CN108456700A - 一种利用糖蜜废醪液和镁离子提高微藻中油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用糖蜜废醪液和镁离子提高微藻中油脂的方法，属于微藻生物技术领域。本发明用水稀释糖蜜废醪液至pH值为4.4~5.0，作为微藻培养的基础培养基，然后加入MgSO4至培养基中Mg2+的含量为400~1600μmol/L，采用NaOH溶液调节培养基的pH值为6.8~7.0，灭菌处理得到微藻培养基；将微藻接入微藻培养基中进行光照摇瓶培养，其中光照摇瓶培养的温度为24~26℃、光照强度为2400~2800lux，摇床转速为145~155r/min；将微藻培养至稳定期后期，利用有机溶剂提取微藻细胞内的油脂。本发明方法操作简单易行，能够有效的利用糖蜜废醪液提高微藻的生物量和油脂含量，降低了生产成本，减少环境污染。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用糖蜜废醪液和镁离子提高微藻中油脂的方法，属于微藻生物技术领域。
背景技术
生物柴油是指以动植物、微生物油脂及废餐饮油等为原料油，通过酯交换工艺制成的甲酯或乙酯燃料。与常规柴油相比，它具有可再生、易降解、燃烧后污染物排放低、温室气体排放低等特点。
微藻具备固碳和产油的功能。利用微藻制备生物柴油具有诸多优势：（1）生产效率高，通常是其它油料作物的10~100倍；（2）光合效率高；（3）脂质与淀粉的含量高；（4）不与粮食作物争地；（5）可利用废水，净化环境；（6）生产周期短，全年不间断生产等。因此，利用微藻制备生物柴油具有广阔的应用前景。
糖蜜废醪液是甘蔗或甜菜糖厂在精制糖产品过程中，排出的无毒、有害、污染负荷高的废水，呈酸性，其化学耗氧量 (COD) 达 4000~50000 mg/L，生物需氧量(BOD)达20000~30000 mg/L，直接排放会严重破坏生态平衡。糖蜜废醪液中含有大量的营养物质，氨氮1500～2500 mg/L，其中还含有许多氨基酸、蛋白质、糖类以及 Na、K、Ca、Mg、P 、Fe、Zn等矿物元素，其固形物含量为 8~10％，有机物质占70 %左右。
云南省是全国主要蔗糖产地之一，全省拥有80多家制糖企业，遍布全省14个地州，涉及40多个县。这些糖厂都附设有酒精生产车间，但其生产过程中会产生大量的酸性高浓度有机废水 , 具有潜在的危害性。一个配有日产量为20 t酒精生产能力的糖厂，其排放的酒精生产废水污染负荷，相当于一个40万人口的城市排放生活污水的污染负荷，会造成水体富营养化、缺氧、鱼虾绝迹、水质恶化、发臭，严重污染地表地下水。如酒精生产排放的废水污染负荷是云南最主要的水污染源，占云南废水排放污染负荷总量约40%。
如何对酒精废醪液进行经济有效的治理，至今仍是糖厂污染治理的一个难题。目前处理糖蜜废醪液的一些技术和方法，包括（1）厌氧发酵处理后，悬浮物（ss）和化学需氧量（COD）的去除率均可达80%以上，达到排放标准，但其中的营养成分流失无法利用。（2）糖蜜废醪液可用于发酵沼气，沼渣可用作肥料灌溉农田，但容易引起土壤酸化和板结，有刺鼻气味，污染空气。
目前尚未有利用糖蜜废醪液来提高微藻中油脂的方法。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题及不足，本发明提供一种利用糖蜜废醪液和镁离子提高微藻中油脂的方法，本发明方法采用糖蜜废醪液作为基础培养基培养微藻生产生物柴油，可解决糖蜜废醪液的处理问题，还能带来经济效益，实了“变废为宝”。
一种利用糖蜜废醪液和镁离子提高微藻中油脂的方法，具体步骤如下：
（1）培养基的制备：用水稀释糖蜜废醪液至pH值为4.4~5.0，作为微藻培养的基础培养基，然后加入MgSO4至培养基中Mg2+的含量为400~1600 μmol/L，采用NaOH溶液调节培养基的pH值为6.8~7.0，灭菌处理得到微藻培养基；
（2）微藻培养：将微藻接入步骤（1）的微藻培养基中进行光照摇瓶培养，其中光照摇瓶培养的温度为24~26℃、光照强度为2400~2800 lux，摇床转速为145 ~155 r/min；
（3）微藻中油脂的提取：将步骤（2）的微藻培养至稳定期后期，利用有机溶剂提取微藻细胞内的油脂；
所述微藻为单针藻菌株Monoraphidium sp. FXY-10（NCBI：JQ809706）；
所述步骤（2）中微藻的初始接种量为0.095~0.105 g/L；
所述步骤（3）中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为2:1；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经3400~3600 r/min离心富集5~6min，用蒸馏水反复洗涤2~4次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的1.9~2.1倍。
本发明的有益效果为：
（1）本发明利用糖蜜废醪液培养微藻，可节约资源，降低生产成本，提高微藻中的油脂含量，糖蜜废醪液实现了零排放，有利于环境的保护；将糖蜜废醪液的处理与微藻产油结合起来，提高了资源的利用率，变废为宝；
（2）本发明与单独利用糖蜜废醪液培养基的相比，到达稳定期后，当Mg2+浓度为800 μM时，油脂含量最高，达到细胞干重的59.58%，提高了25.99%；同时，生物量达到最大，较不添加Mg2+的糖蜜废醪液（0.5705 g/L）培养也提高了58.44%，最终达到0.9044 g/L；
（3）本发明中糖蜜废醪液中添加Mg2+，产油微藻便能较好的生长，不但解决了糖蜜废醪液的处理问题，保护了环境，而且将废弃物资源化，同时节约了资源；Mg2+的添加促进了微藻对糖蜜废醪液中营养成分的吸收及油脂的合成，微藻在添加Mg2+的糖蜜废醪液中生长，增加了生物量和油脂含量。
附图说明
图1为对比例1与实施例1~4的微藻油脂含量和生物量示图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明作进一步说明。
本发明的对比例和实施例采用的微藻为单针藻菌株Monoraphidium sp. FXY-10（NCBI：JQ809706）。
对比例1：一种利用糖蜜废醪液提高微藻中油脂的方法，具体步骤如下：
（1）培养基的制备：用水稀释糖蜜废醪液至pH值为4.4，作为微藻培养的基础培养基，采用NaOH溶液调节培养基的pH值为6.8，灭菌处理得到微藻培养基；
（2）微藻培养：将微藻接入步骤（1）的微藻培养基中进行光照摇瓶培养，其中光照摇瓶培养的温度为24℃、光照强度为2500lux，摇床转速为150r/min；微藻的初始接种量为0.1g/L；
（3）微藻中油脂的提取：将步骤（2）的微藻培养至稳定期后期，利用有机溶剂提取微藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为2:1；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经3500r/min离心富集5min，用蒸馏水反复洗涤2次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2.0倍；
本对比例的油脂含量达细胞干重的47.29 %，生物量为0.57 g/L（见图1）。
实施例1：一种利用糖蜜废醪液和镁离子提高微藻中油脂的方法，具体步骤如下：
（1）培养基的制备：用水稀释糖蜜废醪液至pH值为4.4，作为微藻培养的基础培养基，然后加入MgSO4至培养基中Mg2+的含量为400μmol/L，采用NaOH溶液调节培养基的pH值为6.8，灭菌处理得到微藻培养基；
（2）微藻培养：将微藻接入步骤（1）的微藻培养基中进行光照摇瓶培养，其中光照摇瓶培养的温度为24℃、光照强度为2500lux，摇床转速为150r/min；微藻的初始接种量为0.1g/L；
（3）微藻中油脂的提取：将步骤（2）的微藻培养至稳定期后期，利用有机溶剂提取微藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为2:1；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经3500r/min离心富集5min，用蒸馏水反复洗涤2次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2.0倍；从表1可知，本实施例的油脂含量达细胞干重的53.39%，生物量为0.8376g/L（见图1）；添加Mg2+可提高微藻生物量和油脂含量，生物量为对比例1的1.47倍，藻细胞油脂含量较对比例1增加了12.90%。
实施例2：一种利用糖蜜废醪液和镁离子提高微藻中油脂的方法，具体步骤如下：
（1）培养基的制备：用水稀释糖蜜废醪液至pH值为4.6，作为微藻培养的基础培养基，然后加入MgSO4至培养基中Mg2+的含量为800μmol/L，采用NaOH溶液调节培养基的pH值为6.9，灭菌处理得到微藻培养基；
（2）微藻培养：将微藻接入步骤（1）的微藻培养基中进行光照摇瓶培养，其中光照摇瓶培养的温度为25℃、光照强度为2500lux，摇床转速为150r/min；微藻的初始接种量为0.1g/L；
（3）微藻中油脂的提取：将步骤（2）的微藻培养至稳定期后期，利用有机溶剂提取微藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为2:1；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经3500r/min离心富集5min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的1.9倍；本实施例的油脂含量达细胞干重的59.58%，生物量为0.9044g/L（见图1）；添加Mg2+可提高微藻生物量和油脂含量，生物量为对比例1的1.58倍，藻细胞油脂含量较对比例1增加了25.99%。
实施例3：一种利用糖蜜废醪液和镁离子提高微藻中油脂的方法，具体步骤如下：
（1）培养基的制备：用水稀释糖蜜废醪液至pH值为5.0，作为微藻培养的基础培养基，然后加入MgSO4至培养基中Mg2+的含量为1200μmol/L，采用NaOH溶液调节培养基的pH值为7.0，灭菌处理得到微藻培养基；
（2）微藻培养：将微藻接入步骤（1）的微藻培养基中进行光照摇瓶培养，其中光照摇瓶培养的温度为26℃、光照强度为2500lux，摇床转速为150r/min；微藻的初始接种量为0.1g/L；
（3）微藻中油脂的提取：将步骤（2）的微藻培养至稳定期后期，利用有机溶剂提取微藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为2:1；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经3500r/min离心富集5min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的1.9倍；本实施例的油脂含量达细胞干重的57.61%，生物量为0.8483g/L（见图1）；添加Mg2+可提高微藻生物量和油脂含量，生物量为对比例1的1.48倍，藻细胞油脂含量较对比例1增加了21.82%。
实施例4：一种利用糖蜜废醪液和镁离子提高微藻中油脂的方法，具体步骤如下：
（1）培养基的制备：用水稀释糖蜜废醪液至pH值为5.0，作为微藻培养的基础培养基，然后加入MgSO4至培养基中Mg2+的含量为1600μmol/L，采用NaOH溶液调节培养基的pH值为7.0，灭菌处理得到微藻培养基；
（2）微藻培养：将微藻接入步骤（1）的微藻培养基中进行光照摇瓶培养，其中光照摇瓶培养的温度为26℃、光照强度为2500lux，摇床转速为150r/min；微藻的初始接种量为0.1g/L；
（3）微藻中油脂的提取：将步骤（2）的微藻培养至稳定期后期，利用有机溶剂提取微藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为2:1；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经3500 r/min离心富集5min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的1.9倍；本实施例的油脂含量达细胞干重的54.78%，生物量为0.8444g/L（见图1）；添加Mg2+可提高微藻生物量和油脂含量，生物量为对比例1的1.48倍，藻细胞油脂含量较对比例1增加了15.84%。
结果表明，适当的增加糖蜜废醪液中Mg2+浓度可以促进微藻的生长和油脂的积累，Mg2+可以促进磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化磷酸烯醇式丙酮酸与HCO3 -反应，促进微藻的生长，同时为微藻的三羧酸循环提供了大量的草酰乙酸；Mg2+可以提高ACCase的活性，由ACCase催化乙酰-CoA转化为丙二酸单酰辅酶A，ACCase的浓度和活性的影响脂肪酸合成。
Claims (4)
1.一种利用糖蜜废醪液和镁离子提高微藻中油脂的方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）培养基的制备：用水稀释糖蜜废醪液至pH值为4.4~5.0，作为微藻培养的基础培养基，然后加入MgSO4至培养基中Mg2+的含量为400~1600 μmol/L，采用NaOH溶液调节培养基的pH值为6.8~7.0，灭菌处理得到微藻培养基；
（2）微藻培养：将微藻接入步骤（1）的微藻培养基中进行光照摇瓶培养，其中光照摇瓶培养的温度为24~26℃、光照强度为2400~2800 lux，摇床转速为145~155r/min；
（3）微藻中油脂的提取：将步骤（2）的微藻培养至稳定期后期，利用有机溶剂提取微藻细胞内的油脂。
2.根据权利要求1所述利用糖蜜废醪液和镁离子提高微藻中油脂的方法，其特征在于：微藻为单针藻菌株Monoraphidium sp. FXY-10（NCBI：JQ809706）。
3.根据权利要求1所述利用褪黑素联合缺氮促进异养微藻油脂积累的方法，其特征在于：步骤（2）中微藻的初始接种量为0.095~0.105 g/L。
4.根据权利要求1所述利用糖蜜废醪液和镁离子提高微藻中油脂的方法，其特征在于：步骤（3）中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为2:1；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经3400~3600 r/min离心富集5~6 min，用蒸馏水反复洗涤2~4次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的1.9~2.1倍。
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