CN108434439A - 钙网蛋白的医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体而言涉及钙网蛋白的医药用途。更具体而言，本发明涉及钙网蛋白在预防和/或治疗急性高原病中的用途。

Description

钙网蛋白的医药用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言涉及钙网蛋白的医药用途。更具体而言，本发明涉及钙网蛋白在预防和/或治疗急性高原病中的用途。
发明背景
急性高原病(acute mountain sickness，AMS)指人初入高原时出现的急性缺氧反应或疾病，依其严重程度分为轻型和重型AMS。轻型AMS指的是急性高原反应；重型AMS又分为：高原脑水肿、高原肺水肿和混合型(综合高原脑水肿和高原肺水肿)。
目前关于急性高原病的防治措施多为高原进入过程中阶梯习服，以及针对患者急性肺水肿、脑水肿等急性缺氧症状的对症治疗。此类手段存在阶段性成本高、常规治疗实施时间滞后、影响疗效等问题。因此，本领域迫切需要新的防治急性高原病的简便、有效的药物。
发明概述
在第一方面，本发明提供钙网蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗急性高原病。在一些实施方案中，所述钙网蛋白是人钙网蛋白，优选重组人钙网蛋白。在一些实施方案中，所述钙网蛋白包含选自 SEQ ID NO:1-5的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述急性高原病选自急性高原反应、高原肺水肿、高原脑水肿或其组合。
在第二方面，本发明提供一种用于预防和/或治疗急性高原病的药物组合物，其包含治疗有效量的钙网蛋白，以及药学可接受的载体。在一些实施方案中，所述钙网蛋白是人钙网蛋白，优选重组人钙网蛋白。在一些实施方案中，所述钙网蛋白包含选自SEQ ID NO:1-5的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述急性高原病选自急性高原反应、高原肺水肿、高原脑水肿或其组合。
在第三方面，本发明提供一种用于预防和/或治疗急性高原病的方法，包括给有需要的对象施用治疗有效量的钙网蛋白。在一些实施方案中，所述钙网蛋白是人钙网蛋白，优选重组人钙网蛋白。在一些实施方案中，所述钙网蛋白包含选自SEQ ID NO:1-5的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述急性高原病选自急性高原反应、高原肺水肿、高原脑水肿或其组合。
附图说明
图1.各组大鼠肺组织湿重及干重。
图2.各组大鼠肺湿干重比。
图3.各组大鼠脑组织湿重及干重。与正常对照组比较*P<0.05，与模型组比较，#P<0.05。
图4.各组大鼠脑组织湿干重比。*P<0.05，与正常对照组比较，#P<0.05，与模型组比较。
图5.各组大鼠动脉血pH值。
图6各组大鼠动脉血PCO2。
图7.各组大鼠动脉血PO2。
图8.各组大鼠动脉血Beecf。
图9.各组大鼠动脉血HCO3。
图10.各组大鼠动脉血TCO2。
图11.各组大鼠动脉血sO2％。
图12各组大鼠动脉血Na水平。
图13.各组大鼠动脉血钾水平。
图14.各组大鼠动脉血iCa水平。
图15.各组大鼠动脉血糖水平。
图16.各组大鼠动脉血红细胞压积。
图17.各组大鼠动脉血血红蛋白水平。
图18.大鼠肺组织HE染色图(100×)。
图19.钙网蛋白克隆策略。
具体实施方式
在第一方面，本发明提供了钙网蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗急性高原病。
急性高原病(acute mountain sickness，AMS)指人快速进入高原(如海拔 3000米以上)时出现的急性缺氧反应或疾病，依其严重程度分为轻型和重型 AMS。轻型AMS指的是急性高原反应；重型AMS又分为：高原脑水肿、高原肺水肿和混合型(综合高原脑水肿和高原肺水肿)。
急性高原反应的患者在进入高原时，第1-2日症状最明显，后逐渐减轻，大多6-7日基本消失，少数可持续存在。主要表现为头痛、记忆与思维能力减退、失眠、多梦、呼吸强度和频率增加、心动过速等。部分患者有发绀、血压升高等症状。急性高原反应在诊断上应与病毒性疾病如流行性感冒等相鉴别。
高原肺水肿一般为平原或海拔较低地区人群迅速进入高原后1-3日发病，也有晚于7-14日发病者，其表现与一般肺水肿相同。高原肺水肿在诊断上应与肺炎、肺栓塞、气胸、心源性肺水肿或神经源性肺水肿等鉴别。
高原脑水肿患者大多先有急性高原反应的症状，继而出现明显的精神神经症状如剧烈头痛、精神异常、神志恍惚、顽固恶心、呕吐，重者昏迷。脑脊液检查有压力增高。高原脑水肿在诊断上应与代谢或中毒脑病、脑血管意外和颅脑创伤相鉴别。
在本发明的一些实施方案中，所述急性高原病选自急性高原反应、高原肺水肿或高原脑水肿中的任意一种或多种。
钙网蛋白(calreticulin，CRT)最初作为细胞内质网中钙结合蛋白和伴侣分子被发现，具有调节蛋白质折叠、钙稳态和细胞凋亡等作用。本发明人令人惊奇地发现，钙网蛋白可以有效减轻高原低压、缺氧相关症状，尤其是缓解高原肺水肿和高原脑水肿，从而可以用于预防和/或治疗急性高原病。在本发明一些实施方案中，所述钙网蛋白是人钙网蛋白。
本文所述钙网蛋白除了野生型钙网蛋白之外，还涵盖钙网蛋白的功能性变体。在一些实施方案中，钙网蛋白的功能性变体包含与野生型钙网蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的氨基酸序列，并且具有野生型钙网蛋白的生物学活性。在一些实施方案中，钙网蛋白的功能性变体相对于野生型钙网蛋白具有一或多个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，并且具有野生型钙网蛋白的生物学活性。例如，钙网蛋白的功能性变体包含相对于野生型钙网蛋白具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是保守型取代。在一些实施方案中，所述野生型钙网蛋白包含SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列。
“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
序列“相同性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列相同性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列相同性。(参见，例如： Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press, New York,1988；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W., ed.,Academic Press,New York,1993；ComputerAnalysis of Sequence Data, Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,HumanaPress,New Jersey,1994； Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987； and Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的相同性的方法，但是术语“相同性”是技术人员公知的(Carrillo,H.&Lipman,D., SIAM JApplied Math 48:1073(1988))。
在肽或蛋白中，合适的保守型氨基酸取代是本领域技术人员已知的，并且一般可以进行而不改变所得分子的生物活性。通常，本领域技术人员认识到多肽的非必需区中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见，例如，Watson et al.,Molecular Biologyof the Gene,4th Edition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。
本文中，钙网蛋白的功能性变体还包含去除野生型钙网蛋白的天然信号肽、去除内质网驻留序列、添加纯化标签(如His标签)、添加增加蛋白表达或改变蛋白表达方式的信号肽(如分泌信号肽)等获得的变体。这样的变体并不改变钙网蛋白的生物学活性。在一些实施方案中，所述钙网蛋白的功能性变体包含SEQ ID NO:3-5之一所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述钙网蛋白可以分离自其天然来源。在一些实施方案中，所述钙网蛋白可以是化学合成的。在一些优选实施方案中，所述钙网蛋白是重组表达产生的。在一些优选实施方案中，所述钙网蛋白是重组人钙网蛋白。
重组表达产生蛋白质的方法是本领域已知的。例如，可以将钙网蛋白的编码核酸克隆至合适的表达载体，然后将所述表达载体导入合适的宿主细胞，通过在合适的条件培养所述宿主细胞来产生重组表达的钙网蛋白。
合适的表达载体包括质粒载体、酵母穿梭载体、杆状病毒、复制缺陷的腺病毒等。本领域中已知大量可获得的适于表达本发明的钙网蛋白的表达载体。
适于表达本发明的钙网蛋白的宿主细胞包括原核生物、酵母和高等真核细胞。示例性的原核宿主细胞包括大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞等。示例性的酵母宿主细胞例如酿酒酵母、毕赤酵母、汉逊酵母细胞等。示例性的高等真核细胞包括HEK293细胞、CHO细胞(例如CHO3E7)等等。在一优选实施方式中，本发明的钙网蛋白通过ExpiCHO-STM细胞表达。
在第二方面，本发明提供一种用于预防和/或治疗急性高原病的药物组合物，其包含有效量的钙网蛋白以及药学可接受的载体。所述钙网蛋白和所述急性高原病分别如上所定义。
在第三方面，本发明提供一种用于预防和/或治疗急性高原病的方法，包括给有需要的对象施用治疗有效量的钙网蛋白。所述钙网蛋白和所述急性高原病分别如上所定义。优选地，所述对象是哺乳动物，例如人。
如本文所用，“治疗”患有疾病或疾病状况的个体表示所述个体的症状部分或全部缓解，或者在治疗后保持不变。“预防”指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或疾病发展。
如本文所用，“有效量”包括“治疗有效量”或“预防有效量”。“治疗有效量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的化合物(如本发明钙网蛋白)或包含化合物(如本发明钙网蛋白)的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。如本文所用，“预防有效量”指在施用于对象时会具有预期的预防效果的化合物(如本发明钙网蛋白)或包含化合物(如本发明钙网蛋白)的组合物的量，例如，防止或延迟疾病或症状的发生或复发，减少疾病或症状发生或复发的可能性。完全预防有效剂量不必通过施用一个剂量发生，并且可以仅在施用一系列剂量之后发生。因此，预防有效量可以在一次或多次施用中施用。
待施用的钙网蛋白的有效量取决于治疗目标、施用途径以及患者的疾病状况。此外，主治医师考虑已知改变药物作用的各种因素，包括疾病的严重程度和类型，患者的健康、体重、性别、饮食，施用时间和途径，其他药物以及其他相关临床因素。因此，临床医学家必须按照需要滴定所述钙网蛋白的剂量并修改施用途径以获得最佳疗效。通常，临床医生会施用所述钙网蛋白，直至达到实现期望效果的剂量。这种治疗的进展通过常规测定很容易监测。
通常，施用本文所提供的钙网蛋白的剂量范围是足够大以产生期望的效果(如急性高原病的症状改善)的剂量范围。剂量不是那么大，不会引起有害副作用，剂量会随年龄、疾病状况、性别以及患者中的疾病程度变化，并且可以由本领域技术人员确定。在出现任何有害副作用的情况下，个体医生可以调整剂量。用于预防或治疗急性高原病的示例性剂量包括但不限于约0.01mg/kg至约300mg/kg，例如，约0.01mg/kg、约0.1mg/kg、约 0.5mg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50 mg/kg、约100mg/kg、约150mg/kg、约200mg/kg、约250mg/kg或者约 300mg/kg。在一些优选实施方案中，本发明钙网蛋白的施用剂量为至少5 mg/kg体重。
为了治疗急性高原病，所述钙网蛋白的剂量可以根据疾病的类型和严重程度变化。可以单剂量、多次单独施用或通过连续输液施用所述钙网蛋白。对于根据疾病状况在几天或更长的时间中重复施用，可以重复治疗直至期望的疾病症状抑制发生或者实现期望的患者疾病状况的改善。重复施用可以包括根据治疗的进展增加或减少的所述钙网蛋白的量。还考虑其他剂量方案。
可以通过本领域已知的施用多肽的任何方法将本文所述的钙网蛋白给对象施用，包括例如全身或局部施用。可以通过诸如肠胃外(例如，皮内、肌肉内、腹腔内、静脉内、皮下或腔内)、体表、硬膜外、或粘膜(例如鼻内或口服)的途径施用所述钙网蛋白。可以通过任何方便的途径施用含有钙网蛋白的组合物，例如通过输液或团注射、通过上皮粘膜或皮肤粘膜(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜)吸收。
本文提供的药物组合物可以为各种形式，例如，固体、半固体、液体、粉末、水溶液或冷冻干燥形式。本领域已知合适的药学可接受的载体的实例，并且包括但不限于水、缓冲剂、盐水溶液、磷酸缓冲盐溶液、各种类型的湿润剂、无菌溶液、醇、***树胶、植物油、苄醇、明胶、甘油、碳水化合物(如乳糖、蔗糖、直链淀粉或淀粉)、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸单甘油酯和二甘油酯、季戊四醇脂肪酸酯、羟甲基纤维素、粉末等。本文提供的药物组合物可以包含其他添加剂，包括例如抗氧化剂、防腐剂、抗微生物剂、镇痛剂、粘合剂、崩解剂、着色剂、稀释剂、赋形剂、增量剂、助流剂、增溶剂、稳定剂、张力剂、媒介物、增稠剂、调味剂、乳剂(如油/水乳剂)、乳化和悬浮剂(如***胶、琼脂、藻酸、藻酸钠、膨润土、卡波姆、卡拉胶、羧甲基纤维素、纤维素、胆固醇、明胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、辛基酚聚醚-9、油醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇单硬脂酸酯、十二烷基硫酸钠、山梨聚糖酯、硬脂醇、黄蓍胶、黄原胶及其衍生物)、溶剂以及各种成分，例如晶体纤维素、微晶纤维素、柠檬酸、糊精、葡萄糖、液体葡萄糖、乳酸、乳糖、氯化镁、偏磷酸钾、淀粉等。这样的载体和/或添加剂可以通过常规方法配制，并且可以以合适的剂量给对象施用。稳定剂如脂质、核酸酶抑制剂、聚合物和螯合剂可以防止组合物在体内降解。
在本发明的用途、药物组合物和方法中，所述钙网蛋白还可以和其它治疗急性高原病的药物联合使用。例如，所述药物组合物还可以包含其它治疗急性高原病的药物。或者，所述钙网蛋白可以和单独配制的其它治疗急性高原病的药物同时施用。或者，所述钙网蛋白可以和其它治疗急性高原病的药物分开施用，如顺次施用。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。
以下实施例用于阐述本发明，其无意于以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1重组钙网蛋白制备
本发明使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达***表达重组钙网蛋白。
1.1基因克隆
人CRT蛋白全长417个氨基酸(Genbank登录号：NM_004343)。发明人将人CRT蛋白C端4个氨基酸(KDEL)的内质网驻留信号删除，使得重组 CRT蛋白主要表达在细胞质中。然后，将N端17个氨基酸的原始信号肽替换为增加表达的人工信号肽(MGWSCIILFLVATATGVHS)。为了便于纯化，在C端增加6×His的纯化标签。
根据上述设计的重组蛋白序列，针对CHO细胞进行编码核酸序列的密码子优化，在5’端添加Kozak序列，在两端添加HindIII和EcoRI位点。人工合成该编码核酸片段，克隆至pUC57真核表达载体。克隆策略见图19。
1.2细胞培养和瞬时转染
使CHO-3E7细胞在无血清FreeStyleTM CHO表达培养基(Life Technologies)。将细胞保持在轨道摇床上的锥形烧瓶中，37℃，5％CO2。转染前一天，细胞以适当的密度接种于锥形瓶。转染当天，DNA和转染试剂以最佳比例混合，然后加入准备转染的细胞中。将编码钙网蛋白的重组质粒瞬时转染到100ml悬浮CHO-3E7细胞培养物中。第6天收集细胞培养上清液用于纯化。
1.3蛋白纯化和分析
将细胞培养基离心并以1.0ml/分钟上样到5ml HisTrapTM FF Crude(GE,Cat.No.17-5286-01)。用合适的缓冲液洗涤和洗脱后，将洗脱的级分合并并将缓冲液交换为pH7.2的PBS。通过SEC-HPLC、SDS-PAGE和Western印迹分析纯化的蛋白质使用标准方案进行分子量、产率和纯度测量。使用小鼠抗-his mAb(GenScript，Cat.No.A00186)进行Western印迹。
实施例2重组钙网蛋白减轻高原缺氧反应的药效学研究
(1)实验动物：雄性SPF级SD大鼠(60只，体重200-220g)购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK(京)2016-0002。检疫观察3天。在此期间，观察动物的外观体征、行为活动、粪便性状、体重及饮食等指标，剔除有病动物。动物房环境条件控制室温18℃～26℃；相对湿度40％～70％；光照12小时明暗交替。笼具、食盒、饮水瓶每天冲洗一次，动物房地面和墙面每周消毒一次，用0.1％新洁尔灭或0.5％的84 消毒液擦拭消毒，两种消毒液交叉使用。普通饲料为鼠维持料，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。垫料：灭菌颗粒垫料，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。饮水：饮用纯化水，经酸化后自由饮用。
(2)主要仪器：实验动物低压模拟仓(HCP-III Series)，Abbotti-start血气分析仪、Powerlab生理记录仪、压力传感器。
(3)主要试剂及其配制：重组钙网蛋白如实施例1所述制备、纯化，生理盐水购自北京百奥森泰生物技术有限公司，***磷酸钠注射液购自国药集团容生制药有限公司。
(4)实验分组：
①常氧对照组：腹腔注射0.5ml生理盐水
②低氧模型组：腹腔注射0.5ml生理盐水
③低氧+***5mg/kg组：腹腔注射***5mg/kg
④低氧+CRT 5mg/kg组：腹腔注射CRT 5mg/kg
⑤低氧+CRT 1mg/kg组：腹腔注射CRT 1mg/kg
⑥低氧+CRT 0.2mg/kg组：腹腔注射CRT 0.2mg/kg
(5)低压低氧性模型复制：
腹腔注射1小时后，②-⑥组大鼠置于模拟高原环境低压氧舱中，以10 m·s-1的速度匀速上升到模拟海拔6500m水平，温度设置为白天(8:00～18:00) 0℃，夜间(18:00～08:00)-4℃，连续72h。结束后，在45分钟内使舱内气压平稳回升至常压，出仓。每24小时更换食水一次。
结束实验时，以2％戊巴比妥钠腹腔注射0.5ml/kg麻醉后，经左颈动脉快速取动脉血2毫升，密封后置于冰壶中，用Abbotti-start血气分析仪测血气；并快速处死动物，取右肺组织和右脑半球用于组织湿干重比，取右肺中下叶，进行肺脏大体观察，取约100mg肺组织立即置于10倍体积4％多聚甲醛中常温固定至少48小时，备用于光镜标本制作和观察。另取约1 mm3大小肺2-3块，立即置于新鲜配制的3％戊二醛中4℃固定至少48小时，备用于透射电镜标本制作和观察。将剩余的组织分为3、4份立即放入液氮中冻存备用。
(6)肺(脑)组织湿干重比：右肺组织以滤纸吸干血污，迅速称重，置于恒温烤箱80℃烘烤48h至重量恒重后，再称取干重，计算右肺湿/干重量比值(W/D):肺湿干比值＝肺湿重/肺干重。同上计算脑组织湿重/肺干重。
(7)肺组织学观察：上述肺组织以4％中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，行HE染色，每只大鼠随机选3张肺组织切片，每张切片随机选取三个视野，光镜下观察。
结果：
(1)肺组织湿干重比
肺组织湿干重比的结果见表1和图1、2所示。肺湿重的结果显示，与正常对照组比较，模拟高原缺氧的模型组肺组织湿重明显增加(P<0.05)；与模型组比较，***组及CRT低、中、高剂量各组均有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；且与阳性药物***组比较，CRT各组肺湿重差异无显著性(P>0.05)。
肺湿/干重比的分析结果显示，与正常对照组比较，模拟高原缺氧的模型组肺组织湿/干重明显增加(P<0.05)；与模型组比较，***组及CRT 低、中、高剂量各组肺组织湿/干重均明显降低(P<0.05)；且与阳性药物***组比较，CRT 1ng组显著降低(P<0.05)，但CRT 0.2ng组及CRT 5ng组差异无显著性(P>0.05)。
表1各组大鼠肺组织湿干重比
组别 n 肺湿重(g) 肺干重(g) 肺湿干重比
对照组 20 0.47±0.04 0.12±0.02 4.12±0.57
模型组 16 0.64±0.06* 0.10±0.01 6.43±0.86*
***组 16 0.60±0.07* 0.13±0.01 4.73±0.20*#
CRT 0.2ng组 13 0.60±0.04* 0.12±0.01 4.98±0.16*#
CRT 1ng组 13 0.61±0.06* 0.12±0.01 4.87±0.10*#△
CRT 5ng组 17 0.62±0.06* 0.13±0.01 4.93±0.22*#
注：*P<0.05，与正常对照组比较；#P<0.05，与模型组比较；△P<0.05与***组比较。与正常对照组比较*P<0.05，与模型组比较，#P<0.05。
(2)脑组织湿/干重比
脑组织湿干重比的结果见表2和图3、4所示。脑组织湿重的结果显示，与正常对照组比较，模拟高原缺氧的模型组肺组织湿重明显增加(P<0.05)；与模型组比较，***组及CRT低、中、高剂量各组均有明显降低(P<0.05)；与阳性药物***组比较，CRT各组肺湿重差异无显著性(P>0.05)。脑干重：各组之间无统计学差异。
脑湿/干重比的分析结果显示，与正常对照组比较，模拟高原缺氧的模型组肺组织湿/干重明显增加(P<0.05)；与模型组比较，***组及CRT 低、中、高剂量各组脑组织湿/干重均明显降低(P<0.05)；与阳性药物***组比较，CRT各组无统计学差异(P<0.05)。
表2各组大鼠脑组织湿干重比
组别 n 脑湿重(g) 脑干重(g) 脑湿干重比
对照组 20 1.70±0.12 0.39±0.02 4.30±0.28
模型组 16 1.89±0.05* 0.37±0.02 5.06±0.31*
***组 16 1.71±0.12*# 0.37±0.04 4.69±0.20*#
CRT 0.2ng组 13 1.71±0.08*# 0.36±0.03 4.74±0.33*#
CRT 1ng组 13 1.79±0.06*# 0.36±0.03 4.55±0.22*#
CRT 5ng组 17 1.67±0.11*# 0.37±0.03 4.59±0.22*#
注：*P<0.05，与正常对照组比较；#P<0.05，与模型组比较。
(3)血气分析结果(表3)
如图5所示，pH的结果显示，与正常对照组比较，模拟高原缺氧的模型组pH无明显改变(P>0.05)；但与模型组和阳性药物***组分别比较， CRT高剂量组明显升高(P<0.05)。
如图6所示，PCO2的结果显示，与正常对照组比较，模拟高原缺氧的模型组PCO2明显降低(P<0.05)；与模型组比较，CRT低、中、高剂量各组均有明显升高(P<0.05)；与阳性药物***组比较，CRT低、高剂量组均有明显升高(P<0.05)。
如图7所示，PO2的结果显示，与正常对照组比较，模拟高原缺氧的模型组PO2明显降低(P<0.05)；与模型组比较，CRT高剂量有明显升高 (P<0.05)。
如图8所示，Beecf的结果显示，与正常对照组比较，模拟高原缺氧的模型组Beecf明显增加(P<0.05)；与模型组和阳性药物***组分别比较， CRT低、中、高剂量各组均有明显降低(P<0.05)。
如图9所示，HCO3的结果显示，与正常对照组比较，模拟高原缺氧的模型组HCO3明显降低(P<0.05)；与模型组比较，阳性药物***组、CRT 低、中、高剂量各组有明显升高(P<0.05)；与阳性药物***组比较，CRT 低、中、高剂量各组有明显升高(P<0.05)
如图10所示，TO2的结果显示，与正常对照组比较，模拟高原缺氧的模型组TO2明显增加(P<0.05)；与模型组比较，阳性药物***组、CRT 低、中、高剂量各组有明显降低(P<0.05)；与阳性药物***组比较，CRT 低、中、高剂量各组有明显降低(P<0.05)。
如图11所示，SO2％的结果显示，与正常对照组比较，模拟高原缺氧的模型组SO2％差异无显著性(P>0.05)；与模型组比较，阳性药物***组、CRT低、中、高剂量各组差异均无显著性(P>0.05)。
如图12所示，Na的结果显示，与正常对照组比较，模拟高原缺氧的模型组Na差异无显著性(P>0.05)；与模型组比较，CRT低、中、高剂量各组均降低(P<0.05)；与阳性药物***组比较，CRT高剂量组降低(P<0.05)。
如图13所示，K的结果显示，与正常对照组比较，模拟高原缺氧的模型组K差异无显著性(P>0.05)；与模型组比较，阳性药物***组、CRT 低、中、高剂量各组差异均无显著性(P>0.05)；与阳性药物***组比较， CRT高剂量组升高(P<0.05)。
如图14-15所示，iCa和Glu的结果显示，与正常对照组比较，模拟高原缺氧的模型组iCa和Glu差异无显著性(P>0.05)；与模型组比较，阳性药物***组、CRT低、中、高剂量各组差异均无显著性(P>0.05)。
如图16-17所示，Hct和Hb的结果显示，与正常对照组比较，模拟高原缺氧的模型组Hct和Hb差异无显著性(P>0.05)；与模型组和阳性药物***组分别比较，CRT高剂量有明显降低(P<0.05)。
表3实验各组血气检测结果
(4)肺组织病理结果
大鼠肺组织病理观察代表性图片见图18所示。正常大鼠肺组织镜下可见支气管粘膜内衬单层纤毛柱状上皮细胞、粘液细胞，伴随着肺小动、静脉；大部分肺泡均匀排列，肺泡壁未见明显增厚，间质可见少量中性粒细胞浸润。
低氧处理组大鼠肺组织镜下支气管高度扩张呈囊状，除内衬单层纤毛柱状上皮细胞、粘液细胞外，另见***状增生区域，未见明显的纤维轴心，细胞核略增大，染色深，染色质不均；伴随着肺动、静脉扩张，个别静脉内有较多红细胞；约1/2肺泡壁略增厚，其间质可见灶状淋巴细胞聚集，较多中性粒细胞浸润及炎性肉芽组织形成，并见肺囊肿形成。
与低氧处理组比较，低氧+***5mg/kg组大鼠肺组织支气管扩张减轻，大部分内衬细胞仍可见细***状增生，肺动、静脉扩张减轻；约1/3 肺泡壁略增厚，间质伴较多中性粒细胞浸润，炎性肉芽组织区域减少。
与低氧处理组比较，低氧+CRT 5mg/kg组大鼠肺组织支气管扩张减轻，内衬细胞无***状增生，肺动、静脉无扩张；约1/5肺泡壁略增厚，间质伴中等量中性粒细胞浸润，炎性肉芽组织区域减少。
低氧+CRT 1mg/kg组大鼠肺组织较低氧处理组支气管扩张减轻，大部分内衬细胞仍可见高***状增生，伴随着肺动、静脉壁增厚，肺静脉扩张；肺泡壁增厚融合，间质仍见较多中性粒细胞浸润及炎性肉芽组织形成，个别肺泡水肿。
低氧+CRT 0.2mg/kg组大鼠肺组织较低氧处理组支气管扩张减轻，内衬细胞无***状增生；伴随着肺动脉壁增厚，肺动、静脉无扩张；约1/4肺泡壁略显增厚，间质可见局灶小血管增生、扩张、淤血，伴较多中性粒细胞浸润，其余肺泡已明显恢复正常。
与低氧+***5mg/kg组比较，虽然1mg/kg CRT处理对低氧大鼠肺组织的保护作用无明显差异，但0.2mg/kg和5mg/kg CRT处理均较***对低氧大鼠肺组织保护作用明显，表现为减轻支气管内衬细胞***状增生、肺动静脉扩张及肺泡壁增厚的改变。5mg/kgCRT明显优于5mg/kg***组。
结论：
人源重组CRT低、中、高剂量明显减轻模拟高原缺氧大鼠模型的肺水肿和脑水肿，改善因组织缺氧及缺氧引起的酸碱平衡紊乱，治疗效果与***类似；提示CRT可有效治疗急性高原病。
序列表：
SEQ ID NO:1人钙网蛋白前体
MLLSVPLLLGLLGLAVAEPAVYFKEQFLDGDGWTSRWIESKHKSDFGKFVLSSGKFYGDEEKDKGLQTSQDARFYALSASFEPFSNKGQTLVVQFTVKHEQNIDCGGGYVKLFPNSLDQTDMHGDSEYNIMFGPDICGPGTKKVHVIFNYKGKNVLINKDIRCKDDEFTHLYTLIVRPDNTYEVKIDNSQVESGSLEDDWDFLPPKKIKDPDASKPEDWDERAKIDDPTDSKPEDWDKPEHIPDPDAKKPEDWDEEMDGEWEPPVIQNPEYKGEWKPRQIDNPDYKGTWIHPEIDNPEYSPDPSIYAYDNFGVLGLDLWQVKSGTIFDNFLITNDEAYAEEFGNETWGVTKAAEKQMKDKQDEEQRLKEEEEDKKRKEEEEAEDKEDDEDKDEDEEDEE DKEEDEEEDVPGQAKDEL
SEQ ID NO:2无信号肽的成熟人钙网蛋白
EPAVYFKEQFLDGDGWTSRWIESKHKSDFGKFVLSSGKFYGDEEKDKGLQTSQDARFYALSASFEPFSNKGQTLVVQFTVKHEQNIDCGGGYVKLFPNSLDQTDMHGDSEYNIMFGPDICGPGTKKVHVIFNYKGKNVLINKDIRCKDDEFTHLYTLIVRPDNTYEVKIDNSQVESGSLEDDWDFLPPKKIKDPDASKPEDWDERAKIDDPTDSKPEDWDKPEHIPDPDAKKPEDWDEEMDGEWEPPVIQNPEYKGEWKPRQIDNPDYKGTWIHPEIDNPEYSPDPSIYAYDNFGVLGLDLWQVKSGTIFDNFLITNDEAYAEEFGNETWGVTKAAEKQMKDKQDEEQRLKEEEEDKKRKEEEEAEDKEDDEDKDEDEEDEEDKEEDEEEDVPGQAKDE L
SEQ ID NO:3无内质网驻留序列的重组人钙网蛋白
EPAVYFKEQFLDGDGWTSRWIESKHKSDFGKFVLSSGKFYGDEEKDKGLQTSQDARFYALSASFEPFSNKGQTLVVQFTVKHEQNIDCGGGYVKLFPNSLDQTDMHGDSEYNIMFGPDICGPGTKKVHVIFNYKGKNVLINKDIRCKDDEFTHLYTLIVRPDNTYEVKIDNSQVESGSLEDDWDFLPPKKIKDPDASKPEDWDERAKIDDPTDSKPEDWDKPEHIPDPDAKKPEDWDEEMDGEWEPPVIQNPEYKGEWKPRQIDNPDYKGTWIHPEIDNPEYSPDPSIYAYDNFGVLGLDLWQVKSGTIFDNFLITNDEAYAEEFGNETWGVTKAAEKQMKDKQDEEQRLKEEEEDKKRKEEEEAEDKEDDEDKDEDEEDEEDKEEDEEEDVPGQA
SEQ ID NO:4无信号肽、无内质网驻留序列、带His标签的重组人钙网蛋白序列EPAVYFKEQFLDGDGWTSRWIESKHKSDFGKFVLSSGKFYGDEEKDKGLQTSQDARFYALSASFEPFSNKGQTLVVQFTVKHEQNIDCGGGYVKLFPNSLDQTDMHGDSEYNIMFGPDICGPGTKKVHVIFNYKGKNVLINKDIRCKDDEFTHLYTLIVRPDNTYEVKIDNSQVESGSLEDDWDFLPPKKIKDPDASKPEDWDERAKIDDPTDSKPEDWDKPEHIPDPDAKKPEDWDEEMDGEWEPPVIQNPEYKGEWKPRQIDNPDYKGTWIHPEIDNPEYSPDPSIYAYDNFGVLGLDLWQVKSGTIFDNFLITNDEAYAEEFGNETWGVTKAAEKQMKDKQDEEQRLKEEEEDKKRKEEEEAEDKEDDEDKDEDEEDEEDKEEDEEEDVPGQAHHH HHH
SEQ ID NO:5无内质网驻留序列、带人工信号肽和His标签的重组人钙网蛋白序列
MGWSCIILFLVATATGVHSEPAVYFKEQFLDGDGWTSRWIESKHKSDFGKFVLSSGKFYGDEEKDKGLQTSQDARFYALSASFEPFSNKGQTLVVQFTVKHEQNIDCGGGYVKLFPNSLDQTDMHGDSEYNIMFGPDICGPGTKKVHVIFNYKGKNVLINKDIRCKDDEFTHLYTLIVRPDNTYEVKIDNSQVESGSLEDDWDFLPPKKIKDPDASKPEDWDERAKIDDPTDSKPEDWDKPEHIPDPDAKKPEDWDEEMDGEWEPPVIQNPEYKGEWKPRQIDNPDYKGTWIHPEIDNPEYSPDPSIYAYDNFGVLGLDLWQVKSGTIFDNFLITNDEAYAEEFGNETWGVTKAAEKQMKDKQDEEQRLKEEEEDKKRKEEEEAEDKEDDEDKDEDEEDEE DKEEDEEEDVPGQAHHHHHH
SEQ ID NO:6人工信号肽
MGWSCIILFLVATATGVHS。

Claims (12)

1.钙网蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗急性高原病。
2.权利要求1的用途，其中所述钙网蛋白是人钙网蛋白，优选重组人钙网蛋白。
3.权利要求1的用途，其中所述钙网蛋白包含选自SEQ ID NO:1-5的氨基酸序列。
4.权利要求1-3任一项的用途，其中所述急性高原病选自急性高原反应、高原肺水肿、高原脑水肿或其组合。
5.一种用于预防和/或治疗急性高原病的药物组合物，其包含治疗有效量的钙网蛋白，以及药学可接受的载体。
6.权利要求5的药物组合物，其中所述钙网蛋白是人钙网蛋白，优选重组人钙网蛋白。
7.权利要求5的药物组合物，其中所述钙网蛋白包含选自SEQ ID NO:1-5的氨基酸序列。
8.权利要求5-7任一项的药物组合物，其中所述急性高原病选自急性高原反应、高原肺水肿、高原脑水肿或其组合。
9.一种用于预防和/或治疗急性高原病的方法，包括给有需要的对象施用治疗有效量的钙网蛋白。
10.权利要求9的方法，其中所述钙网蛋白是人钙网蛋白，优选重组人钙网蛋白。
11.权利要求9的方法，其中所述钙网蛋白包含选自SEQ ID NO:1-5的氨基酸序列。
12.权利要求9-11任一项的方法，其中所述急性高原病选自急性高原反应、高原肺水肿、高原脑水肿或其组合。
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