CN108450463A - 法尼醇对***类杀菌剂在防治黑粉病中的增效应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了法尼醇与***类杀菌剂在防治由孢堆黑粉菌属（Sporisorium）和黑粉菌属（Ustilago）引起的甘蔗黑粉病、玉米黑粉病及其他作物的黑粉病等的杀菌增效新用途。法尼醇与***类杀菌剂具有明显的协同增效作用，能大幅减少化学农药的使用量，防治效果明显优于单个药剂使用，具有很好的应用前景。

Description

法尼醇对***类杀菌剂在防治黑粉病中的增效应用

技术领域

本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及法尼醇和***类杀菌剂的增效作用，主要应用于防治甘蔗黑粉病和玉米黑粉病以及由孢堆黑粉菌属（sporisorium）和黑粉菌属（Ustilago）引起的其他作物黑粉病等。

背景技术

甘蔗是我国制糖业的主要原料，玉米则是主要的粮食作物，它们同时也是重要的饲料作物和生物质能源材料。病害侵染是一直以来困扰其发展的严重问题。

甘蔗黑粉病是由孢堆黑粉菌属（sporisorium）侵染所致。玉米黑粉病是由黑粉菌属（Ustilago）侵染所致。这两种病原菌是两型真菌，也属于半专型寄生菌，单倍体不发病，通过有性配合形成双核菌丝体侵染甘蔗和玉米或其他植物，致使作物产量下降，品质降低。

法尼醇（Farnesol）是一类从植物或微生物中提取的天然产物，对环境友好，安全无毒，也称合金欢醇、3,7,11-三甲基-2,6,10-十二烷三烯-1-醇，结构式如下：

。

法尼醇同分异构体主要分为反-反式、反-顺式、顺-反式和顺-顺式，各类研究揭示法尼醇（Farnesol）能够调节细菌、真菌等微生物的生长增殖活动。

目前，防治甘蔗黑粉病和玉米黑粉病采用的措施包括选育抗病品种和化学防治。***类杀菌剂是一类广谱、高效、内吸输导性强杀菌剂，己唑醇和苯醚甲环唑是***类杀菌剂的两个代表性品种，是目前防治对黑粉菌的主要化学药剂，有着较好的防治效果。但是因其在水体和土壤中滞留期较长，农药残留严重易造成环境污染。这也为降低药剂田间用量，而开发增效剂得作用尤为突出。

发明内容

本发明的目的在于提供法尼醇在防治黑粉病病原菌的新用途。

本发明的目的通过以下技术方案来予以实现:

本发明提供法尼醇在***类杀菌剂防治黑粉病中的增效作用中的应用；所述黑粉病主要包括甘蔗黑粉病、玉米黑粉病和由孢堆黑粉菌属和黑粉菌属引起的其他作物黑粉病。

所述的应用，具体地，所述黑粉病是甘蔗黑粉病和玉米黑粉病。

所述法尼醇的使用浓度为0.01～1μM，优选为0.04～0.5μM，与***类杀菌剂混配使用，以增加防治效果。

所述***类杀菌剂为苯醚甲环唑、己唑醇。

优选地，苯醚甲环唑为10%微乳剂，使用浓度为稀释5000～200000倍。

优选地，己唑醇为30%微乳剂，使用浓度为稀释100000～400000倍。

更为优选地，对甘蔗黑粉菌增殖毒力作用，0.15μM的法尼醇与稀释2×10⁵倍10%苯醚甲环唑微乳剂混用；或，法尼醇与己唑醇混配的配比为0.2μM法尼醇+稀释4×10⁵倍30%己唑醇微乳剂；

更为优选地，对玉米黑粉菌，法尼醇与苯醚甲环唑混配比是0.2μM法尼醇+稀释2×10⁵倍10%苯醚甲环唑微乳剂。

本发明所述的法尼醇为购买所得，也可以通过植物或微生物提取得到。本发明将所述法尼醇与***类杀菌剂（苯醚甲环唑和/或己唑醇）通过不同混配比，处理甘蔗黑粉病病菌担孢子和玉米黑粉病病菌担孢子，通过统计其抑制率、增效比、菌落生长情况，确定法尼醇与***类杀菌剂混配使用可显著提高抑菌作用，大幅度降低***类杀菌剂的使用量。所以将其作为***类杀菌剂在防治黑粉病病原菌上的增效剂有着很好的前景。

基于以后生产应用成本控制，本发明提供了所述法尼醇与***类杀菌剂混合配制以0.01μM~1μM浓度范围应用于防治甘蔗黑粉病和玉米黑粉病。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1）本发明中法尼醇在与***类杀菌剂混配时，明显优于单个药剂使用效果，可以显著提高杀菌能力。目前，10%苯醚甲环唑微乳剂在田间推荐用量为稀释4000-10000倍，而本发明中对黑粉菌毒力作用的最优混配比为：0.15μM+稀释2×10⁵倍10%苯醚甲环唑微乳剂，药剂用量降低20倍，增效比高到74倍。30%己唑醇悬浮剂在田间推荐用量为1000-5000倍，对黑粉菌毒力作用的最优混配比为0.2μM+稀释4×10⁵倍己唑醇，药剂用量降低80倍，增效比达到62倍。

2）法尼醇（Farnesol）作为植物或微生物提取的天然产物，它对细菌和真菌等微生物的菌丝形成、生物膜形成以及一些氧化应激反应、调控细胞形态、都有一定影响。本发明首次将法尼醇作为一种增效剂来防治黑粉病进行研究，与传统的增效剂相比，法尼醇作为增效剂具有绿色，安全，天然存在于环境中也可以被土壤微生物降解等优点，具有新颖性。

附图说明

图1为法尼醇和苯醚甲环唑混配对甘蔗黑粉病抑菌效果，其中，1：0.05μmFarnesol，苯醚甲环唑稀释1×10⁵倍，0.025μm Farnesol+苯醚甲环唑稀释2×10⁵倍；2：0.08μm Farnesol，苯醚甲环唑稀释5×10⁴倍，0.04μm Farnesol+苯醚甲环唑稀释1×10⁵倍；3：0.1μm Farnesol，苯醚甲环唑稀释3.34×10⁴倍，0.05μm Farnesol+苯醚甲环唑稀释6.68×10⁴倍；4：0.2μm Farnesol，苯醚甲环唑稀释2×10⁴倍，0.1μm Farnesol+苯醚甲环唑稀释4×10⁴倍；5：0.3μm Farnesol，苯醚甲环唑稀释1.25×10⁴倍，0.15μm Farnesol+苯醚甲环唑稀释2.5×10⁴倍；6：0.2μm Farnesol，苯醚甲环唑稀释1×10⁴倍，0.1μm Farnesol+苯醚甲环唑稀释2×10⁴倍；7：0.225μm Farnesol，苯醚甲环唑稀释6.67×10³倍，0.1125μm Farnesol+苯醚甲环唑稀释1.33×10⁴倍；8：0.25μm Farnesol，苯醚甲环唑稀释5×10³倍，0.125μmFarnesol+苯醚甲环唑稀释1×10⁴倍。

图2 为法尼醇和苯醚甲环唑混配对甘蔗黑粉病毒力效果，其中，A:CK；B:苯醚甲环唑稀释5000倍；C:0.5μMFarnesol；D:苯醚甲环唑稀释10000倍+0.25μM Farnesol。

图3 为法尼醇对苯醚甲环唑在甘蔗黑粉病毒力增效作用，其中，Dif（苯醚甲环唑）稀释1×10⁵倍；2:0.4μM Farnesol；3:Dif（苯醚甲环唑）稀释2×10⁵倍+0.1μM Farnesol；4:Dif（苯醚甲环唑）稀释2×10⁵倍+0.15μM Farnesol；5:Dif（苯醚甲环唑）稀释2×10⁵倍+0.2μM Farnesol。

图4 是法尼醇与苯醚甲环唑对甘蔗黑粉菌抑制率的最优混配比，其中，Dif（苯醚甲环唑）:稀释2×10⁴倍；Far:0.08μM Farnesol。

图5 是法尼醇和苯醚甲环唑混配对玉米黑粉菌的作用效果图，其中，A:CK；B：Dif（苯醚甲环唑）稀释1×10⁵倍；C：0.4μM Farnesol；D：0.2μM Farnesol+Dif（苯醚甲环唑）稀释2×10⁵倍。

图6 是法尼醇和己唑醇混配对甘蔗黑粉病毒力效果，其中，A:CK；B:己唑醇稀释2×10⁵倍；C:0.2μM Farnesol；D:0.3μM Farnesol； E:0.5μM Farnesol；F:己唑醇2 ×10⁵倍+0.1μM Farnesol；G:己唑醇2 ×10⁵倍+0.15μM Farnesol；H:己唑醇2 ×10⁵倍+0.25μMFarnesol。

图7是法尼醇对己唑醇毒力增效作用（甘蔗黑粉病），其中，1:Hex（己唑醇）稀释2×10⁵倍；2:0.4μMFarnesol；3:Hex（己唑醇）稀释4×10⁵倍+0.1μM Farnesol；4:Hex（己唑醇）稀释4×10⁵倍+0.15μM Farnesol；5:Hex（己唑醇）稀释4×10⁵倍+0.2μM Farnesol。

图8是法尼醇和己唑醇混配对甘蔗黑粉病的抑菌效果，1：0.08μMfarnesol，己唑醇稀释2×10⁵倍，0.04μM farnesol+己唑醇稀释4×10⁵倍；2：0.1μM farnesol，己唑醇稀释2×10⁵倍，0.05μM farnesol+己唑醇稀释4×10⁵倍；3：0.2μM farnesol，己唑醇稀释2×10⁵倍，0.1μM farnesol+己唑醇稀释4×10⁵倍；4：0.3μM farnesol，己唑醇稀释2×10⁵倍，0.15μMfarnesol+己唑醇稀释4×10⁵倍；5：0.4μM farnesol，己唑醇稀释2×10⁵倍，0.2μM farnesol+己唑醇稀释4×10⁵倍；6：0.5μM farnesol，己唑醇稀释2×10⁵倍，0.25μM farnesol+己唑醇稀释4×10⁵倍。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

供试材料

法尼醇从sigma公司购买所得， CAS Number:4602-84-0。将所述法尼醇用无水乙醇稀释成浓度为3.98mM母液备用。10%苯醚甲环唑微乳剂和30%己唑醇悬浮剂均为中国农科院植保所生产。供试甘蔗黑粉病菌冬孢子采自广西田间自然发病的甘蔗黑粉病植株，供试的1对甘蔗黑粉病菌担孢子WT17、WT18为该甘蔗黑粉病病株上冬孢子分离所得，并经鉴定二者分别为“+”和-”的单倍体，能相互识别，进行有性配合产生双倍体菌丝，U9、U10（玉米黑粉菌担孢子）为实验室保存菌株。本实验室所用培养液为YEPSA+0.05%甘油。

供试培养基

YEPSA培养基：酵母浸出物10 g、蛋白胨20 g、蔗糖20 g、琼脂18 g，加去离子水定容至1000 mL后常规灭菌。YEPS液体培养基：不加琼脂的YEPSA培养基。培养基在使用时均添加0.5%甘油助溶。

实施例一

在预备试验的基础上，先将法尼醇和10%苯醚甲环唑微乳剂按比例配置成一定浓度梯度的母液备用（法尼醇：0.05μM、0.08μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM 、0.5μM；10%苯醚甲环唑微乳剂（稀释）：1×10⁵倍、5×10⁴倍、3.34×10⁴倍、2×10⁴倍、1.25×10⁴倍、1×10⁴倍、6.67×10³倍、5×10³倍）。从平板上挑取少许甘蔗黑粉菌担孢子于6mLYEPS培养液中过夜培养作为种子液，次日离心收集菌体，用YEPS液体培养基重悬菌体（OD₆₀₀为0.2）待用。分别吸取300μL不同浓度母液到2mL灭菌离心管中，加入等量的担孢子悬浮液混匀设为单独使用组；另分别吸取法尼醇不同浓度母液250μL与250μL嘧菌酯母液混合于5mL灭菌离心管中，加入等体积的菌液混匀，记为混配组；吸取YEPS500μL到5mL灭菌离心管中，加入等体积的菌液混匀，记为对照组，设置重复。然后用分光光度计测量各处理起始OD₆₀₀后，置于28℃，200rpm/min摇床中培养20h，在测得各处理的最终OD₆₀₀，通过计算OD₆₀₀净增长量，求出抑制率。

实验结果显示（参见图1），法尼醇与苯醚甲环唑混配使用效果明显优于单独使用且浓度扩大一倍的抑制效果还要明显。其抑制甘蔗黑粉菌最优混配组为0.025μM法尼醇+稀释2×10⁵倍的苯醚甲环唑，其抑制效果达到99%以上，而0.05μM的法尼醇抑制率仅为6%，稀释1×10⁵倍的苯醚甲环唑抑制率为25%。只有当苯醚甲环唑稀释到5×10³倍时抑制率才达到98%。

实施例二

在预备试验的基础上，先将法尼醇和10%苯醚甲环唑微乳剂按比例配置成一定浓度梯度的母液备用（法尼醇：0.5μM，10%苯醚甲环唑微乳剂：稀释5000倍）。从平板上挑取少许甘蔗黑粉菌担孢子于6mLYEPS培养液中过夜培养作为种子液,次日转接500μL至50mLYEPS培养液中扩大培养（至OD₆₀₀为0.2），分别吸取不同浓度的母液500μL到5mL灭菌离心管中，加入等体积的菌液混匀；然后去250μL法尼醇+250μL稀释5000倍10%苯醚甲环唑微乳剂到5mL灭菌离心管中，加入等体积的菌液混匀；500μLYEPS到5mL灭菌离心管中，加入等体积的菌液混匀，置于28℃，200rpm/min摇床中培养24h。随后用新鲜YEPS液体培养基将各浓度处理的菌液稀释10³倍，吸取200μL涂布于YEPSA固体培养基上，置于28℃培养箱中静置培养48h。最后确定法尼醇和10%苯醚甲环唑微乳剂对黑粉菌增殖的毒力效果。

实验结果显示（参见图2），图中一定浓度的苯醚甲环唑和法尼醇均对甘蔗黑粉菌的增殖生长有抑制作用，当两者浓度均降低为原来1/2后相互混配，其毒力作用更加显著。

在以上基础上，将法尼醇使用浓度不断降低，寻求法尼醇最低有效浓度。单独使用对照组：法尼醇：0.4μM，10%苯醚甲环唑微乳剂：1×10⁵倍；混配组（法尼醇+10%苯醚甲环唑微乳剂）：0.1μM+2×10⁵倍、0.15μM+2×10⁵倍、0.2μM+2×10⁵倍；对照组：YEPS，处理同上。置于28℃，200rpm/min摇床中培养24h。随后用新鲜YEPS液体培养基将各浓度处理的菌液稀释10⁴倍，吸取200μL涂布于YEPSA固体培养基上，置于28℃培养箱中静置培养48h。统计各处理菌落数量，并以对照组增效为1，计算各处理组增效比。

实验结果显示（请参见图3），法尼醇与10%苯醚甲环唑微乳剂混配使用其效果比单独使用且浓度扩大一倍的效果还要明显，说明两者具有协同增效作用。图中显示随着法尼醇浓度提高，增效作用不断增加，对甘蔗黑粉菌增殖毒力作用的最优混配比为：0.15μM+稀释2×10⁵倍10%苯醚甲环唑微乳剂，增效比达到74倍。

实施例三

在预备试验的基础上，先将法尼醇和10%苯醚甲环唑微乳剂按比例配置成一定浓度梯度的母液备用（法尼醇：0.08μM、10%苯醚甲环唑微乳剂：稀释2×10⁴倍）。从平板上挑取少许甘蔗黑粉菌担孢子于6mLYEPS培养液中过夜培养作为种子液,次日转接500μL至50mLYEPS培养液中扩大培养（至OD₆₀₀为0.2）待用。控制法尼醇的浓度为0.08μM，配置苯醚甲环唑的浓度稀释2×10⁴倍，然后设置梯度依次稀释为母液的0.5倍、0.4倍、0.25倍、0.1倍、0.05倍。取同250μL的法尼醇与相同体积的不同浓度的苯醚甲环唑混配于离心管中，并分别以500μL的法尼醇和嘧菌酯母液作为单独使用组；500μLYEPS作为空白对照，设置重复，所有离心管中再加入500μL的菌液混匀，置于28℃，200rpm/min摇床中培养20h，再测得各处理的最终OD₆₀₀，通过计算OD₆₀₀净增长量，求出抑制率，得到抑制黑粉菌的最优混配组。

参见图4，实验结果显示：Farnesol与苯醚甲环唑在防治甘蔗黑粉病病菌上具有协同增效作用且法尼醇的加入可以使化学药剂的用量大幅减少，当法尼醇浓度为0.04μM，苯醚甲环唑的最低浓度为1×10⁵倍，抑制率为0.91，高于单独使用效果。

（如图4中第7组所示，为0.05Dif+0.5Far即1×10⁵倍+0.04μM）

实施例四

在预备试验的基础上，先将法尼醇和10%苯醚甲环唑微乳剂配置成：法尼醇0.4μM，10%苯醚甲环唑微乳剂稀释1×10⁵倍母液待用。从平板上挑取少许玉米黑粉菌担孢子于6mLYEPS培养液中过夜培养作为种子液,次日转接500μL至50mLYEPS培养液中扩大培养（至OD₆₀₀为0.2）待用。分别取0.4μM法尼醇和稀释1×10⁵倍苯醚甲环唑母液、YEPS各500μL于不同灭菌离心管中，再取0.4μM法尼醇和稀释1×10⁵倍苯醚甲环唑母液各250μL于同一离心管中，将各离心管中加入500μL菌悬液，设置三组重复。置于28℃，200rpm/min摇床中培养24h。随后用新鲜YEPS液体培养基将各离心管中处理的菌液稀释10⁵倍，吸取200μL涂布于YEPSA固体培养基上，置于28℃培养箱中静置培养48h。统计菌落数量，观察增益效果。

结果显示（参见图5）0.2μM法尼醇+稀释2×10⁵倍10%苯醚甲环唑微乳剂的混配比同样适用于抑制玉米黑粉菌的增殖生长，由图中看出0.4μM法尼醇和苯醚甲环唑的抑制效果明显没有两者混配并且浓度降低一半时达到的抑制效果好。当0.2μM法尼醇+稀释2×10⁵倍10%苯醚甲环唑微乳剂对玉米黑粉菌毒力作用高于95%以上。

实施例五

在预备试验的基础上，先将法尼醇和30%己唑醇悬浮剂按比例配置成一定浓度梯度的母液备用（法尼醇：0.2μM、0.3μM、0.5μM；30%己唑醇悬浮剂（稀释）：2×10⁵倍、）。从平板上挑取少许甘蔗黑粉菌担孢子于6mLYEPS培养液中过夜培养作为种子液,次日转接500μL至50mLYEPS培养液中扩大培养（至OD600为0.2），分别吸取不同浓度的母液500μL到5mL灭菌离心管中，加入等体积的菌液混匀记为单独使用组；另分别吸取法尼醇不同浓度母液250μL与250μL己唑醇母液混合于5mL灭菌离心管中，加入等体积的菌液混匀，记为混合使用组；吸取YEPS 500μL到5mL灭菌离心管中，加入等体积的菌液混匀，记为对照组，置于28℃，200rpm/min摇床中培养24h。随后用新鲜YEPS液体培养基将各浓度处理的菌液稀释103倍，吸取200μL涂布于YEPSA固体培养基上，置于28℃培养箱中静置培养48h。最后确定法尼醇和30%己唑醇悬浮剂对甘蔗黑粉菌增殖的毒力效果。（图6）

在以上基础上，将法尼醇使用浓度不断降低，寻求法尼醇最低有效浓度。单独使用对照组：法尼醇：0.4μM，30%己唑醇悬浮剂：2×10⁵倍；混配组（法尼醇+30%己唑醇悬浮剂）：0.1μM+4×10⁵倍、0.15μM+4×10⁵倍、0.2μM+4×10⁵倍；对照组：YEPS，处理同上。置于28℃，200rpm/min摇床中培养24h。随后用新鲜YEPS液体培养基将各浓度处理的菌液稀释10⁴倍，吸取200μL涂布于YEPSA固体培养基上，置于28℃培养箱中静置培养48h。统计各处理菌落数量，并以对照组增效为1，计算各处理组增效比。

实验结果显示（请参见图7），法尼醇与30%己唑醇悬浮剂混配使用其效果比单独使用且浓度扩大一倍的效果还要明显，说明两者具有协同增效作用。图中显示随着法尼醇浓度提高，增效作用不断增加，对甘蔗黑粉菌增殖毒力作用的最优混配比为：0.2μM+稀释4×10⁵倍己唑醇，增效比达到62倍。

实施例六

在预备试验的基础上，先将法尼醇和30%己唑醇悬浮剂按比例配置成一定浓度梯度的母液备用（法尼醇：0.08μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM 、0.5μM；30%己唑醇悬浮剂（稀释）：2×10⁵倍、）。从平板上挑取少许甘蔗黑粉菌担孢子于6mLYEPS培养液中过夜培养作为种子液，次日离心收集菌体，用YEPS液体培养基重悬菌体（OD₆₀₀为0.2）待用。分别吸取300μL不同浓度母液到2mL灭菌离心管中，并分别吸取150μL法尼醇母液与150μL己唑醇母液混合于2mL灭菌离心管中，300YEPS为对照，加入等量的担孢子悬浮液混匀，各浓度处理设置三个重复。然后用分光光度计测量各处理起始OD₆₀₀后，置于28℃，200rpm/min摇床中培养20h，在测得各处理的最终OD₆₀₀，通过计算OD₆₀₀净增长量，求出抑制率（图8）。

参见图8，法尼醇与30%己唑醇悬浮剂混配使用效果明显优于单独使用且浓度扩大一倍的增效作用还要明显。0.04μM法尼醇和稀释4×10⁵倍的己唑醇的抑制率达到94%，而稀释2×10⁵倍的法尼醇的抑制率为74%，0.08μM法尼醇的抑制率为8%。

Claims (10)

1.法尼醇在***类杀菌剂防治黑粉病中的增效作用中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黑粉病选自由孢堆黑粉菌属或黑粉菌属引起的作物黑粉病，优选为甘蔗黑粉菌、或玉米黑粉菌。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述法尼醇的使用浓度为0.01μM～1μM。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述***类杀菌剂为苯醚甲环唑、己唑醇。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，苯醚甲环唑为10%微乳剂，试验浓度为稀释5000～200000倍。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，己唑醇为30%微乳剂，使用浓度为稀释100000～400000倍。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，对甘蔗黑粉菌增殖毒力作用，法尼醇与苯醚甲环唑混配比为0.15μM法尼醇+稀释2×10⁵倍10%苯醚甲环唑微乳剂。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，对玉米黑粉菌增殖毒力作用，法尼醇与苯醚甲环唑混配比是0.2μM法尼醇+稀释2×10⁵倍10%苯醚甲环唑微乳剂。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，对甘蔗黑粉菌抑制作用，法尼醇与苯醚甲环唑混配比为0.04μM法尼醇+稀释4×10⁵倍10%苯醚甲环唑微乳剂。

10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，对于甘蔗黑粉菌增殖毒力作用，法尼醇与己唑醇混配的配比为0.2μM法尼醇+稀释4×10⁵倍30%己唑醇微乳剂。