CN108434133A - 一种小白菊内酯用作骨形成蛋白9抑制剂的生物医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小白菊内酯用作骨形成蛋白9抑制剂的生物医药用途。本发明发现，小白菊内酯为骨形成蛋白9的有效抑制剂。根据文献记载，骨形成蛋白9参与包括膀胱癌在内的多种肿瘤的发生、发展和转移，抑制骨形成蛋白9可以抑制这些肿瘤的增殖和迁移。本发明发现，用新发现的骨形成蛋白9的抑制剂小白菊内酯作用于人膀胱癌细胞后，其增殖和迁移能力确实显著降低，小白菊内酯可以用于制备抑制膀胱癌转移的药物，可以用于制备治疗膀胱癌的药物。

Description

一种小白菊内酯用作骨形成蛋白9抑制剂的生物医药用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及小白菊内酯用作骨形成蛋白9抑制剂的生物医药用途。
背景技术
骨形成蛋白9(BMP9)又称生长分化因子2(GDF2)，是BMP家族的一员。研究表明，BMP9参与骨形成、胚胎发育、肿瘤发生等多种生物学功能。
苟理尧等发现，BMP9在人膀胱癌细胞中高表达，BMP9可以促进人膀胱癌细胞的增殖和迁移，BMP9被抑制后人膀胱癌细胞的增殖和迁移均显著降低(骨形成蛋白9对人膀胱癌BIU-87细胞增殖和迁移的影响，中国生物工程杂志，2018年3月)。
因此，BMP9的抑制剂有望用于膀胱癌等肿瘤的治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供小白菊内酯用作骨形成蛋白9抑制剂的生物医药用途。
本发明技术方案如下：
小白菊内酯用作骨形成蛋白9抑制剂的生物医药用途。
小白菊内酯用于制备抑制膀胱癌转移的药物的生物医药用途。
小白菊内酯用于制备治疗膀胱癌的药物的生物医药用途。
一种抑制膀胱癌转移的药物制剂，以小白菊内酯为活性成分，还含有药学上可以接受的辅料，制成药学上可以接受的剂型。
一种治疗膀胱癌的药物制剂，以小白菊内酯为活性成分，还含有药学上可以接受的辅料，制成药学上可以接受的剂型。
本发明对现有技术的贡献：
本发明发现，小白菊内酯为骨形成蛋白9的有效抑制剂。根据文献记载，骨形成蛋白9参与包括膀胱癌在内的多种肿瘤的发生、发展和转移，抑制骨形成蛋白9可以抑制这些肿瘤的增殖和迁移。本发明发现，用新发现的骨形成蛋白9的抑制剂小白菊内酯作用于人膀胱癌细胞后，其增殖和迁移能力确实显著降低，小白菊内酯可以用于制备抑制膀胱癌转移的药物，可以用于制备治疗膀胱癌的药物。
附图说明
图1为小白菊内酯和对比化合物木香烃内酯的化学结构式；
图2为小白菊内酯对BMP9 mRNA含量的影响；
图3为小白菊内酯对BMP9蛋白含量的影响；
图4为小白菊内酯对人膀胱癌细胞增殖能力的影响；
图5为小白菊内酯对人膀胱癌细胞迁移能力的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：小白菊内酯对BMP9的抑制作用
一、实验材料
小白菊内酯和对比化合物木香烃内酯的纯度在98％以上，化学结构式如图1。
膀胱癌T-24购于上海细胞生物研究所。RPMI-1640培养基、胎牛血清购于HyClone公司。
TRIzol购于Invitrogen公司，逆转录及PCR相关试剂购于TaKaRa公司，Westernblot及蛋白质提取相关试剂均购自上海碧云天生物技术公司，鼠抗人β-actin单抗购自Santa Cruz公司，兔抗人BMP9多克隆抗体购自Abcam公司，兔抗人β-catenin单抗购自CST公司，HRP标记山羊抗兔(鼠)IgG购自中杉金桥公司。
二、实验方法
1、细胞培养
使用含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的1640培养基，将膀胱癌T-24细胞在含5％CO2的37℃培养箱中常规培养传代。
2、分组和给药
实验分为小白菊内酯低浓度组(10μM)、小白菊内酯高浓度组(20μM)、木香烃内酯低浓度组(10μM)、木香烃内酯高浓度组(20μM)和对照组(不含药)。
3、实时定量PCR检测各组细胞中BMP9 mRNA含量
取对数生长期膀胱癌T-24细胞，按上述分组培养48h。培养48h后，Trizol法分别提取各组细胞RNA，取0.15μg逆转录成cDNA，进行Q-PCR分析。
β-actin正向引物为5'-GATGACCCAGATCATGTTTGAG-3'，
β-actin反向引物为5'-AGGGCATACCCCTCGTAGAT-3'；
BMP9的正向引物为5'-CTGCCCTTCTTTGTTGTCTT-3'，
BMP9反向引物为5'-CCTTACACTCGTAGGCTTCATA-3'。
以β-actin作为内参，以BMP9 mRNA/β-actin mRNA作为各组BMP9 mRNA相对含量，并且设定对照组BMP9 mRNA相对含量为1。
4、Western blot检测各组细胞中BMP9蛋白含量
取对数生长期膀胱癌T-24细胞，按上述分组培养48h。培养48h后，收集各组细胞后，使用蛋白裂解液4℃裂解30min，4℃高速离心15min，提取细胞总蛋白并定量。取50μg已加入上样缓冲液及煮沸变性的蛋白，在120V电泳分离，210mA转移蛋白至PVDF膜；转膜后用50g/L的脱脂奶粉37℃封闭60min；加兔抗人BMP9 mAb(1:5000)，小鼠抗人β-actin mAb(1:1000)，4℃过夜；洗膜10min×3次，分别加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG或辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(1:5000)，37℃孵育1h；使用1×TBST洗膜10min×3次，ECL显影，最后用Quantity One 4.6.2软件，以β-actin为内参对照对各组条带进行分析，以BMP9蛋白条带灰度/β-actin蛋白条带灰度作为各组BMP9蛋白相对含量，并且设定对照组BMP9蛋白相对含量为1。
5、统计学方法
应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差表示，多组间计量数据比较采用One-wayANOVA分析，组间比较采用LSD，以P<0.05表示差异具有统计学意义。
三、实验结果
结果如表1和图2-3所示。与对照组相比，小白菊内酯低浓度组、高浓度组细胞中BMP9 mRNA含量、BMP9蛋白含量均显著降低(P＜0.05)，且呈现浓度依赖。木香烃内酯低浓度组、高浓度组细胞中BMP9 mRNA含量、BMP9蛋白含量与对照组无明显差异。
表1各组细胞中BMP9 mRNA、BMP9蛋白含量
BMP9 mRNA相对含量 BMP9蛋白相对含量
对照组 1 1
小白菊内酯低浓度组 0.69 0.65
小白菊内酯高浓度组 0.52 0.50
木香烃内酯低浓度组 0.95 0.94
木香烃内酯高浓度组 0.96 0.95
实施例2：小白菊内酯对膀胱癌细胞增殖和迁移能力的抑制作用
一、实验材料
小白菊内酯和对比化合物木香烃内酯同实施例1。
膀胱癌T-24购于上海细胞生物研究所。RPMI-1640培养基、胎牛血清购于HyClone公司。
噻唑蓝(MTT)购于美国Sigma公司。
二、实验方法
1、细胞培养
同实施例1。
2、分组和给药
同实施例1。
3、细胞增殖活力测定
采用MTT法，收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度，按5×103个/孔密度接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液；待细胞贴壁后按上述方法进行分组给药培养，每组设3个复孔，培养48h后弃上清，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，37℃孵育4h，弃培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，用酶标仪测定490nm处吸光度(A)值，实验独立重复3次。按如下公式计算各给药组细胞增殖抑制率。
细胞增殖抑制率＝1-[(A用药组-A空白孔)/(A对照组-A空白孔)]×l00％
4、细胞迁移能力测定
取对数生长期膀胱癌T-24细胞，按上述分组培养48h。培养48h后，收集细胞，调整细胞悬液浓度至2.5×105个/mL，将200μL细胞悬液到加入包被Matigel基质胶的Transwell上室，下室加入600μL含10％血清的RPMI-1640培养基，将其放到培养箱中再培养24h。取出小室，弃上室中的培养基，用4％多聚甲醛将滤膜固定10min。丢弃甲醛，再用1％结晶紫进行染色3min。擦掉未穿过Transwell小室膜的细胞，在显微镜高倍镜下随机挑选5个视野并进行计数，然后将给药组除以对照组得到抑制率。
5、统计学方法
同实施例1。
三、实验结果
结果如表2和图4-5所示。与对照组相比，小白菊内酯低浓度组、高浓度组细胞增殖活力、细胞迁移能力均显著降低(P＜0.05)，且呈现浓度依赖。木香烃内酯低浓度组、高浓度组细胞增殖活力、细胞迁移能力与对照组无明显差异。
表2各组细胞增殖抑制率和迁移抑制率
细胞增殖抑制率(％) 细胞迁移抑制率(％)
小白菊内酯低浓度组 48.2 45.1
小白菊内酯高浓度组 70.5 68.3
木香烃内酯低浓度组 6.8 6.5
木香烃内酯高浓度组 7.0 6.9
实施例3：小白菊内酯的药物制剂
1、小白菊内酯片剂
小白菊内酯200mg，淀粉88g，硬脂酸镁3g。
制备工艺：取小白菊内酯加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，压片，即得。
2、小白菊内酯胶囊
小白菊内酯200mg，淀粉88g，硬脂酸镁3g。
制备工艺：取小白菊内酯加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，装胶囊，即得。
3、小白菊内酯注射液
小白菊内酯47mg，注射用氯化钠7mg。
制备工艺：取小白菊内酯加1.9mL注射用水溶解，加入注射用氯化钠至等渗，调节pH值至7-7.1，滤过，冷藏24小时，加注射用水至规定量，滤过，灌封，灭菌，即得。
4、小白菊内酯片剂
小白菊内酯由小白菊内酯和氢氧化钠成盐制备得到。
小白菊内酯200mg，淀粉88g，硬脂酸镁3g。
制备工艺：取小白菊内酯加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，压片，即得。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (5)

1.小白菊内酯用作骨形成蛋白9抑制剂的生物医药用途。
2.小白菊内酯用于制备抑制膀胱癌转移的药物的生物医药用途。
3.小白菊内酯用于制备治疗膀胱癌的药物的生物医药用途。
4.一种抑制膀胱癌转移的药物制剂，其特征在于：以小白菊内酯为活性成分，还含有药学上可以接受的辅料，制成药学上可以接受的剂型。
5.一种治疗膀胱癌的药物制剂，其特征在于：以小白菊内酯为活性成分，还含有药学上可以接受的辅料，制成药学上可以接受的剂型。
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