一中的变异细胞的恶性肿瘤。因此,肉瘤包括骨、软骨、脂肪、肌肉、血管和造血组织的肿瘤。例如,来自骨的骨肉瘤、来自软骨的软骨肉瘤、来自脂肪的脂肪肉瘤和来自平滑肌的平滑肌肉瘤。示例性的肉瘤包括:Askin瘤、葡萄状肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤-PNET、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤。软组织肉瘤的亚类包括:软组织腺泡状肉瘤、血管肉瘤、叶状囊肉瘤、皮肤纤维肉瘤硬纤维瘤、促纤维化小圆细胞肿瘤、上皮样肉瘤骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波济氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、***肉瘤、淋巴肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。
本文所用术语“白血病”为血液或骨髓的恶性肿瘤,特征在于白细胞的异常增多。白血病是广义术语,其涵盖了一系列疾病。因此,白血病是更广泛的称为血液肿瘤的疾病种类的一部分。白血病细分为多个大类;第一种分类是白血病的急性和慢性形式。急性白血病的特征在于未成熟的血细胞数量的快速增长。由于这些细胞的积聚使得骨髓不能制造健康的血细胞。慢性白血病的特征在于相对成熟、但仍为异常的白细胞的过度产生。通常通过数月或数年的发展,所述细胞的产生速率大大高于正常细胞,导致血液中有很多的异常白细胞。白血病也可以通过受累的血细胞进行细分。这样的分界将白血病划分为成淋巴细胞或淋巴细胞白血病和骨髓性(myeloid)或骨髓性(myelogenous)白血病。在成淋巴细胞或淋巴细胞白血病中,癌变发生在通常继续形成淋巴细胞的骨髓细胞类型中。在骨髓性(myeloid)或骨髓性(myelogenous)白血病中,癌变发生在通常继续形成红细胞、一些其他类型的白细胞和血小板的骨髓细胞类型中。结合这两种分类提供了总共四种主要类别。在这四种主要分类的每一种中,通常有一些亚类别。还存在分类方案之外的罕见类型。示例性的白血病包括:急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、毛细胞性白血病(HCL)、T细胞幼淋巴细胞性白血病、大颗粒淋巴细胞白血病、幼年型粒-单核细胞白血病、B细胞幼淋巴细胞性白血病、伯基特白血病和成人T细胞性白血病。
在本文给出的核酸序列中涉及兼并碱基(除了A、T、C、G常规碱基之外)的使用,其含义与本领域技术人员通常理解的相同。例如,R代表A或G;Y代表C或T,M代表A或C;K代表G或T;S代表C或G;W代表A或T;H代表A或C或T;B代表C或G或T;V代表A或C或G;D代表A或G或T;N代表A或C或G或T。
第一方面,本申请提供了一种特异性结合人CD47的抗体,其包含含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区和含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区,其中
所述HCDR1序列为NYWMH,所述HCDR2序列为VIAPSDNYTNYNQKFQG,所述HCDR3序列为GGKYSMDY,所述LCDR1序列为RSSQSIVHSNGNTYLE,所述LCDR2序列为KVSNRFS,所述LCDR3序列为FQGSHVPFT;或者
所述HCDR1序列为SYWMH,所述HCDR2序列为TIDRSDSYISYNQKFKG,所述HCDR3序列为GGPYGSKMMDN,所述LCDR1序列为HASQNINVWLS,所述LCDR2序列为KASNLHT,所述LCDR3序列为QQGQSYPLT;或者
所述HCDR1序列为DYYMH,所述HCDR2序列为WIYPSSGNTKYAQKFKD,所述HCDR3序列为REEDYFDY,所述LCDR1序列为KSSQSLLYSSNKKNYLT,所述LCDR2序列为WASTRES,所述LCDR3序列为QQFYAYPIS;或者
所述HCDR1序列为DYYMH,所述HCDR2序列为WIYPSSGNTKYAQKFKD,所述HCDR3序列为REEDYFDY,所述LCDR1序列为KSSQSVLYSSNQKNYLT,所述LCDR2序列为WASTRES,所述LCDR3序列为GQYYAYPIT;或者
所述HCDR1序列为DYYMH,所述HCDR2序列为WIYPGSGNTRYSQKFKD,所述HCDR3序列为REEDYFDY,所述LCDR1序列为KSSQSLLYSSNKKNYLT,所述LCDR2序列为WASTRES,所述LCDR3序列为QQFYAYPIS;或者
所述HCDR1序列为DYYMH,所述HCDR2序列为WIYPGSGNTRYSQKFKD,所述HCDR3序列为REEDYFDY,所述LCDR1序列为KSSQSVLYSSNQKNYLT,所述LCDR2序列为WASTRES,所述LCDR3序列为GQYYAYPIT;
其中HCDR和LCDR序列根据Kabat定义。
在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:23、28、30、32或者33所示。
在一些实施方案中,所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24、29、31、34或者35所示。
在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示,所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示;或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示,所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示;或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示,所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示;或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示,所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示;或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示,所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示;或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示,所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示;或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示,所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示。
第二方面,本申请提供了一种特异性结合人CD47的抗体,其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:23、28、30、32或者33中任何一项具有至少90%的一致性,并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:24、29、31、34或者35中任何一项具有至少90%的一致性。
第三方面,本申请提供了一种特异性结合人CD47的抗体,其中所述抗体与SEQ IDNO:1所示人CD47区段的结合表位为不连续表位,包括氨基酸Q1,E29,A30,Q31,N32,E35,E97,E100,L101,T102,R103,E104,G105和E106,上述残基编号参照SEQ ID NO:1。
在第一方面至第三方面的一些实施方案中,所述抗体为单克隆抗体。
在第一方面至第三方面的一些实施方案中,所述抗体为非激活型抗体。
在第一方面至第三方面的一些实施方案中,所述抗体能结合并中和人CD47,进而阻断CD47-SIRPα信号通路。在一些事实方案中,所述抗体能促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用,抑制肿瘤细胞的体内生长,而不增加巨噬细胞对正常血细胞的吞噬。
在第一方面至第三方面的一些实施方案中,所述抗体具有至少一项以下性质:
以低于5nM的KD值的亲和力结合重组人CD47胞外区D1(SEQ ID NO:1);
以低于5nM的IC50值抑制CD172a高亲和力突变体(SEQ ID NO:4)与人CD47-Fc的结合;
在0-133nM浓度下施用不导致红细胞聚集。
在第一方面至第三方面的一些实施方案中,所述抗体为全抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或单链Fv片段(scFv)。
在第一方面至第三方面的一些实施方案中,所述抗体为全人源抗体。
在第一方面至第三方面的一些实施方案中,所述抗体还包含选自IgG1亚型、IgG2亚型或IgG4亚型的重链恒定区和/或包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区。
第四方面,本申请提供了核酸分子,其编码第一方面至第三方面所述的抗体或其抗原结合部分。
在一些实施方案中,所述核酸分子可操作地连接到调控序列,调控序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。
第五方面,本申请提供了药物组合物,其包含第一方面至第三方面所述的抗体和药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
在一些实施方案中,所述药物组合物用于治疗CD47介导的疾病。
在一些实施方案中,所述疾病为肿瘤,例如恶性肿瘤。
在一些实施方案中,恶性肿瘤为伯基特淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中,药物组合物还可包含下述中的一种或多种:润滑剂,如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油;润湿剂;乳化剂;悬浮剂;防腐剂,如苯甲酸、山梨酸和丙酸钙;增甜剂和/或调味剂等。
在一些实施方案中,可将本申请中的药物组合物配制为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、酏剂、悬液、乳剂、溶液、糖浆、栓剂或胶囊等形式。
在一些实施方案中,可以利用任何生理上可接受的给药方式递送本申请的药物组合物,这些给药方式包括但不限于:口服给药、肠胃外给药、经鼻给药、直肠给药、腹膜内给药、血管内注射、皮下给药、经皮给药、吸入给药等。
在一些实施方案中,可以通过混合具有所需纯度的试剂与视情况的药学上可接受的载体、赋形剂等,以冻干制剂或水溶液的形式配制用于治疗用途的药物组合物用于存储。
第六方面,本申请提供了第一方面至第三方面所述的抗体在制备用于预防或治疗CD47介导的疾病的药物中的用途。
在一些实施方案中,所述疾病为肿瘤,例如恶性肿瘤。
在一些实施方案中,恶性肿瘤为伯基特淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
第七方面,本申请提供了预防或治疗CD47介导的疾病的方法,包括向有需要的个体给予第一方面至第三方面所述的抗体或第五方面的药物组合物。
在一些实施方案中,所述疾病为肿瘤,例如恶性肿瘤。
在一些实施方案中,恶性肿瘤为伯基特淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
在其他方面,本申请还提供包含编码本申请抗体或其抗原结合部分的分离的核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或载体的宿主细胞。
在其他方面,本申请还提供产生本申请抗体的方法。在一些实施方案中,产生抗体的方法包括培养宿主细胞以便于表达核酸。在一些实施方案中,产生抗体的方法还包括从宿主细胞培养基中回收抗体。
应当理解,以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容,而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。
以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。
实施例5)分别筛选重链和轻链的高亲和力突变体。
1.hS2C3重链突变库的构建及筛选
利用常规分子生物学方法构建hS2C3重链可变区的突变库,库容为6.5×10E5,突变库的正确率约为95%,其中在HCDR1和HCDR2中引入突变所需引物见表5。以重组huCD47-his为抗原,利用固相筛选策略对hS2C3-HCDR12突变库进行了3轮筛选,最终得到亲和力进一步提高的两个突变体H10C7(SEQ ID NO:32)和H11E5(SEQ ID NO:33)。
表5:hS2C3重链可变区突变库扩增所需引物
2.hS2C3轻链突变库的构建及筛选
类似地,利用表6中的兼并引物,通过重叠延伸PCR技术在hS2C3轻链可变区的LCDR1和LCDR3中引入突变并构建突变库。构建库容量约3.1×10E6,正确率约为90%。以重组huCD47-his为抗原,利用固相筛选策略对hS2C3-LCDR13突变库进行了3轮筛选,最终得到亲和力进一步提高的两个突变体L25B8(SEQ ID NO:34)和L26A6(SEQ ID NO:35)
表6:hS2C3轻链可变区突变库构建所需引物
3.hS2C3突变体的鉴定
利用筛选到的两种高亲和力轻链突变体和两种高亲和力重链突变体进行组合,制备了四种人源化抗体hS2C3的突变体:利用筛选到的两种高亲和力轻链突变体和两种高亲和力重链突变体进行组合,制备了四种人源化抗体hS2C3的突变体:H10C7+L25B8、H10C7+L26A6、H11E5+L25B8和H11E5+L26A6,并参照实施例3中的方法对四种hS2C3的突变体进行了亲和力和功能分析。
利用BIAcore对四种突变体的亲和力分析显示(表7):四种突变体较人源化抗体hS2C3的亲和力有5-10倍的提高,而且四种突变体都能有效抑制hCD47结合hCD72a-D1M1(图6),而且IC50都低于5nM(表8)。
表7:hS2C3突变体的亲和力常数
抗体 |
Kon |
Koff |
KD |
H10C7+L25B8 |
1.031E+6 |
1.151E-3 |
1.115E-9 |
H10C7+L26A6 |
8.33E+5 |
1.932E-3 |
2.32E-9 |
H11E5+L25B8 |
1.189E+6 |
9.597E-4 |
8.072E-10 |
H11E5+L26A6 |
9.297E+5 |
1.7E-3 |
1.829E-9 |
hS2C3 |
1.078E+6 |
1.029E-2 |
0.955E-8 |
表8:hS2C3突变体抑制hCD47和hCD172a-D1M1结合的IC50
|
H10C7+L26A6 |
H11E5+L26A6 |
H10C7+L25B8 |
H11E5+L25B8 |
hS2C3 |
IC50 |
4.25 |
3.521 |
4.511 |
4.129 |
4.13 |
红细胞凝集实验显示(图7)四种亲和力提高的人源化抗CD47单抗在0-133nM浓度范围内都不会导致红细胞凝集,而且四种人源化突变体都能够促进巨噬细胞对CD47+肿瘤细胞(Daudi)的吞噬(图8)。
4.人源化抗CD47单抗体内抑制肿瘤生长
利用人伯基特淋巴瘤raji细胞,以1×104细胞/小鼠的量,皮下接种于雄性NSG小鼠,在肿瘤体积长至100cm3时随机分为5组,每组8只小鼠:(1)介质对照组;(2)20mg/kgH10C7+L26A6组;(3)10mg/kgH10C7+L26A6组;(4)3mg/kg H10C7+L26A6组;(5)10mg/kghu5F9-IgG4组。每周腹腔给药两次,一共3周。给药过程中,一周3次测量肿瘤大小及动物体重以评价抗CD47抗体的抑瘤作用。实验结果如图9所示,图9中横坐标为raji肿瘤的荷瘤小鼠接受药物处理的时间,纵坐标为肿瘤体积。结果表明:与介质对照组相比,人源化抗CD47单抗H10C7+L26A6能够抑制肿瘤的生长,其抑制能力与对照抗体hu5F9-IgG4相当。
5.人源化抗CD47单抗在人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞皮下异种移植NOD/SCID小鼠动物模型中的抑制肿瘤生长作用
在细胞接种前一天,将小鼠进行60Co照射处理(150rad)。雄性NOD/SCID小鼠于右侧背部皮下接种1×107RPMI8226细胞,细胞重悬在PBS与基质胶(matrigel)的1:1混悬液中(0.1ml/只)。待肿瘤平均体积达到80-100mm3时,称量所有小鼠的体重,测量肿瘤体积后随机分组给药。肿瘤细胞接种当天定义为第0天。共分为5组,每组8只小鼠:(1)介质对照组(i.p.BIW*4,p.o.QD*4);(2)10mg/kg达雷木单抗(daratumumab)(i.p.BIW*4)组;(3)10mg/kg H10C7+L26A6(i.p.BIW*4)组;(4)50mg/kg来那度胺(lenolidomide)(p.o.QD*4)组;⑤10mg/kg达雷木单抗(i.p.BIW*4)+50mg/kg来那度胺(p.o.QD*4)组。给药过程中,一周3次测量肿瘤大小及动物体重。达雷木单抗为已上市的针对多发性骨髓瘤的单抗药物,来那度胺为临床多发性骨髓瘤常规用药。实验结果如图10所示,图10中横坐标为皮下异种移植RMPI8226肿瘤的NOD-SCID荷瘤小鼠接受药物处理的时间,纵坐标为肿瘤体积,和介质对照组相比,人源化抗CD47单抗H10C7+L26A6能够显著抑制肿瘤的生长,其抑瘤能力要显著高于达雷木单抗、来那度胺和达雷木单抗+来那度胺的联合用药。
6.人源化抗CD47单抗H10C7+L26A6的CD47结合表位分析
为了研究人源化单抗H10C7+L26A6与人CD47的结合表位,利用HEK293细胞制备重组的H10C7+L26A6Fab片段以及重组的人CD47胞外区D1(hCD47,SEQ ID NO:1)形成Fab-hCD47复合物,在2.0M硫酸铵+5%异丙醇条件下形成复合物晶体,对复合物晶体进行X射线衍射实验,收集到分辨率的数据(表9),并通过分子置换法解析了CD47抗原抗体复合物的晶体结构。最终得到的结构模型包括CD47胞外区1-116aa(SEQ ID NO:1)、抗体重链1-219aa、轻链1-219aa。抗体H链和L链最后一个氨基酸残基在电子密度中均不可见,提示其在晶体中没有固定结构。在复合物晶体结构中,CD47以单体形式存在,而且在N16、N32、N55和N93位点存在可见的糖基化。
CD47与Fab的相互作用面积约为其中CD47与重链的相互作用面积约为与轻链的相互作用面积约为相互作用主要涉及CD47的N端、BC环、β-链F、FG环和β-链G,而抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3,轻链可变区的LCDR1、LCDR3参与了对CD47的识别(图11)。相互作用方式包括氢键、盐键、范德华力以及疏水相互作用(表10)。其中,人源化抗CD47单抗H10C7+L26A6识别人CD47的一个不连续(空间)表位,主要包括氨基酸Q1,E29,A30,Q31,N32,E35,E97,E100,L101,T102,R103,E104,G105和E106。
据文献报道,抗人CD47单抗hu5F9单抗的抗原结合表位包括氨基酸Q1,E29,K39,K41,E97,T99,R103和E104;而抗人CD47单抗2A1的抗原表位包括氨基酸Y37,K39,K41,K43,G44,R45,D46,D51,H90,N93,E97,T99,E104和E106。抗人CD47单抗H10C7+L26A6、hu5F9和2A1的表位都有部分重叠,但又都不完全相同。
为了进一步对抗人CD47单抗H10C7+L26A6的表位进行验证,挑选表位中的部分氨基酸位点,利用常规分子生物学方法制备了三种hCD47的突变体,包括Q1A,E35A和L101A,并利用BIAcore测定了人源化抗CD47单抗H10C7+L26A6与这些hCD47突变体的亲和力,并与天然的hCD47进行了比较(表11)。结果显示:L101A点突变导致完全不结合,Q1A的突变导致亲和力下降约100倍,而E35A突变导致亲和力提高约4倍。表明这些构成单抗H10C7+L26A6表位的关键氨基酸的突变将直接导致抗体-抗原亲和力的变化(降低或者提高)。同时分析抗人CD47单抗hu5F9与这些突变体的亲和力发现(表11),只有hCD47中的Q1A突变影响hu5F9与人CD47的亲和力,而hCD47中的E35A和L101A突变对hu5F9的亲和力没有明显的改变。此结果与hu5F9的抗原表位中包括Q1,而不包括E35和L101一致。
表9.复合物晶体的X射线衍射收据收集及统计
*括号中的数值是对于最高分辨率壳
表10:参与Fab-hCD47结合的氨基酸残基
表11:基于BIAcore分析不同hCD47突变体与人源化抗CD47单抗的亲和力
参考文献
1.Brown,E.J.and Frazier,W.A.(2001)Integrin-associated protein(CD47)and its ligands.Trends Cell Biol.11,130–135
2.Neel,B.G.,Gu,H.,and Pao,L.(2003)The‘Shp’ing news:SH2domain-containing tyrosine phosphatases in cell signaling.Trends Biochem.Sci.28,284-293
3.Matozaki,T.,Murata,Y.,Saito,Y.,et al.(2009)Protein tyrosinephosphatase SHP-2:a proto-oncogene product that promotes Rasactivation.Cancer Sci.100,1786-1793
4.Barclay,A.N.and van den Berg,T.K.(2013)The interaction betweensignal regulatory protein alpha(SIRPa)and CD47:structure,function,andtherapeutic target.Annu.Rev.Immunol.,DOI:10.1146/annurev-immunol-032713-120142
5.Oldenborg,P.A.,Zheleznyak,A.,Fang,Y.F.,et al.(2000)Role of CD47as amarker of self on red blood cells.Science 288,2051-2054
6.Oldenborg,P.A.,Gresham,H.D.,and Lindberg,F.P.(2001)CD47-signalregulatory protein a(SIRPa)regulates Fcgamma and complement receptor-mediatedphagocytosis.J.Exp.Med.193,855-862
7.Tsai,R.K.and Discher,D.E.(2008)Inhibition of“self”engulfmentthrough deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between humancells.J.Cell Biol.180,989–1003
8.Seiffert,M.et al.(2001)Signal-regulatory protein a(SIRPa)but notSIRPb is involved in T-cell activation,binds to CD47with high affinity,and isexpressed on immature CD34+CD38-hematopoietic cells.Blood 97,2741–2749
9.Brown,E.J.and Frazier,W.A.(2001)Integrin-associated protein(CD47)and its ligands.Trends Cell Biol.11,130–135
10.Majeti,R.,Chao,M.P.,Alizadeh,A.A.,et al.(2009)CD47 is an adverseprognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloidleukemia stem cells.Cell 138,2861-299
11.Chao,M.P.,Alizadeh,A.A.,Tang,C.,et al.(2010)anti-CD47 antibodysynergizes with rituximab to promote phagocytosis and eradicate non-Hodgkinlymphoma.Cell 142,699-713
12.Willingham,S.B.,Volkmer,J.P.,Gentles,A.J.,et al.(2012)The CD47-signal regulatory protein alpha(SIRPa)interaction is a therapeutic target forhuman solid tumors.Proc.Natl Acad.Sci.USA 109,6662-6667
13.Chao,M.P.,Alizadeh,A.A.,Tang,C.,et al.(2011)Therapeutic antibodytargeting of CD47 eliminates human acutelymphoblastic leukemia.Cancer Res.71,1374-1384
14.Jaiswal,S.,Jamieson,C.H.,Pang,W.W.,et al.(2009)CD47 is upregulatedon cir-culating hematopoietic stem cells and leukemia cells to avoidphagocytosis.Cell 138,271-285
15.Jie Liu,Lijuan Wang,Feifei Zhao,et al.(2015)Pre-ClinicalDevelopment of a Humanized anti-CD47 Antibody with anti-Cancer TherapeuticPotential.Plos One DOI:10.1371/journal.pone.0137345
16.Kipp Weiskopf,Aaron M.Ring,Chia Chi M.Ho,et al.Engineered SIRPαvariants as immunotherapeutic adjuvants to anti-cancer antibodies.(2013)Science 341,6141
17.Kipp Weiskopf,Nadine S.Jahchan,Peter J.Schnorr,et al.CD47-blockingimmunotherapies stimulate macrophage-mediated destruction of small-cell lungcancer.(2016),The Journal of Clinical Investigation,126(7):2610
18.Patent reference,US2014/0140989 A1,P38
序列表
<110> 北京智仁美博生物科技有限公司
智翔(上海)医药科技有限公司
重庆智翔金泰生物制药有限公司
<120> 抗人CD47抗体及其用途
<130> 18C10410CN
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Gly Asn
1 5 10 15
Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn
20 25 30
Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr
35 40 45
Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser
50 55 60
Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu
65 70 75 80
Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys
85 90 95
Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys
100 105 110
Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu
115 120
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<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
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Gln Leu Leu Phe Ser Asn Val Asn Ser Ile Glu Phe Thr Ser Gly Asn
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Glu Thr Val Val Ile Pro Cys Ile Val Arg Asn Val Glu Ala Gln Ser
20 25 30
Thr Glu Glu Met Phe Val Lys Trp Lys Leu Asn Lys Ser Tyr Ile Phe
35 40 45
Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Asn Ser Thr Thr Thr Asp Gln Asn Phe Thr
50 55 60
Ser Ala Lys Ile Ser Val Ser Asp Leu Ile Asn Gly Ile Ala Ser Leu
65 70 75 80
Lys Met Asp Lys Arg Asp Ala Met Val Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Val
85 90 95
Thr Glu Leu Ser Arg Glu Gly Lys Thr Val Ile
100 105
<210> 3
<211> 109
<212> PRT
<213> 猕猴(Macaca mulatta)
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Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Gly Asn
1 5 10 15
Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn
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Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr
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Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys
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Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile
100 105
<210> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Glu Glu Val Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
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Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Leu Thr Ser Leu Ile Pro
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Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu
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Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Gly Thr Arg Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys
115
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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His His His His His His
1 5
<210> 6
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
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Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 7
Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile
20 25 30
Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val
50 55 60
Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp
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Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln
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Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val
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Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu
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Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr
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Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr
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Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
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Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 9
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
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Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
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Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
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180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 10
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
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Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
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260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
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<210> 11
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<213> 小家鼠(Mus musculus)
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1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
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Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
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Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
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Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
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Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
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Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
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Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
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Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys
<210> 12
<211> 330
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 12
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195 200 205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
210 215 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245 250 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
260 265 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275 280 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
290 295 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305 310 315 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325 330
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 14
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 15
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
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Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 16
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 16
Gly Gln Pro Lys Ser Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Glu Thr Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Thr Ile Thr Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Val Val Thr Val Asp Trp Lys Val Asp Gly Thr Pro
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Val Thr Gln Gly Met Glu Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
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Arg His Ser Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val
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<210> 17
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 19
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ala Pro Ser Asp Asn Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Lys Gly Gly Lys Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro
130 135 140
Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
145 150 155 160
Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys
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180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys
<210> 20
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
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Gly Val Ile Ala Pro Ser Asp Asn Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
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Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
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20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Asp Arg Ser Asp Ser Tyr Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala
145 150 155 160
Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Leu Lys
<210> 23
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Thr Ile Asp Arg Ser Asp Ser Tyr Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Gly Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Gly Gly Pro Tyr Gly Ser Lys Met Met Asp Asn Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 25
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Ser Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Ala Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala
130 135 140
Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Leu Tyr Pro Ser Asn Lys Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
180 185 190
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gln Glu Tyr Tyr Ala Tyr Pro Leu Ser Phe Gly Ala Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 26
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Ser Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Ala Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Pro
20 25 30
Ser Asn Lys Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Glu
85 90 95
Tyr Tyr Ala Tyr Pro Leu Ser Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 28
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ala Pro Ser Asp Asn Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Lys Gly Gly Lys Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
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<210> 29
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 30
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
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65 70 75 80
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Pro
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Lys
<210> 32
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe
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100 105 110
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115
<210> 33
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
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65 70 75 80
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Ala Arg Arg Glu Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
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<210> 34
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Lys Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Lys
<210> 35
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
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Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
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Lys