CN108431601B - 组织样本中药物结合分析的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于确定与在使用置换竞争性抑制的样本中的结合位点可逆结合的配体的特异性结合的方法。该方法包括在第一组织样本上在不存在标记配体的情况下孵育所述(未标记的)配体以及在第二组织样本上在存在标记配体的情况下孵育所述(未标记的)配体，其中第一和第二组织样本是样本的相邻切片。随后使用MALDI质谱成像分别在第一和第二组织样本中显示出结合配体的定位。

Description

组织样本中药物结合分析的方法
技术领域
本发明一般涉及质谱成像领域。更具体地，本方法涉及分析药物特异性和药物选择性的能力，具体地，本发明描述了一种能够通过质谱成像在患者样本中确定药物和代谢物的存在情况和定位的多模式方法。
背景技术
已知地，现今对医疗领域日益增加的需求给研究机构建立并提出提高成本效率以改善临床结果的新解决方案带来了很高的前景和要求。
为了应对这些挑战，现代医疗正在寻找更有效且更有益、同时更节省成本的对患者治疗的方法。监管指令的引入对我们的研究机构来说至关重要，以使研究机构设法满足例如癌症患者期望更安全、更低死亡率且药物起效更快的药物的要求。
因此，需要新的诊断方法，使得医生既能诊断疾病又能显示(manifest)患者对治疗的反应。
与国家癌症研究所、NIH以及当地的临床医生和科学家一起，制定和提供蛋白质生物标志物发现和验证策略已经取得了广泛的进展。这些监管准则为监管机构(例如美国食品和药物管理局；FDA)的批准流程提供了高质量、标准化、灵敏、特异、定量且易于获取的蛋白质、肽，或者健康、疾病或治疗反应的其他生物标志物。这些进展对于医疗专业人员通过理解药物作用机制模型来改进诊断、在早期阶段检测癌症、鉴别癌症复发的可能性以及使用差别生存(differential survivals)进行分期是至关重要的。
癌症也被称为恶性肿瘤或病理性恶性肿瘤发展。癌症的疾病机制涉及异常的细胞生长，该异常的细胞生长导致这些癌细胞入侵并极有可能扩散到器官的其他部分和身体的其他区域。最常见的症状和症状征兆通常包括异常出血和/或长时间咳嗽、不明原因的体重减轻和大便情况改变(alteration in bowel movements)，虽然这些症状可能指示癌症，但它们也可能由于其他问题而出现，并且可能有数百个不同的影响人类的已知癌症。
众所周知，大约22％的癌症死亡的原因是由于烟草的使用。另外有10％是由于超重和肥胖、不良饮食以及经常缺乏体育锻炼和过度饮酒。其他因素包括某些感染和/或暴露于感染和环境污染。在发展中国家，近20％的癌症是由于感染如乙型肝炎、丙型肝炎和人类***状瘤病毒造成的。这些因素至少部分地通过改变细胞的基因和蛋白质起作用。在癌症发病之前，通常需要诸多这样的基因变化。从统计学上说，大约5-10％的癌症是由于遗传自父母的遗传缺陷造成的。
癌症扩散和疾病的起始阶段可以通过一些征兆和症状或诊断测试检测出来。随后通常通过诸如X射线、CT、PET、MRI或质谱成像的多种类型的医学成像平台进行进一步研究，并通过活组织检查的病理诊断确诊。乳腺癌筛查的成效对于患者和社会都是有价值的，正如对患乳腺癌的女性以及患***癌的男性的治疗所证明的，在这两种疾病中，诊断的发展在过去十年中已经显著地降低了死亡率。
癌症通常使用放疗、手术和/或化疗的一些组合进行治疗。最近，靶向治疗已被证明是非常有效的。存活机会取决于癌症类型和在任何类型的治疗开始时的疾病程度。全球癌症的统计数据对任何国家的医疗行业都是一个挑战。2012年全球大约有1400万癌症新发病例，而且该数据不包括皮肤癌患者和其他类型的恶性黑色素瘤患者。癌症造成了全球大约820万人死亡，全球的癌症总体死亡率为14.6％。
男性中最常见的癌症类型是肺癌、***癌、结肠直肠癌和胃癌。女性中最常见的癌症类型是乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌和***。然而，如果包括皮肤癌和所有类型的恶性黑色素瘤，那么上述癌症类型将占病例数量的大约40％。就儿童而言，癌症类型各不相同，最常见的是急性淋巴细胞白血病和脑肿瘤。然而，在非洲，最常见的癌症是非霍奇金淋巴瘤。截至2010年，针对癌症的花费估计为每年1.16万亿美元。
个性化医疗是一种针对个体患者量身定制的医学治疗模式。在个性化医疗中，优化的治疗法通常被应用于基于患者遗传背景或其他分子或细胞分析的情况来选择适当的治疗手段。
遗传信息和药物遗传学的使用在个性化医疗的某些方面发挥了主要作用，尽管“个性化医疗”这一术语最初是在遗传学背景下产生的，但是其已经扩大到了涵盖所有类型的定向个体读数诊断测试(targeted personal read out diagnosis testing)。
个性化医疗的一些现代的进展依赖于通过对最初导致疾病确诊的DNA/RNA和/或蛋白质进行作图谱来确定患者基础生物学的“组学(OMICS)”技术(即以“组学(-omics)”结尾的生物学研究领域，例如基因组学、蛋白质组学或代谢组学)。4P医学的概念利用了这些组学平台，在现代医疗中扮演着强制性的角色，如今奥巴马医疗***(Obama healthcaresystem)正在为其发展投入大量的资源。
通过支持性的生物分子分析，为了确认给定疾病突变以及其是否可能与某种疾病相关联，研究人员经常进行一项名为GWAS(全基因组分析)的研究。GWAS研究着眼于一种疾病，然后对患有该具体疾病的诸多患者的基因组进行测序，以寻找基因组中共有的突变。
然后，通过GWAS分析确定与疾病相关的具体体细胞或点突变，通过查找其基因组序列以发现相同的突变，可以用于诊断具体疾病的基因型和可能的表现型。
多个基因共同影响许多常见和复杂疾病的患病可能性。因此，个性化医疗的进展将会产生显著多样化的治疗方法，该多样化已经被证明是针对个体及其基因组特性所特有的。个性化医疗将通过提供更好的诊断开发、导致更早的干预以及更有效的药物开发和治疗来提高疗效。
通过能够以个体为基础调查每一和各个患者，将能够提供更准确的诊断和个性化的治疗方案。现代的基因分型提供了个体DNA序列的详细说明；随后可以将该基因组与参考基因组进行比较，以评估可以解释可能的疾病状态的现有遗传变异。
除了精确治疗外，个性化医疗还能够极大地帮助预防性护理的进步。这一点多年来已经得到证实，其中通过对女性分别进行针对BRCA1和BRCA2基因中的具体突变的基因分型，以调查因乳腺癌或卵巢癌家族史所导致的易感性(predisposition)。
通过对疾病表观的多个源进行识别(identity)，其根据基因组内存在的突变绘制，表明了在个体中其识别越容易，成功治疗的机会越大。
通过获得个体的遗传背景，最终将允许在确定疾病源并因此对其进行治疗或防止其发展方面做出更好的指导性的决定。
伴随诊断定义为被用于测试针对目标患者组或亚组的药物功效和安全性。在许多情况下，伴随诊断测定有助于提高治疗疗法的效率。
如今，在现代医疗中，通常医生会经常使用试错策略(trial and errorstrategy)，直到他们找到对其患者最有效的治疗方法。
通过个性化医疗，这些治疗法可以更具体地针对个体进行量身定制，并基于他们的基因组和后续有最终表达蛋白质的转录物来理解他们的身体对药物如何反应以及药物是否起作用。
最近，癌症领域已经发现了在传统疾病病理学中呈现的癌症类型的众多遗传多样性。癌症患者之间的肿瘤异质性定义为单一肿瘤内的遗传多样性。这些发现的前景之一是其提高了识别的可能性，将具有结果不好的药物应用于普通人群也可能对具有具体基因谱的一部分病例成功。
Ho Jeong Kwon et.al.(Arch.Pharm.Res.(2015)38:1718–1727)表明，MALDI质谱成像(MSI)提供了一种技术平台，该技术平台允许在组织样本的二维空间内准确地可视化未标记的小分子。还提供了施用维罗非尼(vemurafenib)(一种靶向BRAF突变蛋白的蛋白激酶抑制剂)的患者的多种癌症例如恶性黑色素瘤的质谱成像数据。
因此，考虑个体的改进治疗方法对于这样的新方法是有利的，即该新方法能够有助于指导高复杂度的疾病生物学中的治疗。
发明内容
因此，本发明优选通过提供一种使用置换竞争性抑制(displacementcompetitive inhibition)确定配体与组织样本中的结合位点可逆结合的特异性结合的方法，寻求减轻、缓解或消除本领域中的一种或多种上述缺陷。该方法包括在第一组织样本上在不存在标记配体的情况下孵育所述配体以及在第二组织样本上在存在标记配体的情况下孵育所述配体，所述第一和所述第二组织样本是样本的相邻切片。随后使用MALDI质谱成像分别在所述第一和所述第二组织样本中可视化结合配体的定位。
附图说明
本发明的上述和其他方面、特性和优点将通过以下对本发明的实施例的描述以及参考附图而明晰和被阐明，其中：
图1是MSI实验程序的图示，示出了(A)组织学染色(H&E)的组织切片、(B)浸渗有基质(MS基质)的组织切片、(C)来自MS实验的药物的离子信号，(D)组织学切片和离子信号的叠加；
图2示出了该方法的药物定量原理和(B和C)药物浓度与通过质谱成像的信号响应之间的线性关系(A)；
图3示出了(A)在整个肿瘤组织的各个组织切片之间具有10微米间距的组织学切片的图像以及(B)药物化合物及其具体定位的质谱组织成像；
图4示出了(A)药物维罗非尼的分子结构以及(B)同位素标记的13C-维罗非尼的分子结构，其中星号标示出碳-13同位素；
图5示出了从黑色素瘤癌症肿瘤生成的MSI图像，其中(A)以MS模式(m/z 490.078)示出了维罗非尼信号反应，(B)示出了从母离子(MS/MS，(m/z 383.1))生成的碎片离子，(C)示出了来自于维罗非尼复合信号(MS/MS，(m/z 262.1))的第二碎片离子以及(D)示出了全部三个信号的叠加；
图6示出了从癌症患者的组织切片摄取的图像，其中示出了单细胞沉积形态；
图7示出了(B)从癌症患者的组织切片中摄取的图像，其中100nM维罗非尼施用于具有对应的组织学图像(A)的组织内，随后进行(C)实验，其中在组织内施用100mM 13C-维罗非尼(m/z 389.1)和100nM维罗非尼(m/z 383.1)，在100mM 13C-维罗非尼竞争性结合之后，借助相应的组织学图像(D)观察维罗非尼的残留物(m/z 383.1)；
图8中，(A)示出了从其中施用100nM维罗非尼的BRAF靶蛋白中无V600E突变的患者(阴性对照)的组织切片摄取的维罗非尼(MS/MS)信号响应(m/z 383.1)的图像，(B)示出了从来自于BRAF靶蛋白中具有V600E突变的患者的组织内施用100nM维罗非尼的组织切片摄取的维罗非尼(MS/MS)信号响应(m/z 383.1)的图像，(C)示出了从来自于在组织内施用100nM维罗非尼和1μM 13C-维罗非尼的组织切片摄取的13C-维罗非尼(MS/MS)信号响应(m/z389.1)的图像；
图9中，(A)示出了从来自于在BRAF靶蛋白中具有V600E BRAF突变的患者的施用维罗非尼(100nM)的组织的组织切片摄取的维罗非尼(MS/MS)信号响应(m/z 383.1)的图像，(B)示出了从来自于在BRAF靶蛋白中无V600E BRAF突变的患者(阴性对照)的施用维罗非尼的组织的组织切片摄取的维罗非尼(MS/MS)信号响应(m/z 383.1)的图像，(C)示出了从来自于在BRAF靶蛋白中具有V600E BRAF突变的患者的施用100nM维罗非尼和1μM 13C-维罗非尼的组织切片的细胞摄取的13C-维罗非尼(MS/MS)信号响应(m/z 389.1)的图像；
图10(A)至(D)示出了用于共孵育滴定实验的所摄取的图像，其中将固定浓度的维罗非尼施用于组织样本中，并且将13C-维罗非尼以从(A)到(D)分别为100nM、1μM、10μM、100μM的递增浓度的滴定系列添加，在孵育后，测量13C-维罗非尼(MS/MS)信号响应(m/z 389.1)。
具体实施方式
以下描述着重于本发明的实施例，这些实施例适用于测量组织样本中的药物特异性和药物选择性的质谱分析法，并且特别地适用于能够通过质谱成像筛选患者样本中的单一或多个药物和代谢物的存在的多模式测定，以及用于表征患者组织样本的药物相互作用性质的方法。然而，应当理解，本发明不限于此应用，而是可以应用于测量组织样本中分子性质和相互作用的其他应用中。
质谱分析(MS)是一种有价值的分析技术，因为质谱分析以非常高的灵敏度测量任何给定分子的固有性质(其质量)。因此，MS可以用于测量多种分子类型和多种样本类型/生物材料。在该解离过程中，在形成的一些碎片离子在阱内不稳定的条件下，通过加速将前体离子激活至质量选择性线性离子阱中。经过一段时间延迟后，离子阱的稳定性参数发生变化，以允许捕获此前不稳定的碎片。形成源自具有改进的内能态分布的前体离子的产物离子光谱。在将前体离子导入线性离子阱之后，可以跟随前体内能态分布的演变若干毫秒。时延的碎片产物离子光谱通常显示减少的连续碎片产物，产生更容易解释的光谱。已识别出对时延碎片很重要的几个重要的实验参数，并且该技术可应用于小前体离子和多电荷分子。
串联质谱分析(MS/MS)是复杂混合物的大多数现代质谱研究的核心。碎片涉及通过与目标气体的碰撞来激活前体离子，并且可能产生带电的碎片和中性的碎片。碎片离子的性质及其强度通常指示前体离子的结构，因此可以为未知分析物的识别生成有用的信息，并为不同类别的分析物提供有用的筛选技术。经多次碰撞的激活可延长激活时间并使较高的能量能够沉积至前体离子中。更高的碰撞气体压力也意味着更高的碰撞弛豫速率(collision relaxation rate)。
基质辅助激光解吸/解离(MALDI)是质谱分析中使用的软解离技术。传统的MALDI是一个包括三个步骤的过程，其中样本与合适的基质材料混合并且施加到样本金属板上。脉冲激光照射样本，所述分析物分子通过在蒸发的气体的热喷流(hot plume)中被质子化或去质子化而离子化，随后被加速至质谱仪中用于分析。
MALDI质谱成像被定义为使用基质辅助激光解吸与质谱成像技术(MALDI-MSI)，其中样本由薄组织切片组成。组织切片样本的制备是MSI中的关键步骤。将MALDI基质添加到安装在导电显微镜载玻片上的薄组织切片中。基质物质必须在激光波长处吸收并解离分析物。基质选择和溶剂***很大程度上依赖于成像所需的分析物等级。分析物必须可溶于溶剂中，以将基质混合和重结晶。基质必须具有均匀的涂层以提高灵敏度、强度和次与次的重复性(shot-to-shot reproducibility)。当应用基质时使用最少的溶剂以避免移位。
在这一步骤之后，显微镜载玻片被***MALDI质谱仪中。该仪器将记录诸如药物化合物和代谢药物分子的分子种类的空间分布。此后，可以使用合适的图像处理软件从质谱仪导入数据以允许可视化并与样本的光学图像进行比较。
在MSI研究完成后，也可以对组织切片进行组织学染色。该染色的目的是靶向关注的区域，并且通过洗涤进行预处理以去除抑制关注的分子的物质种类。
图1示出了MSI实验步骤。组织通过组织学染色来表征。通过基质沉积进行MSI实验，基质沉积后通过提供药物分析进行MSI实验。通过叠加两幅图像并识别共同的共定位，组织学切片图像和离子信号可以叠加(overplayed)并显示在最右侧的图像中。该叠加提供了组织内肿瘤细胞定位和药物共定位的证据。通过绘制离子强度与来自样本的数据的相对位置来构建图像，其中空间分辨率很大程度上影响从分析中获得的分子信息。
这项技术自引入以来在生物学研究中的应用日益显著增加。MALDI-MSI为理解疾病、改善诊断和药物送递做出重大贡献。MALDI-MSI已经能够区分药物和代谢物，并提供癌症研究中的组织学信息，使得MALDI-MSI成为具有寻找新蛋白质生物标志物的有前景的工具。目前，质谱成像(MSI)技术应用于制药行业内的药物发现以及药物开发过程。
关于药物表征，已经在行业内使用MSI技术以研究主要器官中的药物分布。ADME药代动力学特征以及可能的药物毒性和药物代谢是FDA和EMEA机构批准新药物实体所需的关键监管考虑因素，通常使用动物模型。如今，MALDI平台是在制药和生物技术行业以及国家研究中心和学术界应用的最常见的质谱技术。
组织内的微观不均一性可以通过使用基质内标(matrix internal standard)来补偿，该基质内标随后用于数据和定量标准化。通过组织表面上的基质晶体均匀薄层，(具有或不具有)内标的基质的整体组织覆盖率是绝对重要的，目的是提供可重复的和高质量的数据。
可以通过MALDI/MSI对药物进行定量，并且多年来已经有所发展，图2(C)示出了一个示例。药物定量可以通过施加已知浓度的药物溶液制剂和将其施加到组织表面(B)上来实现。随后通过MALDI成像实验分析不同水平的药物溶液。所得到的信号响应强度可以相对于药物浓度绘制出来，并且可以在校准实验(A)内建立线性关系，如图2所示。
MALDI/MSI不带有标记，并且可以应用于任何组织环境中的天然药物结构及其代谢物。随着药物通过器官发生扩散，通过各种细胞层会产生浓度梯度。位于整个组织内的细胞之间或细胞内的药物和代谢物沉淀取决于组织的微环境以及给定药物结构的药代动力学变量。在图3A-B中示出了在整个组织结构和形态中识别出的浓度梯度的药物空间分布，使得可以匹配药物水平并将其与组织的形态相关联。在图3中，在此按相邻切片分类的组织的组织学图像(图3A)描述了肿瘤的结构和形态。使用肿瘤环境作为药物图像数据(MSI实验，如图3B所示)的构架来分析维罗非尼(MS m/z 490.078)。可以看出，不同组织结构要素与维罗非尼信号共定位。
在过去的十年中，许多不同的基于MS的定量方法已经得到了发展，这些方法依赖于少数的基础技术，通常涉及一些类型的标准物用于进行比较。
相对定量药物成像的方法测量两个或更多个样本之间的相对丰度比，并且可以分为基于标记的方法和无标记的方法。不同的技术具有不同的优势；例如，体内标记更有效，并且可能标记细胞中的每个分子，但是对于一些样本(例如人类组织)来说通常是不现实的，而体外标记的方法原则上可以应用于任何类型的样本。在任何情况下，计算药物分子水平的定量值都是有挑战的。
基于MS的成像定量方法可以分类为绝对定量和/或相对定量两组。
不带标记的药物分子可以通过相对分析方法来定量，该方法借助于各自的信号读取信号值将一个信号响应与另一个信号响应相关联。确定峰值强度并计算在不同实验中匹配的分子的比率。
绝对定量已经被证明是一种挑战，并且策略通常涉及使用带标记的药物分子。药物化合物通常可以通过在结构内整合至稳定同位素来区分，从而以可预测的方式改变任何给定样本中所有其他分子的质量(如图4所示)。这些稳定的同位素可以在体内以代谢的方式(理想地)整合至所有药物化合物分子中，或者可以使用化学试剂在体外进行标记。同位素标记的药物与未标记的药物具有完全相同的理化性质。
目前对癌症患者的治疗选择很少，迫切需要对这种致死性疾病的发病机制的新了解。在可行性研究中结合啮齿动物的疾病模型对患者进行研究一直是我们研究小组多年来采取的策略。此外，给定的啮齿动物模型与施用药物之间的相关性和对来自于与完整肿瘤环境隔离的器官的组织切片的受控施用的能力是在疾病模型中进行药物表征的有价值的工具。
在作为本发明基础的研究中，使用作为用于治疗晚期黑色素瘤的BRAF酶抑制剂维罗非尼来研究药物-肿瘤的相互作用。已经显示维罗非尼通过中断B-Raf/MEK/ERK通路的B-Raf/MEK步骤导致黑色素瘤细胞系的程序性细胞死亡。图4A示出了药物维罗非尼的分子结构(其中星号代表13C同位素)。在带标记的13C维罗非尼中除了整合至碳-13同位素以外，其余结构相同。令人感兴趣的是，维罗非尼仅在BRAF具有常见的V600E突变或罕见型BRAFV600K突变时才有效。约60％的黑色素瘤具有这些突变，但没有这些突变的黑色素瘤细胞不被维罗非尼抑制。
图5示出了从黑色素瘤癌症肿瘤生成的MSI图像，其中以MS模式示出了维罗非尼信号反应，右上图示出了由母离子(MS/MS)生成的碎片离子，左下图示出了来自于维罗非尼复合信号(MS/MS)的第二碎片离子，右下图示出了全部三个信号的叠加。由于药物和代谢物的定位可以以更高的精度和准确度进行，因此以单细胞分辨率进行施用是优选的。图6示出了组织切片中显示单个细胞分布的组织学图像。激光解吸质谱分析法(MALDI)被用于鉴定患者癌症组织中的药物(维罗非尼)定位。激光直径以30微米空间分辨率的分辨能力在组织室内摄取图像。
传统MALDI-MSI药物定位的一个限制是药物和药物代谢物可能非特异性地结合或粘附到组织样本的非相关部分。这对于具有较低溶解度的或需要较高剂量的非优化药物来说尤其明显。为了使这一限制最小化，在药物孵育后洗涤样本，在此使用PBS洗涤3次，然后用MilliQ水连续洗涤3次。然而，尽管这种洗涤在一定程度上会降低由非特异性结合引起的MS信号，但尤其在诸如FDA和EMEA的当局在批准新药实体(NCEs)时需要有关在主要器官中的药物分布的详细信息时，这一限制仍会造成问题。
在本发明的方法中，通过竞争性抑制，结合在组织样本中的诸如小分子药物的配体被具有较高浓度的带标记配体置换。在实践中，将来自患者的组织样本与未标记配体、不具有同位素标记的配体和具有同位素标记的配体一起在组织样本的相邻切片上孵育，随后使用MALDI质谱成像法对定位可视化并定量结合的配体和/或标记的配体。而非特异性结合不是竞争性的，特异性结合是竞争性的。因此，使用同位素标记的配体可以区分特异性结合和非特异性结合。
在一个实施例中，确定可逆结合于组织样本中结合位点的配体的特异性结合的方法使用置换竞争性抑制。该方法包括在第一组织样本上在不存在标记配体的情况下孵育(未标记的)配体，以及在第二组织样本上在存在标记配体的情况下孵育(未标记的)配体，所述第一和所述第二组织样本是样本的相邻切片。随后，使用MALDI质谱成像分别在所述第一和所述第二组织样本中可视化配体定位。
在一个实施例中，所述配体和标记配体是同系物，特异性地结合到相同的结合位点上。在一个实施例中，所述标记配体是同位素标记的，例如氘标记配体或13C-同位素标记配体。在一个实施例中，所述配体是维罗非尼且标记配体是13C-维罗非尼。在一个实施例中，使用MALDI质谱成像法定量所述配体和/或标记配体。
详细地，我们连续地进行了以下实验步骤：
(1)在-20℃下对10微米的冷冻人类恶性黑色素瘤组织进行切片。此后，(2)通过在室温下缓慢解冻并干燥肿瘤切片来进行样本制备。随后，将切片浸入甲醇中5分钟并在室温下干燥。相应地，以相同的方式处理从***切除的冷冻人类健康组织，用作阴性对照。(3)通过使用未标记配体，这里为维罗非尼，以100nM(纳摩尔)的浓度进行药物孵育1小时，以确定配体分子与其蛋白靶标的结合。还以浓度为100nM的配体，这里为维罗非尼和过量的稳定同位素标记配体，这里为13C-维罗非尼，对患者肿瘤切片进行共孵育实验。在滴定实验过程中，稳定的同位素标记的维罗非尼的浓度分别为100nM、1μM、10μM和100μM(微摩尔)。(4)在孵育后，将切片用PBS洗涤3次，并随后用MilliQ水连续洗涤3次，以及(5)使用MALDI LTQ-Orbitrap XL仪器(德国Thermo Scientific)获得质谱，并且通过轨道阱和离子阱获得化合物信号。使用ImageQuest(德国Thermo Scientific)进行图像分析。对于组织学分析，使用针对BRAF V600E的单克隆抗体进行H&E染色和免疫组织化学分析。
在一个实施例中，对冷冻组织进行切片，并且从所述冷冻组织的相邻切片中制备第一和第二组织样本。在一个实施例中，将所述切片解冻、干燥并浸入甲醇5分钟。在一个实施例中，使用未标记配体进行配体(即药物)孵育1小时，并且使用未标记配体和过量的标记配体进行共孵育1小时。在一个实施例中，切片优选用PBS洗涤3次，随后用MilliQ水连续洗涤3次。在一个实施例中，使用MALDI LTQ-Orbitrap仪器获得质谱，通过轨道阱和离子阱获得信号，并使用ImageQuest进行图像分析。在一个实施例中，使用单克隆抗体通过H&E染色和/或免疫组织化学分析来获得组织学分析。
在一个实施例中，通过共定位，例如通过使用对于蛋白靶标具有特异性的单克隆抗体的免疫组织化学分析，来确认配体结合于蛋白靶标位置。
图7示出了其影响，该图是从癌症患者的组织切片中摄取的图像，其中(A)示出了组织样本的组织学图像，(B)示出了100nM维罗非尼在组织内施用后的相同组织样本的MSI图像，其中维罗非尼信号响应以MS模式显示。随后是癌症患者的组织切片，其中(D)示出了组织样本的组织学图像，(C)示出了在组织内施用100mM 13C-维罗非尼和100nM的维罗非尼的组织样本的MSI图像，其中维罗非尼信号响应以MS模式显示。根据所选择的测定方式，可以同时加入维罗非尼和13C-维罗非尼，从而提供在与靶蛋白结合时具有动力学竞争性的方法读数，或者分开加入维罗非尼和13C-维罗非尼。如图清楚示出的，在图7(A)中的维罗非尼信号在13C-维罗非尼的竞争性抑制后消失。由于13C-维罗非尼浓度高出千倍，结合的维罗非尼将几乎被13C-维罗非尼替换。对于非特异性地粘附在组织样本的部分的未结合维罗非尼，其不会被13C-维罗非尼明确地替换。因此，可以使用置换竞争性抑制来确定特异性结合的维罗非尼。优选地，标记配体在置换过程中以比未标记配体更高的浓度配制，例如标记配体的浓度是未标记配体的浓度的5至10000倍。通常地，未标记药物的优选浓度在纳摩尔的范围内，同位素标记的药物的浓度在微摩尔的范围内。
在一个实施例中，在置换竞争性抑制过程中，标记配体的浓度比未标记配体的浓度更高，例如为5至10000倍或10至1000倍。在一个实施例中，未标记配体具有纳摩尔的浓度，同位素标记配体具有微摩尔的浓度。
在图8和图9中，加入同位素标记的化合物(i-维罗非尼)表明了维罗非尼与i-维罗非尼的竞争***换，该竞争***换同样也提供了特异性药物结合和选择性药物结合的证据。
在图8中，示出了(A)来自于在BRAF靶蛋白中无V600E BRAF突变的患者的阴性对照的组织切片，(B)和(C)来自于在BRAF中具有V600E突变的患者的组织切片。在(A)至(C)中，在组织内施用100nM维罗非尼，并摄取维罗非尼(MS/MS)信号响应(m/z 383.1)的图像。在(C)中，1μM 13C-维罗非尼在组织内共同施用，并且摄取13C-维罗非尼(MS/MS)信号响应(m/z389.1)的图像，替换了100nM维罗非尼。
在图9(A)和(C)中示出了来自于在BRAF中具有V600E突变的患者的组织切片，在(B)中示出了来自于在BRAF靶蛋白中无V600E BRAF突变的患者的阴性对照。在(A)至(C)中，在组织内施用100nM维罗非尼，并摄取维罗非尼(MS/MS)信号响应(m/z 383.1)的图像。在(C)中，1μM 13C-维罗非尼在组织内共同施用，并且摄取13C-维罗非尼(MS/MS)信号响应(m/z389.1)的图像，替换了100nM维罗非尼。
对照组织证实了维罗非尼在无V600E BRAF突变的组织中不会在很大程度上结合。相反地，来自于在BRAF中具有V600E突变的患者的组织样本示出了与位于组织内部细胞的清晰结合。此外，竞争性结合的明确的特异性证明了药物与癌细胞和蛋白靶标结合的特异性。
使用目前的方法，所生成的数据提供了特异性结合性质，所述性质可以在维罗非尼之后和/或在i-维罗非尼药物施用后测定。在图10(A)至(D)中示出了共孵育滴定实验。加入同位素标记的化合物(13C-维罗非尼)表明了维罗非尼与i-维罗非尼的竞争***换，该竞争***换同样也提供了特异性药物结合和选择性药物结合的证据。
在一个实施例中，该方法包括在组织样本的相邻切片上将未标记配体与至少两个不同浓度的标记配体一起孵育。在一个实施例中，该方法包括使用不同的标记配体浓度进行滴定。
图10中的i-维罗非尼(在此为13C-维罗非尼)同位素信号总结于下文的表1中。表1清楚地表明，i-维罗非尼的竞争性结合随着施用水平的增加而增加。质谱分析结果清楚地表明，在维罗非尼背景下，i-维罗非尼药物浓度和与癌细胞的结合之间有线性关系。此外，可以使用所述的方法可确定治疗时的药物动力学以及代谢动力学。通过将滴定结果绘制成剂量响应曲线，可以得到IC50值，即由13C-维罗非尼造成维罗非尼的50％抑制所需要的浓度。类似地，诸如配体解离常数(Kd)的其他常数可以例如使用Cheng-Prussoff关系从IC50值中导出。对于抑制剂(例如在MAPK/ERK通路的B-Raf/MEK步骤中充当抑制剂的维罗非尼)，可以得到抑制常数(Ki)。根据靶蛋白特性以及抑制的模式(即竞争性、非竞争性或混合抑制)，可以使用合适的等式来计算抑制常数(Ki)。通常，在相同的测定条件下测量的相同抑制剂或具有相同作用机制的两种不同抑制剂的Ki和IC50可以比较为：Ki,1/Ki,2＝IC50,1/IC50,2。
因此，在一个实施例中，使用该方法计算配体和/或代谢物和/或靶受体的动力学结合特性。在一个实施例中，所述动力学结合特性为Kd(解离常数)、Ki(抑制剂解离常数)、IC50(半最大抑制浓度)。
为了阐明和理解药物作用模式，结合性质是重要的。药物机制是治疗癌症患者的关键，并且与可能的毒性方面以及患者的安全性直接相关。因此，本发明的方法可以为个体患者提供详细的药物-组织相互作用信息。举例来说，如果药物与肿瘤类型特异性地结合，并且如果药物与所有肿瘤组织均匀地结合，则针对个体可以考虑改进治疗方法，有助于指导高复杂度的疾病生物学中的治疗。
还可以成对使用多于一种的药物化合物(即配体)和同位素化合物(即标记配体)的混合物来探测结合性质。这种药物混合物可提供独特的摄取图像，其中单个药物或多个药物结合的结合性质在给定的时间过程中发生。由此，特异性结合性质的动力学可由药物结合特异性信息和详细数据确定。
在一个实施例中，该方法使用多于一对的配体和标记配体的混合物，即至少一个第一配体和相应的第一标记配体以及第二配体和相应的第二标记配体的混合物，以确定使用置换竞争性抑制可逆地结合于样本中的结合位点的第一配体和/或第二配体的特异性结合。
药物(即配体)混合物还可以包括与多个结合靶标结合的多种药物。对于这种混合物，确定所有混合成分选择性地与肿瘤组织结合是很重要的，以有助于选择有效的药物混合物，或者对于使用特异性药物混合物的治疗已被证明具有临床效果、但也具有大量副作用的情况，以优化用于治疗的药物混合物。
在一个实施例中，该方法使用多于一对的配体和标记配体的混合物，即与第一靶标结合的至少一个第一配体和相应的第一标记配体以及与第二靶标结合的第二配体和相应的第二标记配体。置换竞争性抑制被用于确定第一配体和/或第二配体的特异性结合。
标记配体可以被加入配体受体结合在孵育后已经达到或接***衡的***中。由此，可以在一段时间内监测竞争***换，提供关于药物在组织中的扩散的信息以及可能的非平衡动力学数据。在一个实施例中，该方法包括(1)以未标记配体孵育组织样本，随后(2)以标记配体孵育所述组织样本。也就是说，可以首先(在一个时间点)将配体添加到组织样本中，并且在随后的时间(在第二时间点)添加标记配体。该实验可以提供关于样本中药物渗透和分布的更多信息，并且可能提供进一步的动力学信息，例如结合的配体的滞留时间(tr)和半衰期(t1/2)，非浓度依赖的且对药物功效通常很重要的特征。
材料和方法
以下实施例仅为示例，并且绝不应被解释为限制本发明的范围。相反，本发明仅由所附的权利要求限定。
将冷冻人类恶性黑色素瘤组织从***切除，组成肿瘤组织。组织切片为使用低温恒温器在-20℃下制成的10μM(微米)厚的切片。随后，切片在室温下缓慢解冻并干燥。此后，将切片浸入甲醇中5分钟并在室温下干燥。相应地，从***切除的冷冻人类健康组织用作阴性对照。
通过使用未标记维罗非尼以100nM(纳摩尔)的浓度进行孵育1小时，以确定药物分子与其蛋白靶标的结合。还以浓度为100nM的维罗非尼和过量的稳定同位素标记的维罗非尼对患者肿瘤切片进行共孵育实验。在竞争性结合过程中孵育时间为1小时。孵育时间可以根据所进行的实验种类而变化。在滴定实验过程中，稳定同位素标记的维罗非尼的浓度分别为100nM、1μM、10μM和100μM(微摩尔)。
维罗非尼和同位素标记的13C-维罗非尼的结构式如图4A和图4B所示。
在孵育后，将切片用PBS洗涤3次，并随后用MilliQ水连续洗涤3次。
使用MALDI LTQ-Orbitrap XL仪器(德国Thermo Scientific)获得质谱。通过轨道阱和离子阱获得化合物信号。使用ImageQuest(德国Thermo Scientific)进行图像分析。对于组织学分析，使用针对BRAF V600E的单克隆抗体进行H&E染色和免疫组织化学分析。
通过从质谱图像中识别结合面积来计算结合强度，并且由信号和背景数据通过仪器的ImageQuest软件计算读取的强度。
结果
在图6中，经MSI实验处理的人类恶性黑色素瘤组织切片的图像示出了组织切片样本的单个细胞分布形态。用于鉴定癌症组织中的药物(维罗非尼)定位的激光解吸质谱分析法具有以30微米空间分辨率的分辨能力在组织室内摄取图像的激光直径。
图5(A)示出了由未标记的维罗非尼孵育的人类恶性黑色素瘤组织切片在MS模式下的维罗非尼信号响应的MSI图像。图5(B)和图5(C)分别示出了由维罗非尼的母离子(MS/MS)生成的第一和第二碎片离子的信号响应。图5(D)示出了图5(A)至图5(C)中全部信号的叠加。
图7示出了共孵育实验。图7(A)示出了患者的人类恶性黑色素瘤组织切片的组织学图像，图7(B)示出了从组织切片中摄取的图像，其中在组织中施用100nM维罗非尼。图7(D)示出了另一人类恶性黑色素瘤组织切片的组织学图像，图7(C)示出了共孵育实验，其中在组织中施用100mM13C-维罗非尼和100nM维罗非尼。加入同位素标记的化合物(13C-维罗非尼)表明了维罗非尼与i-维罗非尼的竞争***换，同样也提供了特异性药物结合和选择性药物结合的证据。在这种情况下，对照组织没有任何可测量的药物结合(未示出)。
图8(A)示出了从组织中施用100nM维罗非尼的组织切片中摄取的维罗非尼信号响应(m/z 383.1)的图像。组织(A)切片是来自于在BRAF靶蛋白中无V600E BRAF突变的患者(患者1)的阴性对照组织。图8(B)示出了从在BRAF靶蛋白中具有V600E突变的患者(患者2)摄取的图像，维罗非尼信号响应(m/z 383.1)来自于组织中施用100nM维罗非尼的组织切片。图8(C)示出了从在组织内施用100nM维罗非尼和1μM 13C-维罗非尼的患者2(在BRAF靶蛋白中具有V600E突变)的组织切片摄取的13C-维罗非尼信号响应(m/z 389.1)的图像，100nM维罗非尼被替换。
类似地，图9(A)示出了从在BRAF靶蛋白中具有V600E突变的患者(患者3)摄取的图像，维罗非尼信号响应(m/z 383.1)来自于组织中施用100nM维罗非尼的组织切片的细胞。图9(B)示出了来自于在BRAF靶蛋白中无V600E BRAF突变的患者(患者4)的阴性对照组织，示出了从组织中施用100nM维罗非尼的组织切片的细胞摄取的维罗非尼信号响应(m/z383.1)的图像。图9(C)示出了从来自于在BRAF靶蛋白中具有V600E BRAF突变的患者(患者3)摄取的图像，13C-维罗非尼信号响应(m/z 389.1)来自在组织中施用100nM维罗非尼和1μM13C-维罗非尼的组织切片的细胞，100nM维罗非尼被替换。
维罗非尼与i-维罗非尼的竞争***换提供了特异性药物结合和选择性药物结合的证据。此外，竞争***换可能会提供甚至更多的信息。在图10(A)至(D)中示出了共孵育滴定实验。图10(A)示出了从组织内施用100nM维罗非尼的组织切片的细胞摄取的13C-维罗非尼信号响应(m/z389.1)的图像。图10(B)示出了从组织内施用1μM维罗非尼的组织切片的细胞摄取的13C-维罗非尼信号响应(m/z 389.1)的图像。图10(C)示出了从组织内施用10μM维罗非尼的组织切片的细胞摄取的13C-维罗非尼信号响应(m/z 389.1)的图像。最后，图10(D)示出了从组织内施用100μM维罗非尼的组织切片摄取的13C-维罗非尼信号响应(m/z 389.1)的图像。加入同位素标记的化合物(13C-维罗非尼)表明了维罗非尼与i-维罗非尼的竞争***换，同样也提供了特异性药物结合和选择性药物结合的证据。13C-维罗非尼信号相应总结于下文的表1中。
表1：13C-维罗非尼与维罗非尼的竞争性结合
Figure BDA0001665918690000171
13C-维罗非尼的结合随着施用水平的增加而增加。如表1所示，清楚地表明了以维罗非尼为背景的13C-维罗非尼药物浓度和与癌细胞的结合之间的线性关系。竞争性结合的明确的特异性证明了药物与癌细胞和蛋白靶标结合的特异性，并且信号/浓度关系可以用于计算配体和/或代谢物和/或靶受体的动力学结合特征。
尽管上文参照一个或多个具体实施例描述了本发明，但是其并不意在限于本文所阐述的具体形式。相反，本发明仅由所附的权利要求限定，并且除上述具体实施例以外的例如与上述具体实施例不同的其他实施例在所附的权利要求的范围内具有相同的可能性。
在权利要求中，术语“包括/包含”不排除其他要素或步骤的存在。此外，虽然多个装置、要素或方法步骤单独列出，但其均可以通过例如单个元件或处理器执行。另外，虽然各个特征可以被包括在不同的权利要求中，但是这些特征可能有利地被组合，并且包含在不同的权利要求中并不意味着特征的组合是不可行的和/或不利的。另外，单数的引用不排除多个。术语“一个”(a)、“一个”(an)、“第一”、“第二”等不排除多个。权利要求中的参考标记仅作为明示的例子，并且不应被解释为以任何方式限制权利要求的范围。

Claims (14)

1.一种使用置换竞争性抑制确定配体与组织样本中的结合位点可逆结合的特异性结合的方法，所述方法包括在第一组织样本上在不存在标记配体的情况下孵育未标记的配体，在第二组织样本上在存在标记配体的情况下孵育所述未标记的配体，所述第一组织样本和所述第二组织样本是样本的相邻切片；随后使用MALDI质谱成像分别在所述第一组织样本和所述第二组织样本中可视化未标记配体的定位，其中所述未标记配体和标记配体是同系物，特异性地结合到相同的结合位点上。
2.根据权利要求1的方法，其中所述标记配体是同位素标记配体。
3.根据权利要求2的方法，其中所述同位素标记配体是氘标记配体或13C-同位素标记配体。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在置换竞争性抑制过程中，所述标记配体的摩尔浓度比所述未标记配体的摩尔浓度高。
5.根据权利要求1的方法，其中在置换竞争性抑制过程中，所述标记配体的摩尔浓度是所述未标记配体的摩尔浓度的5至10000倍。
6.根据权利要求2的方法，其中所述未标记配体具有纳摩尔的浓度，所述同位素标记配体具有微摩尔的浓度。
7.根据权利要求2的方法，其中靶蛋白的所述定位与所述同位素结合通过共定位确认。
8.根据权利要求1的方法，其中未标记配体和/或标记配体使用MALDI质谱成像进行定量。
9.根据权利要求1的方法，包括在组织样本的相邻切片上将所述未标记配体与至少两个不同浓度的标记配体一起孵育。
10.根据权利要求9的方法，其中所述方法包括使用不同的标记配体浓度进行滴定。
11.根据权利要求9或10的方法，其中从结合数据计算所述配体和/或代谢物和/或靶受体的动力学结合特性。
12.根据权利要求11的方法，其中所述动力学结合特性为Kd、Ki和/或IC50。
13.根据权利要求1的方法，其中首先在一个时间点将所述未标记配体添加到所述第二组织样本中，并且随后的时间在第二时间点添加所述标记配体。
14.根据权利要求1的方法，其中所述未标记配体是维罗非尼，并且所述标记配体是13C-维罗非尼。
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