CN108484510B

CN108484510B - 一种基于brd4抑制剂rvx-208的衍生物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN108484510B
Application number: CN201810479583.9A
Authority: CN
Inventors: 蔡进; 刘文景; 吉民; 王莹颖; 宁瑶; 麦地努尔·吐尔逊; 许红芹
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2018-05-18
Filing date: 2018-05-18
Publication date: 2020-05-05
Anticipated expiration: 2038-05-18
Also published as: CN108484510A

Abstract

本发明公开了一种基于BRD4抑制剂RVX‑208的衍生物及其制备方法和应用。衍生物的结构如式I所示。制备方法包括：式8化合物与式9化合物反应，得式10化合物；式10化合物与丙二酸、丁二酸或戊二酸反应后，再与碳酸乙烯酯、2‑卤代异丁酸或4‑卤代苯氧基异丁酸反应；或，式10化合物直接与碳酸乙烯酯、2‑卤代异丁酸或4‑卤代苯氧基异丁酸反应。本发明又提供了其应用。本发明提供了基于BRD4抑制剂RVX‑208的衍生物，能够提高降低胆固醇的活性或者同时降低胆固醇和甘油三酯水平。

Description

一种基于BRD4抑制剂RVX-208的衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药化工领域，具体涉及一种基于BRD4抑制剂RVX-208的衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

许多人类疾病的一个重要特征就是乙酰化水平异常，进而导致转录异常。组蛋白赖氨酸的乙酰化水平主要由组蛋白乙酰化转移酶(HATs)、组蛋白去乙酰化酶(HDACs)和溴结构域蛋白(BRD)控制。

BRD是一类能够特异性识别组蛋白乙酰化赖氨酸(Acetylated lysine,KAc) 的蛋白结构域。人体内发现的61种BRD存在于46种蛋白中，根据其功能的不同，被划分为8大家族，其中溴结构域和超末端结构蛋白(Bromodomain and extraterminal domain,BET)属于BRD家族的第2类，包括BRD2、BRD3、BRD4 和BRDT。BRD4蛋白具有2个串联的溴结构域BD1和BD2。BET蛋白通过识别乙酰化赖氨酸(KAc)，并招募不同的转录调节因子，如正性转录延伸因子 b(P-TEFb)来调节靶基因的表达。BET抑制剂在临床研究中呈广谱性，在抗肿瘤、心血管疾病、抗炎及男性避孕等方面均有疗效。特别是BET家族中的BRD4作为表观遗传领域的重要靶标，近年来日益受到制药公司和科研机构的高度关注。

随着社会经济水平的发展，人们的生活水平逐步提高的同时，人们的饮食结构呈现出富余化的趋势。在这种富余化趋势作用下，引发了血脂的升高，随之导致动脉粥样硬化、冠心病等心血管疾病的发病率逐年升高，并伴随有年轻化的趋势，降血脂药物的研究引起越来越多的关注。

血脂指的是血浆或血清中的脂质，主要包含胆固醇(TC)、胆固醇酯、甘油三酯(TG)、磷脂及它们与脂蛋白形成的各种可溶性脂蛋白。在血浆脂蛋白中，脂质和蛋白质的含量是相对固定的，决定脂蛋白密度的主要因素是复合体中脂质和蛋白质的相对含量。

大多数蛋白质的密度介于1.3-1.4g/cm³之间，脂质聚集体的密度介于 0.8-0.9g/cm³之间，因此，复合体中含有的蛋白质越多，脂质越少时，其密度越高。依据密度从低到高的顺序，可将脂蛋白分为乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、中间密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。人体的高血脂症指标是VLDL和LDL升高，临床上，高血脂症指的是血浆中总胆固醇含量高于5.7mmol/L，或者甘油三酯含量高于1.7mmol/L。而血浆中的HDL 可以预防动脉粥样硬化的发生。

目前，临床上应用的降血脂药物包含很多类，主要有他汀类、胆固醇吸收抑制剂、苯氧乙酸类、胆汁螯合剂、烟酸类等。其中，他汀类药物可以有效地降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和TG，但是大量服用他汀类药物会引起肌毒和肝转氨酶升高等不良症状；胆固醇吸收抑制剂和胆酸螯合剂主要用来降低LDL-C，如依泽替米贝和考来维仑，但是这些药物也有一定的不良反应；苯氧乙酸类药物能显著降低TG，烟酸类药物能显著升高HDL含量，但是这两类药物会引发胃肠道不适、肝肾损伤等不良反应。

针对上述问题，临床上主要采用联合用药的方法，通过减少单药的剂量来减少副反应。比如，胆固醇吸收抑制剂用来降低LDL浓度，当联合其它调脂药物使用时，对高脂血症非常有效，这对于不耐受他汀类药物的患者是十分有效的。但是联合用药可能发生药物间相互作用以及复杂的药代动力学问题。目前随着对药物研究的不断深入，新靶点的研究越来越受药物化学工作者的关注。随着表观遗传学工作的不断开展，BRD4小分子抑制剂取得很大的进展，RVX-208在表型筛选中发现对心血管疾病有疗效。

苯氧乙酸类是一类过氧化酶体增殖激活受体(PPARs)的配体，过氧化酶体增殖激活受体(PPARs)属于细胞核激素受体超家族，它包含PPARα、PPARγ和 PPARδ三种受体亚型，在碳水化合物和脂类代谢上发挥重要作用。PPARα类激动剂，例如非诺贝特或者他的活性代谢物非诺贝酸，在降低血清甘油三酯和提高高密度脂蛋白(HDL)胆固醇上很有效。

目前，已报道了多种结构各异的选择性靶向BET的小分子抑制剂，它们都可以特异性的靶向乙酰化赖氨酸(KAc)识别位点，在该位点与KAc竞争保守的天冬酰胺残基140(Asn140)。RVX-208是一种目前处于三期临床BRD4的抑制剂，属于喹唑啉酮类骨架。RVX-208主要作用于BD2，而其他处于临床的抗肿瘤BRD4抑制剂主要作用于BD1，RVX-208也是首个报道的作用于BD2的抑制剂。RVX-208对BRD4中BD1的IC₅₀值为1.8μM，对BRD4中BD2的IC₅₀值为0.04nM。RVX-208能够增加载脂蛋白A-I(ApoA-I)和功能性高密度脂蛋白(HDL) 微粒的形成，降低胆固醇的生成，可有效消除血管内斑块，从而逆转动脉粥样硬化。

发明内容

发明目的：针对现有技术中的问题，本发明提供了一种基于BRD4抑制剂 RVX-208的衍生物，能够提高降低胆固醇的活性或者同时降低胆固醇和甘油三酯水平，本发明的另一个目的是提供该衍生物的制备方法和应用。

技术方案：

所述基于BRD4抑制剂RVX-208的衍生物，结构如式I所示：

其中，R₁选自-CH₃或

R₂选自如下取代基：

；R₃和R₄选自卤素。

式中，n＝1～3；R₁为-CH₃时，R₂不为

取代基R₃和R₄选自氯或溴。

本发明的设计思想是，保留RVX-208的母核喹唑啉酮，能发挥喹唑啉酮类药物靶向BRD4的功能，提高人体内ApoA-I和功能性HDL微粒的形成，降低胆固醇的生成，可有效消除血管内斑块，从而逆转动脉粥样硬化的功能；而对 RVX-208右侧结构进行合理改造，可进一步提升降低胆固醇的活性，另外引入能够降低甘油三酯的水平的苯氧乙酸类药物的药效团，使得目标化合物能够发挥协同作用，同时降低胆固醇和甘油三酯水平。

本发明的衍生物中，可选择的结构如：R₁选自-CH₃，R₂选自如下取代基：

R₃和R₄选自卤素，n＝1～3；

R₁选自

R₂选自如下取代基：

，R₃和R₄选自卤素，n＝1～3。

一些优选的化合物的结构如式RB-X、RA-G、RB-G、RA-C、RB-C、RA-11 或RB-11所示：

本发明还提供了所述的基于BRD4抑制剂RVX-208的衍生物的制备方法，包括：

(1)在催化剂和脱水剂作用下，式8化合物与式9化合物反应，得式10 化合物；

R₁选自 -CH₃或

(2)式10化合物与丙二酸、丁二酸或戊二酸反应后，再与碳酸乙烯酯、2- 卤代异丁酸或4-卤代苯氧基异丁酸反应；或，

式10化合物直接与碳酸乙烯酯、2-卤代异丁酸或4-卤代苯氧基异丁酸反应。

步骤(1)中，反应在有机溶剂中进行，有机溶剂选自：N,N-二甲基甲酰胺或者二甲基乙酰胺；式8化合物与式9化合物的摩尔比为1：1～2，优选为1:1.1；反应温度为110～120℃，优选为120℃，反应时间为12～18h，优选为16h；所述的催化剂为亚硫酸氢钠，所述的脱水剂为甲基苯磺酸一水合物或对甲基苯磺酸；式8化合物与催化剂的摩尔比为1：1～2，优选为1:1.2。

步骤(2)中，式10化合物与丙二酸、丁二酸或戊二酸的反应在有机溶剂中进行，有机溶剂选自：N,N-二甲基甲酰胺或者二甲基乙酰胺，式10化合物与丙二酸、丁二酸或戊二酸的摩尔比为1:1.5～2.5，优选为1：2，反应温度为25～30℃，反应时间为10～16h；反应需要缩合剂及催化剂，所述的缩合剂为EDCI或DCC，但是用DCC代替后反应副产物为DCU，后处理麻烦且会使反应产率降低；所述的催化剂为DMAP；式10化合物与缩合剂的摩尔比为1:2～2.5，式10化合物与催化剂的摩尔比为1:1～1.5。

式10化合物直接与碳酸乙烯酯的反应在有机溶剂中进行，有机溶剂选自： N,N-二甲基甲酰胺或者二甲基乙酰胺，式10化合物与碳酸乙烯酯的摩尔比为1： 1～2，反应需要碱如碳酸钾，式10化合物与碱的摩尔比为1:1～2；反应温度为 110～120℃，优选为110℃，反应时间为10～16h，优选为12h；

式10化合物直接与2-卤代异丁酸或4-卤代苯氧基异丁酸反应在有机溶剂中进行，有机溶剂选自：N,N-二甲基甲酰胺或者二甲基乙酰胺，式10化合物与2- 卤代异丁酸或4-卤代苯氧基异丁酸的摩尔比为1：1.2～1：2，反应需要缩合剂(如 EDCI或DCC)和催化剂作用(如DMAP)，式10化合物与缩合剂的摩尔比为 1:2～2.5，式10化合物与催化剂的摩尔比为1:1～1.5；反应温度为25～30℃，反应时间为12～16h。

式10化合物与丙二酸、丁二酸或戊二酸反应产物与2-卤代异丁酸或4-卤代苯氧基异丁酸反应，反应在需要碱如碳酸钾，上述反应产物与碳酸钾的摩尔比为 1:4～4.5，反应在有机溶剂中进行，有机溶剂选自：N,N-二甲基甲酰胺或者二甲基乙酰胺；反应温度为50～55℃，反应时间为12～16h。

所述化合物8的制备方法包括：

(1)将化合物1分散于有机溶剂如丙酮中，加入碳酸钾，然后滴加硫酸二甲酯，50～55℃反应12～14h，然后用氢氧化钠溶液调节pH至14反应3～4个小时，冷却至室温后用盐酸调节pH至6，得化合物2；

(2)将化合物2分散于有机溶剂如甲苯中，同时加入三乙胺和叠氮磷酸二苯酯，75～80℃反应12～14h，然后冷却至室温，加入氢氧化钠溶液及四氢呋喃溶液，室温下反应2～3小时，得化合物3；

(3)将化合物3分散于有机溶剂如二氯甲烷中，冰水浴条件下滴加三乙胺和三氟乙酸酐，反应0.5～1小时后转移至室温下反应2～3小时，，得化合物4；

(4)将化合物4分散于有机溶剂如二氯甲烷中，在冰水浴条件下加入化合物5，N₂保护下于-5～0℃之间反应2～3小时，得化合物6；

(5)将化合物6分散于有机溶剂如N,N-二甲基甲酰胺中，加入氰化亚铜，N₂保护下升温至110～120℃回流反应12～16小时，反应结束后将体系冷却至室温后，向其中加入水和1,6-己二胺，50～55℃下反应4～6小时，得化合物7；

(6)将化合物7分散于溶剂如甲基磺酸中，N₂保护下，升温至110～120℃反应2～4小时得化合物8；

反应路线如下：

本发明进一步提供了所述的基于BRD4抑制剂RVX-208的衍生物的应用。

所述应用可以是其在制备预防、治疗心血管疾病药物中的应用。心脑血管疾病如动脉粥样硬化、高血压、高脂血症、血液黏稠等导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病。

所述应用可以是制备靶向BRD4药物中的应用。

所述应用还可以是制备降血脂如降低胆固醇或/和甘油三酯药物中的应用。

本发明又提供了一种药物，含有所述的基于BRD4抑制剂RVX-208的衍生物。所述药物中，本发明所述衍生物可以作为单一活性成分也可以与其他活性成分联合用药。所述药物还含有各种药学领域所允许的助剂，制成各剂型。

有益效果：

本发明衍生物通过对BRD4酶活性进行评价，表明各化合物对人BRD4酶活性良好；通过体外测定组织培养肝脏细胞中ApoA-I mRNA和分泌蛋白ApoA-I 的含量，显示化合物具有良好的诱导ApoA-I mRNA表达，增加ApoA-I含量的功能；通过向高脂血症大鼠喂食含有目标化合物的载体，测定大鼠体内HDL-C 和TG含量的变化，发现本发明衍生物如RA-G、RA-C、RA-11、RB-G、RB-C、 RB-11可以增加血浆HDL-C水平，促进TC流出，同时还能降低TG含量，证明目标化合物发挥了降低胆固醇和甘油三酯的双活性，可进一步研制开发为降血脂药物。

本发明的衍生物如RB-X、RB-G、RB-C的毒性更低，提升了用药安全性。

本发明的制备方法简单，条件温和，产率高。

文献报道的合成路线如下式所示，由化合物C₁得到化合物C₄，也就是本发明的由化合物3得到化合物7，虽然文献只有三步，但是涉及的反应条件在实验室中不太好操作。文献报道的路线在实验过程中需要大量持续通入氯化氢气体和氨气，同时反应温度也是高达170℃，在实验室操作起来有一定困难；同时，鉴于原料C₁价格较贵，我们采用了由起始化合物1经过甲基化和重排反应的方法合成化合物3；从C₅反应得到C₆时，其实是将酚羟基变成羟基乙氧基的过程，文献中用到的原料是一种羟基保护基，价钱较贵，我们选用的原料碳酸乙烯酯价钱便宜，反应条件简单；文献报道的路线是最后进行席夫碱生成的反应，即C₄和C₆之间的反应，本发明是化合物8与化合物9先反应生成席夫碱，后又将酚羟基变成了羟基乙氧基；本发明的路线中除了第二步反应产率低于50％，其余各步反应产率在70％以上。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明的范围。

本发明中，

化合物1：结构如式1所示；化合物2：结构如式2所示；

化合物3：结构如式3所示；化合物4：结构如式4所示；

化合物5：溴代丁二酰亚胺，结构如式5所示；化合物6：结构如式6所示；

化合物7：结构如式7所示；化合物8：结构如式8所示；

化合物9A：结构如式9A所示；化合物10A:结构如式10A所示；

化合物11：碳酸乙烯酯，结构如式11所示；化合物12：RVX-208，结构如式12所示；

化合物9B：结构如式9B所示；

化合物10B：结构如式10B所示；化合物RB-X：结构如式RB-X所示；

化合物13：2-溴代异丁酸，结构如式13所示；化合物RA-G：结构如式RA-G 所示；

化合物RB-G：结构如式RB-G所示；化合物14：4-氯苯氧基异丁酸，结构如式14所示；

化合物RA-C：结构如式RA-C所示；化合物RB-C：结构如式RB-C所示；

化合物15：丙二酸，结构如式15所示；化合物RA-1：结构如式RA-1所示；

化合物RA-11：结构如式RA-11所示；化合物RB-1：结构如式RB-1所示；

化合物RB-11：结构如式RB-11所示；

Me₂SO₄：硫酸二甲酯；acetone：丙酮；DPPA：叠氮磷酸二苯酯；

TEA：三乙胺；toluene：甲苯；THF：四氢呋喃；

TFAH：三氟乙酸酐；DCM:二氯甲烷；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；

1,6-Hexanediamine：1,6-己二胺；MeSO₃H：甲基磺酸；

TsOH·H₂O：对甲基苯磺酸一水合物；EDCI：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；

DMAP：4-二甲氨基吡啶；

实施例1先导化合物RVX-208的合成

本发明提供的BRD4抑制剂RVX-208合成路线如下：

(1)制备中间体2(即化合物2)：3,5-二甲氧基苯甲酸

100mL单口烧瓶中加入3,5-二羟基苯甲酸(1.54g,10mmol)，加入20mL丙酮将其溶解，室温下加入碳酸钾(4.14g,30mmol)，同时滴加3.5mL的硫酸二甲酯，加热至55℃，反应回流过夜。待反应完全后，减压浓缩回收丙酮，加入30mL 水，然后加入质量分数为30％的氢氧化钠溶液调节pH至14，在75℃下反应4 个小时，水解完全后将体系冷却至室温，用浓盐酸调pH至6左右，有大量白色固体析出，经过滤，水洗，干燥得目标化合物2(1.78g,收率98％)。

目标产物的数据如下：

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:9.84(s,1H),7.01(s,1H),6.94(s,1H),6.66(t, J＝2.5Hz,1H),3.85(s,3H),3.79(s,3H).

HRMS:[M-H]^-m/z calcd 181.0506for C₉H₁₀O₄,found 181.0546.

(2)制备中间体3(即化合物3)：3,5-二甲氧基苯胺

100mL单口瓶中加入化合物2(1.82g,10mmol)，加入30mL甲苯将其溶解，同时加入三乙胺(3.03g,0.03mol)，叠氮磷酸二苯酯(8.26g,0.03mol)，将反应体系加热至80℃反应过夜，然后冷却至室温，加入2mol/L的氢氧化钠溶液10mL以及20mL四氢呋喃溶液，室温下反应2小时。然后经减压蒸馏除去低沸点溶剂，残余物用乙酸乙酯萃取三次(3*20mL)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到混合物，经柱层析纯化(洗脱液为石油醚/乙酸乙酯，体积比10：1)，得到棕色固体即化合物3(0.66g,收率43％)。

目标产物的数据如下：

HRMS:[M+H]⁺m/z calcd 154.0862for C₈H₁₁NO₂,found 154.0891.

(3)制备中间体4(即化合物4)：N-(3,5-二甲氧基苯)-2,2,2-三氟乙酰胺

100mL单口瓶中加入化合物3(1.53g,10mmol)，加入20mL二氯甲烷将其溶解，在0℃冰水浴条件下滴加三乙胺(1.01g,15mmol)，三氟乙酸酐(3.15g, 15mmol)，反应搅拌0.5小时后转移至室温下反应2小时，待反应结束后向体系中加水10mL，用二氯甲烷萃取三次(3*20mL)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到白色固体即化合物4(2.44g,收率98％)。

目标产物的数据如下：

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ:7.80(s,1H),6.80-6.76(m,2H),6.34(s,1H),3.79(s,6H).

HRMS:[M+H]⁺m/z calcd 250.0685for C₁₀H₁₀F₃NO₃,found 250.0680

(4)制备中间体6(即化合物6)：N-(2-溴-3,5-二甲氧基苯)-2,2,2-三氟乙酰胺

100mL单口瓶中加入化合物4(2.49g,10mmol)，加入20mL二氯甲烷将其溶解，在0℃冰水浴条件下加入化合物5即N-溴代丁二酰亚胺(2.14g,12mmol)，反应体系用N₂保护，于-5～0℃之间反应2小时，反应结束后向体系中加水10mL，用二氯甲烷萃取三次(3*20mL)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到混合物，混合物经过柱层析纯化(洗脱液为石油醚/乙酸乙酯，体积比40： 1)，得到白色固体即化合物6(2.46g,收率75％)。

目标产物的数据如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:8.59(s,1H),7.65(d,J＝2.7Hz,1H),6.39(d, J＝2.4Hz,1H),3.88(s,3H),3.84(s,3H).

HRMS:[M+Na]⁺m/z calcd 349.9610for C₁₀H₉BrF₃NO₃,found 349.9635

(5)制备中间体7(即化合物7)：2-氨基-4,6-二甲氧基苯甲腈

100mL单口瓶中加入化合物6(3.28g,10mmol)，加入N,N-二甲基甲酰胺 30mL将其溶解，同时加入氰化亚铜(6.27g,70mmol)，反应体系用N₂保护，升温至120℃回流反应16小时，反应结束后将体系冷却至室温后，向其中加入水 15mL，同时加入10mL1,6-己二胺，在55℃下反应4小时。反应结束后经抽滤除去反应体系的泥浆，残余液体用乙酸乙酯萃取(3*20mL)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到混合物，混合物经柱层析纯化(洗脱液为石油醚/乙酸乙酯，体积比4：1)，得到淡黄色固体即化合物7(1.39g,收率78％)。

目标产物的数据如下：

¹H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:5.97(s,2H),5.93(d,J＝2.1Hz,1H),5.83(d, J＝2.1Hz,1H),3.77(s,3H),3.72(s,3H).

(6)制备中间体8(即化合物8)：2-氨基-4,6-二甲氧基苯甲酰胺

100mL单口瓶中加入化合物7(1.78g,10mmol)，加入甲基磺酸(31.72g, 330mmol)将其溶解，反应体系用N₂保护，升温至110℃反应2小时，反应结束后，向体系中加入水和二氯甲烷(两者体积比为1：2)的混合液，用质量分数 30％氢氧化钠溶液调节pH至中性，混合液用二氯甲烷萃取三次(3*20mL)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到混合物，经柱层析纯化(洗脱液为石油醚/乙酸乙酯，体积比1：1)，得到咖啡色固体即化合物8(1.47g,收率 75％)。

目标产物的数据如下：

HRMS:[M+K]⁺m/z calcd 235.0479for C₉H₁₂N₂O₃,found 235.0420.

(7)制备中间体10A(即化合物10A)：2-(4-羟基-3,5-二甲基苯基)-5,7- 二甲氧基喹唑啉-4(3H)-酮

100mL单口瓶中加入化合物8(1.96g,10mmol)，加入N,N-二甲基甲酰胺 30mL将其溶解，同时加入化合物9A即3,5-二甲基-4-羟基苯甲醛(1.65g, 11mmol)，亚硫酸氢钠(0.95g,5mmol)，对甲基苯磺酸一水合物(1.25g,12mmol)，搅拌均匀后，将体系升温至120℃，回流反应16小时。反应结束后，向反应体系中加水20mL，用乙酸乙酯萃取三次(3*20mL)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到混合物，经柱层析分离纯化(洗脱液为二氯甲烷/甲醇，体积比20：1)，得到淡黄色固体即化合物10A(2.45g,收率75％)。

目标产物的数据如下：

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:11.64(s,1H),8.94(s,1H),7.85(s,2H),6.71(d, J＝2.1Hz,1H),6.48(d,J＝2.1Hz,1H),3.84(d,J＝13.5Hz,6H),2.24(s,6H).

HRMS:[M+H]⁺m/z calcd 327.1339for C₁₈H₁₈N₂O₄,found 327.1314.

(8)制备先导化合物RVX-208(即化合物12)：2-(4-(2-羟基乙氧基)3,5- 二甲基苯基)-5,7-二甲基喹唑啉-4(3H)-酮

100mL单口瓶中加入化合物10A(3.26g,10mmol)，化合物11即碳酸乙烯酯 (0.88g,10mmol)，加入N,N-二甲基甲酰胺30mL将其溶解，同时加入碳酸钾(1.38g, 10mmol)，将体系升温至110℃，回流反应12小时。反应结束后，向反应体系中加水20mL，用二氯甲烷萃取三次(3*20mL)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到混合物，经柱层析纯化(洗脱液为石油醚/乙酸乙酯，体积比 2：1)，得到黄色固体RVX-208(3.51g,收率95％)。

目标产物的数据如下：

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ:7.79(s,2H),6.89(s,1H),6.45(d,J＝2.2Hz,1H), 5.29(s,1H),3.98(d,J＝4.3Hz,2H),3.95(d,J＝3.9Hz,,5H),3.93(s,3H),2.38(s,6H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:164.88,161.41,160.19,158.89,153.59, 152.99,131.20,128.88,127.87,105.11,101.60,97.97,74.44,60.88,58.37,58.04, 55.30,18.52.

HRMS:[M-H]^-m/z calcd 369.1456for C₂₀H₂₂N₂O₅,found 369.1489.

实施例2RB-X的合成

目标化合物RB-X的合成方法与RVX-208类似，区别是将化合物9A换成 9B，相应的得到的化合物为10B，10B与化合物11反应得到RB-X。具体的，

(1)制备化合物8

化合物8的合成参照实施例1。

(2)制备化合物10B

制备中间体10B：2-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-5,7-二甲氧基喹唑啉-4(3H) -酮

100mL单口烧瓶中加入化合物8(1.96g,10mmol)，加入30mL N,N-二甲基甲酰胺将其溶解，同时加入化合物9B即3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲醛(2.00g, 11mmol)，亚硫酸氢钠(0.95g,5mmol)以及对甲基苯磺酸一水合物(1.25g,12 mmol)，搅拌均匀后，将体系升温至120℃，回流反应16小时。反应结束后，向反应体系中加水20mL，用乙酸乙酯萃取三次(3*20mL)，合并有机相，干燥过夜，过滤，减压蒸馏得到混合物，经柱层析分离纯化(洗脱液为二氯甲烷/甲醇，体积比30：1)，得到淡黄色固体10B(2.68g,收率75％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:11.87(s,1H),9.07(s,1H),7.55(s,2H), 6.72(s,1H),6.49(s,1H),3.86(t,J＝7.1Hz,12H).

HRMS:[M+Na]⁺m/z calcd 381.1057for C₁₈H₁₈N₂O₆,found 381.1056.

(3)制备化合物RB-X

制备目标化合物RB-X：2-(4-(2-羟基乙氧基)-3,5-二甲氧基苯基)-5,7-二甲氧基-4(3H)-酮

100mL单口瓶中加入化合物10B(3.58g,10mmol)，化合物11即碳酸乙烯酯 (0.88g,10mmol)，加入N,N-二甲基甲酰胺30mL将其溶解，同时加入碳酸钾(1.38g, 10mmol)，将体系升温至110℃，回流反应12小时。反应结束后，向反应体系中加水20mL，用二氯甲烷萃取三次(3*20mL)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到混合物，经柱层析纯化(洗脱液为石油醚/乙酸乙酯，体积比 2：1)，得到黄色固体RB-X(3.81g,收率95％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:12.01(s,1H),7.55(s,2H),6.75(d,J＝2.1Hz, 1H),6.53(d,J＝2.1Hz,1H),4.59(t,J＝5.7Hz,1H),3.96(t,J＝5.6Hz,2H), 3.89-3.85(m,12H),3.65(q,J＝5.7Hz,2H).

¹³C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ:166.77,162.85,161.74,154.85,154.73, 154.18,141.42,129.05,107.13,103.13,99.62,76.11,62.16,58.12,57.84,57.53.

实施例3化合物RA-G的合成

本发明提供的RA-G合成路线如下：

制备目标化合物RA-G：(5,7-二甲氧基-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-2-基)-2,6- 二甲基苯基2-溴-2-甲基丙酸酯

100mL单口瓶中加入化合物13即2-溴异丁酸(2.00g,12mmol)，加入20mLN, N-二甲基甲酰胺将其溶解，在0℃冰水浴条件下向反应体系中加入EDCI(3.83g, 20mmol)，DMAP(1.22g,10mmol)，0.5小时后，加入化合物10A(3.26g,10mmol)，并于室温下反应16小时。反应结束后，向体系中加水30mL，用乙酸乙酯萃取三次(3*20mL)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到混合物，经柱层析分离纯化(洗脱液为二氯甲烷/甲醇，体积比20：1)，得到白色固体 RA-G(1.99g,收率40％)。

目标产物的数据如下：

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:11.94(s,1H),7.98(s,2H),6.77(d,J＝2.1Hz, 1H),6.55(d,J＝1.8Hz,1H),3.90(d,J＝11.4Hz,6H),2.23(s,6H),2.11(s,6H).

¹³C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ:170.53,166.17,162.88,161.52,154.83, 154.08,151.55,132.20,130.07,103.21,99.68,58.27,57.53,32.21,17.77.

HRMS:[M+H]⁺m/z calcd 475.0863for C₂₂H₂₃BrN₂O₅,found 475.0699.

实施例4化合物RB-G的合成

目标化合物RB-G的合成与RA-G类似，区别是将9A换成9B，相应的得到的化合物为10B，10B与化合物13反应得到RB-G。

制备目标化合物RB-G：(5,7-二甲氧基-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-2-基)-2,6- 二甲氧基苯基2-溴-2-甲基丙酸酯

100mL单口烧瓶中加入化合物13即2-溴异丁酸(2.00g,12mmol)，加入 20mL N,N-二甲基甲酰胺将其溶解，在0℃冰水浴条件下向反应体系中加入 EDCI(3.83g,20mmol)和DMAP(1.22g,10mmol)，0.5小时后，加入化合物 10B(3.58g,10mmol)，并于室温下反应16小时。反应结束后，向体系中加水 20mL，用乙酸乙酯萃取三次(3*20mL)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到混合物，经柱层析分离纯化(洗脱液为二氯甲烷/甲醇，体积比40： 1)，得到白色固体RB-G(2.53g,50％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:12.12(s,1H),7.61(s,2H),6.80(d,J＝1.8Hz, 1H),6.57(d,J＝1.8Hz,1H),3.91-3.87(m,12H),2.05(s,6H).

¹³C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ:170.70,166.22,162.86,161.65,154.68, 153.90,153.62,132.65,106.69,103.28,99.89,58.43,57.89,57.58,32.61.

HRMS:[M+H]⁺m/z calcd 507.0586for C₂₂H₂₃BrN₂O₇,found 507.0593.

实施例5化合物RA-C的合成

本发明提供的RA-C合成路线如下：

制备目标化合物RA-C：4-(5,7-二甲氧基-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-2-基)-2,6-二甲基苯基2-(4-氯苯氧基)-2-甲基丙酸酯

100mL单口瓶中加入化合物14即4-氯苯氧基异丁酸(4.30g,20mmol)，加入20mL N,N-二甲基甲酰胺将其溶解，在0℃条件下向反应体系中加入EDCI(3.83g, 20mmol)，DMAP(1.22g,10mmol)，0.5小时后，加入化合物10A(3.26g,10mmol)，并于室温下反应16小时。反应结束后，向体系中加水30mL，用乙酸乙酯萃取三次(3*20mL)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到混合物，经柱层析分离纯化(洗脱液为二氯甲烷/甲醇，体积比20：1)，得到白色固体 RA-C(1.65g,40％)。

目标产物的数据如下：

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:11.88(s,1H),7.96(s,2H),7.38(d,J＝6.5Hz, 2H),7.05(d,J＝7.0Hz,2H),6.74(s,1H),6.51(s,1H),3.88(d,J＝15.0Hz,6H),2.12(s, 6H),1.77(s,6H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:171.29,164.71,161.45,160.14,154.15, 153.44,152.53,150.32,130.61,130.51,129.69,128.66,127.19,122.31,105.31, 101.78,98.21,80.33,56.39,56.04,25.81,16.60.

HRMS:[M-H]^-m/z calcd 521.1484for C₂₈H₂₇ClN₂O₆,found 521.1485.

实施例6化合物RB-C的合成

目标化合物RB-C的合成方法与RA-C类似，区别是将9A换成9B，相应的得到的化合物为10B，10B与化合物14反应得到RB-C。

制备目标化合物RB-C：4-(5,7-二甲氧基-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-2-基)-2,6-二甲氧基苯基2-(4-氯苯氧基)-2-甲基丙酸酯

100mL单口烧瓶中加入化合物14即4-氯苯氧基异丁酸(4.30g,20mmol)，加入20mLN,N-二甲基甲酰胺将其溶解，在0℃冰水浴条件下向反应体系中加入EDCI(3.83g,20mmol)和DMAP(1.22g,10mmol)，0.5小时后，加入化合物 10B(3.58g,10mmol)，并于室温下反应16小时。反应结束后，向体系中加水 20mL，用乙酸乙酯萃取三次(3*20mL)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到混合物，经柱层析分离纯化(洗脱液为二氯甲烷/甲醇，体积比40： 1)，得到白色固体RB-C(1.65g,40％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:12.11(s,1H),7.64(s,2H),7.44-7.42(m, 2H),7.08(d,J＝9.0Hz,2H),6.82(s,1H),6.58(s,1H),3.94(d,J＝20.0Hz,12H), 1.72(s,6H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:171.42,164.82,161.47,160.25,154.19, 153.29,152.48,152.23,131.29,130.55,129.56,126.66,121.35,105.33,101.89, 98.50,79.52,56.98,56.49,56.18,55.36,25.62.

HRMS:[M-H]^-m/z calcd 553.1383for C₂₈H₂₇ClN₂O₈,found 553.1386.

实施例7化合物RA-11的合成

本发明提供的RA-11合成路线如下：

(1)制备中间体RA-1(即化合物RA-1)：3-(4-(5,7-二甲氧基-4-氧代-3,4- 二氢喹唑啉-2-基)-2,6-二甲基苯氧基)-3-氧代丙酸

100mL单口瓶中加入丙二酸(3.83g,20mmol)，加入20mLN,N-二甲基甲酰胺将其溶解，在0℃条件下向反应体系中加入EDCI(3.83g,20mmol)，DMAP(1.22g, 10mmol)，0.5小时后，加入化合物10A(3.26g,10mmol)，并于室温下反应16小时。反应结束后，向体系中加水30mL，用乙酸乙酯萃取三次(3*20mL)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到混合物，经柱层析分离纯化(洗脱液为二氯甲烷/甲醇，体积比40：1)，得到白色固体RA-1(1.65g,40％)。

目标产物的数据如下：

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:11.92(s,1H),7.95(s,2H),6.76(d,J＝2.1Hz, 1H),6.54(d,J＝1.8Hz,1H),3.90(d,J＝12.4Hz,6H),2.39(s,2H),2.18(s,6H).

(2)制备目标化合物RA-11：2-((3-(4-(5,7-二甲氧基-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-2-基)-2,6-二甲基苯氧基)-3-氧代丙酰基)氧基)-2-甲基丙酸

100mL单口瓶中加入化合物RA-1(4.12g,10mmol)，加入20mLN,N-二甲基甲酰胺将其溶解，同时加入碳酸钾(碳酸钾做缚酸剂)(5.53g,40mmol)，化合物13即2-溴异丁酸(5.01g,30mmol)，将体系升温至50℃，反应过夜。反应结束后，向体系中加水30mL，用乙酸乙酯萃取三次(3*20mL)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到混合物，经柱层析分离纯化(洗脱液为二氯甲烷/甲醇，体积比40：1)，得到白色固体RA-11(1.99g,40％)。

目标产物的数据如下：

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:11.65(s,1H),8.96(s,1H),7.85(s,2H),6.70(s,1H),6.47(s,1H),3.88(d,J＝13.4Hz,6H),3.33(s,8H),2.23(s,6H).

¹³C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ:164.63,161.42,160.24,156.97,153.83, 153.26,128.40,124.57,123.09,104.94,101.44,98.97,97.64,56.35,56.02,17.03.

HRMS:[M+Na]⁺m/z calcd 381.1057for C₁₈H₁₈N₂O₆,found 381.1056.

实施例8化合物RB-11的合成

目标化合物RB-11的合成方法与RA-11类似，区别是将9A换成9B，相应的得到的化合物为10B，10B与化合物15反应得到RB-1，RB-1与化合物13反应得到RB-11。

制备中间体RB-1：3-(4-(5,7-二甲氧基-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-2-基)-2,6- 二甲氧基苯氧基)-3-氧代丙酸

100mL单口烧瓶中加入丙二酸(3.83g,20mmol)，加入20mL N,N-二甲基甲酰胺将其溶解，在0℃冰水浴条件下向反应体系中加入EDCI(3.83g,20mmol) 和DMAP(1.22g,10mmol)，0.5小时后，加入化合物RB(3.58g,10mmol)，并于室温下反应16小时。反应结束后，向体系中加水20mL，用乙酸乙酯萃取三次(3*20mL)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到混合物，经柱层析分离纯化(洗脱液为二氯甲烷/甲醇，体积比40：1)，得到淡黄色固体 RB-1(1.99g,45％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:12.07(s,1H),7.58(s,2H),6.78(s,1H), 6.56(s,1H),3.89(t,J＝6.2Hz,12H),2.29(s,2H).

制备目标化合物RB-11：2-((3-(4-(5,7-二甲氧基-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-2-基)-2,6-二甲氧基苯氧基)-3-氧代丙酰基)氧基)-2-甲基丙酸

100mL单口烧瓶中加入化合物RB-1(4.44g,10mmol)，加入20mL N,N- 二甲基甲酰胺将其溶解，同时加入碳酸钾(5.53g,40mmol)和化合物13即2- 溴异丁酸(5.01g,30mmol)，将体系升温至50℃反应过夜。反应结束后，向体系中加水20mL，用乙酸乙酯萃取三次(3*20mL)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到混合物，经柱层析分离纯化(洗脱液为二氯甲烷/甲醇，体积比40：1)，得到白色固体RB-11(2.12g,40％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:11.88(s,1H),9.09(s,1H),7.56(s,2H), 6.72(d,J＝2.1Hz,1H),6.48(d,J＝2.1Hz,1H),3.89-3.84(m,12H),3.34(s,8H).

¹³C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ:164.68,161.41,160.36,153.65,153.01, 148.24,139.55,122.25,105.79,104.95,101.50,97.83,56,66,56.37,56.07.

实施例9BRD4酶活性评价

实验化合物：

本发明所述基于BRD4的双活性抑制剂化合物包括RB-X、RA-G、RB-G、 RA-C、RB-C、RA-11、RB-11以及阳性对照化合物RVX-208。

试剂盒：

人BRD4酶联免疫分析试剂盒

操作步骤：

1.加样：分别设空白孔(空白孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μL，待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

3.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

4.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

5.加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。

6.温育：操作同2。

7.洗涤：操作同4。

8.显色：每孔先加入显色剂A50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。

9.终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

10.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

所有实验数据均经统计处理。实验结果如表1所示。

表1化合物抑制BRD4(BD2)酶活性数据(IC₅₀nM)

实验结果：

衍生物RB-X、RB-G和RB-C的活性高于其他化合物，同时高于先导化合物RVX-208，而衍生物RA-C和RA-G的活性与RVX-208基本相同，可能由于右侧苯环上的甲基被甲氧基替换后，增大了其与蛋白质的相互作用；衍生物 RA-11和RB-11的活性稍微差一些，可能由于中间通过linker连接后，分子链太长，不利于化合物进入结合口袋。

实施例10目标化合物对人肝脏细胞体外活性实验

实验化合物：

实施例6：ApoA-I mRNA和蛋白质的诱导

操作步骤：

将肝脏细胞(HepG2，～2×10⁵/孔)置于含有0.5％(v/v)FBS(胎牛血清)的 400μLMEM(最低基本培养基)的24孔板中，在放置24小时后加入目标化合物。目标化合物溶于DMSO中，体积比为0.05％(v/v)。然后将含有目标化合物的 DMSO储备溶液加入到含有0.5％(v/v)FBS的MEM中，达到所需浓度。

在向细胞中加入化合物之前，将原来的培养基吸出并用300μL新鲜的MEM 置换，同时加入0.5％(v/v)FBS，随后加入300μL含有目标化合物的MEM，最终达到600μL总体积中所需要的目标化合物浓度，其中稀释剂DMSO的体积分数是0.05％(v/v)。

将细胞培养达到所需的时间后，收集培养基和细胞。按照下面描述的方法测定ApoA-I mRNA含量，用ApoA-I ELISA测量分泌的ApoA-I，其具体实施方法参照下面描述的。

(1)ApoA-I mRNA含量测定

试剂盒：mRNA捕获试剂盒

操作步骤：

待细胞培养好时，将培养液从肝脏细胞中移出，一部分培养液置于冰上以供立即使用；另一部分保存在-80℃环境下，将来用于ApoA-I和白蛋白ELISAs(酶联免疫吸附测定)实验中。24孔板上的细胞用200μLPBS(磷酸盐缓冲液)冲洗，小心移出PBS以免带走任何松散连接的细胞。

当PBS被移出以后，将85μL细胞裂解液加入到每一个孔内的细胞上，将细胞在室温下温育5-10分钟以使细胞达到完全裂解和分离的状态。然后用mRNA Catcher PLUS plate(mRNA捕获试剂盒)获取mRNA。最后一次清洗时，尽可能多的吸入清洗缓冲液以免孔内干燥。然后将洗脱缓冲液加入到每个孔中，然后在 68℃的条件下用mRNA洗脱缓冲液孵育mRNACatcher PLUS plate5分钟，随后洗脱mRNA，将得到的mRNA立即将板置于冰上。

洗脱分离出来的mRNA用于一步实时室温-PCR(聚合酶链反应)中，用Ultra SenseKit的组分与primer-probe mixes(引物-探针混合物)一起收集数据。使用Ct 值分析实时PCR数据，以确定每个样本的相对于对照组(即相对于每个样本独立 DMSO的对照)的诱导倍数。

有活性的化合物指的是当浓度小于或等于100μM时引起ApoA-I mRNA增加大于15％的化合物，目标化合物测试结果如下表2所示。

表2：目标化合物对ApoA-I mRNA含量作用数据

实验结果：

RVX-208发挥作用的药效团为喹唑啉酮母核，在衍生物的设计上，我们保留它的基本骨架，在羟基上引入苯氧乙酸类药物基团，衍生物依旧能发挥诱导 ApoA-I mRNA表达的功能。

(2)ApoA-I ELISA

试剂盒：

人ApoA-I酶联免疫分析试剂盒

操作步骤：

待细胞培养好时，移出HepG2细胞或者原代细胞中的培养基，储存在1.5mL 微量离心管中，冷冻在-80℃下。

对于人类ApoA-I ELISA实验，将人ApoA-I捕获抗体用包被缓冲液稀释至大约2μg/ml，ELISA板用100μL/孔的人ApoA-I捕获抗体在室温下包被1小时。随后将ELISA板在洗涤缓冲液中洗涤三次。然后在室温下用200μL/孔的人 ApoA-I封闭缓冲液封闭ELISA板至少30分钟。

用来制作标准曲线的样品用HepG2培养基(MEM，加有0.5％(v/v)FBS)制备。系列2是由原来的加有0.5％(v/v)FBS的培养基稀释两倍得到的。用目标化合物处理过的培养基待测样品也用0.5％(v/v)FBS的MEM培养基稀释，该板在洗涤缓冲液中洗涤三次。将标准曲线和待测样品(100μL/孔)一式三份加入到平板中，并在室温下温育1.5小时。

将板在洗涤缓冲液中洗涤三次。人ApoA-I检测抗体用PBS以1：1000的比例稀释，并将其加入到板(100μL/孔)中，将板在室温下温育1小时。将板在洗涤缓冲液中洗涤三次。

山羊抗兔lgG H&L链特异性过氧化物酶结合物用PBS中以1:2000的比例稀释，并将其加入到板(100μL/孔)中，将板在室温黑暗处下温育40分钟。将板在洗涤缓冲液中洗涤六次。

向板中加入TMB(四甲基联苯胺，100μL/孔)液体底物，在显影过程中将板在振荡器箔上孵育。一旦得到充分的“蓝色”，加入终止液(50μL/孔，1M H₂SO₄)并用平板振荡器充分混合，除去气泡，得到450nm处的吸光度，用Molecular Devlces SpectraMax190平板读数仪和人ApoA-I ELISA Softmax软件测定450nm处的吸光度，得到EC₅₀值，测定结果如下表3所示。

表3：目标化合物活性数据(EC₅₀nM)

实验结果分析：

新设计的衍生物依旧可以诱导ApoA-I的表达。其中衍生物RB-X、RB-C和 RB-G的毒性低于其他化合物，同时低于先导化合物RVX-208，衍生物RA-C和 RA-G的毒性和先导化合物基本相同，分析可能原因为，甲氧基的供电子能力比甲基更强，改变了与蛋白之间的相互作用；衍生物RA-11和RB-11的毒性稍微大一些，分析可能的原因为分子中增加了双酯基部分，酯基经过人体胃肠道水解后进入体内，干扰了原来正常的蛋白结合作用。

实施例11体外活性实验

为了测试目标化合物对体内模型是否有效，选用健康雄性SD大鼠，经过高脂高糖乳剂灌胃的方法得到混合型高脂血症大鼠模型，其TC和TG指标都高于正常大鼠。此模型具有饲养方便、周期短、易于取样的优点；同时，其胆固醇合成与代谢途径与人类相似。高脂血症大鼠经过定量喂食含有目标化合物的载体，收集血浆，测定其中HDL-C和TG含量。

操作步骤：

高脂血症大鼠每笼5只饲养，提供食物和水。一周适应期后，大鼠分别通过尾巴编号和称重进行识别。大鼠先进行预取血作为对照组，将100μL血液收集在含有5μL0.5mMEDTA的1.5mL离心管中，置于冰上冷却。将血液在4℃下以14000rpm在高速微型冷冻离心机上离心10分钟后收集血浆，并在-80℃下冷冻。

预取血之后，通过口服给药的方式，用弯曲的一次性喂食针每天喂食两次，分别在早上8点和下午5点，阳性对照吉非贝奇、氯贝丁酯以及RVX-208。每天在载体中加入目标化合物，含量为30mg/kg体重，连续喂食一周。在给药的最后一天，给药后2小时，通过吸入CO₂处死大鼠，并通过心脏穿刺(0.7-1.0mL) 获得血液。收集血浆并在-80℃冷冻。待测样品通过HPLC(高效液相色谱)分析 HDL-C含量，通过GPO-PAP(磷酸甘油氧化酶-过氧化物酶)法测定TG含量，检测结果如下表4所示，HDL-C和TG测定的都是相对于对照组上升以及下降的比例。

表4目标化合物对大鼠HDL-C、TG含量测定结果

实验结果分析：

正常雄性SD大鼠血清内TC的指标范围是2.20±0.07mmol/L，TG为 0.88±0.13mmol/L，而在本实验中预先取血得到的对照组中TC和TG指标为 20.13mmol/L和1.56mmol/L，明显高于正常大鼠的指标，为高脂血症。经过喂食目标化合物后抽血得到的样本，经过分析表4的数据可以发现，吉非贝奇和氯贝丁酯的主要功能是降低TG；先导化合物RVX-208对升高HDL-C有效，而对降低TG没有效果；衍生物RB-X的升高HDL-C效果高于先导化合物RVX-208，同样对降低TG没有作用效果；衍生物RB-C、RB-G和RB-11既有升高HDL-C 的功能，也有降低TG的功能，同时RB-G/RB-C的降TG功能高于RB-11而RB-C 的降TG功能与RB-G基本相同；衍生物RA-C、RA-G和RA-11也是既有升高 HDL-C的功能，也有降低TG的功能总体来说，化合物RB-G/RB-C在降HDL-C 和TG上的效果均优于现有化合物。本发明在母体化合物RVX-208的母体结构上引入不同的苯氧乙酸类药物(吉非贝奇和氯贝丁酯)药效团可以使化合物具有降HDL-C和TG的双重作用，其中母体结构及其基团变化(如连接的甲氧基) 会对苯氧乙酸类药物药效团的作用产生一定的影响。

以上对本发明的特定实施例进行了说明，但本发明的保护内容不仅仅限定于以上实施例，在本发明的所属技术领域中，只要掌握通常知识，就可以在其技术要旨范围内进行多种多样的变更。

Claims

1.一种基于BRD4抑制剂RVX-208的衍生物，其特征在于，结构如式I所示：

其中，R₁选自-CH₃或

R₂选自如下取代基：

R₃和R₄选自卤素；式中，n＝1～3。

2.根据权利要求1所述的基于BRD4抑制剂RVX-208的衍生物，其特征在于，R₃和R₄选自氯或溴。

3.根据权利要求1所述的基于BRD4抑制剂RVX-208的衍生物，其特征在于，结构如式RA-G、RB-G、RA-C、RB-C、RA-11或RB-11所示：

4.根据权利要求1～3任一项所述的基于BRD4抑制剂RVX-208的衍生物的制备方法，其特征在于，包括：

(1)在催化剂和脱水剂作用下，式8化合物与式9化合物反应，得式10化合物；

R₁选自-CH₃或

(2)式10化合物与丙二酸、丁二酸或戊二酸反应后，再与2-卤代异丁酸或4-卤代苯氧基异丁酸反应；或，

式10化合物直接与2-卤代异丁酸或4-卤代苯氧基异丁酸反应。

5.根据权利要求4所述的基于BRD4抑制剂RVX-208的衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，反应在有机溶剂中进行，有机溶剂选自：N,N-二甲基甲酰胺或者二甲基乙酰胺；式8化合物与式9化合物的摩尔比为1：1～2；反应温度为110～120℃，反应时间为12～18h；所述的催化剂为亚硫酸氢钠，所述的脱水剂为甲基苯磺酸一水合物或对甲基苯磺酸。

6.根据权利要求4所述的基于BRD4抑制剂RVX-208的衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，式10化合物与丙二酸、丁二酸或戊二酸的反应在有机溶剂中进行，有机溶剂选自：N,N-二甲基甲酰胺或者二甲基乙酰胺，式10化合物与丙二酸、丁二酸或戊二酸的摩尔比为1:1.5～2.5，反应温度为25～30℃，反应时间为10～16h；

式10化合物直接与2-卤代异丁酸或4-卤代苯氧基异丁酸反应在有机溶剂中进行，有机溶剂选自：N,N-二甲基甲酰胺或者二甲基乙酰胺，式10化合物与2-卤代异丁酸或4-卤代苯氧基异丁酸的摩尔比为1：1.2～1：2；反应温度为25～30℃，反应时间为12～16h。

7.根据权利要求1～3任一项所述的基于BRD4抑制剂RVX-208的衍生物在制备预防、治疗心血管疾病药物中的应用。

8.根据权利要求1～3任一项所述的基于BRD4抑制剂RVX-208的衍生物在制备靶向BRD4药物中的应用。

9.根据权利要求1～3任一项所述的基于BRD4抑制剂RVX-208的衍生物在制备降血脂药物中的应用。

10.一种药物，其特征在于，含有权利要求1～3任一项所述的基于BRD4抑制剂RVX-208的衍生物。