CN108458911A - 卵巢癌的病理切片染色组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种卵巢癌的病理切片染色组合物，所述组合物包括苏木精、无水乙醇、硫酸铝钾、碘酸钠、冰醋酸、硫酸亚铁、硫酸亚铁壳聚糖PLGA双重微球和蒸馏水。本发明的苏木精染色液组成简单，成本低廉，染色液安全有效，对人体无毒副作用，制备过程中对氧化剂的用量和氧化时间无严格要求，有效降低了其制备的难度，且制备耗时明显缩短，染色液一经配制完成，染色能力可长期保持，不会形成氧化膜和沉淀，极大提高了苏木精染色液的有效期，对多种病理组织具有优异的染色能力，尤其对于卵巢癌的染色效果更佳,细胞核、染色质、核膜、核仁染色清晰。
Description
技术领域
本发明属于诊断学技术领域，具体涉及一种卵巢癌的病理切片染色组合物。
背景技术
临床中取部分有病变的组织或者脏器经过处理使之固定硬化后切片并染色，通过显微镜下观察病理变化，从而做出病理诊断，其中染色步骤经典的包括苏木精-伊红染色法，简称HE染色法，是利用碱性的苏木精染色液将细胞核内的染色质与胞质内的核酸染成紫蓝色，利用酸性的伊红使细胞质和细胞外基质中的成分染成红色。
苏木精-伊红染色法中的染料之一的苏木精是一种纯天然染料，从主产墨西哥坎偑切的苏木树提炼而来，是最常用的染料之一，可用于蚕丝、毛皮和皮革的染色以及棉布的印花，用不同的媒染剂可得到蓝色或黑色。苏木精不能直接染色，必须使其氧化得到氧化苏木精(又称苏木素)后才能使用，这也叫做“成熟”。苏木精的“成熟”过程需时较长，配置后时间愈久，染色力愈强。苏木精的成熟一般有两种方法，一是天然成熟，苏木精与其它试剂混合好后，暴露于阳光或亮处，在自然光的作用下，慢慢地氧化成熟，但时间较长，一般需12周左右。二是加入化学试剂如***、碘酸钠、高锰酸钾、重铬酸钾或过氧化氢等氧化剂促进其成熟，历年来发展出多种多样的苏木素染液，包括Harros苏木***、Ehrlich苏木***、Mayer苏木***、Hansen苏木***、Gill半氧化苏木***、重铬酸钾氧化苏木***、Delafield苏木***、碘酸钠氧化苏木***等。
自然成熟的苏木精所需周期长，成本高，使用麻烦，而人工成熟的苏木精除了苏木精的过度氧化从而导致其染色力快速减弱甚至消失外，***等物质存在毒副作用，还会在染液表面及容器壁上产生氧化膜、产生沉淀，导致了染色能力下降过快，有效期短，不能久存。针对于人工成熟的苏木精所存在的问题，发展出了半氧化苏木***，其原理为使大部分的苏木精在较短时间内氧化为氧化苏木精，从而具备染色能力，其余部分的苏木精则处于半氧化的状态，在继续使用的过程中自然氧化，从而有效防止了氧化苏木精的过氧化，通过自然氧化还可以不断补充消耗的色素来保持染液的相对稳定和比较持久的染色能力，但半氧化的苏木精染液是通过在制备之初牺牲掉部分染色能力为代价而减少氧化苏木精的过氧化，人为的降低了染色液的染色能力，且制备方法复杂，需要根据染液量的多少选择适当的氧化剂用量和氧化时间，当半氧化状态的苏木精经约3个月的自然成熟后仍面临氧化苏木精过氧化所导致的染色能力下降过快，有效期短，不能久存的问题。
本发明既是提供一种制备方法简单、染色能力强，且长期有效的苏木精染色组合物，可广泛应用于卵巢癌等的病理切片的染色。
发明内容
本发明的目的提供一种制备方法简单、染色能力强，且长期有效,可广泛应用于卵巢癌等的病理切片的染色组合物，所述组合物包括苏木精、无水乙醇、硫酸铝钾、碘酸钠、冰醋酸、硫酸亚铁、硫酸亚铁壳聚糖PLGA双重微球和蒸馏水；
优选的所述组合物包括苏木精2-4g、无水乙醇200-400mL、硫酸铝钾15-20g、碘酸钠0.4-0.8g、冰醋酸15-30mL、硫酸亚铁0.1-0.3g、硫酸亚铁壳聚糖PLGA双重微球0.2-1.0g、蒸馏水600-800mL；
优选的所述组合物包括苏木精3g、无水乙醇300mL、硫酸铝钾20g、碘酸钠0.7g、冰醋酸30mL、硫酸亚铁0.2g、硫酸亚铁壳聚糖PLGA双重微球0.8g、蒸馏水700mL。
更优选的，所述硫酸亚铁壳聚糖PLGA双重微球通过以下方法制备：
(1)称取100mg硫酸亚铁，溶于50mL浓度为1.0mg/mL的pH为4-5的壳聚糖水溶液，搅拌均匀，持续搅拌，缓慢加入30mL浓度为2.0mg/mL的三聚磷酸钠水溶液，继续搅拌20-40分钟，离心收集沉淀物，使用蒸馏水冲洗1-3次，然后冷冻干燥得硫酸亚铁壳聚糖微球；
(2)将60mg的硫酸亚铁壳聚糖微球分散至含有400mgPLGA的3mL二氯甲烷中，混合均匀作为油相，配制含羧甲基纤维素钠0.2-0.4％的溶液5-10mL，作为水相，将油相添加至水相后，1500-2000rpm下搅拌5-8分钟，随后逐滴加入100-200mL的1％的聚乙烯醇溶液中，500-900rpm搅拌3-5分钟，减压蒸发除去二氯甲烷，离心收集微球后蒸馏水洗涤1-3次后冷冻干燥，既得，其中所述PLGA中乳酸：乙醇酸的质量比为60：40。
优选的，步骤(1)中壳聚糖水溶液的pH为4，加入三聚磷酸钠后继续搅拌30分钟，离心收集沉淀物，使用蒸馏水冲洗3次；步骤(2)中配制羧甲基纤维素钠0.3％的溶液8mL，作为水相，将油相添加至水相后，1800rpm下搅拌7分钟，随后逐滴加入150mL的1％的聚乙烯醇溶液中，700rpm搅拌4分钟，减压蒸发除去二氯甲烷，离心收集微球后蒸馏水洗涤3次后冷冻干燥，既得。
本发明的再一个目的是提供一种制备方法简单、染色能力强，且长期有效,可广泛应用于卵巢癌等的病理切片的染色组合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)备料：称取配方量的各原料备用；
(2)将配方量的苏木精溶于无水乙醇中，搅拌均匀备用；
(3)将硫酸铝钾溶解于蒸馏水中，搅拌均匀备用：
(4)将步骤(2)、(3)制备得到的无水乙醇溶液、水溶液混合后搅拌均匀，加入碘酸钠，搅拌3-20分钟后加入硫酸亚铁和硫酸亚铁壳聚糖PLGA双重微球，继续搅拌1-5分钟后加入冰醋酸，搅拌均匀，既得。
优选的，所述步骤(4)中加入碘酸钠后搅拌6分钟后加入硫酸亚铁和硫酸亚铁壳聚糖PLGA双重微球，继续搅拌3分钟后加入冰醋酸，搅拌均匀，既得。
本发明创新性的在制备人工成熟的苏木精染色液时加入了还原性的硫酸亚铁，有效防止了人工成熟苏木精染色液过程中造成的氧化苏木精的过氧化，从而使得人工成熟过程中对于氧化剂的用量和氧化时间无需严格控制，简化了制备方法。染色液中剩余的硫酸亚铁还可以有效防止染色液中的氧化苏木精在放置过程中被空气中的氧气过氧化形成氧化膜和沉淀，防止了染色液中氧化苏木精浓度的持续降低，有效延长了苏木精染色液的有效期，通过加入硫酸亚铁壳聚糖PLGA双重微球，可缓慢释放硫酸亚铁，即避免了染色液中高浓度的硫酸亚铁对染色效果的影响，还可以避免硫酸亚铁因被快速氧化而失去对染色液的保护能力，从而更加显著的增长了染色液的有效期。
本发明有益效果
1.本发明的苏木精染色液组成简单，成本低廉，染色液安全有效，对人体无毒副作用。
2.本发明苏木精染色液制备过程中对氧化剂的用量和氧化时间无严格要求，从而有效降低了其制备的难度，制备过程简单，且易于操作，制备过程耗时明显缩短。
3.本发明的苏木精染色液一经配制完成，染色能力可长期保持，无需加入甘油，不会形成氧化膜和沉淀，避免了甘油对染色结果的干扰。
4.本发明染色液中硫酸亚铁经壳聚糖PLGA双重包衣后，可缓慢释放硫酸亚铁，有效避免了过氧化苏木精的形成，从而在极大提高了苏木精染色液的有效期的同时，还可有效减少硫酸亚铁自身颜色对染色结果的干扰，硫酸亚铁被氧化为三价铁后还可以作为氧化苏木精的媒染剂，增强染色效果。
5.本申请的苏木精染色液对多种病理组织具有优异的染色能力，尤其对于卵巢癌的染色效果更佳，细胞核、染色质、核膜、核仁染色清晰。
具体实施方式
在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。
实施例1:一种卵巢癌的病理切片染色组合物
所述染色组合物包括苏木精3g、无水乙醇300mL、硫酸铝钾20g、碘酸钠0.7g、冰醋酸30mL、硫酸亚铁0.2g、硫酸亚铁壳聚糖PLGA双重微球0.8g。通过以下方法制备：
(1)备料：称取配方量的各原料备用；
(2)将配方量的苏木精溶于无水乙醇中，搅拌均匀备用；
(3)将硫酸铝钾溶解于蒸馏水中，搅拌均匀备用：
(4)将步骤(2)、(3)制备得到的无水乙醇溶液、水溶液混合后搅拌均匀，加入碘酸钠，搅拌10分钟后加入硫酸亚铁和硫酸亚铁壳聚糖PLGA双重微球，继续搅拌1-3分钟后加入冰醋酸，搅拌均匀，既得。
其中所述硫酸亚铁壳聚糖PLGA双重微球通过以下方法制备得到：
(1)称取100mg硫酸亚铁，溶于50mL浓度为1.0mg/mL的pH为4的壳聚糖水溶液，搅拌均匀，持续搅拌，缓慢加入30mL浓度为2.0mg/mL的三聚磷酸钠水溶液，继续搅拌30分钟，离心收集沉淀物，使用蒸馏水冲洗3次，然后冷冻干燥得硫酸亚铁壳聚糖微球；
(2)将60mg的硫酸亚铁壳聚糖微球分散至含有400mgPLGA的3mL二氯甲烷中，混合均匀作为油相，配制含羧甲基纤维素钠0.3％的溶液8mL，作为水相，将油相添加至水相后，1800rpm下搅拌7分钟，随后逐滴加入150mL的1％的聚乙烯醇溶液中，700rpm搅拌4分钟，减压蒸发除去二氯甲烷，离心收集微球后蒸馏水洗涤3次后冷冻干燥，既得，其中所述PLGA中乳酸：乙醇酸的质量比为60：40。
对比例1：一种卵巢癌的病理切片染色组合物
所述染色组合物包括苏木精3g、无水乙醇300mL、硫酸铝钾20g、碘酸钠0.7g、冰醋酸30mL。通过以下方法制备：
(1)备料：称取配方量的各原料备用；
(2)将配方量的苏木精溶于无水乙醇中，搅拌均匀备用；
(3)将硫酸铝钾溶解于蒸馏水中，搅拌均匀备用：
(4)将步骤(2)、(3)制备得到的无水乙醇溶液、水溶液混合后搅拌均匀，加入碘酸钠，搅拌10分钟后加入冰醋酸，搅拌均匀，既得。
对比例2：一种卵巢癌的病理切片染色组合物
所述染色组合物包括苏木精3g、无水乙醇300mL、硫酸铝钾20g、碘酸钠0.7g、冰醋酸30mL、硫酸亚铁1.0g。通过以下方法制备：
(1)备料：称取配方量的各原料备用；
(2)将配方量的苏木精溶于无水乙醇中，搅拌均匀备用；
(3)将硫酸铝钾溶解于蒸馏水中，搅拌均匀备用：
(4)将步骤(2)、(3)制备得到的无水乙醇溶液、水溶液混合后搅拌均匀，加入碘酸钠，搅拌10分钟后加入硫酸亚铁，继续搅拌1-3分钟后加入冰醋酸，搅拌均匀，既得。
效果例1：卵巢癌的病理切片染色组合物质量检测
将实施例1及对比例1-2中的卵巢癌的病理切片染色组合物分别滴入自来水中，观察其扩散状态，具体结果参见表1。
实施例1的染色组合物滴加入自来水后瞬间由红色变为紫色，随后以紫蓝色逐渐扩散，表明了实施例1的染色液组合物成熟完全，未被过氧化，染色液配制成功，而对比例1的染色液滴入时为浅红色，未经历任何变色，始终以浅红色逐渐扩散，表明了对比例1的染色液成熟过度，而对比例2的染色液滴入自来水时由橘红色变为灰色后变为咖啡色逐渐扩散，推测其可能原因是刚滴入时染色液中的硫酸亚铁浓度较高，之后硫酸亚铁被氧化后产生的三价铁离子，高浓度的硫酸亚铁及三价铁离子对染色液的颜色产生了较大的影响。
表1染色组合物在自来水中的扩散状态
| 扩散状态 | |
| 实施例1 | 瞬间由红色变为紫色，随后变为紫蓝色后逐渐扩散 |
| 对比例1 | 滴入时为浅红色，保持浅红色逐渐扩散 |
| 对比例2 | 滴入时由橘红色变灰色，随后变为咖啡色逐渐扩散 |
效果例2：卵巢癌的病理切片染色组合物稳定性试验
实施例1及对比例1-2染色液配制完成后装入相同规格的带盖玻璃瓶中，室温放置，每天同时开盖一个小时，观察配成完成时、完成后1个月、3个月、6个月、12个月、24个月的状态，具体结果参见表2：
表2实验结果显示了实施例1的染色液组合物配制完成后显示红色，每天开盖一小时，放置24个月后仍无沉淀和氧化膜出现，表明了本发明的染色液配制完成后可保持长期有效，而对比例1的染色液由于缺乏还原剂的保护，3个月后已经开始出现沉淀和氧化膜，表明染色液中的氧化苏木精已开始被过氧化，从而导致了染色液中有效成分逐渐减低乃至失效，对比例2的染色液组合物配制完成后颜色已呈橘红色，推测是由于硫酸亚铁自身呈现浅绿色，对比例2染色液中硫酸亚铁含量较高，从而对染色液的颜色产生了干扰，相对于对比例1，对比例2的有效期明显增长，在配制完成后的第6个月才开始出现沉淀和氧化膜，从而表明了还原剂硫酸亚铁的加入可以有效延长染色液的有效期。虽然对比例2染色液的有效期由于加入了还原剂硫酸亚铁而获得了延长，但仍明显低于本发明实施例1的染色液，其可能的原因是由于对比例2染色液中硫酸亚铁未被包衣保护，在频繁的开盖过程中以较快的速度被空气中的氧气所氧化，而逐渐失效，从而使得染色液失去保护，染色液中的氧化苏木精逐渐因过氧化而产生了沉淀和氧化膜，导致了染色逐渐失效。
表2染色组合物的稳定性实验结果
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
Claims (10)
1.一种卵巢癌的病理切片染色组合物，其特征在于，所述染色组合物包括苏木精、无水乙醇、硫酸铝钾、碘酸钠、冰醋酸、硫酸亚铁、硫酸亚铁壳聚糖PLGA双重微球和蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的卵巢癌的病理切片染色组合物，其特征在于，所述染色组合物由苏木精、无水乙醇、硫酸铝钾、碘酸钠、冰醋酸、硫酸亚铁、硫酸亚铁壳聚糖PLGA双重微球和蒸馏水组成。
3.根据权利要求1或2所述的卵巢癌的病理切片染色组合物，其特征在于，所述组合物由苏木精2-4g、无水乙醇200-400mL、硫酸铝钾15-20g、碘酸钠0.4-0.8g、冰醋酸15-30mL、硫酸亚铁0.1-0.3g、硫酸亚铁壳聚糖PLGA双重微球0.2-1.0g和蒸馏水600-800mL。
4.根据权利要求3所述的卵巢癌的病理切片染色组合物，其特征在于，所述组合物由苏木精3g、无水乙醇300mL、硫酸铝钾20g、碘酸钠0.7g、冰醋酸30mL、硫酸亚铁0.2g、硫酸亚铁壳聚糖PLGA双重微球0.8g、蒸馏水700mL组成。
5.权利要求1-4任一项所述的卵巢癌的病理切片染色组合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)备料：称取配方量的各原料备用；
(2)将配方量的苏木精溶于无水乙醇中，搅拌均匀备用；
(3)将硫酸铝钾溶解于蒸馏水中，搅拌均匀备用：
(4)将步骤(2)、(3)制备得到的无水乙醇溶液、水溶液混合后搅拌均匀，加入碘酸钠，搅拌3-20分钟后加入硫酸亚铁和硫酸亚铁壳聚糖PLGA双重微球，继续搅拌1-5分钟后加入冰醋酸，搅拌均匀，既得。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中加入碘酸钠后搅拌6分钟后加入硫酸亚铁和硫酸亚铁壳聚糖PLGA双重微球，继续搅拌3分钟后加入冰醋酸，搅拌均匀，既得。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于所述硫酸亚铁壳聚糖PLGA双重微球通过以下方法制备：
(1)称取100mg硫酸亚铁，溶于50mL浓度为1.0mg/mL的pH为4-5的壳聚糖水溶液，搅拌均匀，持续搅拌过程中缓慢加入30mL浓度为2.0mg/mL的三聚磷酸钠水溶液，继续搅拌20-40分钟，离心收集沉淀物，使用蒸馏水冲洗1-3次，然后冷冻干燥得硫酸亚铁壳聚糖微球；
(2)将60mg的硫酸亚铁壳聚糖微球分散至含有400mgPLGA的3mL二氯甲烷中，混合均匀作为油相，配制含羧甲基纤维素钠0.2-0.4％的溶液5-10mL，作为水相，将油相添加至水相后，1500-2000rpm下搅拌5-8分钟，随后逐滴加入100-200mL的1％的聚乙烯醇溶液中，500-900rpm搅拌3-5分钟，减压蒸发除去二氯甲烷，离心收集微球后蒸馏水洗涤1-3次后冷冻干燥，既得，其中所述PLGA中乳酸：乙醇酸的质量比为60：40。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中壳聚糖水溶液的pH为4，加入三聚磷酸钠后继续搅拌30分钟，离心收集沉淀物，使用蒸馏水冲洗3次；步骤(2)中配制羧甲基纤维素钠0.3％的溶液8mL，作为水相，将油相添加至水相后，1800rpm下搅拌7分钟，随后逐滴加入150mL的1％的聚乙烯醇溶液中，700rpm搅拌4分钟，减压蒸发除去二氯甲烷，离心收集微球后蒸馏水洗涤3次后冷冻干燥，既得。
9.硫酸亚铁壳聚糖PLGA双重微球在制备卵巢癌的病理切片染色组合物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述硫酸亚铁壳聚糖PLGA双重微球通过以下方法制备得到：
(1)称取100mg硫酸亚铁，溶于50mL浓度为1.0mg/mL的pH为4的壳聚糖水溶液，搅拌均匀，持续搅拌过程中缓慢加入30mL浓度为2.0mg/mL的三聚磷酸钠水溶液，继续搅拌30分钟，离心收集沉淀物，使用蒸馏水冲洗3次，然后冷冻干燥得硫酸亚铁壳聚糖微球；
(2)将60mg的硫酸亚铁壳聚糖微球分散至含有400mgPLGA的3mL二氯甲烷中，混合均匀作为油相，配制含羧甲基纤维素钠0.3％的溶液8mL，作为水相，将油相添加至水相后，1800rpm下搅拌7分钟，随后逐滴加入150mL的1％的聚乙烯醇溶液中，700rpm搅拌4分钟，减压蒸发除去二氯甲烷，离心收集微球后蒸馏水洗3次后冷冻干燥，既得，其中所述PLGA中乳酸：乙醇酸的质量比为60：40。
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