CN108467487A - 淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物、其制备方法及应用。所述淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物的制备方法包括:使酪蛋白多肽和淀粉基糊精进行美拉德共价接枝反应,形成淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物。采用高压均质和微射流技术,使所述淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物的水相溶液与乳化油相组分均匀混合,获得水包油型的淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液。本发明制备的纳米乳液的小液滴尺寸允许高效递送,可提高疏水性生物活性物质吸收效率,具备较好抗氧化活性、抗菌性、较好的乳化性及乳化稳定性等优点,在营养物质的递送、药物的控释、生物活性物质的稳定等领域具有广泛用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液的制备,尤其涉及一种淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物及其制备方法,以及该淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物制备的糊精共价接枝改性的酪蛋白多肽稳定的纳米乳液及其应用,属于蛋白深加工技术领域。
背景技术
纳米乳液是一种胶体分散体系,是非热力学稳定体系,呈透明或半透明状,粒度尺寸在50-200nm之间,具有抗沉降和乳析的动力学稳定特性。水包油型纳米乳液作为水不溶性生物活性物质的载体,应具有良好的乳化性及乳化稳定性,以及高效的递送作用,因此乳化剂的选择和应用受到越来越多人的重视。
酪蛋白作为乳化剂具有高的生物相容性、生物降解性、生物安全性等特性。经超声辅助酶法适度水解制得的酪蛋白肽,使其功能基团更好地暴露出来,改善其的乳化特性。酪蛋白肽再经淀粉基糊精共价接枝改性,其溶解度增加,乳化性及乳化稳定性增强,抗氧化性能提高,抗菌能力有一定程度的改善,在作为递送载体时,进一步提高了包埋活性物质的化学稳定性。因此,将其作为乳化剂制备纳米乳液作为生物活性物质载体,有一定的研究意义。
因此如何制备稳定有效的稳定剂以用于制备水包油型纳米乳液成为研究的热点课题,也是目前业界研发人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物及其制备方法,以克服现有技术的不足。
本发明的另一主要目的在于提供基于前述淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物制备的淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液及其制备方法。
本发明的另一主要目的在于提供前述淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液的应用。
为实现前述发明目的,本发明采用的技术方案包括:
本发明实施例提供了一种淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物的制备方法,其包括:
提供酪蛋白多肽和淀粉基糊精;
使包含所述酪蛋白多肽和淀粉基糊精的混合体系于80~120℃进行美拉德共价接枝反应90~120min,形成淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物。
在一些实施例中,所述酪蛋白多肽与淀粉基糊精的质量比为1:1~2。
在一些实施例中,所述制备方法包括:将所述酪蛋白多肽溶于磷酸盐缓冲液中,之后加入所述淀粉基糊精。
进一步地,所述制备方法还包括:在所述美拉德共价接枝反应完成后,将所述反应体系冷却,之后冷冻干燥至-20℃以下。
进一步地,所述制备方法包括:在pH值为6.8~7.5的条件下,采用超声辅助处理,使酪蛋白和胰蛋白酶于40~60℃进行酶水解反应90~120min,获得酪蛋白多肽。
进一步地,所述酪蛋白多肽的水解度为10~20%。
在一些实施例中,所述制备方法包括:使糯玉米淀粉加热糊化冷却至40~60℃,之后加入普鲁兰酶进行脱枝处理20~24h,获得糊精溶液,再采用聚乙二醇逐步沉淀法将糊精溶液于20~25℃水浴20~24h进行分级,获得聚合度均一的淀粉基糊精。
进一步地,所述淀粉基糊精的聚合度为70~100。
本发明实施例还提供了由前述方法制备的淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物。
本发明实施例还提供了一种淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液的制备方法,其包括:
按照前述方法制备淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物;
采用高压均质和微射流技术,使所述淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物的水相溶液与乳化油相组分均匀混合,获得水包油型的淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液。
在一些实施例中,所述制备方法具体包括:采用高压均质技术,对所述乳化油相组分和水相溶液的混合液于15℃以下进行剪切2~5min,形成粗乳液,之后采用高压微射流技术,在100~120MPa下将所述粗乳液进一步进行均化处理,获得淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液,之后于2~6℃下储存。
进一步地,所述制备方法包括:使疏水性生物活性物质溶于油相溶剂中,并避光50~60℃搅拌10~12min,之后于20~25℃下搅拌1~1.5小时,制得所述乳化油相组分。
进一步地,所述制备方法包括:将所述淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物溶于磷酸盐缓冲液中,并搅拌3h以上,使蛋白充分溶胀,形成所述的水相溶液。
本发明实施例还提供了由前述方法制备的淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液。
进一步地,所述淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液的形态结构为球形,粒径分布为50~150nm。
本发明实施例还提供了前述的淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液于营养物质的递送、药物的控释、生物活性物质的稳定领域中的用途。
与现有技术相比,本发明的优点包括:
本发明以乳化稳定性较好的酪蛋白多肽、淀粉基糊精为原料,采用美拉德共价接枝反应制得淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物作为乳化剂,通过高压均质和高压微射流技术,制备用一定聚合度糊精改性酪蛋白水解多肽稳定的水包油型纳米乳液及载体***,酪蛋白通过酶水解和糊精共价接枝改性后,酪蛋白多肽溶解度增加,乳化性及乳化稳定性增强,抗氧化性能提高,抗菌能力有一定程度的改善;同时,本发明制备的水包油纳米乳液具有纳米级粒径,其小液滴尺寸允许高效递送,易转运吸收,可提高疏水性生物活性物质吸收效率,具备较好抗氧化活性、抗菌性、较好的乳化性及乳化稳定性等优点,良好的生物包埋性和活性物质高效递送作用,在营养物质的递送、药物的控释、生物活性物质的稳定等领域具有广泛用途。
具体实施方式
鉴于现有技术存在的技术问题,本案发明人经长期研究和大量实践,得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
本发明主要是以酪蛋白为原料,经超声辅助酶水解成酪蛋白多肽,通过普鲁兰酶脱枝糯玉米淀粉结合聚乙二醇沉降分级法制备一定聚合度的淀粉基糊精,将酪蛋白多肽与淀粉基糊精进行共价接枝反应,采用高压均质和微射流的方法,制备淀粉基糊精改性的酪蛋白多肽水包油型纳米乳液。
本发明实施例的一个方面提供的一种淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物的制备方法,其包括:
提供酪蛋白多肽和淀粉基糊精;
使包含所述酪蛋白多肽和淀粉基糊精的混合体系于80~120℃进行美拉德共价接枝反应90~120min,形成淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物。
在一些实施例中,所述酪蛋白多肽与淀粉基糊精的质量比为1:1~2。
在一些实施例中,所述制备方法包括:将所述酪蛋白多肽溶于磷酸盐缓冲液中,之后加入所述淀粉基糊精。
进一步地,所述制备方法还包括:在所述美拉德共价接枝反应完成后,将所述反应体系冷却,之后冷冻干燥至-20℃以下。
在一些更为优选的实施案例之中,所述制备方法具体包括:
将酪蛋白多肽溶于磷酸盐缓冲液中,按1:2的比例加入淀粉基糊精,充分搅拌溶解。将所得混合物在100℃水浴中加热90分钟以形成美拉德反应产物,然后在室温(25℃)下冷却。然后将混合物在冷冻干燥机中冻干24小时,然后储存在-20℃直至进一步使用。
进一步地,所述制备方法包括:在pH值为6.8~7.5的条件下,采用超声辅助处理,使酪蛋白和胰蛋白酶于40~60℃进行酶水解反应90~120min,获得酪蛋白多肽。
进一步地,所述酪蛋白多肽的水解度为10~20%。
进一步地,所述酪蛋白包括酪蛋白含量为5~15wt%的酪蛋白水溶液。
进一步地,所述胰蛋白酶的添加量为50~60U/g。
进一步地,所述超声辅助处理采用的温度为60~70℃,功率为450~500W,时间为40~60min。
进一步地,所述制备方法还包括:在所述酶水解反应完成后,向所述酶水解反应的反应液中加入抑制剂灭活胰蛋白酶终止反应。
进一步地,所述酪蛋白多肽具有裸露的氨基酸侧链氨基。
在一些更为优选的实施案例之中,所述酪蛋白多肽的制备方法具体可包括:
将酪蛋白(10%水溶液)用50U/g的添加量的胰蛋白酶在50℃水浴中进行反应,调节pH至7.0,利用超声辅助(温度64℃,功率460W,时间60min)对蛋白进行限制性水解,在水解过程中检测pH变化并用1mol/L的NaOH调节,反应2h后加入抑制剂灭活胰蛋白酶终止反应。得到水解度为10~20%的酪蛋白多肽。
其中,水解度为10~20%酪蛋白多肽中功能基团暴露,具有更好的溶解度、乳化性及乳化稳定性。酪蛋白多肽中氨基酸侧链氨基与糊精还原末端的羟基通过Maillard反应形成氨基共价键,共价接枝后提高了蛋白质的溶解度、抗氧化性、乳化性及乳化稳定性。
在一些实施例中,所述制备方法包括:使糯玉米淀粉加热糊化冷却至40~60℃,之后加入普鲁兰酶进行脱枝处理20~24h,获得糊精溶液,再采用聚乙二醇逐步沉淀法将糊精溶液于20~25℃水浴20~24h进行分级,获得聚合度均一的淀粉基糊精。
进一步地,所述淀粉基糊精的聚合度为70~100。
进一步地,所述普鲁兰酶(60U/g)与糯玉米淀粉的质量比为1:20~25。
在一些更为优选的实施案例之中,所述淀粉基糊精的制备方法具体可包括:
将糯玉米淀粉分散在乙酸缓冲液(0.05M,pH5.0)中煮沸30min,之后在121℃高压灭菌1h以完全糊化,冷却至50℃,用超声辅助普鲁兰酶水解,加入过量95%的乙醇停止水解反应,于40℃烘箱干燥24h,粉碎,过筛。再将其溶于蒸馏水中,配置1.0%-4.0%的糊精溶液,每100mL溶液加入5g聚乙二醇加热搅拌至澄清,冷却至25℃后水浴24h,出现沉淀后进行离心,重复数次,再于40℃干燥24h,粉碎、过筛,得到聚合度为70-100的淀粉基糊精。沉淀物离心后用乙醇洗涤,烘干研磨成粉末。
本发明实施例的另一个方面还提供了由前述方法制备的淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液的制备方法,其包括:
按照前述方法制备淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物;
采用高压均质和微射流技术,使所述淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物的水相溶液与乳化油相组分均匀混合,获得水包油型的淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液。
在一些实施例中,所述制备方法具体包括:采用高压均质技术,对所述乳化油相组分和水相溶液的混合液于15℃以下进行剪切2~5min,形成粗乳液,之后采用高压微射流技术,在100~120MPa下将所述粗乳液进一步进行均化处理,获得淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液,之后于2~6℃下储存。
进一步地,所述乳化油相组分与水相溶液的质量比为1:8~10。
在一些更为优选的实施案例之中,所述淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液的制备方法具体可包括:
所述乳化油相组分与水相溶液按1:8~10的质量比通过高压剪切机剪切2~5min形成粗乳液,而后通过高压微射流仪在100~120MPa优选为103.4MPa下将粗乳液进一步均质数次得到粒径为50~150nm的纳米乳液,均质化期间使用碎冰保持温度低于15℃,样品储存于2~6℃条件下。
进一步地,所述制备方法包括:使疏水性生物活性物质溶于油相溶剂中,并避光50~60℃磁力低速搅拌10~12min,之后于20~25℃下搅拌1~1.5小时以确保完全溶解,制得所述乳化油相组分。
进一步地,所述油相溶剂包括玉米油,但不限于此。
进一步地,所述制备方法包括:将所述淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物(2.0%,w/w)溶于磷酸盐缓冲液(pH7.0,10mmol/L)中,并磁力搅拌3h以上,充分搅拌,使蛋白充分溶胀,形成所述的水相溶液。
其中,作为本发明的一更为优选的实施案例之一,所述制备具体还可以包括以下步骤:
1、酪蛋白多肽的制备:将酪蛋白(10%水溶液)用50U/g的添加量的胰蛋白酶在50℃水浴中进行反应,调节pH至7.0,利用超声辅助(温度64℃,功率460W,时间60min)对蛋白进行限制性水解,在水解过程中检测pH变化并用1mol/L的NaOH调节,反应2h后加入抑制剂灭活胰蛋白酶终止反应。得到水解度为10%~20%的酪蛋白多肽。
2、淀粉基糊精的制备:将糯玉米淀粉分散在乙酸缓冲液(0.05M,pH5.0)中煮沸30min,之后在121℃高压灭菌1h以完全糊化,冷却至50℃,用普鲁兰酶水解,加入过量95%的乙醇停止水解反应,于40℃烘箱干燥24h,粉碎,过筛。再将其溶于蒸馏水中,配置1.0%-4.0%的糊精溶液,每100mL溶液加入5g聚乙二醇加热搅拌至澄清,冷却至25℃后水浴24h,出现沉淀后进行离心,再于40℃干燥24h,粉碎、过筛,得到聚合度为70~100的淀粉基糊精。
3、淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物的制备:将一定量的酪蛋白肽溶于磷酸盐缓冲液中,按一定比例加入淀粉基糊精,在100℃下水浴加热90min形成美拉德反应共轭物,室温下冷却,冷冻干燥后低温储存。
4、配制乳化油相组分:将疏水性生物活性物质溶于玉米油溶剂中,避光60℃磁力低速搅拌10min,随后在室温下搅拌1小时以确保完全溶解,制成乳化油相组分。
5、配制水相溶液:将淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物(2.0%,w/w)溶于磷酸盐缓冲液(pH7.0,10mmol/L)中,磁力搅拌3h以上,充分搅拌,使蛋白充分溶胀,形成水相溶液。
6、水包油型纳米乳液的制备:乳化油相组分与水相溶液按1:9的重量比通过高压剪切机剪切2min形成粗乳液,而后通过高压微射流仪在103.4MPa下将粗乳液进一步均质数次得到粒径为50~150nm的纳米乳液,均质化期间使用碎冰保持温度低于15℃,样品储存于2~6℃条件下。
本发明实施例的另一个方面还提供了由前述方法制备的淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液。
进一步地,所述淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液的形态结构为球形,粒径分布为50~150nm。所得纳米乳液具备较好抗氧化活性、抗菌性、乳化性及乳化稳定性,良好的生物包埋性和活性物质高效递送作用。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液于营养物质的递送、药物的控释、生物活性物质的稳定领域中的用途。
本发明制备淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液的机理可能在于:本发明以乳化稳定性较好的酪蛋白多肽、淀粉基糊精为原料,采用美拉德共价接枝反应制得淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物作为乳化剂,通过高压均质和高压微射流技术,制备用一定聚合度糊精改性酪蛋白水解多肽稳定的水包油型纳米乳液及载体***,酪蛋白通过酶水解和糊精共价接枝改性后,酪蛋白多肽溶解度增加,乳化性及乳化稳定性增强,抗氧化性能提高,抗菌能力有一定程度的改善。
本发明制备的水包油纳米乳液具有纳米级粒径,其小液滴尺寸允许高效递送,易转运吸收,可提高疏水性生物活性物质吸收效率,具备较好抗氧化活性、抗菌性、较好的乳化性及乳化稳定性等优点,良好的生物包埋性和活性物质高效递送作用,在营养物质的递送、药物的控释、生物活性物质的稳定等领域具有广泛用途。
以下通过若干实施例并进一步详细说明本发明的技术方案。然而,所选的实施例仅用于说明本发明,而不限制本发明的范围。
实施例1
称取10g酪蛋白,用磷酸缓冲液溶解,调节pH至7.5,底物浓度为5%,在试管中以50U/g的添加量加入胰蛋白酶(13000-20000个BAEE单位mg-1蛋白),置于55℃水浴中进行酶解反应,同时采用超声波辅助(温度64℃,功率460W,时间50min)水解反应,在水解过程中检测pH变化并用1mol/L的NaOH调节,反应时间为2h。反应结束后,添加胰蛋白酶抑制剂灭活胰蛋白酶,得到水解度为10%的酪蛋白多肽,将其冻干保存。糯玉米淀粉分散于乙酸缓冲液(0.05M,pH5.0)中并在沸腾的水中煮沸30分钟,在121℃高压灭菌1小时以完全糊化,冷却至50℃,并按淀粉:酶为1:20的比例加入普鲁兰酶(60U/g)水解24小时,加入过量95%的乙醇停止水解反应,沉淀物在3500通过离心10分钟收集,用95%的乙醇洗涤三次,在40℃的烘箱中干燥24小时,然后在研钵中研磨成细粉末,过筛。再将其溶于蒸馏水中,配置1.0%-4.0%的糊精溶液,每100mL溶液加入5g聚乙二醇加热搅拌至澄清,冷却至25℃后水浴24h,出现沉淀后进行离心,再于40℃干燥24h,粉碎、过筛,得到聚合度为70-95的淀粉基糊精。
将上述制得的淀粉基糊精与酪蛋白多肽进行共价接枝反应。称取2g酪蛋白多肽溶于1/15mol/L的磷酸盐缓冲液中,按1:2的比例加入淀粉基糊精,充分搅拌溶解。将所得混合物在100℃水浴中加热90分钟以形成美拉德反应产物,然后在室温(25℃)下冷却。然后将混合物在冷冻干燥机中冻干24小时,然后储存在-20℃直至进一步使用。
将淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物(2.0%,w/w)溶于磷酸盐缓冲液(pH7.0,10mmol/L)中,磁力搅拌3h以上,使蛋白充分溶胀,形成水相溶液;将一定量的β-胡萝卜素溶于玉米油中,浓度为0.1%(w/w),磁力搅拌机充分搅拌至完全溶解,制成油相组分。将油相组分与水相溶液按1:9的重量比均质2min形成粗乳液,而后通过高压微射流仪在103.4MPa下将粗乳液进一步均质6次,均质化期间使用碎冰保持温度低于15℃。所得纳米乳液粒径为120-150nm,与仅由酪蛋白稳定的纳米乳液相比,具有更好的乳化性和储藏稳定性,同时提高了抗氧化活性和抗菌性,是一种功能特性良好的生物活性物质载体。
实施例2
称取10g酪蛋白,用磷酸缓冲液溶解,调节pH至7.5,底物浓度为5%,在试管中以50U/g的添加量加入胰蛋白酶(13000-20000个BAEE单位mg-1蛋白),置于55℃水浴中进行酶解反应,同时采用超声波辅助(温度64℃,功率460W,时间60min)水解反应,在水解过程中检测pH变化并用1mol/L的NaOH调节,反应时间为100min。反应结束后,添加胰蛋白酶抑制剂灭活胰蛋白酶,得到水解度为10%的酪蛋白多肽,将其冻干保存。糯玉米淀粉分散于乙酸缓冲液(0.05M,pH5.0)中并在沸腾的水中煮沸30分钟,在121℃高压灭菌1小时以完全糊化,冷却至50℃,并按淀粉:酶为1:20的比例加入普鲁兰酶(60U/g)水解24小时,加入过量95%的乙醇停止水解反应,沉淀物在3500通过离心10分钟收集,用95%的乙醇洗涤三次,在40℃的烘箱中干燥24小时,然后在研钵中研磨成细粉末,过筛。再将其溶于蒸馏水中,配置1.0%-4.0%的糊精溶液,每100mL溶液加入5g聚乙二醇加热搅拌至澄清,冷却至25℃后水浴24h,出现沉淀后进行离心,再于40℃干燥24h,粉碎、过筛,得到聚合度为70-95的淀粉基糊精。
将上述制得的淀粉基糊精与酪蛋白多肽进行共价接枝反应。称取2g的酪蛋白多肽溶于1/15mol/L的磷酸盐缓冲液中,按1:2的比例加入淀粉基糊精,充分搅拌溶解。将所得混合物在100℃水浴中加热100分钟以形成美拉德反应产物,然后在室温(25℃)下冷却。然后将混合物在冷冻干燥机中冻干24小时,然后储存在-20℃直至进一步使用。
将淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物(2.0%,w/w)溶于磷酸盐缓冲液(pH7.0,10mmol/L)中,磁力搅拌3h以上,使蛋白充分溶胀,形成水相溶液;将一定量的β-胡萝卜素溶于玉米油中,浓度为0.1%(w/w),磁力搅拌机充分搅拌至完全溶解,制成油相组分。将油相组分与水相溶液按1:9的重量比均质2min形成粗乳液,而后通过高压微射流仪在103.4MPa下将粗乳液进一步均质8次,均质化期间使用碎冰保持温度低于15℃。所得纳米乳液粒径为50-130nm,与仅由酪蛋白稳定的纳米乳液相比,具有更好的乳化性和储藏稳定性,同时提高了抗氧化活性和抗菌性,是一种功能特性良好的生物活性物质载体。
实施例3
称取10g酪蛋白,用磷酸缓冲液溶解,调节pH至7.0,底物浓度为5%,在试管中以60U/g的添加量加入胰蛋白酶(13000-20000个BAEE单位mg-1蛋白),置于60℃水浴中进行酶解反应,同时采用超声波辅助(温度60℃,功率450W,时间60min)水解反应,在水解过程中检测pH变化并用1mol/L的NaOH调节,反应时间为2h。反应结束后,添加胰蛋白酶抑制剂灭活胰蛋白酶,得到水解度为10%的酪蛋白多肽,将其冻干保存。糯玉米淀粉分散于乙酸缓冲液(0.05M,pH5.0)中并在沸腾的水中煮沸30分钟,在121℃高压灭菌1小时以完全糊化,冷却至40℃,并按淀粉:酶为1:25的比例加入普鲁兰酶(60U/g)水解20小时,加入过量95%的乙醇停止水解反应,沉淀物在3500通过离心10分钟收集,用95%的乙醇洗涤三次,在40℃的烘箱中干燥24小时,然后在研钵中研磨成细粉末,过筛。再将其溶于蒸馏水中,配置1.0%-4.0%的糊精溶液,每100mL溶液加入5g聚乙二醇加热搅拌至澄清,冷却至25℃后水浴24h,出现沉淀后进行离心,再于40℃干燥24h,粉碎、过筛,得到聚合度为80-100的淀粉基糊精。
将上述制得的淀粉基糊精与酪蛋白多肽进行共价接枝反应。称取2g酪蛋白多肽溶于1/15mol/L的磷酸盐缓冲液中,按1:1的比例加入淀粉基糊精,充分搅拌溶解。将所得混合物在120℃水浴中加热90分钟以形成美拉德反应产物,然后在室温(25℃)下冷却。然后将混合物在冷冻干燥机中冻干24小时,然后储存在-20℃直至进一步使用。
将淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物(2.0%,w/w)溶于磷酸盐缓冲液(pH7.0,10mmol/L)中,磁力搅拌3h以上,使蛋白充分溶胀,形成水相溶液;将一定量的β-胡萝卜素溶于玉米油中,浓度为0.1%(w/w),磁力搅拌机充分搅拌至完全溶解,制成油相组分。将油相组分与水相溶液按1:10的重量比均质4min形成粗乳液,而后通过高压微射流仪在100MPa下将粗乳液进一步均质5次,均质化期间使用碎冰保持温度低于15℃。所得纳米乳液粒径为100-150nm,与仅由酪蛋白稳定的纳米乳液相比,具有更好的乳化性和储藏稳定性,同时提高了抗氧化活性和抗菌性,是一种功能特性良好的生物活性物质载体。
实施例4
称取10g酪蛋白,用磷酸缓冲液溶解,调节pH至7.5,底物浓度为5%,在试管中以50U/g的添加量加入胰蛋白酶(13000-20000个BAEE单位mg-1蛋白),置于50℃水浴中进行酶解反应,同时采用超声波辅助(温度68℃,功率500W,时间40min)水解反应,在水解过程中检测pH变化并用1mol/L的NaOH调节,反应时间为90min。反应结束后,添加胰蛋白酶抑制剂灭活胰蛋白酶,得到水解度为16%的酪蛋白多肽,将其冻干保存。糯玉米淀粉分散于乙酸缓冲液(0.05M,pH5.0)中并在沸腾的水中煮沸30分钟,在121℃高压灭菌1小时以完全糊化,冷却至50℃,并按淀粉:酶为1:20的比例加入普鲁兰酶(60U/g)水解24小时,加入过量95%的乙醇停止水解反应,沉淀物在3500通过离心10分钟收集,用95%的乙醇洗涤三次,在40℃的烘箱中干燥24小时,然后在研钵中研磨成细粉末,过筛。再将其溶于蒸馏水中,配置1.0%-4.0%的糊精溶液,每100mL溶液加入5g聚乙二醇加热搅拌至澄清,冷却至20℃后水浴22h,出现沉淀后进行离心,再于40℃干燥24h,粉碎、过筛,得到聚合度为80-100的淀粉基糊精。
将上述制得的淀粉基糊精与酪蛋白多肽进行共价接枝反应。称取2g的酪蛋白多肽溶于1/15mol/L的磷酸盐缓冲液中,按1:2的比例加入淀粉基糊精,充分搅拌溶解。将所得混合物在100℃水浴中加热100分钟以形成美拉德反应产物,然后在室温(25℃)下冷却。然后将混合物在冷冻干燥机中冻干24小时,然后储存在-20℃直至进一步使用。
将淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物(2.0%,w/w)溶于磷酸盐缓冲液(pH7.0,10mmol/L)中,磁力搅拌3h以上,使蛋白充分溶胀,形成水相溶液;将一定量的β-胡萝卜素溶于玉米油中,浓度为0.1%(w/w),磁力搅拌机充分搅拌至完全溶解,制成油相组分。将油相组分与水相溶液按1:9的重量比均质4min形成粗乳液,而后通过高压微射流仪在120MPa下将粗乳液进一步均质4次,均质化期间使用碎冰保持温度低于15℃。所得纳米乳液粒径为60-135nm,与仅由酪蛋白稳定的纳米乳液相比,具有更好的乳化性和储藏稳定性,同时提高了抗氧化活性和抗菌性,是一种功能特性良好的生物活性物质载体。
实施例5
称取10g酪蛋白,用磷酸缓冲液溶解,调节pH至6.8,底物浓度为5%,在试管中以55U/g的添加量加入胰蛋白酶(13000-20000个BAEE单位mg-1蛋白),置于40℃水浴中进行酶解反应,同时采用超声波辅助(温度70℃,功率460W,时间50min)水解反应,在水解过程中检测pH变化并用1mol/L的NaOH调节,反应时间为2h。反应结束后,添加胰蛋白酶抑制剂灭活胰蛋白酶,得到水解度为20%的酪蛋白多肽,将其冻干保存。糯玉米淀粉分散于乙酸缓冲液(0.05M,pH5.0)中并在沸腾的水中煮沸30分钟,在121℃高压灭菌1小时以完全糊化,冷却至60℃,并按淀粉:酶为1:25的比例加入普鲁兰酶(60U/g)水解22小时,加入过量95%的乙醇停止水解反应,沉淀物在3500通过离心10分钟收集,用95%的乙醇洗涤三次,在40℃的烘箱中干燥24小时,然后在研钵中研磨成细粉末,过筛。再将其溶于蒸馏水中,配置1.0%-4.0%的糊精溶液,每100mL溶液加入5g聚乙二醇加热搅拌至澄清,冷却至22℃后水浴20h,出现沉淀后进行离心,再于40℃干燥24h,粉碎、过筛,得到聚合度为75-100的淀粉基糊精。
将上述制得的淀粉基糊精与酪蛋白多肽进行共价接枝反应。称取2g的酪蛋白多肽溶于1/15mol/L的磷酸盐缓冲液中,按1:1.5的比例加入淀粉基糊精,充分搅拌溶解。将所得混合物在80℃水浴中加热120分钟以形成美拉德反应产物,然后在室温(25℃)下冷却。然后将混合物在冷冻干燥机中冻干24小时,然后储存在-20℃直至进一步使用。
将淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物(2.0%,w/w)溶于磷酸盐缓冲液(pH7.0,10mmol/L)中,磁力搅拌3h以上,使蛋白充分溶胀,形成水相溶液;将一定量的β-胡萝卜素溶于玉米油中,浓度为0.1%(w/w),磁力搅拌机充分搅拌至完全溶解,制成油相组分。将油相组分与水相溶液按1:8的重量比均质5min形成粗乳液,而后通过高压微射流仪在120MPa下将粗乳液进一步均质4次,均质化期间使用碎冰保持温度低于15℃。所得纳米乳液粒径为60-120nm,与仅由酪蛋白稳定的纳米乳液相比,具有更好的乳化性和储藏稳定性,同时提高了抗氧化活性和抗菌性,是一种功能特性良好的生物活性物质载体。
综上所述,藉由本发明的上述技术方案获得的纳米乳液的小液滴尺寸允许高效递送,可提高疏水性生物活性物质吸收效率,具备较好抗氧化活性、抗菌性、较好的乳化性及乳化稳定性等优点,在营养物质的递送、药物的控释、生物活性物质的稳定等领域具有广泛用途。
此外,本案发明人还参照实施例1-5的方式,以本说明书中列出的其它原料和条件等进行了试验,并同样制得了具备较好抗氧化活性、抗菌性、较好的乳化性及乳化稳定性等优点的淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液。
应当理解的是,上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物的制备方法,其特征在于包括:
提供酪蛋白多肽和淀粉基糊精;
使包含所述酪蛋白多肽和淀粉基糊精的混合体系于80~120℃进行美拉德共价接枝反应90~120min,形成淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述酪蛋白多肽与淀粉基糊精的质量比为1:1~2;优选的,所述制备方法包括:将所述酪蛋白多肽溶于磷酸盐缓冲液中,之后加入所述淀粉基糊精;优选的,所述制备方法还包括:在所述美拉德共价接枝反应完成后,将所述反应体系冷却,之后冷冻干燥至-20℃以下。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于包括:在pH值为6.8~7.5的条件下,采用超声辅助处理,使酪蛋白和胰蛋白酶于40~60℃进行酶水解反应90~120min,获得酪蛋白多肽;优选的,所述酪蛋白多肽的水解度为10~20%;优选的,所述酪蛋白包括酪蛋白含量为5~15wt%的酪蛋白水溶液;优选的,所述胰蛋白酶的添加量为50~60U/g;优选的,所述超声辅助处理采用的温度为60~70℃,功率为450~500W,时间为40~60min;优选的,所述制备方法还包括:在所述酶水解反应完成后,向所述酶水解反应的反应液中加入抑制剂灭活胰蛋白酶终止反应;优选的,所述酪蛋白多肽具有裸露的氨基酸侧链氨基。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于包括:使糯玉米淀粉加热糊化冷却至40~60℃,之后加入普鲁兰酶进行脱枝处理20~24h,获得糊精溶液,再采用聚乙二醇逐步沉淀法将糊精溶液于20~25℃水浴20~24h进行分级,获得聚合度均一的淀粉基糊精;优选的,所述淀粉基糊精的聚合度为70~100;优选的,所述普鲁兰酶与糯玉米淀粉的质量比为1:20~25。
5.由权利要求1-4中任一项所述方法制备的淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物。
6.一种淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液的制备方法,其特征在于包括:
按照权利要求1-4中任一项所述方法制备淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物;
采用高压均质和微射流技术,使所述淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物的水相溶液与乳化油相组分均匀混合,获得水包油型的淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于包括:采用高压均质技术,对所述乳化油相组分和水相溶液的混合液于15℃以下进行剪切2~5min,形成粗乳液,之后采用高压微射流技术,在100~120MPa下将所述粗乳液进一步进行均化处理,获得淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液,之后于2~6℃下储存;优选的,所述乳化油相组分与水相溶液的质量比为1:8~10。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法,其特征在于包括:使疏水性生物活性物质溶于油相溶剂中,并避光50~60℃搅拌10~12min,之后于20~25℃下搅拌1~1.5小时,制得所述乳化油相组分;优选的,所述油相溶剂包括玉米油;
和/或,所述制备方法包括:将所述淀粉基糊精改性酪蛋白多肽共轭物溶于磷酸盐缓冲液中,并搅拌3h以上,使蛋白充分溶胀,形成所述的水相溶液。
9.由权利要求6-8中任一项所述方法制备的淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液;优选的,所述淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液的形态结构为球形,粒径分布为50~150nm。
10.权利要求9所述的淀粉基糊精改性酪蛋白多肽纳米乳液于营养物质的递送、药物的控释、生物活性物质的稳定领域中的用途。
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