CN108486009A - 一株邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯降解菌及其培养方法和应用 - Google Patents

一株邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯降解菌及其培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

一株邻苯二甲酸二(2‑乙基)己酯降解菌及其培养方法和应用，涉及一株邻苯二甲酸二(2‑乙基)己酯降解菌及其培养方法和应用。本发明提供一株邻苯二甲酸二(2‑乙基)己酯降解菌及其培养方法和应用，为有效解决DEHP的污染问题提供工具。该菌株为Arthrobacter sp.DNEH‑S1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年6月8日，保藏编号为CCTCC No：M 2017315。本发明的邻苯二甲酸二(2‑乙基)己酯降解菌能够降解土壤中的DEHP，可以有效降低DEHP对土壤微生物活性的毒害作用。

Description

一株邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯降解菌及其培养方法和应用
技术领域
本发明涉及一株邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯降解菌及其培养方法和应用。
背景技术
邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)是一种高分子量的邻苯二甲酸酯类化合物(Phthalic acid esters,PAEs)，同时其作为一种增塑剂已被广泛应用于聚氯乙烯的制造中。由于DEHP具有生物毒性，且对人体具有“三致”毒性，已被美国国家环保局和中国环境监测总站列为优先控制污染物，DEHP污染环境的修复也因而成为国内外研究的热点之一，其中微生物修复具有经济、安全、高效等优势而具有较大的应用潜力。
DEHP是产量最大、使用最广的增塑剂品种。随着中国塑料制造业的产量不断提高，废水、河流、湖泊底泥与土壤中均能够检测到DEHP的存在；由于DEHP为亲酯高疏水性污染物，因此很容易在环境中累积并对环境造成污染。
DEHP生物毒性高，具致畸性、致突变性、致癌性及生殖毒性，加上其不易被生物分解，因此对于如何降低DEHP对生态环境及环境中生物所造成的危害以及深入探讨土壤典型有机污染物的微生物修复机制，已经成为全世界相关领域学者和专家研究的热点。
发明内容
本发明提供一株邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯降解菌及其培养方法和应用，为有效解决DEHP的污染问题提供工具。
本发明邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯降解菌为Arthrobacter sp.DNEH-S1，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2017年6月8日，保藏编号为CCTCC No：M 2017315。
本发明Arthrobacter sp.DNEH-S1为革兰氏阳性菌，杆状，呈链状排列，菌体大小约为2.1μm×0.6μm。菌落为乳白色、有光泽，表面湿润且中间***，边缘整齐。
本发明Arthrobacter sp.DNEH-S1的脲酶试验、糖酵解试验、甲基红试验、柠檬酸盐利用试验、吲哚试验均为阳性，淀粉水解试验、V-P试验、油脂水解试验、明胶液化试验、石蕊牛乳试验为阴性，能利用DEHP为唯一碳源和能源进行生长繁殖。
本发明Arthrobacter sp.DNEH-S1的培养方法简单，生长迅速，很难发生变异，其菌液可以直接作用于被DEHP污染的土壤。
本发明Arthrobacter sp.DNEH-S1可在无机盐培养基中培养，其中无机盐培养基成分是：K2HPO4·3H2O：1g；MgSo4·7H2O：0.4g；NaCl：1g；NH4NO3：0.5g；FeCl3·6H2O：0.01g；CaCl2·2H2O：0.075g；蒸馏水：1L。Arthrobacter sp.DNEH-S1的最适生长温度为30～35℃，最适pH值为7～9。
本发明Arthrobacter sp.DNEH-S1的培养方法如下:
将菌株Arthrobacter sp.DNEH-S1添加到无机盐培养基中培养，其中无机盐培养基成分是：K2HPO4·3H2O：1g；MgSO4·7H2O：0.4g；NaCl：1g；NH4NO3：0.5g；FeCl3·6H2O：0.01g；CaCl2·2H2O：0.075g；蒸馏水：1L。摇床转速为120～175rpm·min-1，培育温度为30～35℃，pH值为7～9，接菌量(m/m)为3％～5％，初始DEHP浓度为1000～2000mg·L-1。
本发明Arthrobacter sp.DNEH-S1通过16S rDNA序列比对分析，与节杆菌属(Arthrobacter sp.)内各种之间有极高的同源性，同源性为99％以上。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定Arthrobacter sp.DNEH-S1属于节杆菌属(Arthrobacter sp.)。
本发明的有益效果：
本发明Arthrobacter sp.DNEH-S1在最适条件下培养84h，该菌对DEHP的降解率到达98.86％，效果显著。为有效解决DEHP的污染问题提供工具。此外，对DNEH-S1进行广谱性测试，发现该菌具有较强的底物特异性。
本发明Arthrobacter sp.DNEH-S1能够降解土壤中的DEHP。在42天的修复过程后，添加降解菌DNEH-S1的修复处理土壤样品中DEHP的浓度从50mg·kg-1降至9.88mg·kg-1，而在未加入降解菌的污染处理中，DEHP在土壤样品中残留浓度仍高达25.33±0.29mg·kg-1，表明降解菌DNEH-S1的添加能够加快土壤中的DEHP分解速度。同时降解菌DNEH-S1对DEHP污染土壤中微生物生物量碳、氮、磷随修复时间的动态变化为随着时间的延长呈现降低-升高-降低-升高的变化趋势，降解菌DNEH-S1的加入能够更好的缓解DEHP对土壤微生物活性的毒害作用。
本发明Arthrobacter sp.DNEH-S1，属于节杆菌属(Arthrobacter sp.)，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2017年6月8日，保藏编号为CCTCC No：M 2017315。
附图说明
图1为本发明Arthrobacter sp.DNEH-S1的透射电镜照片(×4000)；
图2为本发明Arthrobacter sp.DNEH-S1的透射电镜照片(×10000)；
图3为本发明Arthrobacter sp.DNEH-S1基因组DNA的电泳结果；
图4为本发明Arthrobacter sp.DNEH-S1 16S rDNA序列的PCR扩增结果；
图5为本发明Arthrobacter sp.DNEH-S1及其相关种的16S rDNA序列***发育树；
图6为实施例4中Arthrobacter sp.DNEH-S1最佳培养条件下的生长曲线；
图7为实施例4中Arthrobacter sp.DNEH-S1最佳培养条件下的降解曲线；
图8为实施例4中Arthrobacter sp.DNEH-S1在不同碳源中的生长情况；
图9为实施例5修复过程中不同处理土壤中DEHP的浓度；
图10为实施例5中不同处理样品的土微生物生物量碳变化情况；
图11为实施例5中不同处理样品的土微生物生物量氮变化情况；
图12为实施例5中不同处理样品的土微生物生物量磷变化情况。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
实施例1：本实施例邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯降解菌为Arthrobacter sp.DNEH-S1，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2017年6月8日，保藏编号为CCTCC No：M 2017315。
本实施例Arthrobacter sp.DNEH-S1为革兰氏阳性菌，菌落为乳白色、有光泽，表面湿润且中间***，边缘整齐。Arthrobacter sp.DNEH-S1的透射电镜照片如图1和图2所示。
参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌***鉴定手册》对Arthrobactersp.DNEH-S1进行生理生化鉴定：本实施例Arthrobacter sp.DNEH-S1的脲酶试验、糖酵解试验、甲基红试验、柠檬酸盐利用试验、吲哚试验均为阳性，淀粉水解试验、V-P试验、油脂水解试验、明胶液化试验、石蕊牛乳试验为阴性，能利用DEHP为唯一碳源和能源进行生长繁殖。
本实施例Arthrobacter sp.DNEH-S1的培养方法简单，生长迅速，很难发生变异。
本实施例Arthrobacter sp.DNEH-S1可在无机盐培养基中培养，其中无机盐培养基成分是：K2HPO4·3H2O：1g；MgSo4·7H2O：0.4g；NaCl：1g；NH4NO3：0.5g；FeCl3·6H2O：0.01g；CaCl2·2H2O：0.075g；蒸馏水：1L。Arthrobacter sp.DNEH-S1的最适生长温度为30～35℃，最适pH值为7～9。
实施例2：Arthrobacter sp.DNEH-S1的驯化与分离
本实施例Arthrobacter sp.DNEH-S1由哈尔滨某荒废污染设施土壤中分离得到。分离方法按以下步骤进行：一、取0～20cm的土壤表层样品500g放入灭菌的防水纸袋内，于4℃冰箱中保存。二、在取回的土壤中加入少量塑料碎屑，置于30℃恒温培养箱中富集培养2周。三、取3份富集培养后的土样，每份各称5g，分别放入含有90mL灭菌水、5～8粒玻璃珠的三角瓶中并用封口膜封好，于35℃，125rpm/min的恒温振荡培养箱中振荡30min，然后静置30min。
分别吸取l0mL上清液加入100mL含有DEHP的基础无机盐培养液中进行培养。首先对土壤悬液中具有DEHP降解能力的菌株进行初步驯化，每5d作为一个驯化周期进行转接，总共进行5次梯度驯化。每个梯度DEHP的初始浓度分别为50、100、200、500和1000mg/L，每次取5mL上层菌液转接到100mL新鲜无机盐培养液中，于35℃，125rpm/min的振荡摇床中进行培养。最后吸取10μL菌液，用平板涂布法在含有DEHP的固体无机盐培养基进行接种，放至30℃生化培养箱中培养，待长出肉眼可见的菌落后，对形态特征不同的菌落分别平板划线得到单菌落，存于斜面培养基中。
为了验证分离出的单菌株的降解能力，把保存的形态特征不同的菌株分别再次接种至灭菌后的基础无机盐培养液中培养。观察菌液浓度并对菌株降解能力进行初步测定，对降解能力较高的菌株进行二次驯化，以5d作为一个驯化周期，每个周期第5天取10μL菌液涂布于选择培养基(以DEHP为唯一碳源的无机盐培养基)中，放至30℃培养箱中培养，观察菌落形态特征是否与接种前一致，以便对降解菌进行纯化。然后继续选取该菌落接种于含有更高DEHP浓度的基础无机盐培养液中，如此重复五次。DEHP浓度依次递增为：100、400、800、1300、2000mg/L。最后，选择出降解效果最好的菌株(菌液表观为DEHP小油滴较少且菌液浓度较高)作为目的菌株并冻存于50％甘油水溶液(v/v)中，即为本实施方式的Arthrobacter sp.DNEH-S1。以上步骤全程在无菌条件下进行操作。
实施例3：Arthrobacter sp.DNEH-S1的分子鉴定
对分离筛选得到的Arthrobacter sp.DNEH-S1进行分子鉴定，按以下步骤进行：提取菌株的总DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物27f和1522r，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后利用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物；之后，进行克隆、转化，筛选阳性克隆子菌落，经扩大培养后测序。Arthrobacter sp.DNEH-S1基因组DNA的电泳结果如图3。Arthrobactersp.DNEH-S1 16S rDNA序列的PCR扩增结果如图4。
Arthrobacter sp.DNEH-S1的16SrDNA序列提交至GenBank获得的序列号为KC874838，测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，构建的***发育树如图5所示，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与节杆菌属(Arthrobactersp.)内各种之间有极高的同源性，同源性为99％以上。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定Arthrobacter sp.DNEH-S1属于节杆菌属(Arthrobacter sp.)。
实施例4：Arthrobacter sp.DNEH-S1的最适生长条件
(1)单因素试验
用无机盐培养基培养菌体过夜，离心收集菌体，清除培养基，以无菌水重悬菌体，调节OD600值至0.8，a％接菌量接入无机盐培养基培养，培养基中DEHP浓度为bmg/L，设定不同温度、pH，每组处理设置三个平行实验组，摇速d培养72h，取样测定OD600，设置不接菌的含有同浓度DEHP的无机盐培养基作为空白对照。
接菌量a设定：0.5％、1％、2％、3％、4％、5％
DEHP b浓度设定：50、100、200、500、1000、2000mg/L
温度设定：10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃
pH设定：4、5、6、7、8、9、10
摇速d设定：50、75、100、125、150、175rpm/min
得到Arthrobacter sp.DNEH-S1的最适生长条件范围是：接菌量3％～5％，DEHP浓度1000～2000mg/L，温度30～35℃，pH值7～9，摇床转速125～175rpm/min。
(2)正交试验
通过单因素试验，挑选出最适生长条件范围，然后进行5因素3水平的正交试验，培养方法同上，培养72h后，测定OD600，选出最高值，结果表明，最适生长条件为接菌量4％，初始DEHP浓度为2000mg/L，温度30℃，pH＝9，摇速为150rpm/min。
(3)最适生长曲线测定
用无机盐培养基培养菌体过夜，离心收集菌体，清除培养基，以无菌水重悬菌体，调节OD600值至0.9，以4％(v/v)的接菌量加入灭好菌的基础无机盐培养基中，使得培养液中DEHP的浓度为2000mg/L，同时将不添加降解菌的培养液作为空白对照。以上操作均在无菌操作台中进行。在30℃，150rpm/min恒温振荡摇床中培养84h，并且从0h开始每隔12h取样并对样品的OD600值进行测定。为确保试验的可靠性，添加降解菌以及不添加降解菌的处理分别设置三个重复。测定的结果将时间作为横坐标，OD600值作为纵坐标绘制降解菌Arthrobacter sp.DNEH-S1最佳培养条件下的生长曲线。结果如图6所示，DNB-S1在生长24h之后进入对数期并直到72h结束，然后在一段时期内处于稳定期，这两个时期是生产和科研用菌的主要时期。
(4)最佳培养条件下降解曲线的测定
无机盐培养基培养菌体过夜，离心收集菌体，清除培养基，以无菌水重悬菌体，调节OD600值至0.9，以4％(v/v)的接菌量加入灭好菌的基础无机盐培养基中，使得培养液中DEHP浓度为2000mg/L，同时以不添加降解菌的培养液为空白对照。以上操作均在无菌操作台中进行。在30℃，150rpm/min恒温振荡摇床中培养84h，并且从0h开始每隔12h取样，每组处理设置三个重复。接菌与未接菌(CK)的无机盐培养液中DEHP的测定结果将时间作为横坐标，DEHP浓度作为纵坐标绘制降解菌降解DEHP的曲线。如图7，24h～68h间降解菌生长较快，DEHP的浓度也在此期间迅速减少，是因为DNEH-S1的大量生长繁殖必须以DEHP为碳源和能源来进行，因此促进了DEHP的降解。DNEH-S1在衰亡期虽然降解速率开始减缓，但是DEHP浓度仍然持续减少，最终在84h内DNEH-S1对DEHP的去除率高达98.86％。
(5)广谱性研究
无机盐培养基培养菌体过夜，离心收集菌体，清除培养基，以无菌水重悬菌体，调节OD600值至0.9，按4％(v/v)的接菌量加入灭菌后的基础无机盐培养基中，分别在培养液中加入DBP、DEP、DMP、DEHP作为唯一碳源和能源，使得培养液中DBP、DEP、DMP、DEHP的浓度为1000mg/L，同时以不接菌的培养液为空白对照。在30℃，150rpm/min恒温振荡器中培养72h。为了保证数据准确性，每组处理设置三个重复。72h后对菌体的生长量进行测定，记录吸光值并计算平均值。如图8，72h时降解菌DNEH-S1在将DEHP作为唯一碳源和能源的无机盐培养液中的OD600值明显高于其他三种碳源，该菌株具有较强的底物特异性。
实施例5：Arthrobacter sp.DNEH-S1对DEHP污染土壤修复效果及土壤微生物生物量的影响
(1)DEHP污染土壤的模拟修复试验
无机盐培养基培养菌体过夜，离心收集菌体，清除培养基，以无菌水重选菌体，调节OD600值至0.9，按5％(v/m)的接菌量将菌悬液加入到准备好的土样(称取900g预备好的土壤样品，置于30℃生化培养箱中预培养3d，然后用喷壶将22.5mL浓度为10000mg/L的DEHP乙醇溶液喷洒在土壤样品中，喷洒时应不断搅拌土壤使DEHP尽可能的均匀分布在土壤中。然后将其放入通风橱过夜，待乙醇挥发后备用。这时土样中DEHP浓度为250mg/kg。将该样品与3600g未污染的过筛土壤充分混合，此时土壤中DEHP最终浓度为50mg/kg，将4500g土样平均分成6份并装入6个陶瓷花盆中，同时设置等量的三盆不含DEHP的土样)中，该试验设定三个处理，每组处理设置三个平行。具体处理如下：(1)污染处理(只含DEHP的土样)；(2)修复处理(含有DEHP和降解菌的土样)；(3)空白处理(新鲜土样)。
将上述土壤处理样品置于室温条件下培养。为维持土壤含水率在20％左右，每隔3天取少量土样测定土壤质量，并加入相应体积的蒸馏水使土壤含水率维持在20％左右。培养过程中分别在0、7、14、21、28、35和42d取样，共进行7次取样。对土壤中DEHP进行测定，分析DEHP浓度变化，明确降解菌DNEH-S1对土壤中DEHP的处理效果。如图9(其中▲表示污染处理，●表示修复处理)，结果表明，所采集的土壤样品里存在对DEHP具有一定降解作用的微生物。此外，添加一定浓度的降解菌DNEH-S1可以加快土壤中DEHP的降解速率，在修复至42天时，添加降解菌DNEH-S1的修复处理在土壤样品中的DEHP已经降低至一个比较低的浓度。
(2)降解菌DNEH-S1对DEHP污染土壤微生物生物量的影响
基于上面的试验设计，在0、7、14、21、28、35和42d，分别在九个陶瓷盆中多点取土样，测定不同处理在不同时间下土壤微生物量碳、氮、磷含量的变化。
利用熏蒸提取-容量分析法对土壤微生物量碳进行检测。吸取10mL提取液加到硬质消煮管中，加入5mL 0.1000mol/L重铬酸钾标准溶液和5mL浓H2SO4，加入少量玻璃珠防暴沸，慢慢摇匀后将消煮管放入170～180℃沙浴中沸腾10min。冷却至室温后，用去离子水洗涤消煮管并转入锥形瓶中，消煮管中总体积为70mL左右。滴入2滴邻菲罗啉指示剂，用0.05mol/L硫酸亚铁标准溶液进行滴定，溶液由开始的橙黄色逐渐变为蓝绿色，直至变化为棕红色，即停止滴定，并记录数据。如图10所示(其中表示空白处理，表示修复处理，表示污染处理)。
土壤有机碳计算公式:
式中：W(c)：有机碳(Oc)质量分数(mg/kg)；
V0：滴定空白样品时消耗的FeSO4体积(mL)；
V1：滴定样品时所消耗的FeSO4体积(mL)；
c：FeSO4溶液的浓度(mol/L)；
3：碳(1/4C)的毫摩尔质量，M(1/4C)＝3mg·mmoL-1；
ts：分取倍数，等于(浸提液体积+土中的水)/吸取液体积；
m：烘干土质量(g)。
土壤微生物生物量碳(BC)计算公式：
BC＝2.64E(c)
式中：BC：土壤微生物生物量碳质量分数(mg/kg)；
E(c)：熏蒸和未熏蒸土样中有机碳量的差值(mg/kg)。
采用熏蒸提取-茚三酮比色法对土壤微生物量氮进行检测。吸取提取液1.5mL于40mL于消煮管中，滴加3.5mL柠檬酸缓冲溶液并慢慢摇动消煮管，使CaSO4和K2SO4完全溶解，然后贴消煮管壁缓缓滴加2.5mL茚三酮试剂。将消煮管放入沸水浴中加热25min后静置消煮管，待其达到室温后，加入乙醇溶液9.0mL并完全混合，在570nm波长下测定吸光度，记录相应数值。
工作曲线的绘制：在7个100mL容量瓶中分别加入0.0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL浓度为50μg·N·mL-1的(NH4)2SO4标液，然后加入0.5mol/L K2SO4溶液进行定容，最终得到的(NH4)2SO4标准氮系列溶液的浓度分别为0，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5μg·N·mL-1。分别向消煮管中加入上述不同浓度的标准氮系列溶液1.5mL，其余步骤同氯仿熏蒸之后的提取液。如图11(其中表示空白处理，表示修复处理，表示污染处理)。
土壤微生物生物量氮计算公式：
BN＝mEmin-N
式中：Emin-N：熏蒸土壤与未熏蒸土壤之差；
m：转换系数。
采用熏蒸提取-无机磷测定法对土壤微生物量磷进行检测。每份称量相当于5.0g烘干土壤重量的新鲜土样，熏蒸结束后，将未经氯仿熏蒸和熏蒸过的土样转入200mL聚乙烯提取瓶，加入100mL 0.5mol/L的NaHCO3浸提液(水土比20:1)，于25℃、200rpm/min的恒温振荡器上浸提30min，用无磷滤纸过滤。同时设置3个无土壤空白作为对照。另外称量3份相当于5.0g烘干土壤重量的新鲜土样至200mL聚乙烯提取瓶中，加入0.5mL浓度为250μg·P·mL-1的KH2PO4溶液后混匀，然后加入100mL 0.5mol/L的NaHCO3溶液，采用上述浸提方法以检测外加磷酸盐态无机磷的回收率(Rpi)，用于校准土壤在熏蒸过程中所吸附的土壤微生物量磷。
向25mL容量瓶中加入10mL提取液，然后加入适量的浓度为1mol/L的HCl溶液(通常占提取液总体积的一半)，静置4h，间隔晃动来去除提取液中产生的CO2。补充去离子水至总体积为20mL，然后滴加4mL混合显色液，用去离子水定容后充分混合。待显色完全后，在882nm波长下测定吸光度，并记录数值。
工作曲线：分别向25mL容量瓶中加入0.0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL的磷酸二氢钾标准溶液(4μg·P·mL-1)，然后滴加4mL钼锑抗试剂，用去离子水定容至25mL，显色完全后比色，即得到0，0.08，0.16，0.24，0.32，0.4μg·P·mL-1系列标准磷工作曲线。如图12(其中表示空白处理，表示修复处理，表示污染处理)。
式中：Epi：熏蒸与未熏蒸土壤之差；
Rpi：[(加入KH2PO4溶液后土壤的所测数值-未熏蒸土壤的所测数值)/25]×100％；
kp：转换系数，取值0.4。
通过测定土壤微生物生物量碳、氮、磷的含量来反应修复过程中土壤微生物活性变化。研究显示，在整个试验周期，土壤微生物量碳、氮、磷的变化趋势大致相同，整体上呈现“降低-升高-降低-恢复初始水平”的趋势。在修复过程中，降解菌DNEH-S1的添加可以有效降低DEHP对土壤微生物活性的毒害作用。

Claims (5)

1.一株邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯降解菌，其特征在于该菌株为Arthrobactersp.DNEH-S1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2017年6月8日，保藏编号为CCTCC No：M 2017315。
2.如权利要求1所述邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯降解菌的培养方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
将菌株Arthrobacter sp.DNEH-S1添加到无机盐培养基中培养，摇床转速为120～175rpm·min-1，培育温度为30～35℃，pH值为7～9，接种量为3％～5％，初始DEHP浓度为1000～2000mg·L-1。
3.根据权利要求2所述的邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯降解菌的培养方法，其特征在于所述无机盐培养基成分是：K2HPO4·3H2O：1g；MgSO4·7H2O：0.4g；NaCl：1g；NH4NO3：0.5g；FeCl3·6H2O：0.01g；CaCl2·2H2O：0.075g；蒸馏水：1L。
4.根据权利要求2所述的邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯降解菌的培养方法，其特征在于摇床转速为150rpm·min-1，培育温度为30℃，pH值为9，接菌量为4％，初始DEHP浓度为2000mg·L-1。
5.如权利要求1所述的邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯降解菌在降解土壤中邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯中的应用。
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