CN108456687B

CN108456687B - 基于赖氨酸浓度控制的重组表达质粒、转化子及其应用

Info

Publication number: CN108456687B
Application number: CN201710094155.XA
Authority: CN
Inventors: 陆文强; 周豪宏; 刘修才
Original assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Current assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Priority date: 2017-02-21
Filing date: 2017-02-21
Publication date: 2023-08-29
Anticipated expiration: 2037-02-21
Also published as: CN108456687A

Abstract

本发明涉及一种重组表达质粒，还涉及一种含有重组表达质粒的转化子，本发明还涉及该转化子的应用，特别是在发酵生产赖氨酸脱羧酶及发酵生产1,5‑戊二胺方面的应用。本发明的技术要点在于一种重组表达质粒，包括：第一启动子；目的基因；对赖氨酸响应的抑制型分子开关如lysC5'‑UTR序列；所述第一启动子控制所述目的基因的表达；还包括：第二启动子；所述第一启动子的阻遏蛋白基因；所述第二启动子控制所述lysC5'‑UTR序列的转录，并且控制所述第一启动子的阻遏蛋白基因的表达；所述lysC5'‑UTR序列位于所述第二启动子和所述第一启动子的阻遏蛋白基因之间。一种转化子，所述转化子包括如上所述的重组表达质粒。本发明的重组表达质粒对赖氨酸响应的表达属于激活型的表达。

Description

基于赖氨酸浓度控制的重组表达质粒、转化子及其应用

技术领域

本发明涉及一种重组表达质粒，还涉及一种含有重组表达质粒的转化子，本发明还涉及该转化子的应用，特别是在发酵生产赖氨酸脱羧酶及发酵生产1,5-戊二胺方面的应用。

背景技术

控制蛋白表达的表达***有很多，目前常见的有需要诱导剂IPTG诱导的lac系列启动子的表达***，包含lac、lacUV⁵、tac、trc等启动子，也有需要诱导剂IPTG诱导的基于lacUV⁵和T7启动子组合表达***，还有需要***糖诱导的ara启动子表达***等等。但是在实际生产中，有时会涉及到一些比较复杂的蛋白表达要求，如需要在一个***中随着代谢物赖氨酸的多少和有无进行有针对性地控制相关蛋白是否表达及表达量的多少。这时候利用上述表达***就存在一定的问题，如在IPTG作为诱导剂的表达***中，因为IPTG是不参与细胞代谢的，因此在诱导表达过程中，其表达量是恒定的。因此使用过程操作要求较多，首先需要通过实验确定所加的IPTG的浓度，而一旦加入IPTG后，蛋白处于不断表达的过程中，如果想要其停止表达或中止表达，则需要将发酵液离心清洗掉其中的IPTG后才能继续后续培养实验。即该表达***表达蛋白只有“关”-“开”模式。同样使用***糖作为诱导剂诱导蛋白表达时，蛋白表达模式通常是“关”-“开”模式，虽然***糖可以被细菌作为碳源利用消耗，可能存在“关”-“开”-“关”模式。但是诱导表达后再关闭是因为***糖的消耗导致的，进一步而言，***糖的多少只是与细胞的OD存在关联，即是细胞生物量控制蛋白表达而不是代谢产物控制目标蛋白表达。因此利用***糖启动子的蛋白表达***也不能够灵活地、实时地控制蛋白的表达。而利用对代谢物响应的表达***，如对赖氨酸响应的表达***，那么在产赖氨酸的菌株中，可以使表达***随赖氨酸的产量自动地实现“关”-“开”-“关”-“开”的循环过程，并且“开”的强度可以由细胞自身赖氨酸浓度调节，使得细胞内能量及碳源物质最大化的优化利用，也使得需要表达的蛋白对细胞的影响减少到最低。

对赖氨酸响应的分子原件有lysC5'-UTR序列，该序列是位于天冬氨酸激酶lysC基因5’端的一段序列，常见的是ATG上游-95到-332的237个碱基。lysC5’-UTR序列作用原理是，在没有赖氨酸存在的情况下，lysC5’-UTR序列转录后的mRNA上对应序列(下称lysC5’-UTR分子开关)形成的环(loop)不与茎部(核糖体结合位点区域及起始密码子AUG)区域结合，使得基因前面的RBS及基因翻译起始位点暴露出来，核糖体结合上去，翻译起始；当存在赖氨酸时，赖氨酸与lysC5’-UTR分子开关结合，改变了环结构，环与茎部结合，使得RBS区域及AUG因与环形成二级结构而无法与核糖体结合，导致无法翻译出AUG后面的蛋白(Rodionov,D.A.,A.G.Vitreschak,A.A.Mironov and M.S.Gelfand(2003)."Regulationof lysine biosynthesis and transport genes in bacteria:yet another RNAriboswitch？"Nucleic Acids Res 31(23):6748-6757；Sudarsan,N.,J.K.Wickiser,S.Nakamura,M.S.Ebert and R.R.Breaker(2003)."An mRNA structure in bacteriathat controls gene expression by binding lysine."Genes Dev 17(21):2688-2697；Blouin,S.,R.Chinnappan and D.A.Lafontaine(2011)."Folding of the lysineriboswitch:importance of peripheral elements for transcriptional regulation."Nucleic Acids Res 39(8):3373-3387.)。在现有的技术中，专利申请US20100190244A1描述了利用lysC 5'-UTR分子开关控制蛋白表达的***。虽然该专利描述了利用对赖氨酸响应的lysC 5'-UTR分子开关结合赖氨酸直接进行蛋白表达，但lysC 5'-UTR分子开关属于抑制型的表达元件，所谓抑制型的表达元件指的是在没有抑制剂(对lysC 5'-UTR分子开关而言抑制剂是赖氨酸)的情况下，表达***处于表达状态，随着抑制剂的逐渐增加，表达逐渐受到抑制直至停止表达。因此在抑制型的表达***中，表达量的上限是固定的。所以该专利公开的表达***的表达上限是固定的，并且该***的使用上并不能满足一些特殊的表达要求，如当一个菌株在赖氨酸浓度高的时候才需要表达目标蛋白而浓度低的时候不能表达该目标蛋白时，该专利的技术则不能适用。

发明内容

现有技术中对赖氨酸响应的表达***属于抑制型的表达***，即没有赖氨酸的情况下表达，但有赖氨酸的情况下不表达。本发明的第一方面目的在于提供一种重组表达质粒，该重组表达质粒对赖氨酸响应的表达属于激活型的表达。

一种重组表达质粒，包括：

第一启动子；

目的基因；

对赖氨酸响应的抑制型分子开关；

所述第一启动子控制所述目的基因的表达；

第二启动子；

所述第一启动子的阻遏蛋白基因，或者编码阻遏所述目的基因表达的小分子RNA的聚核苷酸序列；

所述第二启动子控制所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关的转录，并控制所述第一启动子的阻遏蛋白基因的表达，或者并控制所述编码阻遏所述目的基因表达的小分子RNA的聚核苷酸序列的表达；

所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关位于所述第二启动子和所述第一启动子的阻遏蛋白基因之间，或者所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关位于所述第二启动子和所述编码阻遏所述目的基因表达的小分子RNA的聚核苷酸序列之间。

优选地，所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关为lysC5'-UTR序列或其截短序列。

进一步，所述第二启动子和所述第一启动子的阻遏蛋白基因之间用lysC5'-UTR序列或其截短序列连接。

在上述任一技术方案的基础上进一步，所述第一启动子是lac、tac或trc启动子，所述第一启动子的阻遏蛋白基因是阻遏蛋白lacI基因或其突变基因；

或者，所述第一启动子是araB启动子，所述第一启动子的阻遏蛋白基因是阻遏蛋白araC基因或其突变基因；

或者，所述第一启动子是tet启动子，所述第一启动子的阻遏蛋白基因是阻遏蛋白TetR基因或其突变基因。

在上述任一技术方案的基础上进一步，所述lysC5'-UTR序列来源于大肠杆菌(Escherichia coli)lysC基因5’上游的非翻译区，或者来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)lysC基因5’上游的非翻译区；又进一步，所述lysC5'-UTR序列包含lysC基因起始密码子ATG上游的-95到-332的237个碱基。当然，lysC5'-UTR序列也可以是包括该237bp序列的截短序列，该截短序列可以完成对赖氨酸的响应分子开关的功能。所谓对赖氨酸的响应指的是当赖氨酸浓度低时，其后续的蛋白可以表达，当赖氨酸浓度高时，其后续的蛋白表达受到抑制。优选地，所述lysC5'-UTR序列来源于枯草芽孢杆菌lysC基因起始密码子ATG上游的332个碱基序列。

在上述任一技术方案的基础上进一步，所述第二启动子是诱导型启动子或组成型启动子；又进一步，所述第二启动子是诱导型启动子，所述第一启动子也是诱导型启动子，所述第一启动子和所述第二启动子是不同系列的诱导型启动子。所谓同系列启动子指的是受相同诱导剂影响表达的启动子，如lac启动子和tac启动子会受到IPTG的诱导调控，则不建议同时使用在本发明中。在本发明的一个实施例中，所述第一启动子优选是tac启动子，所述第二启动子优选是阻遏蛋白lacI的启动子。

在上述任一技术方案的基础上进一步，所述目的基因是目的蛋白基因；优选地，所述目的蛋白基因是单个蛋白基因或多个串联表达的蛋白基因；又优选地，所述目的基因是编码多肽的聚核苷酸，或者所述目的基因是编码多肽的聚核苷酸及标记基因的串联表达基因，或者所述目的基因是标记基因；更优选地，所述标记基因包括荧光蛋白标记基因，所述荧光蛋白标记基因包括RFP、GFP、YFP及它们的变种中的至少一种。

在上一技术方案的基础上更进一步，所述的多肽是蛋白质、酶或多肽类药物；优选地，所述的酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种，所述多肽类药物是激素、抗体和生长因子中的至少一种，所述蛋白质是转运蛋白LysE；又优选地，所述裂合酶是脱羧酶；更优选地，所述脱羧酶包括氨基酸脱羧酶，如赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。又更优选地，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段。

本发明的第二方面目的在于提出一种转化子，该转化子对赖氨酸响应的表达属于激活型的表达。

一种转化子，所述转化子包括如上任一技术方案所述重组表达质粒。

进一步，所述转化子的重组表达质粒中，所述目的蛋白基因是编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸或者所述目的蛋白基因是编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸及mRFP基因的串联表达基因；优选地，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段。

在上述任一技术方案的基础上进一步，所述转化子的宿主菌为蜂房哈夫尼菌或大肠杆菌；进一步，所述蜂房哈夫尼菌是无内源性质粒的蜂房哈夫尼菌或者有内源性质粒的蜂房哈夫尼菌，所述大肠杆菌是无内源性质粒的大肠杆菌或者有内源性质粒的大肠杆菌。

因为所述第一启动子、所述目的基因、所述lysC5'-UTR序列、所述第二启动子和所述第二启动子的阻遏蛋白基因并不必要在同一质粒上，所以本发明还提出了以下技术方案：

一种转化子，包括：

第一启动子；

目的基因；

对赖氨酸响应的抑制型分子开关；

所述第一启动子控制所述目的基因的表达；

其特征在于，还包括：

第二启动子；

进一步，所述第一启动子、所述目的基因、所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关、所述第二启动子和所述第二启动子的阻遏蛋白基因位于同一质粒上；或者，

所述第一启动子、所述目的基因、所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关、所述第二启动子和所述第二启动子的阻遏蛋白基因位于宿主菌基因组中；或者，

所述第一启动子和所述目的基因位于第一质粒上，所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关、所述第二启动子和所述第二启动子的阻遏蛋白基因位于第二质粒上；或者，

所述第一启动子和所述目的基因位于质粒上，所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关、所述第二启动子和所述第二启动子的阻遏蛋白基因位于宿主菌基因组中；或者，

所述第一启动子和所述目的基因位于宿主菌基因组中，所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关、所述第二启动子和所述第二启动子的阻遏蛋白基因位于质粒上。

在上述任一技术方案的基础上进一步，所述第一启动子是lac、tac、trc启动子，所述第一启动子的阻遏蛋白基因是阻遏蛋白lacI基因或其突变基因；

在上述任一技术方案的基础上进一步，所述lysC5'-UTR序列来源于大肠杆菌lysC基因5’上游的非翻译区，或者来源于枯草芽孢杆菌lysC基因5’上游的非翻译区；又进一步，所述lysC5'-UTR序列包含lysC基因起始密码子ATG上游的-95到-332的237个碱基。当然，lysC5'-UTR序列也可以是包含该237bp序列的截短序列，该截短序列可以完成对赖氨酸的响应分子开关的功能。所谓对赖氨酸的响应指的是当赖氨酸浓度低时，其后续的蛋白可以表达，当赖氨酸浓度高时，其后续的蛋白表达受到抑制。优选地，所述lysC5'-UTR序列来源于枯草芽孢杆菌lysC基因起始密码子ATG上游的332个碱基序列。

在上述任一技术方案的基础上进一步，所述第二启动子是诱导型启动子或组成型启动子；又进一步，所述第二启动子是诱导型启动子，所述第一启动子也是诱导型启动子，所述第一启动子和所述第二启动子是不同系列的诱导型启动子。所谓同系列启动子指的是受相同诱导剂影响表达的启动子，如lac启动子和tac启动子会受到IPTG的诱导调控，则不能同时使用在本发明中。在本发明的一个实施例中，所述第一启动子优选是tac启动子，所述第二启动子优选是阻遏蛋白lacI的启动子。

在上述任一技术方案的基础上进一步，所述目的基因是目的蛋白基因；优选地，所述目的蛋白基因是单个蛋白基因或多个串联表达的蛋白基因；又优选地，所述目的基因包括编码多肽的聚核苷酸，或者所述目的基因包括编码多肽的聚核苷酸及标记基因的串联表达基因，或者所述目的基因包括标记基因；更优选地，所述标记基因包括荧光蛋白标记基因；又更优选地，所述荧光蛋白标记基因包括RFP、GFP、YFP及它们的变种中的至少一种。

在上一技术方案的基础上更进一步，所述的多肽包括蛋白质、酶或多肽类药物；优选地，所述的酶包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种，所述多肽类药物包括激素、抗体和生长因子中的至少一种，所述蛋白质是转运蛋白LysE；又优选地，所述裂合酶包括脱羧酶，更优选地，所述脱羧酶包括氨基酸脱羧酶，如赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。又更优选地，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段。

本发明的第三方面在于提出一种发酵生产多肽的方法，该发酵方法生产多肽时重组表达质粒对赖氨酸响应的表达属于激活型的表达。

一种发酵生产多肽的方法，包括以下步骤：

A)培养如上文任一项技术方案所述的转化子；

B)从步骤A中得到的菌液或菌体中得到多肽。

进一步，所述的一种发酵生产多肽的方法，是发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：1)培养如上文任一项技术方案所述的转化子(当然，所述技术方案中所述多肽包括赖氨酸脱羧酶)；

2)从步骤1中得到的菌液或菌体中得到赖氨酸脱羧酶。

本发明用于生产赖氨酸脱羧酶的话，可以实现动态自动控制(当赖氨酸浓度升高时，赖氨酸脱羧酶表达增多，消耗掉赖氨酸，让赖氨酸浓度下降，相应地赖氨酸脱羧酶表达减少)。在涉及赖氨酸消耗的***中，当没有赖氨酸的情况下，不需要表达赖氨酸脱羧(减少代谢负担，节省碳源，减少赖氨酸脱羧作用于赖氨酸后的产物对细胞的毒害作用等)，当赖氨酸大量积累后，需要开启表达，或者将赖氨酸转化成戊二胺(CadA)。

本发明可以用于一步法生成戊二胺(即微生物发酵生产L-赖氨酸并偶联催化L-赖氨酸脱羧反应生成1,5-戊二胺)，首先通过宿主细胞生成赖氨酸，生成的赖氨酸作为诱导剂诱导表达目标蛋白赖氨酸脱羧酶，然后生成的赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧，生成了戊二胺，此时由于赖氨酸的消耗，诱导表达***关闭，赖氨酸脱羧酶停止产生(随后被降解)，直到赖氨酸再次积累时，赖氨酸脱羧酶又开始表达。

本发明还可以用于两步法生成戊二胺，将赖氨酸添加到发酵液中，赖氨酸作为诱导剂诱导赖氨酸脱羧酶的表达，赖氨酸脱羧酶将赖氨酸作为底物进行脱羧反应，生成戊二胺。

本发明还可以用于赖氨酸的生产，此时，所述目的基因是表达赖氨酸转运蛋白(LysE)的基因，在产赖氨酸的菌株中，当赖氨酸积累时，赖氨酸诱导目标蛋白赖氨酸转运蛋白(LysE)的表达，LysE将赖氨酸运输到胞外，减少胞内赖氨酸对赖氨酸合成途径的反馈抑制，从而提高赖氨酸的产量。当胞内赖氨酸减少时，LysE的表达也开始减少，从而减少了LysE对碳源氮源的消耗，提高碳源氮源到赖氨酸的产率。

本发明的第四方面在于提出一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，该发酵方法生产多肽时重组表达质粒对赖氨酸响应的表达属于激活型的表达。

一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：

I)培养如上文任一项技术方案所述的转化子(所述编码多肽的聚核苷酸是编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸)，所述转化子的宿主菌能产生赖氨酸；

II)获得戊二胺。

本发明利用两对调控原件构建了一个基于对赖氨酸响应的抑制型分子开关如lysC 5'-UTR序列的代谢物动力学控制表达***。所谓代谢物动力学控制表达***指的是在细胞内没有合成某代谢物(对lysC 5'-UTR序列而言对应的代谢物是赖氨酸)的情况下，表达***处于关闭状态，随着对应的代谢物的逐渐合成，表达***受到激活逐渐表达目标蛋白。

本发明涉及一种利用赖氨酸作为诱导剂控制蛋白表达的新方法。主要是利用一个对赖氨酸浓度敏感的RNA序列和对目的基因的启动子具有阻遏作用的蛋白序列，所述第二启动子控制所述lysC5'-UTR序列和第一启动子的阻遏蛋白基因的转录，在没有赖氨酸存在的情况下，lysC5'-UTR序列转录形成的lysC5'-UTR分子开关处于开放状态，其后的所述第一启动子的阻遏蛋白基因的mRNA开始翻译，形成第一启动子的阻遏蛋白，该第一启动子的阻遏蛋白与所述第一启动子的操纵序列结合，从而阻碍了第一启动子控制的所述目的基因的转录，所以没有所述目的蛋白的表达；当存在赖氨酸的情况下，赖氨酸与所述lysC5'-UTR的环结合，lysC5'-UTR分子开关处于关闭状态，其后的所述第一启动子的阻遏蛋白基因不表达，因为第一启动子的操纵序列没有阻遏蛋白的结合，所以会表达目的蛋白。本发明所涉及的***可以在产赖氨酸的菌株中无需外源性的化合物对目标蛋白进行有针对性的表达调控，也可以在不产赖氨酸的菌株中通过添加廉价的赖氨酸进行目标蛋白的表达调控。本发明的表达***在两种情况下使用有两种不同的价值，当在不产赖氨酸菌株中使用时，该***可以利用其诱导剂廉价的特点占据优势，当在产赖氨酸菌株中使用时，该***则可以根据代谢物赖氨酸的多少动态地控制蛋白的表达量。本发明用于一步法生产1,5-戊二胺的优势在于可以按需产赖氨酸脱羧酶，使得碳源氮源至赖氨酸或赖氨酸脱羧酶之间的分配更加优化，使得能源得到最高效利用。

附图说明

图1是实施例1中质粒pETacLYS的质粒谱图；

图2是实施例1中质粒pTLRA的质粒谱图；

图3是实施1中质粒pTLR的质粒谱图；

图4是实施例1中不同浓度赖氨酸诱导表达mRFP的菌体照片；

图5是实施例1中不同浓度赖氨酸诱导表达mRFP的荧光值；

图6是重组菌株JMTLRA表达赖氨酸脱羧酶CadA时，添加赖氨酸后，赖氨酸、戊二胺及荧光值随时间的变化图。

具体实施方式

下面结合附图，详细说明本发明。

本发明的第一方面目的在于提供了一种重组表达质粒，该重组表达质粒，包括：

第一启动子；

目的基因；

对赖氨酸响应的抑制型分子开关；

所述第一启动子控制所述目的基因的表达；

第二启动子；

所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关位于所述第二启动子和所述第一启动子的阻遏蛋白基因之间，或者所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关位于所述第二启动子和所述编码阻遏所述目的基因表达的小分子RNA的聚核苷酸序列之间，优选地，所述第二启动子和所述第一启动子的阻遏蛋白基因之间用对赖氨酸响应的抑制型分子开关连接。

所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关优选lysC5'-UTR序列或其截短序列。

所述第一启动子是lac、tac、trc启动子，所述第一启动子的阻遏蛋白基因是阻遏蛋白lacI基因或其突变基因；

或者，所述第一启动子是araB启动子，所述第一启动子的阻遏蛋白基因是阻遏蛋白araC基因或其突变基因；(阻遏蛋白araC基因突变基因在现有技术中已经有披露，如曾伟强，Ron,G,W(1998)."大肠杆菌araC突变基因的分子克隆及DNA序列分析."微生物学报28(1):34-39.)或者，所述第一启动子是tet启动子，所述第一启动子的阻遏蛋白基因是阻遏蛋白TetR基因或其突变基因。

所述lysC5'-UTR序列来源于大肠杆菌lysC基因5’上游的非翻译区，或者来源于枯草芽孢杆菌lysC基因5’上游的非翻译区；进一步，所述lysC5'-UTR序列包含lysC基因起始密码子ATG上游的-95到-332的237个碱基。当然，lysC5'-UTR序列也可以是包含该237bp序列的截短序列，该截短序列可以完成对赖氨酸的响应分子开关的功能。所谓对赖氨酸的响应指的是当赖氨酸浓度低时，其后续的蛋白可以表达，当赖氨酸浓度高时，其后续的蛋白表达受到抑制。优选地，所述lysC5'-UTR序列来源于枯草芽孢杆菌lysC基因起始密码子ATG上游的332个碱基序列。

所述第二启动子是诱导型启动子或组成型启动子；又进一步，所述第二启动子是诱导型启动子，所述第一启动子也是诱导型启动子，所述第一启动子和所述第二启动子是不同系列的诱导型启动子。所谓同系列启动子指的是受相同诱导剂影响表达的启动子，如lac启动子和tac启动子会受到IPTG的诱导调控，则不能同时使用在本发明中。在本发明的一个实施例中，所述第一启动子优选是tac启动子，所述第二启动子优选是阻遏蛋白lacI的启动子。

所述目的基因是目的蛋白基因；优选地，所述目的蛋白基因是单个蛋白基因或多个串联表达的蛋白基因；又优选地，所述目的基因是编码多肽的聚核苷酸，或者所述目的基因是编码多肽的聚核苷酸及mRFP基因的串联表达基因。或者所述目的基因是标记基因。

更进一步，所述的多肽包括蛋白质、酶或多肽类药物；优选地，所述的酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种，所述多肽类药物是激素、抗体和生长因子中的至少一种，所述蛋白质是赖氨酸转运蛋白；又优选地，所述裂合酶包括脱羧酶，更优选地，所述脱羧酶包括氨基酸脱羧酶，如赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。又更优选地，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段。

本发明的第二方面目的在于提出一种转化子，所述转化子包括如上任一技术方案所述重组表达质粒。

所述转化子的重组表达质粒中，所述目的蛋白基因是编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸或者所述目的蛋白基因是编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸及mRFP基因的串联表达基因；优选地，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段。

所述转化子的宿主菌为蜂房哈夫尼菌或大肠杆菌；进一步，所述蜂房哈夫尼菌是无内源性质粒的蜂房哈夫尼菌或者有内源性质粒的蜂房哈夫尼菌，所述大肠杆菌是无内源性质粒的大肠杆菌或者有内源性质粒的大肠杆菌。

一种转化子，包括：

第一启动子；

目的基因；

对赖氨酸响应的抑制型分子开关；

所述第一启动子控制所述目的基因的表达；

其特征在于，还包括：

第二启动子；

更进一步，所述的多肽包括酶或多肽类药物；优选地，所述的酶包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种，所述多肽类药物包括激素、抗体和生长因子中的至少一种，所述蛋白质是赖氨酸转运蛋白；又优选地，所述裂合酶包括脱羧酶；更优选地，所述脱羧酶包括氨基酸脱羧酶，如赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。又更优选地，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段。

本发明的第三方面提出了一种发酵生产多肽的方法，该发酵生产多肽的方法包括以下步骤：A)培养如上文任一项技术方案所述的转化子；

B)从步骤A)中得到的菌液或菌体中得到多肽。

进一步，所述的一种发酵生产多肽的方法，是发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：

1)培养如上文任一项技术方案所述的转化子(当然，所述技术方案中所述多肽包括赖氨酸脱羧酶)；

2)从步骤1)中得到的菌液或菌体中得到赖氨酸脱羧酶。

本发明的第四方面提出了一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：

I)培养如上文任一项技术方案所述的转化子(当然，所述技术方案中所述多肽包括赖氨酸脱羧酶)，所述转化子的宿主菌能产生赖氨酸；

II)获得戊二胺。

本发明涉及一种利用赖氨酸作为诱导剂控制蛋白表达的新方法。主要是利用一个对赖氨酸浓度敏感的RNA序列和对启动子具有阻碍作用的蛋白序列。本发明所涉及的转化子可以在产赖氨酸的菌株中无需外源性的化合物对目标蛋白进行有针对性的表达调控，也可以在不产赖氨酸的菌株中通过添加廉价的赖氨酸进行目标蛋白的表达调控。本发明的转化子在两种情况下使用有两种不同的价值，当在不产赖氨酸菌株中使用时，该转化子可以利用其诱导剂廉价的特点占据优势，当在产赖氨酸菌株中使用时，该***则可以根据代谢物赖氨酸的多少动态地控制蛋白的表达量。

以下实施例中提到的PCR扩增、纯化、质粒提取、酶切、酶切产物连接等的具体步骤、条件参数等均按所购相关酶和试剂的说明书建议的条件进行。其中PCR扩增所用的DNA聚合酶、酶切所用的内切酶、酶切产物连接所用的连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司。质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒均购自康宁生命科学(吴江)有限公司，商标Axygen，引物均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，商标INVITROGEN。

质粒转化：将10ul的连接产物或2μl的质粒加入至100ul的BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴20min后在42℃中热激90s。冰上孵育5min后加入1ml的LB培养基。涂布至相对应的抗性平板上。

OD600测量方法：将3ml的未培养细胞的培养基加入到1cm宽的比色皿中，在UV-8000紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)中600nm下吸收光(ABS)校零。将比色皿洗净晾干后加入2.9ml未培养细菌的培养基，加入0.1ml的发酵液混匀后在UV-8000紫外可见分光光度计中测试600nm下的吸收光值。仪器显示数值乘以30即为发酵液的OD600。

实施例1

1.1载体构建

以质粒pGEX-4T-1(购自北京天恩泽基因科技有限公司)为模板，引物4-1F(序列如SEQ ID NO：1所示)和4-1R(序列如SEQ ID NO：2所示)扩增出tac启动子(下称目标片段1)，PCR产物用XbaI和NcoI酶切，割胶回收目标片段1。以质粒pET30(购自北京天恩泽基因科技有限公司)为模板，引物4-2F(序列如SEQ ID NO：3所示)和4-2R(序列如SEQ ID NO：4所示)扩增出除T7启动子部分的片段(下称目标片段2)，PCR用XbaI和NcoI酶切，割胶回收目标片段2。将目标片段1和目标片段2用T4连接酶连接后得到质粒pETac。以pETac为模板，引物4-3F(序列如SEQ ID NO：5所示)和4-3R(序列如SEQ ID NO：6所示)扩增出目标片段3并用NdeI和BglII酶切，回收得到目标片段3。以枯草芽孢杆菌基因组作为模板，用引物4-4F(序列如SEQ ID NO：7所示)和4-4R(序列如SEQ ID NO：8所示)扩出lysC基因上游的332个碱基，lysC5’UTR序列，用NdeI和BglII酶切，回收得到目标片段4。将目标片段3和目标片段4连接，得到质粒pETacLYS(序列如SEQ ID NO：9所示)，参见图1。通过全合成的方法合成mRFP基因，在基因上游加入BamHI位点，在基因下游加入SacI位点，将合成的mRFP序列经BamHI和SacI酶切后***到pETacLYS质粒的BamHI和SacI位点之间，得到质粒pTLR(序列如SEQ ID NO：10所示)，参见图2。以大肠杆菌MG1655K12(购自北京天恩泽基因科技有限公司)基因组为模板，引物4-5F(序列如SEQ ID NO：11所示)和4-5R(序列如SEQ ID NO：12所示)扩增出赖氨酸脱羧酶基因，在引物4-5F上加入了RBS序列(序列如SEQ ID NO：13所示)，PCR产物用SacI和SalI酶切，***到质粒pTLR的SacI和SalI位点之间，得到质粒pTLRA(序列如SEQ ID NO：14所示)，参见图3。

1.2赖氨酸诱导表达mRFP

将质粒pTLR转化到大肠杆菌JM109(购自北京博迈德基因技术有限公司)中，得到大肠杆菌JMTLR。将大肠杆菌JMTLR接种到5ml含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和转速为220rpm的摇床(购自上海世平实验设备有限公司，标准型大容量恒温培养摇床，型号SPH-211B，下同)中过夜培养后以2v/v％的转接量转接到新的200ml含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中继续在37℃和转速为220rpm的摇床中培养，当培养到细胞OD₆₀₀达到0.8时，将菌液分装到空的试管中，每根试管分装5ml。然后在各管中加入灭菌过的赖氨酸，使赖氨酸最终浓度分别达到0g/L，10g/L，30g/L，50g/L，70g/L，做四个重复。加入赖氨酸后，各试管均在37℃和转速为220rpm的摇床中继续培养。当培养到OD₆₀₀达到2.0时，取100ul的菌液进行荧光检测。发现，在不添加赖氨酸的发酵液中，没有检测到荧光值，同样的，在其自然沉降的菌体中也未观察到mRFP的玫红色，而在添加赖氨酸的试管中，均能从自然沉降的菌体中观察到mRFP的玫红色(参见图4)，说明通过添加赖氨酸可以诱导目标蛋白的表达。另外从沉降下来的菌体中可以发现，随着赖氨酸浓度的增加，菌体的玫红色逐渐加深，对应的，其荧光值也逐渐增加(参见图5)，这说明通过改变赖氨酸的浓度可以调节目的蛋白的表达量。

1.3表达与赖氨酸代谢相关的酶

赖氨酸脱羧酶CadA可以将赖氨酸上的alpha羧基脱去，得到二元胺—戊二胺。将质粒pTLRA转化到大肠杆菌JM109中，得到重组菌株JMTLRA。将大肠杆菌JMTLRA接种到5ml含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和转速为220rpm的摇床中过夜培养后以2v/v％的转接量转接到新的200ml含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中继续在37℃和转速为220rpm的摇床中培养，当培养到细胞OD₆₀₀达到0.8时，加入70g/L的赖氨酸，继续培养并测发酵液各个时间段的赖氨酸、戊二胺及荧光值得变化，直至赖氨酸含量降至1g/L以下。再次加入50g/L的赖氨酸，继续培养并测发酵液各个时间段的赖氨酸、戊二胺及荧光值得变化。参见图6，从结果可以看出，当未添加赖氨酸之前，菌液中的荧光值是没有的，说明在未添加赖氨酸之前，lysC5’UTR控制的基因是没有表达的。当添加赖氨酸后，荧光值增加，说明赖氨酸开始诱导mRFP的表达，因为CadA与mRFP是串联表达，所以CadA也开始表达。随着CadA的表达，赖氨酸被脱羧形成戊二胺，因此在发酵液中赖氨酸的含量逐渐减少直至无，而戊二胺的含量逐渐增加到一个稳定的值，而发酵液中的荧光值，在加入赖氨酸后的前几个小时内以非常快的速度增加，在后几个小时，荧光值仍在增加但是增速不及之前，其中的原因应该是随着赖氨酸被CadA的消耗，其诱导分子开关lysC5’UTR处于开的状态的能力逐渐增强，阻遏蛋白表达量增强，导致诱导表达的强度开始减弱，因此增速放慢，而其中荧光值没有因为mRFP表达量减少而减少是因为mRFP没有能在短时间内快速降解有关。随着第二次赖氨酸的加入，分子开关又处于关闭状态，阻遏蛋白lacI表达受到抑制，因此CadA和mRFP进入表达状态，mRFP的荧光值快速增加。赖氨酸和戊二胺分别进入快速消耗和快速增加的阶段，直到赖氨酸被消耗完，戊二胺不再增加，同时因为表达***的关闭，mRFP不再增加。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司

凯赛生物产业有限公司

<120> 一种基于赖氨酸浓度控制的重组表达质粒、转化子及其应用

<130> PA16012

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 4-1F

<400> 1

gggggtctag acgatactgt cgtcgtccc 29

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 4-1R

<400> 2

ccatgggaat actgtttcct gtgtg 25

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 4-2F

<400> 3

gggtctagac gatctcgatc ctctacgcc 29

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 4-2R

<400> 4

gaaaccgctg ctgctaaa 18

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 4-3F

<400> 5

ccccccatat ggtgaaacca gtaacgttat acga 34

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 4-3R

<400> 6

ccccccagat ctcgggcgct atcatg 26

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 4-4F

<400> 7

ggggagatct aatttcatag ttagatcgtg 30

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 4-4R

<400> 8

ccccatatgt attaaccacc ctttaca 27

<210> 9

<211> 5967

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Plasmid pETacLYS

<220>

<221> CDS

<222> (5)..(1084)

<223> lacI

<220>

<221> rep_origin

<222> (2518)..(2518)

<223> ColE1 pBR322

<220>

<221> CDS

<222> (3227)..(4039)

<223> kan sequence

<220>

<221> rep_origin

<222> (4135)..(4590)

<223> f1 origin

<220>

<221> terminator

<222> (4627)..(4673)

<223> T7 terminator

<220>

<221> protein_bind

<222> (4839)..(4859)

<223> RBS

<220>

<221> promoter

<222> (4865)..(4893)

<223> tac promoter

<220>

<221> misc_feature

<222> (5635)..(5966)

<223> lysC5UTR

<400> 9

tatggtgaaa ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct cttatcagac 60

cgtttcccgc gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg aaaaagtgga 120

agcggcgatg gcggagctga attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac tggcgggcaa 180

acagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc cgtcgcaaat 240

tgtcgcggcg attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg tgtcgatggt 300

agaacgaagc ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg cgcaacgcgt 360

cagtgggctg atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg tggaagctgc 420

ctgcactaat gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac cagacaccca tcaacagtat 480

tattttctcc catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg cattgggtca 540

ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc tgcgtctggc 600

tggctggcat aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac gggaaggcga 660

ctggagtgcc atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg gcatcgttcc 720

cactgcgatg ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg ccattaccga 780

gtccgggctg cgcgttggtg cggacatctc ggtagtggga tacgacgata ccgaagacag 840

ctcatgttat atcccgccgt taaccaccat caaacaggat tttcgcctgc tggggcaaac 900

cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca atcagctgtt 960

gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc 1020

ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg 1080

gcagtgagcg caacgcaatt aatgtaagtt agctcactca ttaggcaccg ggatctcgac 1140

cgatgccctt gagagccttc aacccagtca gctccttccg gtgggcgcgg ggcatgacta 1200

tcgtcgccgc acttatgact gtcttcttta tcatgcaact cgtaggacag gtgccggcag 1260

cgctctgggt cattttcggc gaggaccgct ttcgctggag cgcgacgatg atcggcctgt 1320

cgcttgcggt attcggaatc ttgcacgccc tcgctcaagc cttcgtcact ggtcccgcca 1380

ccaaacgttt cggcgagaag caggccatta tcgccggcat ggcggcccca cgggtgcgca 1440

tgatcgtgct cctgtcgttg aggacccggc taggctggcg gggttgcctt actggttagc 1500

agaatgaatc accgatacgc gagcgaacgt gaagcgactg ctgctgcaaa acgtctgcga 1560

cctgagcaac aacatgaatg gtcttcggtt tccgtgtttc gtaaagtctg gaaacgcgga 1620

agtcagcgcc ctgcaccatt atgttccgga tctgcatcgc aggatgctgc tggctaccct 1680

gtggaacacc tacatctgta ttaacgaagc gctggcattg accctgagtg atttttctct 1740

ggtcccgccg catccatacc gccagttgtt taccctcaca acgttccagt aaccgggcat 1800

gttcatcatc agtaacccgt atcgtgagca tcctctctcg tttcatcggt atcattaccc 1860

ccatgaacag aaatccccct tacacggagg catcagtgac caaacaggaa aaaaccgccc 1920

ttaacatggc ccgctttatc agaagccaga cattaacgct tctggagaaa ctcaacgagc 1980

tggacgcgga tgaacaggca gacatctgtg aatcgcttca cgaccacgct gatgagcttt 2040

accgcagctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc 2100

cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg 2160

cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg 2220

gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat 2280

atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc 2340

gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 2400

cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 2460

tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 2520

cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 2580

aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 2640

cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 2700

gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 2760

ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 2820

cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 2880

aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 2940

tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 3000

ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 3060

tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 3120

ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 3180

aacaataaaa ctgtctgctt acataaacag taatacaagg ggtgttatga gccatattca 3240

acgggaaacg tcttgctcta ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg atttatatgg 3300

gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc gattgtatgg 3360

gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt 3420

tacagatgag atggtcagac taaactggct gacggaattt atgcctcttc cgaccatcaa 3480

gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc ccgggaaaac 3540

agcattccag gtattagaag aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg atgcgctggc 3600

agtgttcctg cgccggttgc attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta acagcgatcg 3660

cgtatttcgt ctcgctcagg cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg atgcgagtga 3720

ttttgatgac gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa tgcataaact 3780

tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat 3840

ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg 3900

ataccaggat cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa 3960

acggcttttt caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt 4020

gatgctcgat gagtttttct aagaattaat tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt 4080

agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgaaattg 4140

taaacgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta 4200

accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt 4260

tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca 4320

aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca ccctaatcaa 4380

gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat 4440

ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag 4500

gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg 4560

ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt cccattcgcc aatccggata tagttcctcc 4620

tttcagcaaa aaacccctca agacccgttt agaggcccca aggggttatg ctagttattg 4680

ctcagcggtg gcagcagcca actcagcttc ctttcgggct ttgttagcag ccggatctca 4740

gtggtggtgg tggtggtgct cgagtgcggc cgcaagcttg tcgacggagc tcgaattcgg 4800

atccgatatc agccatggga atactgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc 4860

cacacattat acgagccgat gattaattgt caacagctca tttcagaata tttgccagaa 4920

ccgttatgat gtcggcgcaa aaaacattat ccagaacggg agtgcgcctt gagcgacacg 4980

aattatgcag tgatttacga cctgcacagc cataccacag cttccgatgg ctgcctgacg 5040

ccagaagcat tggtgcaccg tgcagtcgat aacgtaattc caacgccatc aaaaataatt 5100

cgcgtctggc cttcctgtag ccagctttca tcaacattaa atgtgagcga gtaacaaccc 5160

gtcggattct ccgtgggaac aaacggcgga ttgaccgtaa tgggataggt tacgttggtg 5220

tagatgggcg catcgtaacc gtgcatctgc cagtttgagg ggacgacgac agtatcgtct 5280

agacgatctc gatcctctac gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc gccacaggtg 5340

cggttgctgg cgcctatatc gccgacatca ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg 5400

ggctcatgag cgcttgtttc ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc gggggactgt 5460

tgggcgccat ctccttgcat gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc 5520

tactactggg ctgcttccta atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga gatcccggac 5580

accatcgaat ggcgcaaaac ctttcgcggt atggcatgat agcgcccgag atctaatttc 5640

atagttagat cgtgttatat ggtgaagata gaggtgcgaa cttcaagagt atgcctttgg 5700

agaaagatgg attctgtgaa aaaggctgaa aggggagcgt cgccgaagca aataaaaccc 5760

catcggtatt atttgctggc cgtgcattga ataaatgtaa ggctgtcaag aaatcatttt 5820

cttggagggc tatctcgttg ttcataatca tttatgatga ttaattgata agcaatgaga 5880

gtattcctct cattgctttt tttattgtgg acaaagcgct ctttctcctc accggcacga 5940

accaaaatgt aaagggtggt taataca 5967

<210> 10

<211> 6672

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Plasmid pTLR

<220>

<221> protein_bind

<222> (40)..(60)

<223> RBS

<220>

<221> promoter

<222> (66)..(94)

<223> tac promoter

<220>

<221> misc_feature

<222> (836)..(1167)

<223> lysC5'UTR

<220>

<221> CDS

<222> (1173)..(2252)

<223> lac I

<220>

<221> rep_origin

<222> (3686)..(3686)

<223> ColE1 pBR322

<220>

<221> CDS

<222> (4395)..(5207)

<223> kan sequence

<220>

<221> rep_origin

<222> (5303)..(5758)

<223> f1 origin

<220>

<221> terminator

<222> (5795)..(5841)

<223> T7 terminator

<220>

<221> misc_feature

<222> (5961)..(6671)

<223> Mcherry RFP

<400> 10

gatccgatat cagccatggg aatactgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 60

ccacacatta tacgagccga tgattaattg tcaacagctc atttcagaat atttgccaga 120

accgttatga tgtcggcgca aaaaacatta tccagaacgg gagtgcgcct tgagcgacac 180

gaattatgca gtgatttacg acctgcacag ccataccaca gcttccgatg gctgcctgac 240

gccagaagca ttggtgcacc gtgcagtcga taacgtaatt ccaacgccat caaaaataat 300

tcgcgtctgg ccttcctgta gccagctttc atcaacatta aatgtgagcg agtaacaacc 360

cgtcggattc tccgtgggaa caaacggcgg attgaccgta atgggatagg ttacgttggt 420

gtagatgggc gcatcgtaac cgtgcatctg ccagtttgag gggacgacga cagtatcgtc 480

tagacgatct cgatcctcta cgccggacgc atcgtggccg gcatcaccgg cgccacaggt 540

gcggttgctg gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc 600

gggctcatga gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc cgggggactg 660

ttgggcgcca tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgctcaa cggcctcaac 720

ctactactgg gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg gagagcgtcg agatcccgga 780

caccatcgaa tggcgcaaaa cctttcgcgg tatggcatga tagcgcccga gatctaattt 840

catagttaga tcgtgttata tggtgaagat agaggtgcga acttcaagag tatgcctttg 900

gagaaagatg gattctgtga aaaaggctga aaggggagcg tcgccgaagc aaataaaacc 960

ccatcggtat tatttgctgg ccgtgcattg aataaatgta aggctgtcaa gaaatcattt 1020

tcttggaggg ctatctcgtt gttcataatc atttatgatg attaattgat aagcaatgag 1080

agtattcctc tcattgcttt ttttattgtg gacaaagcgc tctttctcct caccggcacg 1140

aaccaaaatg taaagggtgg ttaatacata tggtgaaacc agtaacgtta tacgatgtcg 1200

cagagtatgc cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt ggtgaaccag gccagccacg 1260

tttctgcgaa aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc ggagctgaat tacattccca 1320

accgcgtggc acaacaactg gcgggcaaac agtcgttgct gattggcgtt gccacctcca 1380

gtctggccct gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat taaatctcgc gccgatcaac 1440

tgggtgccag cgtggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg cgtcgaagcc tgtaaagcgg 1500

cggtgcacaa tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat cattaactat ccgctggatg 1560

accaggatgc cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt tccggcgtta tttcttgatg 1620

tctctgacca gacacccatc aacagtatta ttttctccca tgaagacggt acgcgactgg 1680

gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc agcaaatcgc gctgttagcg ggcccattaa 1740

gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa atatctcact cgcaatcaaa 1800

ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat gtccggtttt caacaaacca 1860

tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct ggttgccaac gatcagatgg 1920

cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg cgttggtgcg gacatctcgg 1980

tagtgggata cgacgatacc gaagacagct catgttatat cccgccgtta accaccatca 2040

aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg cttgctgcaa ctctctcagg 2100

gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact ggtgaaaaga aaaaccaccc 2160

tggcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg 2220

cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtaagttag 2280

ctcactcatt aggcaccggg atctcgaccg atgcccttga gagccttcaa cccagtcagc 2340

tccttccggt gggcgcgggg catgactatc gtcgccgcac ttatgactgt cttctttatc 2400

atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg ctctgggtca ttttcggcga ggaccgcttt 2460

cgctggagcg cgacgatgat cggcctgtcg cttgcggtat tcggaatctt gcacgccctc 2520

gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc aaacgtttcg gcgagaagca ggccattatc 2580

gccggcatgg cggccccacg ggtgcgcatg atcgtgctcc tgtcgttgag gacccggcta 2640

ggctggcggg gttgccttac tggttagcag aatgaatcac cgatacgcga gcgaacgtga 2700

agcgactgct gctgcaaaac gtctgcgacc tgagcaacaa catgaatggt cttcggtttc 2760

cgtgtttcgt aaagtctgga aacgcggaag tcagcgccct gcaccattat gttccggatc 2820

tgcatcgcag gatgctgctg gctaccctgt ggaacaccta catctgtatt aacgaagcgc 2880

tggcattgac cctgagtgat ttttctctgg tcccgccgca tccataccgc cagttgttta 2940

ccctcacaac gttccagtaa ccgggcatgt tcatcatcag taacccgtat cgtgagcatc 3000

ctctctcgtt tcatcggtat cattaccccc atgaacagaa atccccctta cacggaggca 3060

tcagtgacca aacaggaaaa aaccgccctt aacatggccc gctttatcag aagccagaca 3120

ttaacgcttc tggagaaact caacgagctg gacgcggatg aacaggcaga catctgtgaa 3180

tcgcttcacg accacgctga tgagctttac cgcagctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac 3240

ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat 3300

gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca 3360

gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag 3420

agcagattgt actgagagtg caccatatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag 3480

gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 3540

cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 3600

atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 3660

taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 3720

aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 3780

tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 3840

gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 3900

cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 3960

cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 4020

atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 4080

tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat 4140

ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 4200

acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 4260

aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 4320

aaactcacgt taagggattt tggtcatgaa caataaaact gtctgcttac ataaacagta 4380

atacaagggg tgttatgagc catattcaac gggaaacgtc ttgctctagg ccgcgattaa 4440

attccaacat ggatgctgat ttatatgggt ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat 4500

caggtgcgac aatctatcga ttgtatggga agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac 4560

atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta cagatgagat ggtcagacta aactggctga 4620

cggaatttat gcctcttccg accatcaagc attttatccg tactcctgat gatgcatggt 4680

tactcaccac tgcgatcccc gggaaaacag cattccaggt attagaagaa tatcctgatt 4740

caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg 4800

tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa 4860

tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg 4920

aacaagtctg gaaagaaatg cataaacttt tgccattctc accggattca gtcgtcactc 4980

atggtgattt ctcacttgat aaccttattt ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg 5040

atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat accaggatct tgccatccta tggaactgcc 5100

tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac ggctttttca aaaatatggt attgataatc 5160

ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga tgctcgatga gtttttctaa gaattaattc 5220

atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca 5280

tttccccgaa aagtgccacc tgaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta 5340

aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat 5400

aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca 5460

ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc 5520

ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta 5580

aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg 5640

gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg 5700

gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc 5760

cattcgccaa tccggatata gttcctcctt tcagcaaaaa acccctcaag acccgtttag 5820

aggccccaag gggttatgct agttattgct cagcggtggc agcagccaac tcagcttcct 5880

ttcgggcttt gttagcagcc ggatctcagt ggtggtggtg gtggtgctcg agtgcggccg 5940

caagcttgtc gacggagctc ttatttatac agttcatcca ttccgcccgt gctatgccgt 6000

ccctccgcac gctcatactg ttccacaatg gtataatctt cattatggct ggtaatatcc 6060

agcttaatgt tcacattata agcgcctggt aactgcaccg gttttttcgc tttataggtg 6120

gttttcactt ccgcatcata gtgcccacca tcttttaact tcagacgctg cttaatttcg 6180

cccttcagcg cgccatcctc cgggtacata cgttcgctgc tcgcctccca gcccatggtc 6240

tttttctgca tcaccgggcc atcgctggga aagttggtgc cacgcagctt caccttgtaa 6300

atgaattcgc cgtcttgcag gctgctatcc tgggtcacgg tcaccacgcc gccatcttca 6360

aaattcatca cacgttccca tttgaagccc tccggaaagc tcagtttcag ataatccgga 6420

atatccgccg gatgtttcac atacgctttg ctgccataca taaactgcgg gctcagaatg 6480

tcccacgcaa acggcagtgg tccgcctttg gtcactttca gtttagcggt ctgggtgcct 6540

tcatacggac ggccttctcc ttcgccttca atttcaaact catgcccatt cacgctgcct 6600

tccatatgca ctttaaaacg cataaattct ttgataatcg ccatattatc ttcctcgcct 6660

ttagacacca tg 6672

<210> 11

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 4-5F

<400> 11

gggggagctc aagaaggaga tatacatatg atgaacgtta ttgcaatatt gaatcac 57

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 4-5R

<400> 12

ccccccgtcg acttattttt tgctttcttc tt 32

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RBS

<400> 13

aagaaggaga tatacatatg 20

<210> 14

<211> 8839

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Plasmid pTLRA

<220>

<221> CDS

<222> (22)..(2169)

<223> CadA

<220>

<221> terminator

<222> (2282)..(2328)

<223> T7\terminator

<220>

<221> rep_origin

<222> (2365)..(2820)

<223> f1\origin

<220>

<221> rep_origin

<222> (4437)..(4437)

<223> ColE1\pBR322

<220>

<221> CDS

<222> (5871)..(6950)

<223> lac\I

<220>

<221> misc_feature

<222> (6956)..(7287)

<223> lysC5UTR

<220>

<221> promoter

<222> (8029)..(8057)

<223> tac\promoter

<220>

<221> protein_bind

<222> (8063)..(8083)

<223> RBS

<220>

<221> misc_feature

<222> (8124)..(8834)

<223> Mcherry\RFP

<400> 14

caagaaggag atatacatat gatgaacgtt attgcaatat tgaatcacat gggggtttat 60

tttaaagaag aacccatccg tgaacttcat cgcgcgcttg aacgtctgaa cttccagatt 120

gtttacccga acgaccgtga cgacttatta aaactgatcg aaaacaatgc gcgtctgtgc 180

ggcgttattt ttgactggga taaatataat ctcgagctgt gcgaagaaat tagcaaaatg 240

aacgagaacc tgccgttgta cgcgttcgct aatacgtatt ccactctcga tgtaagcctg 300

aatgacctgc gtttacagat tagcttcttt gaatatgcgc tgggtgctgc tgaagatatt 360

gctaataaga tcaagcagac cactgacgaa tatatcaaca ctattctgcc tccgctgact 420

aaagcactgt ttaaatatgt tcgtgaaggt aaatatactt tctgtactcc tggtcacatg 480

ggcggtactg cattccagaa aagcccggta ggtagcctgt tctatgattt ctttggtccg 540

aataccatga aatctgatat ttccatttca gtatctgaac tgggttctct gctggatcac 600

agtggtccac acaaagaagc agaacagtat atcgctcgcg tctttaacgc agaccgcagc 660

tacatggtga ccaacggtac ttccactgcg aacaaaattg ttggtatgta ctctgctcca 720

gcaggcagca ccattctgat tgaccgtaac tgccacaaat cgctgaccca cctgatgatg 780

atgagcgatg ttacgccaat ctatttccgc ccgacccgta acgcttacgg tattcttggt 840

ggtatcccac agagtgaatt ccagcacgct accattgcta agcgcgtgaa agaaacacca 900

aacgcaacct ggccggtaca tgctgtaatt accaactcta cctatgatgg tctgctgtac 960

aacaccgact tcatcaagaa aacactggat gtgaaatcca tccactttga ctccgcgtgg 1020

gtgccttaca ccaacttctc accgatttac gaaggtaaat gcggtatgag cggtggccgt 1080

gtagaaggga aagtgattta cgaaacccag tccactcaca aactgctggc ggcgttctct 1140

caggcttcca tgatccacgt taaaggtgac gtaaacgaag aaacctttaa cgaagcctac 1200

atgatgcaca ccaccacttc tccgcactac ggtatcgtgg cgtccactga aaccgctgcg 1260

gcgatgatga aaggcaatgc aggtaagcgt ctgatcaacg gttctattga acgtgcgatc 1320

aaattccgta aagagatcaa acgtctgaga acggaatctg atggctggtt ctttgatgta 1380

tggcagccgg atcatatcga tacgactgaa tgctggccgc tgcgttctga cagcacctgg 1440

cacggcttca aaaacatcga taacgagcac atgtatcttg acccgatcaa agtcaccctg 1500

ctgactccgg ggatggaaaa agacggcacc atgagcgact ttggtattcc ggccagcatc 1560

gtggcgaaat acctcgacga acatggcatc gttgttgaga aaaccggtcc gtataacctg 1620

ctgttcctgt tcagcatcgg tatcgataag accaaagcac tgagcctgct gcgtgctctg 1680

actgacttta aacgtgcgtt cgacctgaac ctgcgtgtga aaaacatgct gccgtctctg 1740

tatcgtgaag atcctgaatt ctatgaaaac atgcgtattc aggaactggc tcagaatatc 1800

cacaaactga ttgttcacca caatctgccg gatctgatgt atcgcgcatt tgaagtgctg 1860

ccgacgatgg taatgactcc gtatgctgca ttccagaaag agctgcacgg tatgaccgaa 1920

gaagtttacc tcgacgaaat ggtaggtcgt attaacgcca atatgatcct tccgtacccg 1980

ccgggagttc ctctggtaat gccgggtgaa atgatcaccg aagaaagccg tccggttctg 2040

gagttcctgc agatgctgtg tgaaatcggc gctcactatc cgggctttga aaccgatatt 2100

cacggtgcat accgtcaggc tgatggccgc tataccgtta aggtattgaa agaagaaagc 2160

aaaaaataag tcgacaagct tgcggccgca ctcgagcacc accaccacca ccactgagat 2220

ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa 2280

ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga 2340

actatatccg gattggcgaa tgggacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg 2400

tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg 2460

ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg 2520

ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt 2580

agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt 2640

tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta 2700

tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa 2760

atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt 2820

caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac 2880

attcaaatat gtatccgctc atgaattaat tcttagaaaa actcatcgag catcaaatga 2940

aactgcaatt tattcatatc aggattatca ataccatatt tttgaaaaag ccgtttctgt 3000

aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc cataggatgg caagatcctg gtatcggtct 3060

gcgattccga ctcgtccaac atcaatacaa cctattaatt tcccctcgtc aaaaataagg 3120

ttatcaagtg agaaatcacc atgagtgacg actgaatccg gtgagaatgg caaaagttta 3180

tgcatttctt tccagacttg ttcaacaggc cagccattac gctcgtcatc aaaatcactc 3240

gcatcaacca aaccgttatt cattcgtgat tgcgcctgag cgagacgaaa tacgcgatcg 3300

ctgttaaaag gacaattaca aacaggaatc gaatgcaacc ggcgcaggaa cactgccagc 3360

gcatcaacaa tattttcacc tgaatcagga tattcttcta atacctggaa tgctgttttc 3420

ccggggatcg cagtggtgag taaccatgca tcatcaggag tacggataaa atgcttgatg 3480

gtcggaagag gcataaattc cgtcagccag tttagtctga ccatctcatc tgtaacatca 3540

ttggcaacgc tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg gcgcatcggg cttcccatac 3600

aatcgataga ttgtcgcacc tgattgcccg acattatcgc gagcccattt atacccatat 3660

aaatcagcat ccatgttgga atttaatcgc ggcctagagc aagacgtttc ccgttgaata 3720

tggctcataa caccccttgt attactgttt atgtaagcag acagttttat tgttcatgac 3780

caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 3840

aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 3900

accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 3960

aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 4020

ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 4080

agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 4140

accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 4200

gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 4260

tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 4320

cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 4380

cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 4440

cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 4500

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 4560

taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 4620

gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 4680

tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 4740

cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 4800

gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 4860

gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 4920

catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 4980

tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 5040

ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 5100

tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 5160

ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 5220

aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 5280

gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 5340

tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 5400

acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 5460

cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 5520

cccgtggggc cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg 5580

gaccagtgac gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc 5640

cgatcatcgt cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg 5700

gcacctgtcc tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca 5760

tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag 5820

atcccggtgc ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 5880

tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 5940

gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc 6000

tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc 6060

cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct 6120

tcggtatcgt cgtatcccac taccgagatg tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta 6180

atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg 6240

atgccctcat tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct 6300

tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga 6360

cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc 6420

aatgcgacca gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg 6480

ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct 6540

tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt 6600

tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc 6660

gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc 6720

gacggcgcgt gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc 6780

gccagttgtt gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact 6840

ttttcccgcg ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga 6900

taagagacac cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac catatgtatt 6960

aaccaccctt tacattttgg ttcgtgccgg tgaggagaaa gagcgctttg tccacaataa 7020

aaaaagcaat gagaggaata ctctcattgc ttatcaatta atcatcataa atgattatga 7080

acaacgagat agccctccaa gaaaatgatt tcttgacagc cttacattta ttcaatgcac 7140

ggccagcaaa taataccgat ggggttttat ttgcttcggc gacgctcccc tttcagcctt 7200

tttcacagaa tccatctttc tccaaaggca tactcttgaa gttcgcacct ctatcttcac 7260

catataacac gatctaacta tgaaattaga tctcgggcgc tatcatgcca taccgcgaaa 7320

ggttttgcgc cattcgatgg tgtccgggat ctcgacgctc tcccttatgc gactcctgca 7380

ttaggaagca gcccagtagt aggttgaggc cgttgagcac cgccgccgca aggaatggtg 7440

catgcaagga gatggcgccc aacagtcccc cggccacggg gcctgccacc atacccacgc 7500

cgaaacaagc gctcatgagc ccgaagtggc gagcccgatc ttccccatcg gtgatgtcgg 7560

cgatataggc gccagcaacc gcacctgtgg cgccggtgat gccggccacg atgcgtccgg 7620

cgtagaggat cgagatcgtc tagacgatac tgtcgtcgtc ccctcaaact ggcagatgca 7680

cggttacgat gcgcccatct acaccaacgt aacctatccc attacggtca atccgccgtt 7740

tgttcccacg gagaatccga cgggttgtta ctcgctcaca tttaatgttg atgaaagctg 7800

gctacaggaa ggccagacgc gaattatttt tgatggcgtt ggaattacgt tatcgactgc 7860

acggtgcacc aatgcttctg gcgtcaggca gccatcggaa gctgtggtat ggctgtgcag 7920

gtcgtaaatc actgcataat tcgtgtcgct caaggcgcac tcccgttctg gataatgttt 7980

tttgcgccga catcataacg gttctggcaa atattctgaa atgagctgtt gacaattaat 8040

catcggctcg tataatgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagta 8100

ttcccatggc tgatatcgga tccatggtgt ctaaaggcga ggaagataat atggcgatta 8160

tcaaagaatt tatgcgtttt aaagtgcata tggaaggcag cgtgaatggg catgagtttg 8220

aaattgaagg cgaaggagaa ggccgtccgt atgaaggcac ccagaccgct aaactgaaag 8280

tgaccaaagg cggaccactg ccgtttgcgt gggacattct gagcccgcag tttatgtatg 8340

gcagcaaagc gtatgtgaaa catccggcgg atattccgga ttatctgaaa ctgagctttc 8400

cggagggctt caaatgggaa cgtgtgatga attttgaaga tggcggcgtg gtgaccgtga 8460

cccaggatag cagcctgcaa gacggcgaat tcatttacaa ggtgaagctg cgtggcacca 8520

actttcccag cgatggcccg gtgatgcaga aaaagaccat gggctgggag gcgagcagcg 8580

aacgtatgta cccggaggat ggcgcgctga agggcgaaat taagcagcgt ctgaagttaa 8640

aagatggtgg gcactatgat gcggaagtga aaaccaccta taaagcgaaa aaaccggtgc 8700

agttaccagg cgcttataat gtgaacatta agctggatat taccagccat aatgaagatt 8760

ataccattgt ggaacagtat gagcgtgcgg agggacggca tagcacgggc ggaatggatg 8820

aactgtataa ataagagct 8839

Claims

1.一种重组表达质粒，包括：

第一启动子；

目的基因；

对赖氨酸响应的抑制型分子开关；

所述第一启动子控制所述目的基因的表达；

其特征在于，还包括：

第二启动子；

所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关位于所述第二启动子和所述第一启动子的阻遏蛋白基因之间，或者所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关位于所述第二启动子和所述编码阻遏所述目的基因表达的小分子RNA的聚核苷酸序列之间；

所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关为lysC5’-UTR序列

2.如权利要求1所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述第二启动子和所述第一启动子的阻遏蛋白基因之间用lysC5’-UTR序列连接。

3.如权利要求1所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述第一启动子是lac、tac和trc启动子中的一种，所述第一启动子的阻遏蛋白基因是阻遏蛋白lacI基因；或者，所述第一启动子是araB启动子，所述第一启动子的阻遏蛋白基因是阻遏蛋白araC基因；

或者，所述第一启动子是tet启动子，所述第一启动子的阻遏蛋白基因是阻遏蛋白TetR基因。

4.如权利要求1-3任一项所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述lysC5’-UTR序列来源于大肠杆菌(Escherichia coli)lysC基因5’上游的非翻译区，或者来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)lysC基因5’上游的非翻译区。

5.如权利要求1所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述第二启动子是诱导型启动子或组成型启动子。

6.如权利要求5所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述第二启动子是诱导型启动子，所述第一启动子也是诱导型启动子，所述第一启动子和所述第二启动子是不同系列的诱导型启动子。

7.如权利要求1所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述目的基因是目的蛋白基因。

8.如权利要求7所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述目的蛋白基因是单个蛋白基因或多个串联表达的蛋白基因。

9.如权利要求7所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述目的基因是编码多肽的聚核苷酸，或者所述目的基因是编码多肽的聚核苷酸及标记基因的串联表达基因，或者所述目的基因是标记基因。

10.如权利要求9所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述标记基因包括荧光蛋白标记基因。

11.如权利要求10所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述荧光蛋白标记基因包括RFP、GFP、YFP及它们的变种中的至少一种。

12.如权利要求9所述的一种重组表达质粒，其特征在于：所述的多肽是酶或多肽类药物。

13.如权利要求12所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述的酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种，所述多肽类药物是激素、抗体和生长因子中的至少一种。

14.如权利要求13所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述裂合酶是脱羧酶。

15.如权利要求14所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述脱羧酶是氨基酸脱羧酶。

16.如权利要求15所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述氨基酸脱羧酶选自赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。

17.如权利要求9所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述多肽是转运蛋白LysE。

18.根据权利要求9所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述编码多肽的聚核苷酸是编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸。

19.根据权利要求18所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸是cadA基因、ldcC基因或haldc基因。

20.根据权利要求18所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸是cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段。

21.一种转化子，包括：

第一启动子；

目的基因；

对赖氨酸响应的抑制型分子开关；

所述第一启动子控制所述目的基因的表达；

其特征在于，还包括：

第二启动子；

所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关为lysC5’-UTR序列

22.如权利要求21所述的一种转化子，其特征在于：

所述第一启动子、所述目的基因、所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关、所述第二启动子和所述第一启动子的阻遏蛋白基因位于同一质粒上；或者，

所述第一启动子、所述目的基因、所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关、所述第二启动子和所述第一启动子的阻遏蛋白基因位于宿主菌基因组中；或者，

所述第一启动子和所述目的基因位于第一质粒上，所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关、所述第二启动子和所述第一启动子的阻遏蛋白基因位于第二质粒上；或者，

所述第一启动子和所述目的基因位于质粒上，所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关、所述第二启动子和所述第一启动子的阻遏蛋白基因位于宿主菌基因组中；或者，

所述第一启动子和所述目的基因位于宿主菌基因组中，所述对赖氨酸响应的抑制型分子开关、所述第二启动子和所述第一启动子的阻遏蛋白基因位于质粒上。

23.一种转化子，其特征在于，所述转化子包括如权利要求1-20任一项所述的重组表达质粒。

24.如权利要求23所述的转化子，其特征在于，所述转化子包括如权利要求18至20中任一项所述的重组表达质粒，所述转化子的宿主菌为蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)或大肠杆菌。

25.如权利要求24所述的转化子，其特征在于，所述蜂房哈夫尼菌是无内源性质粒的蜂房哈夫尼菌或者有内源性质粒的蜂房哈夫尼菌，所述大肠杆菌是无内源性质粒的大肠杆菌或者有内源性质粒的大肠杆菌。

26.一种发酵生产重组多肽产物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)培养权利要求23-25任一项所述的转化子；

B)从步骤A)中得到的菌液或菌体中得到重组多肽产物。

27.如权利要求26所述的一种发酵生产重组多肽产物的方法，其特征在于，是发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：

1)培养如权利要求24-25任一项所述的转化子；

2)从步骤1)中得到的菌液或菌体中得到赖氨酸脱羧酶。

28.一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：

培养如权利要求24-25任一项所述的转化子，所述转化子的宿主菌能产生赖氨酸，所述赖氨酸经脱羧获得戊二胺。