CN108484620A - 一种水溶性罗丹明基Cu2+荧光探针及其合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于诊断生物细胞领域，具体涉及一种水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针及其合成方法，其结构式如图所示，包括灵敏度高、光稳定性好、荧光量子产率高、波长长的罗丹明荧光团，水溶性好的葡萄糖，在一定条件下一定量的罗丹明内酰胺与葡萄糖发生缩合反应得到水溶性罗丹明基荧光探针，此合成过程原料简单易得、反应条件温和、操作简单，同时所得水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针能够在水环境下快速检测生物细胞内物质。

Description

一种水溶性罗丹明基Cu2+荧光探针及其合成方法

技术领域

本发明属于诊断生物细胞领域，具体涉及一种水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针及其合成方法。

背景技术

对大多数生物体而言，铜是一种微量的有营养的物质，其在人体过渡金属的含量中位居第三位。铜离子作为一种催化辅助因子对各种金属酶具有重要的作用，如超氧化物歧化酶，细胞色素c氧化酶和络氨酸酶。然而当铜离子的含量超过一定的量，将会表现出铜中毒，导致神经退行性疾病(如老年痴呆症和威尔逊疾病)，产生此病症可能是由于铜离子参与到了活性氧的生产。因此开发新的具有高选择性、高灵敏度、水溶性好的铜离子荧光探针具有重要意义。

目前检测铜元素的主要方法有：高效液相色谱法、质谱法、原子吸收光谱法、等离子体感应光谱法、原子发射光谱法、电化学传感、比色法等，但是这些方法比较昂贵，专业性强，耗时而且操作复杂。

近年来随着生命科学的不断的发展，以荧光探针为代表的新型分析技术在生命，环境，医药等方面得到了广泛的应用，尤其是检测生物活体的特定物质。虽然分析检测生物体物质的其他方法也不断发展，例如高效液相色谱法，质谱法，原子吸收光谱法，等离子体原子发射光谱法，电化学传感等，但是这些方法比较昂贵，耗时而且操作复杂。荧光法应用合适的探针可以对目标物实现高效检测，无损耗，同时对目标物进行定性和定量分析。目前具有不同激发和发射波长的荧光团被用作化学检测器的信号接受者，例如香豆素、芘、1,8-萘二甲酰胺、罗丹明、花菁类、BODIPY类等。其中以罗丹明为荧光基团构建的荧光探针，由于其优异的荧光性能和良好的可修饰性，目前已成为最受关注的荧光探针之一。

罗丹明是一类属于呫吨类的荧光染料，其结构如图A为氧蒽杂环结构，B为罗丹明染料。由于其具有优越的光物理性能，如高摩尔消光系数，光稳定性好，荧光量子产率高，发射波长长等优点，使得其得到了广泛的应用。自1905年Noelting和Dziewonsky首次报道合成了罗丹明类化合物(Noelting,E.；Dziewonski,K.TotheknowledgeoftheRhodamine[J].Ber.DtschChem.Ges.,1905,38,3516-3527.)，此后罗丹明类化合物便广泛应用于各领域。

1997年Czarnik等报道了首个基于罗丹明内酰胺螺环off-on机理的Cu²⁺探针(DujolsVirginieFord,FrancisCzarnik,AnthonyW.ALong-WavelengthFluorescentChemodosimeterSelectiveforCu(II)IoninWater[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,1997,119(31):7386-7387.)后，罗丹明荧光探针的设计与合成便引起了广大化学家的注意。罗丹明内酰胺或內酰酯衍生物是无荧光和无色的，而当螺环打开时便会产生强烈的荧光和红色。从此罗丹明类荧光探针根据off-on原理在细胞生物学，环境化学，药理学，分析化学等领域得到了广泛的应用，但目前的罗丹明铜离子荧光存在水溶性较差，灵敏度度低，专一性差，抗干扰能力差等问题。

如专利号CN201710019765.3公开了一种罗丹明衍生物类双功能荧光探针及应用，所述荧光探针在含有VO²⁺和Cu²⁺的缓冲溶液中，利用荧光和紫外可见吸收光谱可分别检测识别VO²⁺和Cu²⁺。该探针对VO²⁺和Cu²⁺的识别都有优良的选择性，抗干扰能力强，具有较好的传感性质，检测限低、检测灵敏度高；后续加入焦磷酸根离子之后，焦磷酸根离子与VO²⁺、Cu^{2 +}结合，配位的金属离子释放出来，该荧光探针中的酰肼又回到闭环状态，体系的荧光迅速降低，实现了荧光探针分子的可逆操作，可见所述探针的专一性和抗干扰能力较差。

专利号CN201510952259.0公开了一种多金属离子同时选择测定的探针试剂及制备和应用，所述探针以三(2-氨乙基)胺为母体，分别在一个氨基链上连接罗丹明B、在另外两个氨基链上连接2-羟基-1-萘甲醛基团，制备得到三角架结构的罗丹明-羟基萘衍生物探针。在1,4-二氧六环/水(19/1，v/v，pH＝7)溶液中，利用不同波长的比率吸收，探针分别检测Cu²⁺、Co²⁺、Fe³⁺，相互不干扰检测；在乙腈/水(19/1，v/v)溶液中，利用不同pH下不同波长的荧光发射，探针分别检测Zn²⁺、Al³⁺、Hg²⁺、Cu²⁺，相互不干扰检测；在365nm紫外灯下，检测Zn²⁺、Al³⁺、Hg²⁺分别呈蓝色、桃红色、橙红色荧光，探针-Zn²⁺混合物检测Cu²⁺呈现蓝色荧光消失，所述探针在乙腈与水体积比为19:1的溶液中进行，说明探针的水溶性较差。

专利号CN201710180512.4公开了一种含罗丹明-丹磺酰结构的Cu²⁺荧光探针及其制备方法和应用，通过紫外可见分光光度计与荧光光谱仪研究了探针在CH₃CH₂OH-H₂O(v:v＝9:1)溶液中对金属离子的识别性能，研究结果表明：本发明对Cu²⁺具有高效专一的选择性，具有较强的抗金属阳离子和阴离子干扰能力，并能通过溶液颜色变化实现对铜离子的裸眼识别，所述探针对铜离子的最低检测限为1.72μM，所述表明探针的灵敏度不够高和水溶性较差。

因此为了克服仪器昂贵、专业性强、耗时而且操作复杂等问题和目前荧光探针水溶性较差、灵敏度度低、抗干扰能力差等问题，设计合成一种水溶性好、灵敏度高、抗干扰能力强的新型荧光探针具有重要的意义。

发明内容

为了解决上述分析仪器昂贵、专业性强、耗时而且操作复杂等问题和目前荧光探针水溶性较差，灵敏度度低，抗干扰能力差等问题，本发明一种水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针及其合成方法。

一种水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针，其结构式如图1所示。

进一步的，水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针结构式中基团R1、R2、R3、R4为H，或基团R1与R2为CH₃、基团R3与R4为H，或基团R1与R2为C₂H₅、基团R3与R4为H，或基团R1为C₂H₅、基团R2与R3为H、基团R4为CH₃。

进一步的，水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针结构式中n为0，2，3，...n。

进一步的，制备上述水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针，其合成方法如下：

步骤一：合成罗丹明内酰胺中间体，称取2-3g罗丹明染料，将其溶于有机溶剂，接着将胺类化合物溶液逐滴加入到罗丹明染料溶液中，加热至50-60℃，回流反应2-7h后得到罗丹明内酰胺中间体；

步骤二：合成水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针，称取1-2mmol罗丹明内酰胺，将其溶于有机溶剂，接着将葡萄糖溶液逐滴加入到罗丹明内酰胺溶液中，加热至60-85℃，回流，薄层层析跟踪至反应结束，反应结束后通过柱层析分离纯化得到水溶性罗丹明基荧光探针。

进一步的，有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈。

进一步的，合成罗丹明内酰胺中间体的反应温度为60℃，反应时间为6h。

进一步的，罗丹明内酰胺与葡萄糖的摩尔比为1:1.0-2.0。

进一步的，合成目标化合物的反应温度为80℃。

进一步的，柱层析分离纯化溶剂为二氯甲烷与乙醇。

进一步的，柱层析分离纯化溶剂乙醇与二氯甲烷体积比为1:150-230。

本发明基于罗丹明染料和葡萄糖具有较好的水溶性，设计出一种特殊结构的水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针。一定量的罗丹明内酰胺与葡萄糖在一定条件下发生缩合反应得到水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针，合成过程原料简单易得、反应条件温和、操作简单，同时所得水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针能够在水环境下快速检测生物细胞内物质。

附图说明

图1为水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针的结构式；

图2为水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针对金属离子选择性的荧光发射光谱图；

图3为水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针对不同铜离子浓度的荧光发射光谱图；

图4为水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针的荧光线性范围。

具体实施方式

如图1所示，一种水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针，具体实施方案如下：

实施例一

一种罗丹明110Cu²⁺荧光探针，基团R1、R2、R3、R4为H，n为2的罗丹明110Cu²⁺荧光探针。

一种罗丹明110Cu²⁺荧光探针的合成方法，制备上述的罗丹明110Cu²⁺荧光探针，其合成方法如下：

合成罗丹明110内酰胺中间体：称取2g罗丹明110染料，将其溶于乙醇溶剂，接着将乙二胺溶液逐滴加入到罗丹明110溶液中，加热至50℃，回流反应6h，反应过程中溶液由枣红色变成橙黄色，得到罗丹明110内酰胺中间体；

合成罗丹明110Cu²⁺荧光探针：取1mmol罗丹明110内酰胺，将其溶于乙醇溶剂，接着将1.2mmol葡萄糖溶液逐滴加入到罗丹明110内酰胺溶液中，加热至80℃，回流，薄层层析跟踪至反应结束，反应结束后通过柱层析分离纯化得到罗丹明110Cu²⁺荧光探针，柱层析分离纯化溶剂乙醇与二氯甲烷体积比为1:200。

实施例二

一种四甲基罗丹明Cu²⁺荧光探针，基团R1与R2为CH₃、基团R3与R4为H，n为2的四甲基罗丹明Cu²⁺荧光探针。

一种水溶性四甲基罗丹明荧光探针的合成方法，制备上述的四甲基罗丹明Cu²⁺荧光探针，其合成方法如下：

合成四甲基罗丹明内酰胺中间体：称取2g四甲基罗丹明染料，将其溶于乙醇溶剂，接着将乙二胺溶液逐滴加入到四甲基罗丹明溶液中，加热至50℃，回流反应6h，反应过程中溶液由枣红色变成橙黄色，得到四甲基罗丹明内酰胺中间体；

合成四甲基罗丹明Cu²⁺荧光探针：取1mmol四甲基罗丹明内酰胺，将其溶于乙醇溶剂，接着将1.2mmol葡萄糖溶液逐滴加入到四甲基罗丹明内酰胺溶液中，加热至80℃，回流，薄层层析跟踪至反应结束，反应结束后通过柱层析分离纯化得到四甲基罗丹明Cu²⁺荧光探针，柱层析分离纯化溶剂乙醇与二氯甲烷体积比为1:200。

实施例三

一种罗丹明BCu²⁺荧光探针，基团R1与R2为C₂H₅、基团R3与R4为H，n为2的水溶性罗丹明B荧光探针。

一种水溶性罗丹明BCu²⁺荧光探针的合成方法，制备上述的罗丹明B荧光探针，其合成方法如下：

合成罗丹明B内酰胺中间体：称取2g罗丹明B染料，将其溶于乙醇溶剂，接着将乙二胺溶液逐滴加入到罗丹明B溶液中，加热至50℃，回流反应6h，反应过程中溶液由枣红色变成橙黄色，得到罗丹明B内酰胺中间体；

合成罗丹明BCu²⁺荧光探针：取1mmol罗丹明B内酰胺，将其溶于乙醇溶剂，接着将1.2mmol葡萄糖溶液逐滴加入到罗丹明B内酰胺溶液中，加热至80℃，回流，薄层层析跟踪至反应结束，反应结束后通过柱层析分离纯化得到罗丹明BCu²⁺荧光探针，柱层析分离纯化溶剂乙醇与二氯甲烷体积比为1:200。

实施例四

一种水溶性罗丹明6GCu²⁺荧光探针，基团R1为C₂H₅、基团R2与R3为H、基团R4为CH₃，n为2的水溶性罗丹明6GCu²⁺荧光探针。

一种水溶性罗丹明6GCu²⁺荧光探针的合成方法，制备上述的罗丹明6GCu²⁺荧光探针，其合成方法如下：

合成罗丹明6G内酰胺中间体：称取2g罗丹明6G染料，将其溶于乙醇溶剂，接着将乙二胺溶液逐滴加入到罗丹明6G溶液中，加热至50℃，回流反应6h，反应过程中溶液由枣红色变成橙黄色，得到罗丹明6G内酰胺中间体；

合成罗丹明6GCu²⁺荧光探针：取1mmol罗丹明6G内酰胺，将其溶于乙醇溶剂，接着将1.2mmol葡萄糖溶液逐滴加入到罗丹明6G内酰胺溶液中，加热至80℃，回流，薄层层析跟踪至反应结束，反应结束后通过柱层析分离纯化得到罗丹明6GCu²⁺荧光探针，柱层析分离纯化溶剂乙醇与二氯甲烷体积比为1:200。

实施例五

如图2所示，往探针溶液中分别加入5倍当量的K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Pb²⁺离子时，探针溶液为无色，在580nm处荧光强度也没有发生变化，可见探针保持原来的结构，能够稳定存在于这些溶液体系中。当探针溶液中加入Cu²⁺后，溶液由无色变为红色，在580nm处荧光强度明显增强，出现一个强的发射峰。这是由于Cu²⁺与探针反应使得罗丹明的螺环打开，产生荧光发射。

实施例六

如图3和图4所示，配制16份5mL的5μM探针溶液，分别加入0-80μM的铜离子，进行荧光检测(λ_Ex＝520nm)，计算各体系中荧光强度，通过分析580nm处的荧光强度与Cu²⁺浓度的关系，评估探针对Cu²⁺的响应性能。图3表明随着Cu²⁺浓度的增大，溶液的荧光强度逐渐增强，直到最大发射强度不在变化。图4表明探针在Cu²⁺浓度4×10^-6mol/L～6×10^-5mol/L范围内呈线性关系，线性相关系数为R²＝0.9915，而且探针对Cu²⁺的检测限为1.16×10^-8mol/L。

上述仅为本发明的优选具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

Claims (10)

1.一种水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针，其特征在于：水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针结构式如下所示：

2.根据权利要求1所述水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针，其特征在于：所述罗丹明Cu²⁺基荧光探针结构式中基团R1、R2、R3、R4为H，或基团R1与R2为CH₃、基团R3与R4为H，或基团R1与R2为C₂H₅、基团R3与R4为H，或基团R1为C₂H₅、基团R2与R3为H、基团R4为CH₃。

3.根据权利要求1所述水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针，其特征在于：所述水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针结构式中n为0，2，3，...n。

4.一种水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针的合成方法，其特征在于，制备权利要求1所述的水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针，其合成方法如下：

步骤一：合成罗丹明内酰胺中间体，称取2-3g罗丹明染料，将其溶于有机溶剂，接着将胺类化合物溶液逐滴加入到罗丹明染料溶液中，加热至50-60℃，回流反应2-7h后得到罗丹明内酰胺中间体；

步骤二：合成水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针，称取1-2mmol罗丹明内酰胺，将其溶于有机溶剂，接着将葡萄糖溶液逐滴加入到罗丹明内酰胺溶液中，加热至60-85℃，回流，薄层层析跟踪至反应结束，反应结束后通过柱层析分离纯化得到水溶性罗丹明基荧光探针。

5.根据权利要求4所述水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针的合成方法，其特征在于：所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈。

6.根据权利要求4所述水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针的合成方法，其特征在于：所述合成中间体的反应温度为60℃，反应时间为6h。

7.根据权利要求4所述水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针的合成方法，其特征在于：所述罗丹明内酰胺与葡萄糖的摩尔比为1:1.0-2.0。

8.根据权利要求4所述水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针的合成方法，其特征在于：所述合成目标化合物的反应温度为80℃。

9.根据权利要求4所述水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针的合成方法，其特征在于：所述柱层析分离纯化溶剂为二氯甲烷与乙醇。

10.根据权利要求9所述水溶性罗丹明基Cu²⁺荧光探针的合成方法，其特征在于：所述柱层析分离纯化溶剂乙醇与二氯甲烷体积比为1:150-230。