CN108474800B - 采血管、试剂及利用了它们的血液性状分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种血栓形成能力或凝血能力的分析方法，其特征在于，使用以含柠檬酸钠的采血管所采集的血液，在该血液中添加钙、凝血因子XII(FXII)抑制剂及激肽释放酶抑制剂，引发凝血反应。优选的是：在所述血液中进一步添加肝素、硫酸乙酰肝素及组织因子，进行血栓形成能力或凝血能力的分析。

Description

采血管、试剂及利用了它们的血液性状分析方法
技术领域
本发明涉及可以适合用于血小板血栓形成能力、混合白色血栓形成能力等血液性状分析的采血管、试剂及使用了它们的血液性状分析方法。
背景技术
在血液检查中，大多情况下无法在采血后立即进行检查，随着时间的经过血液发生凝固，因此使用预先添加了肝素、柠檬酸钠等抗凝剂的采血管来进行采血。作为将肝素利用为抗凝剂的采血管，例示了专利文献1中所公开的采血管。
另一方面，关于在生物体内的血栓形成或止血反应，由在胶原上的血小板黏附和凝聚反应构成的一次止血与由继其之后的凝血因子的活化产生的纤维蛋白凝胶的二次止血同时进行。在动脉条件下以血小板凝聚反应为主体的一次止血占优势，在静脉条件下由凝血反应构成的二次止血比一次止血占优势，形成含有更多纤维蛋白的血栓。迄今为止，本发明人等开发了一种使用微型芯片的血液性状分析装置，所述微型芯片用于使用微量血液评价血小板血栓形成能力、混合白色血栓形成能力且具有模仿血管的流路(专利文献2～5)。
另外，作为对在非血流下的凝血反应进行详细解析的装置，使用血栓弹性描记法(TEG)、ROTEM(商标)等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平4‐9143号公报
专利文献2：日本再表2010/018833号公报
专利文献3：日本再表2011/99569号公报
专利文献4：日本再表2009/69656号公报
专利文献5：日本再表2007/46450号公报
发明内容
发明要解决的课题
如上所述，已知在内部包含肝素等抗凝剂的采血管，通过使血液与采血管的管帽(cap)接触，从而引起凝固级联的接触因子的活化反应等，在公知的采血管中尚有改善的余地。另外，在使用如上述那样的血液性状分析装置来评价所采集的血液时，理想的是被进一步定制的采血管。
另外，期望开发一种试剂，其即使在使用以往所通用的包含柠檬酸的采血管的情况下，也能以更良好的灵敏度进行混合白色血栓形成能力的分析及凝血检查。
用于解决课题的手段
本发明人等发现即使是一般所通用的含有肝素、柠檬酸钠等抗凝剂的真空采血管，也会活化接触因子，促进全血中的凝血，并且发现该凝固促进可以通过在采血管中预先添加少量的凝血因子XII(FXII)抑制剂、激肽释放酶抑制剂等接触因子抑制剂来进行抑制。进而发现：利用此种在内部包含肝素(优选低分子肝素)或柠檬酸钠、和接触因子抑制剂的采血管所采集的血液，可以适合用于血小板血栓形成能力、混合白色血栓形成能力的分析以及以往的凝血检查(ROTEM、TEG等)。
另外，发现：在使用以往所通用的包含柠檬酸的采血管的情况下，在试剂中添加来自玉米的胰蛋白酶抑制剂(CTI)等FXII抑制剂及激肽释放酶抑制剂，并且优选进一步添加少量的肝素和/或硫酸乙酰肝素，从而可以适合用于混合白色血栓形成能力的分析及以往的凝血检查(ROTEM、TEG等)，以至完成本发明。
本发明提供一种采血管，其在内部包含肝素或柠檬酸钠、和凝血因子XII(FXII)抑制剂及激肽释放酶抑制剂等接触因子抑制剂。
在此，所使用的肝素可以使用低分子肝素、戊糖(pentasaccharide)(促进抗凝血酶的Xa抑制的肝素内的五糖结构)，但肝素优选质均分子量为4500～6500的低分子肝素，低分子肝素优选以在采血时相对于血液为0.1～10单位/mL(0.1～10IU(国际单位)/mL)的量被涂布于采血管内部。另外，作为肝素的替代物，可以使用硫酸乙酰肝素。另外，FXII抑制剂优选为来自玉米的胰蛋白酶抑制剂(CTI)，CTI优选以在采血时相对于血液为5～50μg/mL的量被涂布于采血管内部。
激肽释放酶抑制剂优选为抑肽酶，抑肽酶优选以在采血时相对于血液为1～50μg/mL的量被涂布于采血管。
FXII抑制剂及激肽释放酶抑制剂等接触因子抑制剂，优选被涂布在采血管内部并且是处于干燥状态。
另外，本发明提供一种以纤维蛋白和活化血小板为主成分的混合白色血栓形成能力的分析方法，其使用采用在内部包含上述肝素和接触因子抑制剂的采血管所采集的血液，向其中添加肝素酶后，测定血栓形成能力。在此，优选以1～10单位/mL(1～10IU(国际单位)/mL)的浓度添加肝素酶，另外，可以是如下方式：在采血管的内部包含25μg/mL以下的CTI和/或1～50μg/mL的抑肽酶，并且肝素酶与10μg/mL以上的CTI一起被添加。更优选的分析方法是使用在内部设有模仿血管的流路的微型芯片并使血液流入流路而进行分析的方法，微型芯片优选具有在流路上涂布有胶原和组织因子(tissue factor：组织促凝血酶原激酶)的部位。但是，也可以用于ROTEM(商标：rotation thromboelastometry)、TEG(商标：Thromboelastography)等其他的凝血检查。在该情况下，在包含肝素和接触因子抑制剂的血液中添加肝素酶和低浓度(例如0.1nM～10nM)的组织因子，由此引发凝固。
另外，本发明提供一种血小板血栓形成能力的分析方法，其以活化血小板为主体，并且使用采用上述采血管所采集的血液，使该血液流入微型芯片的流路，从而测定血栓形成，所述微型芯片是在内部设有模仿血管的流路且在流路上具有流路分割部。
另外，本发明提供通过使用由以往的具有橡胶栓的采血管所采集的血液并添加接触因子抑制剂(FXII抑制剂、激肽释放酶抑制剂)和肝素(或硫酸乙酰肝素)来对在血流下的血栓形成进行解析的方法、以及通过添加接触因子抑制剂和肝素及组织因子而使用ROTEM或TEG进行凝血的解析的方法。
发明效果
利用肝素(优选低分子肝素)和FXII抑制剂(来自玉米的胰蛋白酶抑制剂(CTI)等)和/或激肽释放酶抑制剂(抑肽酶等)等接触因子抑制剂进行抗凝处理并且被保存的血液，保持良好的血小板功能，适合在涂布有胶原的微型芯片内测定血小板血栓形成能力。
进而，在利用肝素和接触因子抑制剂进行抗凝处理并被保存的血液中添加肝素酶，将肝素分解后的血液适合于测定在涂布有胶原和组织因子的微型芯片内的以纤维蛋白和活化血小板为主成分的混合白色血栓形成能力。
另外，例如，若在用肝素和激肽释放酶抑制剂进行抗凝处理并被保存的血液中在测定时添加肝素酶和CTI来进行测定，则在测定时能够利用激肽释放酶抑制剂和CTI两者更强力地抑制接触因子，适合于混合白色血栓形成能力测定及ROTEM、TEG等凝血测定。
与抑肽酶相比，CTI价格高，因此作为特别优选的实施方式，理想的是：在采血管中涂布低分子肝素和抑肽酶和/或少量的CTI(25μg/mL以下)，在测定时进一步添加肝素酶和CTI(例如10～50μg/mL)的混合物，从而进行测定。
另外，在仅用于以凝血为主体的检查的情况下，也可以代替肝素而使用柠檬酸钠。在该情况下，可以用包含柠檬酸钠(优选约11mM)和激肽释放酶抑制剂的采血管进行采血，并添加钙(例如氯化钙；以下同义)或者添加钙和CTI来进行测定。
另一方面，在使用以一般能够获得的包含3.2～3.8％的柠檬酸钠的真空采血管所采集的血液进行测定的情况下，即使在测定时添加CTI(例如10～50μg/mL)和激肽释放酶抑制剂(例如10～50μg/mL的抑肽酶)及钙，也会抑制测定时的接触因子的活化及凝血的促进，能够准确地测定血栓形成能力。在该情况下，除CTI、激肽释放酶抑制剂和钙外，还通过添加低浓度(0.5单位(U)/mL以下)的肝素、低分子肝素、达那肝素钠(以硫酸乙酰肝素为主成分的低分子类肝素)，从而能够更良好地抑制凝血，适合于上述混合白色血栓形成能力测定。
另外，通过在采集于包含柠檬酸钠的采血管中的血液检体中添加CTI、激肽释放酶抑制剂、钙，优选通过还添加低浓度的肝素或硫酸乙酰肝素，更优选通过还添加低浓度的组织因子，从而引发凝血的情况下，在ROTEM、TEG等凝血检查中，能够进一步进行生理性的凝血反应的解析。
一般而言，生物体内的凝血并不单纯化地为外因系、内因系，而因在细胞表面所表达的少量的组织因子而被引发，可以说会因少量产生的基于凝血酶得到的凝血因子XI、VIII、V的活化而被放大。根据(基于细胞的凝血模型(cell based coagulation model)；兽医急诊和重症监护杂志(Journal of Veterinary Emergency and Critical Care)19(1)2009，pp 3～10)，在上述的分析中，认为抑制来自橡胶栓的非生理性凝血的活化同时由少量的组织因子引发凝血的测定接近于生物体内的凝血。进而，近年来，凝血因子VII(NovoSeven)、组织因子路径的抑制剂(TFPI：BAX499)等也被作为止血用制剂来使用(或在开发中)，在评价这些药剂的效果上，也认为是有用的。
综上，利用肝素和接触因子抑制剂进行抗凝处理后的血液，可以用于血小板血栓和混合白色血栓两者的测定，进而也可以用于ROTEM、TEG等凝血测定。
另外，在利用一般能够获得的将橡胶栓用作管帽的包含3.2～3.8％柠檬酸的采血管进行采血的情况下，通过在测定时添加钙、FXII抑制剂及激肽释放酶抑制剂，优选还添加少量的肝素或硫酸乙酰肝素，从而能够进行混合白色血栓的测定或凝血的测定。
作为FXII因子抑制剂，优选CTI，作为激肽释放酶抑制剂，优选抑肽酶。进而，更优选除了CTI、抑肽酶、氯化钙之外还添加少量的肝素或硫酸乙酰肝素。通过使用该混合物，从而能够适合进行在使用了涂布有组织因子和胶原的流路的血流下的混合白色血栓的解析。
另外，除了CTI、抑肽酶、肝素之外还添加少量的组织因子，引发凝血，由此能够良好地进行使用了ROTEM、TEG等的凝血解析。
通过使用这些试剂，从而在通过CTI来抑制接触因子的活化的环境下，通过少量的组织因子而引发凝血，在基于所生成的少量的凝血酶的针对凝血因子XI、VIII、V的反馈活化下，放大凝固级联，能够进行更接近生理的凝固反应的解析。
所使用的组织因子可以是由动物组织提取的组织促凝血酶原激酶或利用基因重组技术制作的可溶性(细胞外域)的组织因子。作为基因重组的组织因子，可以使用作为重组PT试剂而市售的DADE INOVIN(西门子)、Hemos IL(IL JAPAN)等。
所添加的组织因子的量并无特别限制。在所添加的肝素或硫酸乙酰肝素的量多的情况下，组织因子的量也变多，但是，为了进行凝血的解析，理想的是在正常的血液中引发凝血发生在3分钟～30分钟之间。这是由于：当在3分钟以内引发凝血的情况下，由组织因子所致的外因系的凝血的影响大，内因系的参与很微小，有时不适合于血友病等的诊断，在如凝血的引发超过30分钟的情况下，作为检查，过于耗费时间。
在使用由基因重组所制成的组织因子的情况下，理想的是以0.1nM～10nM的范围进行添加。
在使用肝素和CTI或激肽释放酶抑制剂而对患者血液检体的血小板血栓形成进行分析的情况下，在患者接受肝素或低分子肝素的给药的情况下，所分析的血小板血栓形成能力受到影响。在此种情况下，添加肝素酶/凝血酶抑制剂(例如水蛭素、阿加曲班/BAPA(苄基磺酰基－D－Arg－Pro－4－脒基苄基酰胺)等)的试剂，将低分子肝素分解，置换成凝血酶抑制剂，由此患者不会受到由肝素带来的对治疗的影响，能够分析血小板血栓形成能力。
另外，肝素酶/凝血酶抑制剂混合试剂，对于分析由被广泛通用的涂布有肝素的采血管所采集的血液的、血小板血栓形成能力也是有用的。
一般而言，使用了辅助人工心肺的心脏外科手术，主要需要监测由血液稀释带来的止血功能的降低及由止血制剂(血浆分级制剂、血小板制剂等的输血)带来的止血功能的恢复。接受手术的患者基本上要确保利用导管从动脉采血的路径，在这样的患者中无需使用真空采血管。尤其在辅助人工心肺的使用中给药大量的肝素，在对这样的患者的血液检体的血小板血栓(一次止血能力)进行分析的情况下，对于肝素酶和凝血酶抑制剂的混合试剂(优选预先涂布有混合试剂的容器)，优选在纤维蛋白和血小板血栓(一次止血二次止血综合)的分析中使用肝素酶和CTI的混合试剂(优选预先涂布有混合试剂的容器)来进行分析。在使用预先涂布有上述试剂的容器的情况下，在血液采集后添加到容器中，仅通过进行颠倒混合，便可以在测定中使用，因此较为简便。尤其，在对具有感染症的患者血液检体、失血、血液稀释而血细胞比容的降低显著的患者的血液进行分析的情况下，在上述的试剂中添加4,4'-二硝基二苯乙烯-2,2'-二磺酸双钠盐(Disodium4,4'－Dinitrostilbene－2,2'－disulfonate(DNDS))，从而可以抑制血沉，并且可以对血栓形成能力、止血功能进行分析。理想的是此时的DNDS的浓度为20～200μg/mL。
附图说明
图1为表示用于使用由本发明的采血管所采集的血液而对血栓形成能力进行评价的微型芯片的第一方式的图。
图2为表示用于使用由本发明的采血管所采集的血液而对血栓形成能力进行评价的微型芯片的第二方式的图。
图3为表示使用采用包含柠檬酸钠的各种采血管所采集的血液并添加氯化钙或添加氯化钙和CTI而进行的ROTEM测定的结果的图～实施例1。
图4为表示使用采用包含低分子肝素的采血管所采集的血液并添加肝素酶或添加肝素酶和CTI而进行的ROTEM测定的结果的图～实施例2。
图5为表示使用采用包含柠檬酸钠的各种采血管所采集的血液并添加氯化钙和CTI而进行的白色血栓形成测定的结果的图～实施例3。
图6为表示使用采用包含柠檬酸钠的各种采血管所采集的血液并添加氯化钙和CTI而进行的白色血栓形成测定的结果以及使用采用包含低分子肝素的各种采血管所采集的血液并添加肝素酶而进行的白色血栓形成测定的结果的图～参考例。
图7为表示使用在包含低分子肝素和CTI的真空采血管、水蛭素采血管及BAPA采血管中所采集的血液并进行血小板血栓形成的测定的结果的图～实施例4。
图8为表示使用在BD公司肝素采血管中所采集的血液并添加肝素酶-BAPA混合试剂而进行血小板血栓形成的测定的结果的图～实施例5。
图9为表示使用在BD公司柠檬酸钠采血管中采集的血液并添加各试剂而进行ROTEM的测定的结果的图～实施例6。
图10为表示使用在BD公司柠檬酸钠采血管中采集的血液并添加各试剂而进行ROTEM的测定的结果的图～实施例7。
图11为表示使用采用采血管B所采集的血液并添加氯化钙和CTI而进行的白色血栓形成测定的结果以及使用采用BD公司采血管所采集的血液并添加氯化钙、CTI、抑肽酶和肝素钠而进行的白色血栓形成测定的结果的图～实施例8。
图12为表示使用采用采血管B所采集的血液并添加氯化钙和CTI而进行的白色血栓形成测定的结果以及使用采用BD公司采血管所采集的血液并添加氯化钙、CTI、抑肽酶和肝素钠而进行白色血栓形成测定的结果的图。其是表示(a)为无抗凝药的结果、(b)为以各浓度添加利伐沙班时的结果、(c)为以各浓度添加达比加群时的结果的～实施例9。
图13为表示使用在BD公司柠檬酸钠采血管中采集的血液并添加各试剂而进行ROTEM的测定的结果的图～实施例10。
图14为表示使用在BD公司柠檬酸钠采血管中采集的血液并添加各试剂而进行ROTEM的测定的结果的图～比较例。
图15为表示使用采用BD公司柠檬酸钠采血管所采集的血液并添加氯化钙、CTI、抑肽酶和达那肝素钠而进行的白色血栓形成测定的结果的图～实施例11。
图16为表示使用在BD公司柠檬酸钠采血管中采集的血液并添加氯化钙、CTI、抑肽酶和达那肝素钠而进行ROTEM的测定的结果的图～实施例12。
图17为表示使用在BD公司柠檬酸钠采血管中采集的血液并添加氯化钙、CTI、抑肽酶和达那肝素钠而进行ROTEM的测定的结果的图～实施例13。
具体实施方式
本发明的采血管在内部包含低分子肝素或柠檬酸钠、和接触因子抑制剂(例如FXII抑制剂或激肽释放酶抑制剂)。
肝素是硫酸化D－葡糖胺、D－葡糖醛酸、L－艾杜糖醛酸形成聚合物而构成的分子量约5000～30000的粘多糖类。在本发明中所使用的肝素优选质均分子量为4500～6500的低分子肝素。另外，肝素可以是肝素钠或肝素锂等金属盐。肝素一般可以安全地使用来自牛的肝素，此外，也可以使用来自猪、狗等动物或人等的肝素。
作为FXII抑制剂，可列举CTI、COU254、RD12等合成抑制剂，其中，优选CTI。CTI被公开在例如以下的文献中，并且可以使用市售的产品，也可以自己从玉米制备来使用。
J Biol Chem.1977Nov 25；252(22)：8105－7.
Thromb Res.1980Oct 15；20(2)：149－62.
Blood.1996Nov 1；88(9)：3432－45.
COU254、RD12被记载于例如下述的文献中。
Exp Transl Stroke Med.2010；2：5.Published online 2010Feb 15.doi：10.1186/2040－7378－2－5
ACS Chem Biol.2015Aug 21；10(8)：1861－70.doi：10.1021/acschembio.5b00103.Epub 2015May 19.
A Synthetic Factor XIIa Inhibitor Blocks Selectively IntrinsicCoagulation Initiation.
Baeriswyl V1，Calzavarini S2，3，Chen S1，Zorzi A1，Bologna L2，3，Angelillo－Scherrer A2，3，Heinis C1.
作为激肽释放酶抑制剂，可列举抑肽酶，也可以使用其他低分子的激肽释放酶抑制剂。
Expert Opin Investig Drugs.2006Sep；15(9)：1077－90
本发明的采血管的形状并无特别限制，可以为与公知的采血管同样的形状，但是，作为本发明的一个实施方式的采血管，可列举在有底筒状的采血管本体上安装有对采血管本体的开口部进行密封的栓体的采血管。
另外，理想的是对安装有上述栓体的采血管本体内进行减压。通过预先对采血管内进行减压，从而可以快速地进行采血。予以说明，减压的程度只要根据采血量进行适当设定即可。
作为本发明的采血管中的有底管，优选玻璃、聚对苯二甲酸乙二醇酯-聚对苯二甲酸丁二醇酯-聚萘二甲酸乙二醇酯-聚间苯二甲酸乙二醇酯等的均聚物或共聚物、丙烯酸类树脂、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚缩醛、聚酰胺、聚氨酯等。
作为对本发明的采血管中的有底管的开口部进行密封的栓体，优选橡胶、弹性体或铝蒸镀膜等。作为橡胶，可列举氯化丁基橡胶、溴化丁基橡胶、异戊二烯橡胶、天然橡胶等，作为弹性体，可列举烯烃系、聚酯系、聚氨酯系等。另外，作为铝蒸镀膜，可列举按照针能够刺穿的方式在铝蒸镀膜上设置异戊二烯等的橡胶按钮而与有底管粘接的形态。
作为将肝素或柠檬酸钠及FXII抑制剂、激肽释放酶抑制剂等接触因子抑制剂引入至采血管内部的方法，可例示以下方法：通过对采血管的内壁喷雾肝素或柠檬酸钠及接触因子抑制剂的溶液，并使其干燥，从而使之附着于内壁的方法。另外，在采血管内封入肝素或柠檬酸钠及接触因子抑制剂，用栓体密封有底管的开口端后，用铝蒸镀膜或塑料包装材料进行密封，由此保护其长期免受热、水分的影响，可以增加肝素或柠檬酸钠及接触因子抑制剂的稳定性。另外，在使肝素或柠檬酸钠及接触因子抑制剂存在于本发明的采血管之前，对有底管内表面实施硅酮涂敷，从而可以防止血液的异常凝固、附着等。
在本发明中，每1mL所要采集的血液中，作为抗凝剂而被封入采血管内的低分子肝素优选为1～10单位(抗FXa单位：国际单位)(1～10IU/mL)，更优选为3～8单位(3～8IU/mL)。
在本发明中，作为抗凝剂而被封入采血管内的柠檬酸钠，理想的是相对于所要采集的血液为1/10量的3.2～3.8％的柠檬酸钠。
在本发明中，被封入采血管内的FXII抑制剂的量，只要是能够抑制凝血因子XII的量即可，但在CTI的情况下，在每1mL所要采集的血液中，优选为5～50μg。予以说明，关于CTI的量，可以仅添加防止在采血管内的接触因子活化所需的量。可列举例如25μg/mL以下、优选5～20μg/mL的量。
在本发明中，被封入采血管内的激肽释放酶抑制剂的量，只要是能够抑制激肽释放酶的量即可，但在抑肽酶的情况下，在每1mL所要采集的血液中，优选为1～50μg。予以说明，可以将抑肽酶和CTI两者封入采血管内，在该情况下，CTI的量可以仅为防止在采血管内的接触因子活化所需的量，例如可以为1～10μg/mL的量。
使用采用此种采血管所采集的血液而进行血栓形成能力的分析。血栓形成能力的分析方法只要是在体外的方法，则并无特别限制，但优选列举使用了在内部设有模仿血管的微流路的微型芯片的、在血流下的血栓形成能力的分析方法。予以说明，也可以用于以往的ROTEM、TEG等的凝固能力解析中。
作为此种使用了微型芯片的血栓形成能力的分析方法，本发明人等报道了在流路的中途具有流路分割部的血小板血栓分析用的微型芯片和在流路的中途具有涂布了胶原和组织因子的血栓观测部的混合白色血栓分析用的微型芯片。
首先，参照图1对使用了血小板血栓分析用的微型芯片A的、血小板血栓形成能力的分析方法进行说明。予以说明，在图1的例子中，平行地设置有2条流路，但是只不过是例示，当然流路也可以为1条，还可以为别的方式。
在微型芯片A的第一流入口104及第二流入口114，分别倒立地连接有储液器(血液收容容器)106、116，在储液器106、116上连接有送液泵107、117。在送液泵107、117上连接有压力传感器108、118。
在刚要测定之前将由本发明的采血管所采集的血液引入储液器106、116中，进行测定。
送液泵107、117的液体为矿物油或生理盐水等比重比血液小的液体，用送液泵107、117将该液体分别引入到预先填充有血液的储液器106、116中，使该液体在血液上分层，并且将该液体用泵107、117挤出，由此将血液引向流路101、111。通过测定该液体的流入压，从而可以间接地测定血液向流路中流入的流入压。
具体而言，使矿物油从送液泵107、117被压入储液器106、116内，在血液上分层，将血液挤出至微型芯片1的流路101、111内。血液通过流路101、111，到达反应部102、112。在第一反应部及第二反应部涂布胶原，再如专利文献2、3所公开那样沿着血液的流动方向进行延伸，设置将流路的宽度分割成多个的多个流路分割壁，在分割壁的部分比其他部分更先发生由血栓形成所致的闭塞。流路分割壁的间隔理想的是200μm以下。另外，在流路分割部中，理想的是流路的宽度被流路分割壁分割为5个以上。流路分割壁的形状只要将流路的宽度分割为多个，则并无特别限制。另外，如专利文献3中记载的那样，可以对流路分割壁实施使表面粗糙度(Ra)达到10～200nm的处理。
在通过反应部时产生由血小板所致的血栓形成，观测基于该血栓形成带来的流入压的上升。用压力传感器检测这些压力上升图案，并进行比较，由此可以评价血液的性状、即血小板血栓形成能力。
供于检查的血液从流路101、111的终端到达废液存积部103、113而被存积，并且从废液口105、115被排出。予以说明，若在废液存积部内配置了浸渗有EDTA等的海绵等血液吸收材料，则血液废液被血液吸收材料吸收，未凝固，因此不会对压力的测定造成不良影响。
接着，参照图2对使用了混合白色血栓分析用的微型芯片B的、混合白色血栓形成能力的分析方法进行说明。予以说明，图2的例子是在通过流路后的血液中添加凝血防止剂的方式，但只不过是例示，当然也可以为别的方式。
在微型芯片B的流入口204上倒立地连接有储液器(血液收容容器)206，在储液器206上连接有送液泵207。在送液泵207上连接有压力传感器208。
在刚要测定之前对由本发明的采血管所采集的血液添加肝素酶而将肝素分解后，引入到储液器206中，进行测定。肝素酶也取决于所采集的血液试样中的肝素的量，但是，在每1mL血液中，优选为0.1～10单位(0.1～10IU/mL)，更优选为0.2～5单位(0.2～5IU/mL)。
予以说明，在使存在于采血管内部的CTI的量仅为防止在采血管内的接触因子活化所需的量的情况下，对于混合白色血栓分析而言，优选与肝素酶一起追加地添加CTI。例如，优选使采血管的内部的CTI的量为25μg/mL以下(例如5～20μg/mL)，并且在刚要测定之前与肝素酶一起添加10μg/mL以上的CTI而供于混合白色血栓分析。
送液泵207的液体为矿物油或生理盐水等比重比血液小的液体，用送液泵207将该液体引入到预先填充有血液的储液器206中，使该液体在血液上分层，用泵207挤出该液体，由此将血液引向流路201中。通过测定该液体的流入压，从而可以间接地测定血液向流路中流入的流入压。
具体而言，由送液泵207将矿物油压入储液器206内，在血液上分层，将血液挤出至微型芯片B的流路201内。血液通过在流路的中途设置的狭窄部209，到达反应部202。通过预先设置狭窄部，从而也能够观测到由高剪切应力引起的血小板凝聚，还能够再现动脉粥样硬化血栓症的血栓生成，因此是优选的。在反应部涂布胶原及组织因子(Tissue factor)，在此形成血栓。通过包含胶原和组织因子，从而诱发在胶原上血小板的黏附及凝聚以及由组织因子所致的凝固系的活化等综合性地参与血栓形成的现象。观测到基于该血栓形成带来的流入压的上升。利用压力传感器检测这些压力上升图案，并进行比较，由此可以评价血液的性状、即混合白色血栓形成能力。
供于检查的血液从流路201的终端到达废液存积部203。然后，与从凝血防止剂流入口211通过凝血防止剂流路210而被注入的凝血防止剂混合，从排出口205排出。作为凝血防止剂，是出于防止由废液的凝血所致的堵塞、压力上升的目的而使用的物质，可以使用EDTA、柠檬酸等螯合剂、酸、碱溶液、醇类或胍、尿素、SDS等变性剂。
另外，在使用通用的包含柠檬酸钠的采血管对混合白色血栓形成进行解析的情况下，添加钙(优选氯化钙)、接触因子抑制剂(FXII因子抑制剂、激肽释放酶抑制剂)而引发凝血反应，由此能够进行良好的测定。
一般所通常使用的采血管中所含的柠檬酸钠，按照相对于血液为0.32～0.38％的方式进行调整。
所添加的氯化钙的浓度，只要能够解除由柠檬酸钠所致的螯合作用，则并无特别限制，但理想的是11～12mM。
接触因子抑制剂可列举FXII抑制剂及激肽释放酶抑制剂。
FXII抑制剂只要是具有FXII抑制活性的物质，则并无特别限制，可以使用CTI。在CTI的情况下，每1mL血液中，优选为5～200μg，更优选为10～50μg。
激肽释放酶抑制剂并无特别限制，但理想的是抑肽酶。在抑肽酶的情况下，每1mL血液中，优选为1～100μg。
通过并用FXII抑制剂和激肽释放酶抑制剂，从而能够进行更完全的接触因子的活化抑制，因此是理想的。
尤其，抑肽酶除对激肽释放酶进行抑制外还对血纤维蛋白溶酶进行抑制。另外，血纤维蛋白溶酶的基质特异性较低，将凝血因子活化。
因此，通过抑制激肽释放酶，从而完全抑制接触因子的活化，并且同时抑制血纤维蛋白溶酶，从而能够抑制由更完全的非特异性的路径所致的凝血因子的活化。另外，在抑制血纤维蛋白溶酶的情况下，抑制纤溶反应，因此适合于患者的凝血的状态、例如血友病的诊断、抗凝固药的评价。
进而，在进行混合白色血栓的解析的情况下，通过添加对混合血栓形成不造成影响的少量肝素、低分子肝素和/或硫酸乙酰肝素(例如达那肝素钠)，从而完全抑制由与容器的接触所致的凝血，因此是理想的。
理想的是：如果是肝素，则为0.01～0.2U/mL，如果是低分子肝素，则为0.01～0.5IU/mL，如果是达那肝素钠，则为0.01～0.5U(抗FXa单位)/mL左右。
若将上述的血液流入涂布有胶原和组织因子的微型芯片，则在血小板的活化(黏附-凝聚反应)的同时，发生由被涂布的组织因子所致的外因系凝固的活化，之后，在微流路内，促进在胶原上的活化血小板表面发生内因系凝固，形成在血流下的混合白色血栓。
另外，在使用通用的包含柠檬酸钠的采血管而进行凝血的解析的情况下，除氯化钙、上述接触因子抑制剂、少量的肝素(或低分子肝素或硫酸乙酰肝素)外，还添加少量的组织因子，引发凝血，由此能够进一步解析生理性的凝血反应。
在该情况下，在利用氯化钙、接触因子抑制剂、少量的肝素(或低分子肝素或硫酸乙酰肝素)完全抑制由采血管或测定容器所致的凝血的状态下，由组织因子引发外因系的凝血，所产生的微量的凝血酶引发内因系的凝血，将凝血反应放大。
所使用的组织因子的浓度并无特别限制，但是，在基因重组可溶性组织因子的情况下，理想的是100nM～0.1nM。在所添加的肝素多的情况下，还需要大量地添加组织因子。在使用健康人的血液的情况下，若凝血的引发为3～30分钟之间，则容易进行测定，较为理想。
所使用的凝血解析装置并无特别限制，理想的是ROTEM、TEG、Sonoclot等在非血流下的凝血的解析装置。
因此，本发明提供一种血栓形成能力或凝血能力的分析试剂，其含有钙、凝血因子XII(FXII)抑制剂及激肽释放酶抑制剂。该分析试剂优选还含有肝素或硫酸乙酰肝素，更优选还含有组织因子。可以以分别包含以上各成分的试剂盒的形式来提供该分析试剂。
实施例
实施例1
在采血管A(丁基橡胶制橡胶栓、含有3.2％柠檬酸钠、Sunphoria公司制品)及采血管B(用膜封条进行密封，不使用橡胶栓；含有3.2％柠檬酸钠、TERUMO株式会社制品)中进行采血，实施了ROTEM的测定。
反应引发使用以下的不同试剂。
(1)在采血管A的血液中添加STARTEM(商标)试剂(氯化钙；终浓度为12mM)
(2)在采血管A的血液中添加CTI(终浓度为50μg/mL)和氯化钙(终浓度为12mM)
(3)在采血管A中在采血前添加抑肽酶(终浓度为10μg/mL)而进行采血，添加CTI(终浓度为50μg/mL)和氯化钙(终浓度为12mM)
(4)在采血管A中在采血前添加抑肽酶(终浓度为10μg/mL)和CTI(终浓度为10μg/mL)而进行采血，添加STARTEM试剂(氯化钙；终浓度为12mM)
(5)在采血管A中在采血前添加抑肽酶(终浓度为10μg/mL)和CTI(终浓度为10μg/mL)而进行采血，添加CTI(终浓度为50μg/mL)和STARTEM试剂(氯化钙；终浓度为12mM)
(6)在采血管B的血液中添加STARTEM试剂(氯化钙、终浓度为12mM)
(7)在采血管B的血液中添加CTI(终浓度为50μg/mL)和氯化钙(终浓度为12mM)
结果如图3所示。
与膜封条的采血管相比，在丁基橡胶的橡胶栓的采血管中采集的血液在添加氯化钙时更早地发生凝血。进而，膜封条的采血管的血液通过添加CTI来抑制由氯化钙诱发的凝血，与此相对，在丁基橡胶的橡胶栓的采血管中，通过添加CTI而抑制由氯化钙诱发的凝血是限定性的。但是，当在将抑肽酶及较低浓度的CTI添加于丁基橡胶的橡胶栓的采血管而采集的血液中添加氯化钙的情况下，显著地抑制凝血，在进一步添加氯化钙与CTI的混合物而引发凝血的情况下，更强地抑制了凝血。事先添加抑肽酶和低浓度的CTI，进行采血，在测定时再度添加CTI，这会最好地抑制凝血。
实施例2
使用在采血管C(丁基橡胶制橡胶栓、含有低分子肝素2IU/mL、Sunphoria公司制)中采集的血液(检体A)、在采血管C中在采血前添加了抑肽酶(终浓度为10μg/mL)后采集的血液(检体B)和在采血管C中在采血前添加抑肽酶(终浓度为10μg/mL)和CTI(终浓度为10μg/mL)后采集的血液(检体C)，实施了ROTEM的解析。反应的引发利用以下的试剂来进行。
(1)在检体A中添加肝素酶(终浓度为0.17IU/mL)
(2)在检体B中添加肝素酶(终浓度为0.17IU/mL)和CTI(终浓度为50μg/mL)
(3)在检体B中添加肝素酶(终浓度为0.17IU/mL)和CTI(终浓度为50μg/mL)
结果如图4所示。
在包含低分子肝素的橡胶栓的采血管中进行采血，在添加了肝素酶的情况下，凝血在早期便开始了。另外，在(1)的案例中，即使当除肝素酶外在测定开始时还添加CTI 50μg/mL的情况下，也不会抑制凝血。
另一方面，事先添加低分子肝素和抑肽酶及CTI，进行采血，在测定开始时添加肝素酶和CTI的情况下，显著地抑制了凝血。
实施例3
在采血管A中采集的血液及在采血管A中在采血前添加抑肽酶(终浓度为10μg/mL)后采集的血液中，添加氯化钙(终浓度为12mM)和CTI(终浓度为50μg/mL)，使用图2的装置，进行血栓形成能力的解析。在流速为10μL/min的条件下实施了解析。
结果如图5所示。
即使在除柠檬酸外还添加抑肽酶而进行采血的情况下，在血流下的血栓形成能力的评价中对数据也无影响。但是，根据实施例1的结果，认为抑制在储液器内的非血流下的凝血(血块形成)，并且认为通过添加抑肽酶，从而在储液器内抑制凝血，并且能够进行非血流下的白色血栓形成的评价。
参考例
在用采血管B所采集的血液中添加氯化钙(终浓度为12mM)和CTI(终浓度为50μg/mL)，并且在用采血管C所采集的血液中添加肝素酶(终浓度为0.17IU/mL)，分别使用图2的装置，进行了血栓形成能力的解析。
结果如图6所示。
与在柠檬酸处理血液中添加氯化钙和CTI的情况同样，即使在橡胶栓的采血管(包含低分子肝素和CTI)中添加肝素酶来测定，也能进行血栓形成能力的解析。
实施例4
使用在包含低分子肝素(终浓度为2IU/mL)和CTI(终浓度为50μg/mL)的真空采血管、水蛭素采血管(Roche Diagnostic公司制、水蛭素终浓度为50μg/mL)及BAPA采血管(BAPA终浓度为100μM)中采集的血液，并且使用图1所示的装置，进行了血小板血栓形成的测定。
任一真空采血管均是使用丁基橡胶的橡胶栓的采血管。
其结果为：如图7所示，各采血管的血液能够同样地解析血小板血栓形成。另外，即使在包含低分子肝素和CTI的采血管的血液中在采血30分钟后添加肝素酶-BAPA试剂(终浓度；各0.17IU/mL，100μM)的情况下，也能同样地进行血小板血栓形成的测定。
实施例5
在BD公司制肝素采血管中进行采血，在其30分钟后，向该血液中添加肝素酶-BAPA混合试剂，使各自的终浓度达到0.17IU/mL和100μM，制成血液试样。
另一方面，作为比较，使用了在水蛭素采血管(Roche Diagnostic公司)中采集的血液试样。
使用这些血液试样，并且使用图1所示的装置，进行了血小板血栓形成的流速测定。血液以18μL/min来实施。
任一真空采血管均是使用了丁基橡胶的橡胶栓的采血管。
结果如图8所示。
通过在采集于肝素采血管的血液中添加肝素酶-BAPA混合试剂，从而能够与在水蛭素采血管中进行采血的情况同样地进行血小板血栓形成的解析。
另一方面，在对采集于肝素采血管的血液直接进行同样的测定的情况下，几乎未观察到由血小板血栓形成所致的压力上升。
实施例6
在采集于BD公司制柠檬酸钠采血管(包含相对于血液为1/10容量的3.2％柠檬酸钠)的血液检体中添加以下的试剂，实施了ROTEM的测定。
(1)STARTEM试剂
(2)氯化钙(终浓度为12mM)和CTI(终浓度为50μg/mL)
(3)氯化钙(终浓度为12mM)、CTI(终浓度为50μg/mL)和抑肽酶(终浓度为20μg/mL)
(4)氯化钙(终浓度为12mM)、CTI(终浓度为50μg/mL)、抑肽酶(终浓度为20μg/mL)和达那肝素钠(终浓度为0.25U/mL)
结果如图9所示。
结果从左侧起(从凝固引发更早的一方起)依次为(1)、(2)、(3)、(4)。
通过在氯化钙和CTI的基础上还添加抑肽酶，从而抑制凝固引发，并且通过进一步添加低浓度的达那肝素钠，从而完全抑制了凝血。
予以说明，基于利用(3)、(4)的添加，涂布有组织因子和胶原的微型芯片中的混合白色血栓形成也得到了同样的结果。
实施例7
在采集于BD制柠檬酸钠采血管(包含相对于血液为1/10容量的3.2％柠檬酸钠)的血液检体中添加以下的试剂，实施了ROTEM的测定。
(1)STARTEM试剂(氯化钙试剂)
(2)氯化钙(终浓度为12mM)和CTI(终浓度为50μg/mL)
(3)氯化钙(终浓度为12mM)、CTI(终浓度为50μg/mL)和抑肽酶(终浓度为20μg/mL)
(4)氯化钙(终浓度为12mM)、CTI(终浓度为50μg/mL)、抑肽酶(终浓度为20μg/mL)和肝素钠(持田制药：终浓度为0.15U/mL)
结果如图10所示。
结果为从左侧起(从凝固引发更早的一方起)依次为(1)、(2)、(3)、(4)。
通过在氯化钙和CTI的基础上还添加抑肽酶，从而抑制凝血的引发，并且通过进一步添加低浓度的肝素钠，从而完全抑制了凝血。
实施例8
使用在采集于采血管B(用膜封条进行密封，不使用橡胶栓；含有3.2％柠檬酸钠、TERUMO株式会社制品)的血液中添加了氯化钙(终浓度为12mM)和CTI(终浓度为50μg/mL)的血液检体及在采集于BD公司制柠檬酸钠采血管(包含相对于血液为1/10容量的3.2％柠檬酸钠)的血液中添加了氯化钙(终浓度为12mM)、CTI(终浓度为50μg/mL)、抑肽酶(终浓度为20μg/mL)及肝素钠(终浓度为0.15U/mL)的血液检体，使用图2的装置，进行了血栓形成能力的解析。在流速为10μL/min的条件下实施了解析。
结果如图11所示。
与TERUMO公司制膜封条的采血管同样，利用BD公司制的使用了丁基橡胶的橡胶栓的采血管，能够进行白色血栓形成能力的测定。
实施例9
使用A)在采集于采血管B(用膜封条进行密封，不使用橡胶栓；含有3.2％柠檬酸钠、TERUMO株式会社制品)的血液中添加了氯化钙(终浓度为12mM)和CTI(终浓度为50μg/mL)的血液检体及B)在采集于BD公司制柠檬酸钠采血管(包含相对于血液为1/10容量的3.2％柠檬酸钠)的血液中添加了氯化钙(终浓度为12mM)、CTI(终浓度为50μg/mL)、抑肽酶(终浓度为20μg/mL)及肝素钠(终浓度为0.15U/mL)的血液检体，使用图2的装置进行了血栓形成能力的解析。在流速为10μL/min的条件下实施了解析(图12(a))。
进而，在上述A)、B)两种检体中分别以0nM、500nM及1000nM添加作为抗凝药的利伐沙班及达比加群，进行了同样的测定。
利伐沙班及达比加群的结果分别如图12的(b)及(c)所示。
其结果为：检体B)与检体A)同样地能够灵敏度良好地测定抗凝药的抗血栓效果。
实施例10
在采集于BD公司制柠檬酸钠采血管(包含相对于血液为1/10容量的3.2％柠檬酸钠)的血液检体中添加以下的试剂，实施了ROTEM的测定。
(1)氯化钙(终浓度为12mM)、CTI(终浓度为50μg/mL)、抑肽酶(终浓度为20μg/mL)、肝素钠(终浓度为0.15U/mL)和凝血酶原试剂(按照终浓度为约0.04％的方式添加Hemos ILRecombPlasTin(15μg/mL))
(2)氯化钙(终浓度为12mM)、CTI(终浓度为50μg/mL)、抑肽酶(终浓度为20μg/mL)、肝素钠(终浓度为0.15U/mL)、NovoSeven(终浓度为2μg/mL)和凝血酶原试剂(按照终浓度达到0.04％的方式添加Hemos IL RecombPlasTin)
(3)氯化钙(终浓度为12mM)、CTI(终浓度为50μg/mL)、抑肽酶(终浓度为20μg/mL)、肝素钠(终浓度为0.15U/mL)、组织因子路径抑制剂(TFPI)(Ac－FQSKpNVHVDGYFERLXAKL－NH2；N末端乙酰基化，C末端酰胺化，第5位p＝D体Pro残基，第17位X＝Aib(α－甲基丙氨酸(methyl alanine))；J Biol Chem.2014Jan 17；289(3)：1732－41；终浓度为10μg/mL)和凝血酶原试剂(按照终浓度达到0.04％的方式添加Hemos IL RecombPlasTin)
结果如图13所示。从左侧起按照(2)、(3)、(1)的顺序依次较早地凝固。
比较例
在采集于BD公司制柠檬酸钠采血管(包含相对于血液为1/10容量的3.2％柠檬酸钠)的血液检体中添加以下的试剂，实施了ROTEM的测定。
(1)STARTEM试剂和EXTEM试剂(商标：以组织因子为主体的检查用试剂)
(2)STARTEM试剂、EXTEM试剂和NovoSeven(Novo Nordisk Pharma：终浓度为2μg/mL)
(3)STARTEM试剂、EXTEM试剂和TFPI(终浓度为10μg/mL)
结果如图14所示。(1)、(2)、(3)表示相同的波形。
根据实施例和比较例，在氯化钙、抑肽酶和肝素中添加了组织因子的体系中，能够评价NovoSeven、TFPI等止血制剂的效果，与此相对，在EXTEM试剂的体系中，无法进行评价。
实施例11
使用在采集于BD公司制柠檬酸钠采血管(包含相对于血液为1/10容量的3.2％柠檬酸钠)的血液中添加了氯化钙(终浓度为12mM)、CTI(终浓度为50μg/mL)、抑肽酶(终浓度为20μg/mL)及达那肝素钠(终浓度为0.05U/mL)的血液检体，使用图2的装置，进行了血栓形成能力的解析。在流速为10μL/min的条件下实施了解析。
使用在上述血液中进一步添加了达比加群(1000nM)或Abciximab(抗血小板剂：商品名ReoPro)(2μg/mL)的血液，实施了同样的实验。
结果如图15所示。利用使用了BD公司制的丁基橡胶的橡胶栓的采血管，能够进行白色血栓形成能力的测定及抗凝剂、抗血小板剂的评价。
实施例12
在采集于BD公司制柠檬酸钠采血管(包含相对于血液为1/10容量的3.2％柠檬酸钠)的血液检体中添加氯化钙(终浓度为12mM)、CTI(终浓度为50μg/mL)、抑肽酶(终浓度为20μg/mL)和达那肝素钠(终浓度为0.05U/mL)，测定了ROTEM。
进而，进行了添加重组因子VIIa(商品名NovoSeven)(0.5μg/mL)、TFPI(50μg/mL)及它们的组合的血液的测定。
结果如图16所示。图16的(1)均未添加NovoSeven、TFPI，(2)只有NovoSeven，(3)只有TFPI，(4)为NovoSeven+TFPI。
其结果为：利用BD公司制柠檬酸钠采血管，能够进行ROTEM的测定及止血制剂的效果的判定。
实施例13
在采集于BD公司制柠檬酸钠采血管(包含相对于血液为1/10容量的3.2％柠檬酸钠)的血液检体中添加氯化钙(终浓度为12mM)、CTI(终浓度为50μg/mL)、抑肽酶(终浓度为20μg/mL)和达那肝素钠(终浓度为0.05U/mL)，测定了ROTEM。
进而，进行了添加抗FVIII多克隆抗体(FVIII抑制活性；96μg/mL；218BU(FVIII抑制活性单位))以及NovoSeven(0.5μg/mL)、TFPI(50μg/mL)及它们的组合的血液的测定。
结果如图17所示。图17的(1)只有抗FVIII多克隆抗体，(2)为抗FVIII多克隆抗体+NovoSeven，(3)为FVIII多克隆抗体+TFPI，(4)为FVIII多克隆抗体+NovoSeven+TFPI。
利用BD公司制柠檬酸钠采血管，能够进行ROTEM的测定及止血制剂的效果的判定。
符号说明
A---微型芯片；101、111---流路；102、112---反应部；103、113---废液存积部；104、114---流入口；105、115---废液口；106、116---储液器；107、117---送液泵；108、118---压力传感器；B---微型芯片；201---流路；202---反应部；203---废液存积部；204---流入口；205---废液口；206---储液器；207---送液泵；208---压力传感器；209---狭窄部；210---凝血防止剂流路；211---凝血防止剂流入口。

Claims (10)

1.肝素或硫酸乙酰肝素在制备利用通过具有丁基橡胶制橡胶栓且在内部含有柠檬酸钠的采血管所采集的血液进行的血栓形成能力或凝血能力分析用试剂中的用途，其中，所述试剂包含11～12mM的氯化钙、5～200μg/mL的来自玉米的胰蛋白酶抑制剂CTI及1～100μg/mL的抑肽酶，其中，所述肝素的浓度为0.01～0.2单位/mL，所述单位/mL是U/mL。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，肝素是质均分子量为4500～6500的低分子肝素。
3.根据权利要求2所述的用途，其中，低分子肝素的浓度为0.01～0.5单位/mL，所述单位/mL是IU/mL。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，硫酸乙酰肝素为达那肝素钠。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，达那肝素钠的浓度为0.01～0.5单位/mL，所述单位/mL是U/mL。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂进一步含有组织因子。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，组织因子为来自动物组织的促凝血酶原激酶或基因重组可溶性组织因子。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，基因重组可溶性组织因子的浓度为0.1nM～10nM。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的用途，其中，血栓形成能力的分析是通过使用在内部设有模仿血管的流路的微型芯片，使血液流入流路，从而分析混合白色血栓形成能力来进行的。
10.根据权利要求1～8中任一项所述的用途，其中，凝血能力的分析是利用ROTEM来进行的。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2019160072A1 (ja) * 2018-02-16 2020-09-10 京セラ株式会社 流路デバイスおよび計測装置
CN110208411B (zh) * 2019-06-10 2021-12-24 浙江龙传生物医药科技有限公司 用于药物代谢检测的羧酸酯酶抑制剂制剂
JPWO2022145477A1 (zh) * 2020-12-28 2022-07-07
US20240044921A1 (en) 2020-12-28 2024-02-08 Fujimori Kogyo Co., Ltd. Method for evaluating blood coagulation performance, and method for inspecting risk of thrombosis

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1761876A (zh) * 2003-04-25 2006-04-19 积水化学工业株式会社 血液凝固促进剂和血液收集管
WO2013116366A1 (en) * 2012-01-30 2013-08-08 Baxter International Inc. Non-anticoagulant sulfated or sulfonated polysaccharides
WO2015156322A1 (ja) * 2014-04-08 2015-10-15 藤森工業株式会社 血液性状検査用マイクロチップおよび血液性状検査用装置

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3814248A (en) * 1971-09-07 1974-06-04 Corning Glass Works Method and apparatus for fluid collection and/or partitioning
US5472850A (en) * 1991-04-10 1995-12-05 Oklahoma Medical Research Foundation Quantitative clotting assay for activated factor VII
JP2540649B2 (ja) 1990-04-27 1996-10-09 テルモ株式会社 採血管
JP2000083934A (ja) * 1998-09-14 2000-03-28 Medical Link Kk 採血管
DE10116586B4 (de) * 2001-04-03 2005-07-21 Stief, Thomas, Dr.med. Testsystem zur Bestimmung der Hämostaseaktivierung von biologischen Flüssigkeiten
US20100248329A1 (en) * 2003-04-25 2010-09-30 Ryusuke Okamoto Blood coagulation promoter and blood collection tube
WO2007046450A1 (ja) 2005-10-18 2007-04-26 Fujimori Kogyo Co., Ltd. 血栓観測装置および血栓観測方法
WO2007140231A2 (en) * 2006-05-25 2007-12-06 Momenta Pharmaceutical, Inc. Low molecular weight heparin composition and uses thereof
BRPI0820397A2 (pt) * 2007-11-26 2015-05-19 Fujimori Kogyo Co Microchip, métodos para medir a formação de trombo e trombólise e para medir a função plaquetária, e, dispositivo de monitoração do sangue.
CN102150042B (zh) 2008-08-11 2014-12-10 藤森工业株式会社 血小板检验方法和血小板检验装置
WO2010091122A1 (en) 2009-02-03 2010-08-12 Amunix, Inc. Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
GB0908129D0 (en) * 2009-05-12 2009-06-24 Innovata Ltd Composition
US20120263701A1 (en) 2009-08-24 2012-10-18 Volker Schellenberger Coagulation factor vii compositions and methods of making and using same
EP2535721B1 (en) 2010-02-10 2017-04-19 Fujimori Kogyo Co., Ltd. Microchip for platelet examination and platelet examination device using same
IS2809B (is) * 2011-03-08 2012-10-15 Haskoli Islands Blóðstorkumæling
US9108951B2 (en) * 2011-10-14 2015-08-18 Bristol-Myers Squibb Company Substituted 5,6,7,8-tetrahydro-1,6-naphthyridines as factor XIa inhibitors
MX2015009914A (es) * 2013-02-01 2015-09-25 Becton Dickinson Co Dispositivos de recogida de sangre que contienen aditivos de inhibicion de la via de contacto.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1761876A (zh) * 2003-04-25 2006-04-19 积水化学工业株式会社 血液凝固促进剂和血液收集管
WO2013116366A1 (en) * 2012-01-30 2013-08-08 Baxter International Inc. Non-anticoagulant sulfated or sulfonated polysaccharides
WO2015156322A1 (ja) * 2014-04-08 2015-10-15 藤森工業株式会社 血液性状検査用マイクロチップおよび血液性状検査用装置

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