CN108490086A

CN108490086A - 利用液相色谱-离子淌度差分质谱联用技术定量分析福大赛因同分异构体的方法

Info

Publication number: CN108490086A
Application number: CN201810203841.0A
Authority: CN
Inventors: 郑昕; 崔馨戈; 江骥
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2018-03-13
Filing date: 2018-03-13
Publication date: 2018-09-04
Anticipated expiration: 2038-03-13
Also published as: CN108490086B

Abstract

本发明提供一种利用高效液相色谱‑离子淌度差分质谱串联装置定量分析福大赛因的四种同分异构体FD‑1、FD‑2、FD‑3和FD‑4的方法，所述方法包括以下步骤：1)制备福大赛因样品溶液；2)将所述样品溶液注入到高效液相色谱‑离子淌度差分质谱串联装置中，获得质量色谱图；3)根据所述质量色谱图使用外标法定量分析福大赛因的四种同分异构体FD‑1、FD‑2、FD‑3和FD‑4，其中，在所述高效液相色谱中使用由流动相A和流动相B组成的混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为pH值在9.5～11.5范围内的弱碱性水性流动相，所述流动相B为甲醇和乙腈的混合物。

Description

利用液相色谱-离子淌度差分质谱联用技术定量分析福大赛因同分异构体的方法

技术领域

本发明涉及生物化学和药物分析化学领域，更具体地涉及一种利用液相色谱-离子淌度差分质谱定量分析福大赛因同分异构体的方法。

背景技术

光动力疗法(Photodynamic therapy，PDT)作为一种癌症治疗的新手段，近来得到了广泛的关注。光动力疗法的应用基于三个关键因素：光敏剂，特定波长的激光和氧气。

福大赛因是一种两亲性二磺酸基二邻苯二甲酰亚胺甲基酞菁锌二钾盐，由四种同分异构体FD-1，FD-2，FD-3和FD-4组成。

作为一种新型的抗癌酞菁类光敏剂，中国国家食品药品监督管理局(CFDA)于2008年6月批准了福大赛因的临床试验，目前正在进行II期临床试验。根据临床试验结果，福大赛因比已上市的光敏剂更有效地渗透到癌症组织中，在临床应用上具有很好的潜力。

而光敏剂的药物代谢动力学特征对于光敏剂临床应用，尤其是在优化激光治疗时间和给药后患者避免日光的时间方面都是非常重要的。而对于福大赛因而言，是将四种异构体混合物作为一个新型化学实体进行临床研究，在临床研究中考察这四种异构体之间是否存在药物代谢动力学差异是非常重要的，因此开发一种能够在生物基质中快速同时定量福大赛因四种同分异构体的分析方法，对于研究福大赛因的药物代谢动力学特征是尤为迫切的。

在现有技术中，只有使用高效液相色谱方法来分离分析福大赛因四种同分异构体的方法，而此方法分析时间长，特异性差且分析灵敏度较差，不能满足药物代谢动力学研究的要求。因此亟需开发一种快速、特异性、高灵敏度且高稳定性的定量分析方法来同时定量福大赛因的四种同分异构体。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用液相色谱-离子淌度差分质谱联用技术定量分析福大赛因同分异构体的方法。

本发明的一个方面涉及一种利用高效液相色谱-离子淌度差分质谱串联装置定量分析福大赛因的四种同分异构体FD-1、FD-2、FD-3和FD-4的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)制备福大赛因样品溶液；

2)将所述样品溶液注入到高效液相色谱-离子淌度差分质谱串联装置中，获得质量色谱图；

3)根据所述质量色谱图使用外标法定量分析福大赛因的四种同分异构体FD-1、FD-2、FD-3和FD-4，

其中，在所述高效液相色谱中使用由流动相A和流动相B组成的混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为pH值在9.5～11.5范围内的弱碱性水性流动相，所述流动相B为甲醇和乙腈的混合物。

在一个优选实施方案中，所述梯度洗脱程序的总时长不超过15分钟，优选不超过10分钟，其中起始流动相和最终流动相均为90％流动相A+10％流动相B，且流动相B的浓度梯度从30％变化到45％所用的时间为4.5min至6.0min。

在一个优选实施方案中，所述梯度洗脱程序为：

0.0至5.7min，10体积％至45体积％流动相B；5.7至6.5min，45体积％至90体积％流动相B；6.5至9.0min，90体积％至10体积％流动相B；

其中流动相A和流动相B的总量为100体积％。

在一个优选实施方案中，所述梯度洗脱程序为：

0.0至0.5min，10体积％至30体积％流动相B；0.5至1.0min，30体积％至32体积％流动相B；1.0至1.5min，32体积％至35体积％流动相B；1.5至2.5min，35体积％至38体积％流动相B；2.5至5.0min，38体积％至45体积％流动相B；5.0至5.7min，45体积％流动相B；5.7至5.8min，45体积％至90体积％流动相B；5.8至6.5min，90体积％流动相B；6.5至7.5min，90体积％至10体积％流动相B；7.5至9.0min，10体积％流动相B。

在一个优选实施方案中，所述高效液相色谱中的色谱柱为反相色谱柱，优选以十八烷基硅烷键合硅胶填充的色谱柱。

在一个优选实施方案中，所述流动相A为0.01质量％至0.02质量％的氨水，所述流动相B中甲醇和乙腈的体积比为10∶90至40∶60，优选20∶80。

在一个优选实施方案中，在所述离子淌度差分质谱中，用于FD-1的离子淌度差分补偿电压为-22.6V，用于FD-2的离子淌度差分补偿电压为-24.8V，用于FD-3的离子淌度差分补偿电压为-20.4V，用于FD-4的离子淌度差分补偿电压为-22.6V。

在一个优选实施方案中，所述制备福大赛因样品溶液包括：用N，N-二甲基甲酰胺溶解福大赛因粉末，然后用由甲醇、乙腈和水组成的稀释液稀释。

在一个优选实施方案中，所述福大赛因来自受试者的血浆。

在一个优选实施方案中，所述制备福大赛因样品溶液包括：向所述血浆中加入由甲醇和乙腈组成的沉淀剂，将所得混合物离心，取上清液并加水稀释。

本发明的方法能够同时准确定量分析福大赛因的四种同分异构体，以满足临床药物代谢动力学研究的需求。与现有技术相比，本发明首次应用高效液相色谱-离子淌度差分质谱技术同时分离定量福大赛因的四种同分异构体，本方法将现有技术的分析时间从几十分钟缩短到几分钟，且本方法具有灵敏度高，稳定性好，特异性强和数据重现性强等优点，具有较高的实用性和可靠性，能够在血浆中同时准确定量福大赛因的四种同分异构体，即FD-1，FD-2，FD-3和FD-4。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施方案描述中所使用的附图作简单地介绍。

图1为通过高效液相色谱-离子淌度差分质谱串联装置获得的福大赛因四种同分异构体的质量色谱图。

图2为福大赛因四种同分异构体的检测典型标准曲线。

图3示出根据本发明的方法对福大赛因进行药物代谢动力学研究的结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅为本公开一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在下面给出本发明的技术方案的具体实施例，但本领域技术人员能够理解，以下具体实施例仅是实施本发明的多种方案中的一部分示例，它们不应被理解为以任何方式限制本发明的范围。

实施例中使用的试剂及原料：

福大赛因对照品粉末(福建省龙华药业有限责任公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，赛默飞世尔)；氨水(分析纯，广州化学试剂厂)；N，N-二甲基甲酰胺(分析纯，Amresco公司，Solon，美国)；若无特别说明，在实验过程中使用的纯净水均由Milli-Q水纯化***(Millipore公司，Molsheim，法国)制备而成。

下列实施例中采用的仪器：

高效液相色谱 LC AD***(Sciex公司，Concord，加拿大)；离子淌度差分质谱仪为 DMS***联合6500***(SCIEX公司，Concord，加拿大)。

实施例1：福大赛因四种同分异构体的定量分析

本实施例说明通过高效液相色谱-离子淌度差分质谱联用技术对福大赛因四种同分异构体的分离定量。

溶液配制：称量福大赛因混合物粉末10mg，使用10mL N，N-二甲基甲酰胺溶解，配制为浓度1mg/mL的溶液，使用稀释液(甲醇∶乙腈∶水＝25∶25∶50)稀释为800ng/mL的溶液，取10-20μL上述溶液注入高效液相色谱-离子淌度差分质谱串联装置中，获得质量色谱图(图1)。福大赛因的四种同分异构体通过色谱和离子差分二维分离实现完全分离，因此能够实现同时定量。

高效液相色谱条件：

色谱柱：Waters UPLC BEH C₁₈柱，规格：2.1×50mm，1.7μm

流动相：流动相A(0.0167质量％氨水)和流动相B(甲醇：乙腈体积比为20：80)

梯度洗脱程序：

0.0至0.5min，10体积％至30体积％流动相B；0.5至1.0min，30体积％至32体积％流动相B；1.0至1.5min，32体积％至35体积％流动相B；1.5至2.5min，35体积％至38体积％流动相B；2.5至5.0min，38体积％至45体积％流动相B；5.0至5.7min，45体积％流动相B；5.7至5.8min，45体积％至90体积％流动相B；5.8至6.5min，90体积％流动相B；6.5至7.5min，90体积％至10体积％流动相B；7.5至9.0min，10体积％流动相B；其中流动相A和流动相B的总量为100体积％。

流速：0.2mL/min

柱温：40℃

自动进样器温度：10℃

进样体积：10-20μL

所述离子淌度差分质谱的工作参数在以下表1中示出：

表1：离子淌度差分质谱的工作参数

实施例2：方法学验证

本实施例说明血浆中福大赛因四种同分异构体定量分析方法的方法学验证。

血浆样本制备方法：

取50μL含有福大赛因的血浆，加入200μL沉淀剂(甲醇：乙腈＝50：50)，离心5分钟，取100μL上清液，加入100μL水，混合，取10-20μL进样。

采用本发明提供的分析方法，使用外标法进行定量分析。对方法的特异性、标准曲线、定量下限、精密度和准确度、基质效应和回收率进行验证。

A.特异性：采用6个不同志愿者的个体血浆样本，使用本发明提供的分析方法测定，在得到的质量色谱图中根据保留时间可以判断血浆中没有内源性物质的干扰。

B.标准曲线：配制含有福大赛因四种同分异构体FD-1，FD-2，FD-3和FD-4浓度为10-2000ng/mL的血浆标准曲线，采用本发明提供的定量方法进行测定。以浓度为横坐标，四种同分异构体峰面积为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线见图2。标准曲线相关系数＞0.99，线性相关性良好。

C.定量下限、精密度和准确度：配制4个不同浓度的质量控制样本(定量下限(LLOQ)、低浓度质控(LQC)、中浓度质控(MQC)和高浓度质控(HQC))，采用本发明提供的定量方法重复制备和测定5个样本，连续测定3批，计算日内和日间精密度和准确度。结果如表1所示，定量下限精密度结果RSD＜20％，准确度结果：偏差维持在20％以内，低中高3种浓度的质控样本精密度结果RSD＜15％，准确度结果：偏差维持在15％以内。该结果说明本方法准确性高，重现性好，具有较高的实用可靠性。

表2：福大赛因四种同分异构体精密度和准确度结果

a日间(日内)

D.基质效应和回收率：使用稀释液(甲醇∶乙腈∶水＝25∶25∶50)作为对照配制低中高3种浓度的质控样品进行测定；同时使用空白血浆作为样品进行沉淀萃取，使用该萃取液配制低中高3种浓度的质控样品溶液，进行测定。通过对比相同浓度水平的上述两种方式处理得到的样本的峰面积，来判断血浆基质增强或抑制电离。

四种同分异构体3种不同浓度的质控样本得到的基质效应和平均回收率在以下表3中示出。

表3：福大赛因四种同分异构体的基质效应和回收率

	FD-1	FD-2	FD-3	FD-4
					基质效应	105.2％-117.4％	97.1％-106.8％	99.5％-109.8％	101.7％-116.5％
平均回收率	39.7％	41.5％	38.8％	40.5％

表3中的结果表明，血浆基质对于本发明提供的方法的影响在不同的样本浓度条件下保持稳定。

实施例3：药物代谢动力学研究

本实施例说明肿瘤患者静脉注射福大赛因注射液后四种同分异构体的药物代谢动力学研究。

晚期食管癌患者静脉注射7mg福大赛因1小时，给药24小时后，使用670nm激光进行照射治疗，在给药后的一定时间范围内(0h，0.5h，1h，2h，6h，12h，24h，48h，96h，144h，192h和288h)，收集血样(3mL)，将这些血样在4℃以3000g离心10分钟以获得血浆。采用本发明所提供的血浆预处理方法和利用高效液相色谱-离子淌度差分质谱串联装置的定量分析方法分析人血浆中福大赛因四种同分异构体的药物代谢动力学特征，以研究该创新药物的临床药理学。药物代谢动力学研究的结果在图3中示出。由图3可以看出，四种异构体之间的药物代谢动力学存在差异。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种利用高效液相色谱-离子淌度差分质谱串联装置定量分析福大赛因的四种同分异构体FD-1、FD-2、FD-3和FD-4的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)制备福大赛因样品溶液；

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述梯度洗脱程序的总时长不超过15分钟，优选不超过10分钟，其中起始流动相和最终流动相均为90％流动相A+10％流动相B，且流动相B的浓度梯度从30％变化到45％所用的时间为4.5min至6.0min。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述梯度洗脱程序为：

其中流动相A和流动相B的总量为100体积％。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述梯度洗脱程序为：

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述高效液相色谱中的色谱柱为反相色谱柱，优选以十八烷基硅烷键合硅胶填充的色谱柱。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述流动相A为0.01质量％至0.02质量％的氨水，所述流动相B中甲醇和乙腈的体积比为10∶90至40∶60，优选20∶80。

7.根据权利要求1所述的方法，其中在所述离子淌度差分质谱中，用于FD-1的离子淌度差分补偿电压为-22.6V，用于FD-2的离子淌度差分补偿电压为-24.8V，用于FD-3的离子淌度差分补偿电压为-20.4V，用于FD-4的离子淌度差分补偿电压为-22.6V。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述制备福大赛因样品溶液包括：用N，N-二甲基甲酰胺溶解福大赛因粉末，然后用由甲醇、乙腈和水组成的稀释液稀释。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述福大赛因来自受试者的血浆。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述制备福大赛因样品溶液包括：向所述血浆中加入由甲醇和乙腈组成的沉淀剂，将所得混合物离心，取上清液并加水稀释。