CN108431030A - 基因疗法 - Google Patents

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Abstract

一种AAV载体，所述AAV载体包含编码因子I或因子H或者其片段或衍生物的核苷酸序列。该载体用于治疗或预防补体介导的眼部病症。

Description

基因疗法
技术领域
本发明涉及用于眼部疾病的基因疗法的化合物。更具体地，本发明涉及腺相关病毒(AAV)载体用于治疗或预防年龄相关的黄斑变性(AMD)的用途，其中所述载体能够向眼部递送因子I和/或因子H或者其片段或衍生物。
背景技术
黄斑是与视神经毗邻的眼部视网膜上的一个小区域，其大小约为3至5毫米。该区域是视网膜上最敏感的区域并含有中央凹，中央凹一个具有高视敏度并含有非常密集的锥体的凹陷区域，锥体是负责色觉的光感受器。
年龄相关的黄斑变性(AMD)是导致发达国家50岁以上人群功能性失明的最常见原因(Seddon,J M.Epidemiology of age-related macular degeneration.In:Ogden,T E,et al.,eds.Ryan S J,ed-in-chief.Retina Vol II.3rd ed.St.Louis,Mo.:Mosby；2001:1039-50)。AMD与来源于脉络膜并延伸至视网膜下腔的新生血管形成有关。此外，AMD的特征是视网膜、视网膜色素上皮细胞(RPE)和脉络膜下(位于RPE下方，在视网膜和巩膜之间的具有大量血管的组织)进行性退化。
包括氧化应激、具有可能的自身免疫成分的炎症、遗传背景(例如，突变)以及环境或行为因素(如吸烟和饮食)在内的多种因素可能有助于AMD的发病机制。
根据黄斑改变所处的阶段对AMD的临床进展进行表征。早期AMD的标志是玻璃膜疣，其是视网膜下累积的细胞外碎片，在临床检查和眼底照片上显示为视网膜上的黄色斑点。按照尺寸将玻璃膜疣分为小型(<63μm)、中型(63-124μm)和大型(>124μm)。根据眼科检查中其边缘的外观，还将其判定为硬的或软的。硬的玻璃膜疣具有清楚的边界，而软的具有不清楚且流动的边界。年龄相关的眼部疾病研究(AREDS)眼底照片严重程度分级是用于这种病况的主要分类***之一。
将AMD分类为“干”型和“湿”(渗出或新生血管)型。干性AMD比湿性AMD更为常见，但干型能够进展为湿型，且在很多情况下这两种情况同时发生。干性AMD的典型特征是上覆感光细胞的RPE层中的细胞进行性凋亡，以及通常脉络膜毛细血管层以下的细胞也进行性凋亡。将伴有上覆光感受器萎缩的RPE细胞死亡的汇合区域称为地图状萎缩。这种形式AMD患者的中央视觉经历缓慢且进行性的恶化。
湿性AMD的特征是从RPE和黄斑下的脉络膜血管(脉络膜毛细血管)生长的异常血管出血和/或流体渗漏，其可能会导致突然的视力丧失。据估计，患者出现的大部分视力丧失是由于这种脉络膜新生血管形成(CNV)及其继发性并发症所致。将新生血管性AMD亚型称为视网膜血管瘤样增生(RAP)。在这里，血管瘤样增生从视网膜开始并向下延伸到视网膜下腔，在一些情况下最终与脉络膜心血管相连通。
根据对AMD患者眼部玻璃膜疣中CS成分的鉴定发现，补体***(CS)参与早期AMD的发病机制。在AMD中，已经鉴定出至少129种类型的玻璃疣沉积蛋白，包括不同类型的载脂蛋白(E、B或A-I)、若干淀粉样肽(P、Aβ或SA-1)、TIMP-3、血清白蛋白以及与细胞功能相关的某些蛋白(例如，ATP合酶β亚基、清道夫受体B2和视黄醇脱氢酶)。来源于AMD的玻璃膜疣还含有几乎所有的补体蛋白，包括以单独的和复合形式存在的调控蛋白(CFH、补体受体1(CR1)、玻连蛋白和凝聚素)、CS的活化和降解产物(C1q、C3、C3a、C3b和C5a)以及包含MAC成分(即，5、6、8(α、β和γ)和9)的终末CS通路成员。玻璃膜疣的累积可以激活CS，触发局部炎性介质的产生并吸引白细胞，进而增强AMD中存在的局部炎症状态。
AMD目前的治疗选择包括使用苯并卟啉进行光动力疗法(Arch Ophthalmol.1999；117:1329–1345)以及靶向血管内皮生长因子(VEGF)通路的多种疗法。这种VEGF靶向疗法的实例包括适体培加他尼(N Engl J Med.2004；351:2805–2816)和诸如雷珠单抗(N Engl JMed.2006Oct 5；355(14):1432-44)和贝伐单抗(BMJ.2010Jun 9；340:c2459.)的抗体。然而，并非所有的患者均对使用抗-VEGF抗体的治疗产生应答，其或者不能恢复视力或者发展成注册失明(registered blindness)。
已开发了一种用于治疗地图状萎缩的疗法，该疗法目前正在进行III期临床研究(Genentech/Roche的MAHALO研究)。Lampalizumab是一种针对补体因子D的人源化单克隆抑制性抗体，通过玻璃体内注射施用以阻止地图状萎缩的进展速率。如图1中所示，因子D是C3b反馈(“扩增”)循环的一部分。因子D以非常低的血清浓度存在，并且是替代通路的关键因子。尽管如此，由于其尺寸较小(27kDa)，使得因子D被肾脏迅速清除并快速重新合成。该疗法需要每月进行玻璃体内注射。
本领域中需要治疗AMD的新方法。
发明内容
本发明人现提供了一种用于调节补体***的方法，该方法用于例如治疗AMD。本发明提供了通过基因疗法递送的因子I，其目的是通过靶向分解循环负向调节补体C3b反馈循环(图1)。替代通路反馈回路的所产生的重新平衡将促进C3b和iC3b分解，从而消除补体介导的病症中的主要疾病因子，特别是在替代通路调控中具有潜在缺陷的病症。或者，也可以使用因子H。
在一个方面中，本发明提供了一种腺相关病毒(AAV)载体，所述AAV载体包含编码因子I或者其片段或衍生物的核苷酸序列。在另一个方面中，本发明提供了一种腺相关病毒(AAV)载体，所述AAV载体包含编码因子H或者其片段或衍生物的核苷酸序列。在另一个方面中，本发明提供了一种腺相关病毒(AAV)载体，所述AAV载体包含编码抗-因子D抗体的核苷酸序列。在另一个方面中，本发明提供了一种腺相关病毒(AAV)载体，所述AAV载体包含编码抗-补体成分5(C5)抗体的核苷酸序列。
在一个实施方式中，编码因子I或者其片段或衍生物的核苷酸序列包含选自下组的序列：
(a)编码与SEQ ID NO：1或9具有至少70％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列；
(b)与SEQ ID NO：2或8具有至少70％同一性的核苷酸序列；以及
(c)SEQ ID NO：2或8所示的核苷酸序列。
优选地，编码因子I或者其片段或衍生物的核苷酸序列编码具有天然因子I活性的蛋白(例如，如SEQ ID NO：1或9所示的蛋白)。例如，编码因子I或者其片段或衍生物的核苷酸序列可以编码具有将C3b和iC3b加工成无活性降解产物能力的蛋白。换言之，因子I或者其片段或衍生物优选地保持C3b失活和iC3b降解活性。
在优选的实施方式中，编码因子I或者其片段或衍生物的核苷酸序列编码使C3b失活和iC3b降解活性的蛋白。
在一个实施方式中，编码因子H或者其片段或衍生物的核苷酸序列包含选自下组的序列：
(a)编码与SEQ ID NO：3具有至少70％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列；
(b)与SEQ ID NO：4具有至少70％同一性的核苷酸序列；以及
(c)SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
优选地，编码因子H或者其片段或衍生物的核苷酸序列编码具有天然因子H活性的蛋白(例如，如SEQ ID NO：3所示的蛋白)。例如，编码因子H或者其片段或衍生物的核苷酸序列可以编码具有作为因子I介导的C3b裂解的辅因子以及增加C3转化酶和C5转化酶解离速率的能力。
在另一个方面中，本发明提供了一种使用本发明的AAV载体转染的细胞。
在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明的AAV载体或细胞与药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂的组合。在优选的实施方式中，药物组合物用于眼内施用。
在一个实施方式中，AAV载体包含例如与编码因子I或H或者其片段或衍生物可操作地连接的鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。在一个实施方式中，AAV载体包含例如与编码因子I或H或者其片段或衍生物可操作地连接的CAG启动子。在一个实施方式中，AAV载体包含例如与编码因子I或H或者其片段或衍生物可操作地连接的具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的启动子。
在一个实施方式中，AAV载体包含例如与编码因子I或H或者其片段或衍生物可操作地连接的巨细胞病毒(CMV)增强子元件。
在一个实施方式中，AAV载体包含例如与编码因子I或H或者其片段或衍生物可操作地连接的牛生长激素poly-A信号，优选地牛生长激素poly-A信号具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。
在一个实施方式中，AAV载体包含例如与编码因子I或H或者其片段或衍生物可操作地连接的土拔鼠肝炎转录后调控元件(WPRE)，优选地WPRE具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。
在优选的实施方式中，本发明的AAV载体是病毒颗粒形式。
在优选的实施方式中，AAV病毒颗粒包含AAV2基因组和AAV2衣壳蛋白。优选地，编码因子I或H或者其片段或衍生物的核苷酸序列与CAG启动子可操作地连接，优选地该启动子具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
可以将本发明的AAV载体、细胞或药物组合物用于治疗或预防眼部病症。
在一个实施方式中，本发明提供了本发明的AAV载体、细胞或药物组合物用于治疗或预防补体介导的眼部病症的用途。
在一个实施方式中，该病症与补体C3b反馈循环的过度活化和/或C3b分解循环的活化不足相关(见图1)。在一个实施方式中，该病症是年龄相关的黄斑变性(AMD)或糖尿病视网膜病变。在优选的实施方式中，该病症是AMD，优选干性AMD。
在一个实施方式中，该用途是在下述对象中治疗或预防病症：
(a)在眼部和/或血清中具有低于正常的因子I的活性或浓度，优选地在血清中的浓度或活性为0-30或0-20或0-10μg/mL；和/或
(b)与年龄相关的黄斑变性(AMD)相关的SNP(优选稀有因子I变体)是杂合子或纯合子。
在一个实施方式中，该用途是在下述对象中治疗或预防病症：
(a)在眼部和/或血清中具有正常水平的因子I的活性或浓度，优选地在血清中至少为30μg/mL，如30-40μg/mL；和/或
(b)不携带稀有因子I变体等位基因。
在另一个方面中，本发明提供了本发明的AAV载体、细胞或药物组合物用于治疗或预防与年龄相关的黄斑变性(AMD)的用途。AMD可以是例如干性AMD。在优选的实施方式中，AMD是干性AMD。
在另一个方面中，本发明提供了本发明的AAV载体、细胞或药物组合物用于治疗或预防糖尿病视网膜病变的用途。
在一个实施方式中，地图状萎缩的形成被阻止或减少。在另一个实施方式中，地图状萎缩的量减少。
在一个实施方式中，地图状萎缩的进展被减慢。优选地，相对于同一时期的未治疗眼，在向对象的治疗眼施用后12个月内，地图状萎缩面积的增加减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
在另一个方面中，本发明提供了本发明的AAV载体、细胞或药物组合物用于例如在患有眼部病症(如本申请所公开的眼部病症)的对象中改善或恢复视力或视敏度的用途。在另一个方面中，本发明提供了本发明的AAV载体、细胞或药物组合物用于减轻视力或视敏度丧失(例如与眼部病症(如本申请所公开的眼部病症)相关的视力或视敏度丧失)的用途。
在另一个方面中，本发明提供了本发明的AAV载体、细胞或药物组合物用于例如在患有眼部病症(如本申请所公开的眼部病症)的对象中改善或恢复阅读速度的用途。在另一个方面中，本发明提供了本发明的AAV载体、细胞或药物组合物用于在对象中减轻阅读速度减慢(例如与眼部病症(如本申请所公开的眼部病症)相关的阅读速度减慢)的用途。
在另一个方面中，本发明提供了本发明的AAV载体、细胞或药物组合物用于减少或预防光感受器和/或视网膜色素上皮(RPE)损失(例如与眼部病症(如本申请所公开的眼部病症)相关的光感受器和/或RPE损失)的用途。
在优选的实施方式中，用于根据本发明用途的AAV载体、细胞或药物组合物是眼内施用的。发明人意识到，这种疗法的局部施用提供了实际上达到所需水平的补体因子以治疗或预防补体介导的眼部病症(例如AMD)的手段。
在一个实施方式中，本发明的AAV载体、细胞或药物组合物通过视网膜下、直接视网膜、脉络膜上或玻璃体内注射向对象的眼部施用。
在一个特别优选的实施方式中，本发明的AAV载体、细胞或药物组合物通过视网膜下注射向对象的眼部施用。
在一个实施方式中，本发明的AAV载体、细胞或药物组合物的施用使得增加了对象中(特别是对象的眼中(如RPE中))C3b失活和C3b降解活性的水平。在另一个实施方式中，本发明的AAV载体、细胞或药物组合物的施用使得增加了对象中(特别是其水平超出了眼内正常水平的对象的眼中(如RPE中))C3b失活和C3b降解活性的水平。
在另一个方面中，本发明提供了一种治疗或预防补体介导的眼部病症的方法，所述方法包括向需要其的对象施用本发明的AAV载体、细胞或药物组合物。
在一个实施方式中，该病症与补体C3b反馈循环的过度活化和/或C3b分解循环的活化不足相关。在一个实施方式中，该病症是年龄相关的黄斑变性(AMD)或糖尿病视网膜病变。在优选的实施方式中，该病症是AMD，优选地干性AMD。
在另一个方面中，本发明提供了一种治疗或预防年龄相关的黄斑变性(AMD)的方法，所述方法包括向需要其的对象施用本发明的AAV载体、细胞或药物组合物。AMD可以是例如干性AMD。在优选的实施方式中，AMD是干性AMD。
在另一个方面中，本发明提供了一种治疗或预防糖尿病视网膜病变的方法，所述方法包括向需要其的对象施用本发明的AAV载体、细胞或药物组合物。
对象可以是例如已被诊断为患有AMD或处于患AMD的风险中。
在优选的实施方式中，AAV载体、细胞或药物组合物是眼内施用。
在一个实施方式中，通过视网膜下、直接视网膜、脉络膜上或玻璃体内注射向对象的眼部施用AAV载体、细胞或药物组合物。
在一个特别优选的实施方式中，通过视网膜下注射向对象的眼部施用AAV载体、细胞或药物组合物。
在另一个方面中，本发明提供了本发明的AAV载体、细胞或药物组合物用于制备用于治疗或预防补体介导的眼部病症的药物的用途。
在一个实施方式中，该病症与补体C3b反馈循环的过度活化和/或C3b分解循环的活化不足相关。在一个实施方式中，该病症是年龄相关的黄斑变性(AMD)或糖尿病视网膜病变。在优选的实施方式中，该病症是AMD，优选地干性AMD。
在另一个方面中，本发明提供了本发明的AAV载体、细胞或药物组合物用于制备用于治疗或预防年龄相关的黄斑变性(AMD)的药物的用途。在优选的实施方式中，AMD是干性AMD。
在另一个方面中，本发明提供了本发明的AAV载体、细胞或药物组合物用于制备用于治疗或预防糖尿病视网膜病变的药物的用途。
在一个实施方式中，本发明的AAV载体不包含hAAT启动子。
在一个实施方式中，本发明的AAV载体不包含ApoR增强子。
在另一个实施方式中，本发明的AAV载体不包含两个ApoR增强子。
在一个实施方式中，本发明的AAV载体不包含AAV2基因组和AAV8衣壳蛋白，即本发明的AAV载体不是AV2/8载体。
在一个实施方式中，本发明的AAV载体、细胞或药物组合物不全身施用。在另一个实施方式中，本发明的AAV载体、细胞或药物组合物不静脉内施用。
附图说明
图1
脊椎动物补体替代途径的C3b反馈(扩增)和分解(下调)循环(“I”＝因子I；“H”＝因子H；“B”＝因子B和“D”因子D)。
图2
CFI和CFIco的限制性消化物的琼脂糖凝胶。将CFI的1752bp条带切下并克隆进入pAAV-CBA-WPRE-bGHpA骨架。
图3
CFI(图3A)和GFP(图3B)的免疫印迹。3A：CFI表现为70kDa条带(非还原)，并且在使用pAAV.CFI或pAAV.CFIco转染ARPE-19后以相等的比率表达。使用pAAV转染后无CFI表达。使用10％正常人血清(NHS)作为CFI免疫印迹的阳性对照。3B：通过将ARPE-19细胞与pCMV.GFP共转染对转染效能进行分析。GFP表现为30kDa条带并且免疫印迹证实细胞以相似的效能转染。
图4
在病毒转导的HEK-293和ARPE-19细胞系的上清液中CFI的免疫印迹。4A：在非还原条件下将上清液上样并且使用针对人CFI的小鼠单克隆抗体(OX21,Thermo FisherScientific)和驴抗小鼠IgG HRP偶联的抗体(Abcam)对CFI进行检测。在这两种细胞系中表达CFI和CFIco。将使用AAV.GFP转导的细胞系作为阴性对照，同时将0.5μg从血浆中纯化的人CFI(在本申请中称为“CFIpl”)(Comptech)作为阳性对照。4B：在非还原条件下将上清液上样并使用针对人CFI的山羊抗血清(Comptech)和家兔抗山羊IgG(全分子)过氧化物酶抗体(Sigma)检测CFI。CFI出现在80kDa(酶原)、50kDa(经加工的；重链)和35kDa(经加工的；轻链)。将AAV.GFP作为阴性对照，同时将0.5μg从血浆中纯化的人CFI(Comptech)和10％正常人血清(在本申请中称为“NHS”)作为阳性对照。在这两种细胞系中表达CFI和CFIco。
图5
C3b裂解测定的典型结果。第1道显示了仅使用CFH孵育的C3b。第2道显示了使用CFH和CFIpl孵育的C3b。C3b被CFIpl降解为iC3b和C3dg。第3道显示了使用CFH和使用AAV.CFI转导的HEK-293的上清液孵育的C3b。第4-5道显示了使用CFH和来自使用AAV.CFI(第4道)或AAV.CFIco(第5道)转导的ARPE-19细胞的免疫沉淀的CFI(称为“IP CFI”)孵育的C3b。第6-7道显示了使用CFH和来自使用AAV.CFI(第6道)或AAV.CFIco(第7道)转导的HEK-293细胞的免疫沉淀的CFI(称为“IP CFI”)孵育的C3b。
图6
由transwell培养的ARPE-19细胞分泌的CFI的免疫印迹。细胞未分化为六边形细胞，而是以融合的单层细胞形式培养，并且通过加入含1％血清的培养基而将细胞***降至最低。6A：将来自两个小室的上清液在非还原条件下上样并使用针对CFI的小鼠单克隆抗体进行western印迹分析(Ap＝顶室和Bl＝底室)。结果表明，在这两个小室中均检测到由融合的单层细胞和分泌的蛋白表达的CFI。6B：对细胞核进行Hoechst染色已证实存在单层细胞(在收集上清液后进行染色)。
图7
通过免疫印迹分析混合样品中CFI蛋白的表达。在所有剂量下以及来自AAV.CFI和AAV.CFIco时，CFI均在可检测水平下表达。将β-肌动蛋白上样作为上样对照。7A：在非还原条件下将40μg蛋白裂解物上样并使用针对人CFI的多克隆山羊抗血清检测CFI。检测到CFI在80kDa(酶原)、50kDa(经加工的；重链)和35kDa(经加工的；轻链)。这些条带对应于CFI的预期尺寸和经确证的加工，即存在重链和轻链。7B：将使用109gc/眼的AAV.CFIco注射眼和未注射眼的裂解物样品也以相同的蛋白裂解物量上样。使用针对CFI的小鼠单克隆抗体(左图，非还原凝胶)和针对CFI的山羊抗血清(右图，还原凝胶)检测CFI。在非还原凝胶(左图)中检测到在注射动物中CFI为75kDa的条带而在未注射眼中未检测到条带。在还原凝胶(右图)中，CFI出现在80kDa(酶原)、50kDa(经加工的；重链)和35kDa(经加工的；轻链)。
图8
通过qPCR进行的基因表达分析。
图9
在假处理(A-C)、AAV.CFI(D-F)和AAV.CFIco(G-H)注射的眼中hCFI的定位。使用纤连蛋白(A、D和G)和hCFI(B、E和H)将视网膜切片双重标记。使用DAPI对细胞核进行染色并进行重叠显示(C、F和I)。Scl：巩膜，RPE：视网膜色素上皮细胞，OS：光感受器外段，IS：光感受器内段，OPL：外丛状层，GCL：神经节细胞层，NFL：神经纤维层，放大倍数：20X，比例尺：50μm。
图10
在假处理(A-C)和AAV.CFI(D-F)注射的眼中hCFI的定位：对RPE进行更高倍数的放大。使用纤连蛋白(A和D)和hCFI(B和E)将视网膜切片双重标记。使用DAPI对细胞核进行染色并进行重叠显示(C和F)。Scl：巩膜，Bru：布鲁赫膜，Cho：脉络膜毛细血管层，RPE：视网膜色素上皮细胞，IPM：互感光矩阵。放大倍数：189X，比例尺：10μm。箭头表示囊泡染色，带有星号的RPE下缘表示RPE微绒毛。
图11
在假处理(A-C)和AAV.CFI(D-F)注射的眼中hCFI的定位：对光感受器层进行更高倍数的放大。使用纤连蛋白(A和D)和hCFI(B和E)将视网膜切片双重标记。使用DAPI对细胞核进行染色并进行重叠显示(C和F)。IPM：互感光矩阵，OS：外段，IS：内段，ONL：外核层。放大倍数：189X，比例尺：10μm。
图12
在假处理(A-C)和AAV.CFI(D-F)注射的眼中hCFI的定位：对外丛状层(OPL)进行更高倍数的放大。使用纤连蛋白(A和D)和hCFI(B和E)将视网膜切片双重标记。使用DAPI对细胞核进行染色并进行重叠显示(C和F)。ONL：外核层，INL：内核层。放大倍数：189X，比例尺：10μm。箭头表示水平细胞染色。
图13
在假处理(A-C)和AAV.CFI(D-F)注射的眼中hCFI的定位：对神经节细胞层(GCL)进行更高倍数的放大。使用纤连蛋白(A和D)和hCFI(B和E)将视网膜切片双重标记。使用DAPI对细胞核进行染色并进行重叠显示(C和F)。IPL：内丛状层，NFL：神经纤维层。放大倍数：189X，比例尺：10μm。
图14
在假处理(A-C)、AAV.CFI(D-F)和AAV.CFIco(G-H)注射的眼中hCFI的定位。使用纤连蛋白(A、D和G)和hCFI(B、E和H)将全标本包埋视网膜色素上皮细胞双重标记。放大倍数：40X，比例尺：30μm。
具体实施方式
补体***
补体***是体液免疫***的组成部分，并且参与组织炎症、细胞调理作用和细胞溶解。其提供了针对微生物的保护作用并且介导来自宿主组织的外源性和内源性细胞碎片的清除。
补体***级联由四条活化通路组成。所有通路最终均以C3因子中心裂解并产生其活性片段C3a和C3b结束。C3a是触发一系列趋化和促炎性应答(如炎性细胞的募集和增加微血管渗透性)的过敏毒素，而C3b负责外源表面共价附接至C3b的调理作用。用活化的C3片段(C3b和iC3b)进行调理实现三个主要功能：(i)通过吞噬细胞(例如，巨噬细胞或小胶质细胞)消除细胞碎片和刺激适应性免疫***(B细胞和T细胞)；(ii)通过形成表面结合的C3转化酶扩增补体活化；以及(iii)组装C5转化酶。
C5转化酶的组装负责C5裂解，其导致形成能够在细胞膜中产生穿孔的溶细胞膜攻击复合物(MAC)，从而促进细胞裂解和消除不必要的细胞。通过所有这些活动，先天性补体级联支持和促进免疫***下游机制的功能，其保护了宿主组织的完整性。总体而言，补体***通路活化导致促炎性应答(包括MAC产生，其介导细胞裂解)，释放趋化因子以便将炎性细胞吸引到损伤位点以及增强毛细血管通透性以促进浸润白细胞的外渗。在生理条件下，通过可溶性和膜结合补体调节分子(CRM)的协同作用有效地控制了补体活化。诸如C1-抑制剂、过敏毒素抑制剂、C4b结合蛋白(C4BP)、补体因子H(CFH)、补体因子I(CFI)、凝聚素和玻连蛋白等的可溶性补体调节剂限制了在人体组织中在多个位点的级联反应中补体的作用。此外，由表面蛋白(如补体受体1(CR1、CD35))、膜辅因子蛋白(CD46)和糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(如衰变加速因子(CD55)或CD59分子)保护每个单个细胞免受同源补体的攻击。值得注意的是，受到充分保护而免受补体攻击的宿主细胞和组织可能被旁邻细胞所裂解。
本发明涉及治疗或预防补体介导的眼部病症。例如，补体介导的病症可以是与替代通路调控缺陷相关的病症，以及特别是补体C3b反馈循环过度活化和/或C3b分解循环活化不足。
在一个实施方式中，在本发明的AAV载体、细胞或药物组合物施用之前，对象具有较低水平(例如，低于正常水平)的因子I活性，例如在眼中具有较低水平的因子I活性和/或在血清中具有较低的因子I活性。亚正常水平的因子I活性可能是由于正常功能性因子I的亚正常表达或因子I的非功能性或亚功能性变体至少部分地(例如，杂合子)表达(在正常或亚正常水平)所致。(这种对象可能携带一个或多个拷贝的AMD相关SNP，例如对象可能是将在下文中进一步讨论的稀有因子I变体之一的纯合子或杂合子。)因此，对象在眼和/或血清中可能具有低浓度(例如，低于正常浓度)的因子I。对于人对象，可以将正常水平的因子I活性(C3b-失活和iC3b降解活性)等效为在对象的血清中30-40μg/mL因子I所提供的活性。因此，在因子I活性较低的对象中，可以将血清中因子I的活性对应为小于30μg/mL且大于0μg/mL因子I，如0-20或0-10μg/mL(这些因子I血清浓度范围可以包括具有较低因子I浓度的对象)。
因此，拟被本发明所治疗的对象可能患有补体介导的眼部病症，如AMD，更具体地干性AMD(例如，其特征为地图状萎缩)，或者可能处于发展成此类病症的风险中。例如，对象可能是对与补体介导的病症相关的一个或多个SNP易感的纯合子或杂合子。
在一个实施方式中，对象处于发展成AMD的风险中。例如，对象可能是对与AMD相关的一个或多个SNP易感的纯合子或杂合子，例如与晚期AMD相关的因子I的稀有突变，其通常会导致血清因子I水平降低(Kavanagh et al.,Hum Mol Genet.2015Jul 1；24(13):3861-70)。特别地，对象可能携带一个或两个拷贝的一个或多个下述稀有的因子I变体：rs144082872(编码P50A)；4:110687847(编码P64L)；rs141853578(编码G119R)；4:110685721(编码V152M)；4:110682846(编码G162D)；4:110682801(编码N177I)；rs146444258(编码A240G)；rs182078921(编码G287R)；rs41278047(编码K441R)；rs121964913(编码R474)。
本发明还可以包括确定对象是否处于发展成补体介导的病症(例如AMD)的风险中，例如通过确定对象是否是对与补体介导的病症相关的一个或多个SNP易感的纯合子或杂合子(例如，通过确定对象是否是对与上文所列的AMD相关的一个或多个稀有因子I变体易感的纯合子或杂合子)。
或者，对象可以例如在眼和/或血清中具有正常水平的内源性因子I的活性或浓度和/或可以不携带因子I稀有变体的等位基因。
在一个实施方式中，施用本发明的AAV载体、细胞或药物组合物，从而在对象的眼中增加C3b-失活和iC3b降解活性的水平。在另一个实施方式中，施用本发明的AAV载体、细胞或药物组合物，从而在对象的眼中增加C3b-失活和iC3b降解活性的水平，使得该水平超出在眼中的正常水平。更特别地，在眼RPE中C3b-失活和iC3b-降解活性的水平增加。
将意识到的是，在由本发明的AAV载体表达因子I或者其片段或衍生物后，在对象中的C3b-失活和iC3b-降解活性可以包括由对象的内源性因子I(即，对象的因子I不是由AAV载体表达产生的)导致的C3b-失活和iC3b-降解活性和由本发明的AAV载体表达产生的C3b-失活和iC3b-降解活性，以使得在对象中C3b-失活和iC3b-降解活性的总水平超出了正常水平。
在一个实施方式中，在对象中(例如，在眼中)C3b-失活和iC3b-降解活性的水平增至高于正常水平至少5％、10％、15％、20％或25％的水平。
在另一个实施方式中，在对象中(例如，在眼中)C3b-失活和iC3b-降解活性的水平增至高达正常水平两倍的水平，或者高达超出正常水平80％、60％、40％或20％。
例如，在对象中(例如，在眼中)C3b-失活和iC3b-降解活性的水平可以增至高于正常水平5-100％、5-80％、5-60％、5-40％、5-20％、10-100％、10-80％、10-60％、10-40％、10-20％、15-100％、15-80％、15-60％、15-40％、15-20％、20-100％、20-80％、20-60％、20-40％、25-100％、25-80％、25-60％或25-40％的水平。
在一个实施方式中，施用本发明的AAV载体、细胞或药物组合物不会可检测地增加对象血清/血浆中C3b-失活和iC3b-降解活性的水平。在另一个实施方式中，施用本发明的AAV载体、细胞或药物组合物不会将对象血浆/血清中C3b-失活和iC3b-降解活性的水平可检测地增至高于正常水平的水平。
在前述章节中，除明显不适用的情况外，所提及的因子I以及C3b-失活和iC3b-降解活性可以被因子H替代并且其能够充当因子I介导C3b裂解的辅因子以及分别增加C3转换酶和C5转化酶的解离速率。在一个实施方式中，在施用本发明的AAV载体、细胞或药物组合物之前，对象具有较低水平(例如，低于正常水平)的因子H，例如在眼中具有较低水平的因子H和/或在血清中具有较低水平的因子H。对于人对象，在对象血清中因子H的正常水平可以是约200-500μg/mL。因此，在具有较低水平因子H的对象中，血清中的水平可以是小于200μg/mL且大于0μg/mL，如0-100μg/mL。或者，对象(例如，在眼和/或血清中)可以具有正常水平的内源性因子H。
因子I
补体因子I(因子I，CFI)，也称为C3b/C4b灭活剂，在人体内是由CFI基因编码的蛋白。
因子I是一种丝氨酸蛋白酶，其以酶原样状态(Roversi et al.；PNAS；2011；108(31):12839-12844)以～35μg/mL的浓度(Nilsson et al；Mol Immunol 2011,48(14):1611-1620)存在于循环中。因子I蛋白是由通过单一二硫键连接的两条多肽链组成的具有大量N-糖基化的二聚体。重链(50kDa)包括N-末端区域；FI膜攻击复合物(FIMAC)结构域；CD5样结构域或清道夫受体富含半胱氨酸(SRCR)的结构域；两个低密度脂蛋白受体(LDLr)结构域；以及功能未知的C-末端区域，该区域是物种间序列变异性的位点(Roversi etal.；如上所述)。轻链(38kDa)含有具有保守的催化残基的丝氨酸蛋白酶(SP)结构域(Goldberger et al；J Biol Chem 1987,262(21):10065-10071)。
因子I通过将C3b裂解成iC3b、C3d和C3d,g使其失活以及以类似的方法将C4b裂解成C4c和C4d。为正确执行这一功能，因子I需要存在辅因子蛋白，如C4b-结合蛋白(C4BP)、补体因子H(CFH)、补体受体1(CR1/CD35)和膜辅因子蛋白(MCP/CD46)((Degn et al.；Am JHum Genet 2011,88(6):689-705)。
iC3b不能与因子B结合，因此不能使补体级联保持放大或通过替代通路活化。因此，一旦C3b被裂解成iC3b，则不会启动替代通路或终止补体级联活化。
iC3b能够通过结合至或活化多形核白细胞(主要是中性粒细胞)、NK细胞和单核吞噬细胞(如巨噬细胞)上的补体受体3(CR3)(CD11b/CD18)提供促炎性作用。
因子I能够通过需要辅因子CR1的蛋白酶活性将iC3b加工成C3d,g。C3d,g不能与CR3结合。由于iC3b与补体受体CR3的反应是补体活化以产生炎症的主要机制，因此将iC3b裂解成C3d,g是减少补体诱导的炎症所必需的(Lachmann(2009),Adv.Immunol.,104:115-149)。
因子I具有独特的促进C3b裂解成iC3b以及加速iC3b降解的能力——加之其在人血清中的相对浓度较低，意味着达到治疗有效性所需的递送的量较低——这使得其是特别有利的靶点。
在一个实施方式中，因子I多肽或者其片段或衍生物能够将C3b裂解成无活性降解产物。例如，因子I多肽或者其片段或衍生物能够将C3b裂解成iC3b。
在一个实施方式中，因子I多肽或者其片段或衍生物能够将iC3b加工成无活性的降解产物。例如，因子I多肽或者其片段或衍生物可能具有将iC3b加工成C3d,g的能力。
在一个优选的实施方式中，因子I多肽或者其片段或衍生物能够将C3b裂解成iC3b以及将iC3b加工成C3d,g。
因子I的片段或衍生物可以保留天然因子I的C3b-失活和iC3b-降解活性的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。可以使用本领域技术人员公知的任意适宜方法确定因子I的片段或衍生物以及天然因子I的C3b-失活和iC3b-降解活性。例如，在Hsiunget al(Biochem.J.(1982)203,293-298)中描述了对因子I蛋白水解活性的测量。在Ed DMWeir Blackwells Scientific Publications出版的Handbook of ExperimentalImmunology(第3版)第5A章第17页中的Lachmann PJ&Hobart MJ(1978)"ComplementTechnology"中描述了对TI活性的溶血和凝集测定。Harrison RA(1996)在由HerzenbergLeonore A'Weir DM主编的Herzenberg Leonard A&Blackwell C Blackwells ScientificPublications出版的“Weir's Handbook of Experimental Immunology”(第5版)中给出了包括蛋白水解测定在内的更详细的描述，见第75章，第36-37页。凝集测定非常敏感，能够用于检测将固定的C3b转化为iC3b并获取与凝集素的反应性的第一(双)夹子(clip)；以及通过从固定的iC3b开始并且寻找与凝集素的反应性丢失用于检测对C3dg的最终的夹子。溶血测定用于将C3b转化为iC3b，以及蛋白水解测定检测所有的夹子。
在一个实施方式中，因子I是人因子I。
人因子I蛋白的实例是具有UniProtKB登记号P05156的人因子I蛋白。该示例性序列的长度为583个氨基酸(如SEQ ID NO:1所示)，其中氨基酸1至18是信号序列。
在一个实施方式中，因子I的氨基酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列。在一个实施方式中，因子I的氨基酸序列是如SEQ ID NO:1的位置19至583所示的序列。
(SEQ ID NO:1)
在一个实施方式中，因子I的氨基酸序列是如SEQ ID NO:9所示的序列，其对应于NCBI登记号NP_000195。在一个实施方式中，因子I的氨基酸序列是如SEQ ID NO:9的位置19至583所示的序列。
(SEQ ID NO:9)
编码因子I的核苷酸序列的实例是具有NCBI登记号NM_000204的核苷酸序列。在一个实施方式中，编码因子I的核苷酸序列是具有NCBI登记号NM_000204的核苷酸序列。
在一个实施方式中，编码因子I的核苷酸序列是如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
(SEQ ID NO:2)
在本发明中使用的核苷酸序列可以是密码子优化的。此前已在WO1999/041397和WO 2001/079518中对密码子优化进行了描述。不同的细胞在使用特定密码子方面有所不同。这种密码子偏好对应于在细胞类型中特定tRNA相对丰度的偏好。通过改变序列中的密码子，使得能够对其进行定制以匹配相应tRNA的相对丰度，这可能会增加表达。同样地，通过故意选择与已知在特定细胞类型中稀有的相应tRNA对应的密码子，可能会减少表达。因此，可以获得附加程度的翻译控制。
在一个实施方式中，编码因子I的核苷酸序列是如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
ATGAAGCTGCTGCATGTCTTTCTGCTGTTTCTGTGCTTCCATCTGCGGTTCTGTAAAGTGACCTATACTAGCCAGGAGGATCTGGTGGAGAAGAAGTGTCTGGCCAAGAAGTACACACACCTGAGCTGCGACAAGGTGTTCTGTCAGCCTTGGCAGCGGTGCATCGAGGGCACCTGCGTGTGCAAGCTGCCTTACCAGTGCCCAAAGAACGGCACCGCCGTGTGCGCCACAAATCGGAGATCTTTTCCAACATATTGCCAGCAGAAGAGCCTGGAGTGTCTGCACCCCGGCACCAAGTTCCTGAACAATGGCACCTGCACAGCCGAGGGCAAGTTTTCTGTGAGCCTGAAGCACGGCAACACAGATAGCGAGGGCATCGTGGAGGTGAAGCTGGTGGACCAGGATAAGACCATGTTCATCTGTAAGAGCTCCTGGTCCATGAGGGAGGCAAACGTGGCATGCCTGGATCTGGGATTCCAGCAGGGAGCAGACACACAGAGGCGCTTTAAGCTGTCCGACCTGTCTATCAATAGCACCGAGTGCCTGCACGTGCACTGTAGGGGCCTGGAGACATCCCTGGCAGAGTGCACCTTCACAAAGCGGAGAACCATGGGCTACCAGGACTTTGCCGACGTGGTGTGCTATACCCAGAAGGCCGATAGCCCCATGGACGATTTCTTTCAGTGCGTGAACGGCAAGTATATCTCCCAGATGAAGGCCTGCGACGGCATCAATGACTGTGGCGATCAGTCTGACGAGCTGTGCTGTAAGGCCTGTCAGGGCAAGGGCTTCCACTGCAAGAGCGGCGTGTGCATCCCTTCCCAGTACCAGTGCAACGGCGAGGTGGATTGTATCACAGGAGAGGACGAAGTGGGATGCGCAGGATTTGCATCTGTGGCACAGGAGGAGACAGAGATCCTGACAGCCGACATGGATGCCGAGAGGCGCCGGATCAAGTCTCTGCTGCCTAAGCTGAGCTGTGGCGTGAAGAATCGGATGCACATCAGAAGGAAGCGCATCGTGGGAGGCAAGAGGGCACAGCTGGGCGATCTGCCATGGCAGGTGGCCATCAAGGACGCCTCTGGCATCACCTGCGGCGGCATCTACATCGGAGGATGTTGGATCCTGACCGCAGCACACTGCCTGAGAGCAAGCAAGACACACAGGTATCAGATCTGGACCACAGTGGTGGATTGGATCCACCCAGACCTGAAGAGAATCGTGATCGAGTACGTGGATAGGATCATCTTTCACGAGAACTACAATGCCGGCACATATCAGAACGACATCGCCCTGATCGAGATGAAGAAGGATGGCAATAAGAAGGACTGTGAGCTGCCCAGATCCATCCCTGCATGCGTGCCATGGAGCCCCTATCTGTTCCAGCCCAACGATACCTGCATCGTGTCCGGATGGGGAAGGGAGAAGGACAATGAGCGGGTGTTTTCTCTGCAGTGGGGCGAGGTGAAGCTGATCTCCAACTGTTCTAAGTTCTACGGCAATAGGTTTTATGAGAAGGAGATGGAGTGCGCCGGCACCTACGATGGCAGCATCGACGCCTGTAAGGGCGATTCCGGAGGACCACTGGTGTGCATGGACGCAAACAATGTGACATACGTGTGGGGAGTGGTGTCCTGGGGAGAGAACTGCGGCAAGCCAGAGTTCCCCGGCGTATATACCAAGGTGGCCAATTATTTTGATTGGATTTCCTACCACGTCGGCAGGCCCTTTATTTCCCAGTATAATGTCTAA
(SEQ ID NO:8)
编码因子I或者其片段或衍生物的核苷酸序列例如可以包含与SEQ ID NO:2或8具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，其中由该核苷酸序列编码的蛋白基本上保留了如SEQ ID NO:1或9所示蛋白的功能性活性。
编码因子I或者其片段或衍生物的核苷酸序列例如可以包含与SEQ ID NO:2或8的位置55至1752所示的序列具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，其中由该核苷酸序列编码的蛋白基本上保留了如SEQ ID NO:1或9所示蛋白的功能性活性。
编码因子I或者其片段或衍生物的核苷酸序列例如可以编码与SEQ ID NO:1或9具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸序列基本上保留了如SEQ ID NO:1或9所示蛋白的功能性活性。
编码因子I或者其片段或衍生物的核苷酸序列例如可以编码与SEQ ID NO:1或9的位置19至583所示的序列具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸序列基本上保留了如SEQ ID NO:1或9所示蛋白的功能性活性。
本发明的优点是因子I是以纯化蛋白的形式特别难以制备的。因此，例如，本发明人设计了一种调节补体***的方法，以便能够治疗年龄相关的黄斑变性(AMD)，该***通过以包含编码因子I的核苷酸序列的AAV载体形式施用因子I。AAV载体可以向所关注的位点(例如，眼部)施用，以使得能够在原位翻译因子I多肽。
因子H
补体因子H(因子H，CFH)是一种补体控制蛋白。
其是通常以200–300μg/mL的浓度存在于人血浆中的较大的(155kDa)、可溶性糖蛋白(Hakobyan et al.；2008；49(5):1983–90)。因子H的主要功能是调控补体***的替代通路。
因子H为因子I介导的C3b裂解提供了辅因子活性。因子H还增加了C3bBb复合物(C3转化酶)和(C3b)NBB复合物(C5转化酶)的解离速率，从而降低了替代不同通路的活性。
因子H由彼此之间通过短接头(在3至8个氨基酸残基之间)连接的20个补体控制蛋白(CCP)模块(也称为短共有重复序列或Sushi结构域)组成并且以头尾相连延伸的形式排列。每个CCP模块由约60个氨基酸组成，其中具有在1-3 2-4排列中以二硫键连接的四个半胱氨酸残基，以及周围由几乎不变的色氨酸残基构成的疏水性核。CCP模块的编号为从1-20(从蛋白的N-末端开始)。CCP 1-4和CCP 19-20与C3b结合，而CCP7和CCP 19-20与GAG和唾液酸结合(Schmidt et al；2008；Journal of Immunology 181(4):2610–9)。
已发现，使用因子H的基因疗法能够减轻在小鼠中诱导的AMD样病理变化(Cashmanet al.(2015)J.Gene Med.17:229-243)。使用下述物质对小鼠进行视网膜下共注射：(i)表达补体成分C3的腺病毒载体，此前已证实其能够再现人AMD的很多病理特征；以及(ii)表达因子H的腺病毒载体。与接受GFP而非因子H的对照小鼠相比，使用因子H转导的小鼠内皮细胞增殖减少91％和RPE萎缩减少69％。视网膜电图显示在接受因子H的小鼠中视网膜功能得到改善，以及视紫红质和RPE65的免疫细胞化学与在此类动物中对光感受器和RPE的挽救一致。
在一个实施方式中，因子H多肽或者其片段或衍生物能够作为因子I介导的C3b裂解的辅因子。在一个实施方式中，因子H多肽或者其片段或衍生物能够增加C3转化酶和C5转化酶的解离速率。
在一个优选的实施方式中，因子H多肽或者其片段或衍生物能够作为因子I介导的C3b裂解的辅因子以及增加C3转化酶和C5转化酶的解离速率。
在一个实施方式中，因子H是人因子H。
示例性的人因子H蛋白是具有UniProtKB登记号P08603的人因子H蛋白。该示例性序列的长度为1231个氨基酸(如SEQ ID NO:3所示)，其中氨基酸1至18是信号序列。
在一个实施方式中，因子H的氨基酸序列为如SEQ ID NO:3所示的序列。在一个实施方式中，因子H的氨基酸序列是如SEQ ID NO:3的位置19至1231所示的序列。
(SEQ ID NO:3)
编码因子H的核苷酸序列的实例是具有NCBI登记号NM_000186的核苷酸序列。在一个实施方式中，编码因子H的核苷酸序列是具有NCBI登记号NM_000186的核苷酸序列。
在一个实施方式中，编码因子H的核苷酸序列是如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
(SEQ ID NO:4)
编码因子H或者其片段或衍生物的核苷酸序列例如可以包含与SEQ ID NO:4具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，其中由该核苷酸序列编码的蛋白基本上保留了如SEQ ID NO:3所示蛋白的功能性活性。
编码因子H或者其片段或衍生物的核苷酸序列例如可以包含与SEQ ID NO:4的位置55至3696所示的序列具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，其中由该核苷酸序列编码的蛋白基本上保留了如SEQ ID NO:3所示蛋白的功能性活性。
编码本发明的因子H的核苷酸序列例如可以编码与SEQ ID NO:3具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸序列基本上保留了如SEQ ID NO:3所示蛋白的功能性活性。
编码本发明的因子H的核苷酸序列例如可以编码与SEQ ID NO:3的位置19至1231所示的序列具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中该氨基酸序列基本上保留了如SEQ ID NO:3所示蛋白的功能性活性。
因子D
补体因子D(因子D，CFD)参与补体***的替代补体通路。其功能是将因子B裂解为因子Bb和Ba。
因子D是肽酶的胰蛋白酶家族成员。丝氨酸蛋白酶中的糜蛋白酶家族中的所有成员均具有非常相似的结构。在包括因子D在内的所有情况下，在所有酶中均具有两个反向平行的β-桶状结构域，其中的每个桶状结构中含有相同类型的6个β-链。因子D与糜蛋白酶家族中其他丝氨酸蛋白酶在骨架上的主要差异在于连接二级结构元件的表面环上。
替代性补体活化级联由血浆中富含的C3的自发性水解引发。通过C3中硫酯键的自发性裂解形成C3(H2O)发生“缓慢运转(Tickover)”。
这种形状的变化能够使血浆蛋白与因子B结合，这使得因子D将因子B裂解为Ba和Bb。Bb仍然是C3(H2O)的一部分以形成C3(H2O)Bb。还将这种复合物称为液相C3-转化酶。这种转化酶尽管产生的量较少，但是能够将多个C3蛋白裂解为C3a和C3b。
本发明的AAV载体可以含有编码抗-因子D抗体的核苷酸序列。
抗-因子D抗体可以与因子D结合并减少或阻止因子D的功能性活性。例如，抗-因子D抗体可以减少或阻止因子D与因子B结合和/或因子D对因子B的裂解。
适宜的抗-因子D抗体是本领域公知的。这种抗体包括但不限于Lampalizumab。
补体成分5
补体成分5(C5)是第五种补体成分，其在炎症和细胞杀伤过程中起重要作用。C5由通过二硫键桥连的α和β多肽链组成。
C5被蛋白酶C5-转化酶裂解为补体成分5a(C5a)和C5b片段。C5b在补体级联的晚期事件中是重要的，而C5a的作用是高度炎性肽。C5的来源通常是肝细胞，但是在巨噬细胞中也发现了其合成，并且这可能导致C5a的局部增加。C5a具有催化和过敏毒素性质，其在先天免疫中是必要的，但是也与获得性免疫有关。C5a的产生增加与多种炎性疾病有关。
C5a是一种过敏毒素，其导致内皮上粘附分子的表达增加，使平滑肌收缩以及使血管通透性增加。C5a des-Arg(其缺乏C-末端精氨酸)是一种效力低得多的过敏毒素。C5a和C5a des-Arg均能够触发肥大细胞脱颗粒、释放促炎性分子组胺和TNF-α。C5a还是一种有效的化学引诱物，其引发补体和吞噬细胞在感染部位的积聚或将抗原呈递细胞募集到***。C5a在增加中性粒细胞和单核细胞向血管壁的迁移和粘附中起关键作用。通过上调整合素的亲和力、脂氧合酶通路以及花生四烯酸代谢使白细胞活化。C5a还能够调节白细胞上的IgG Fc受体的活化与抑制之间的平衡，从而增强自身免疫性应答。
本发明的AAV载体可以包含编码抗-C5抗体的核苷酸序列。
抗-C5抗体可以与C5结合并阻止C5裂解为C5a和C5b。
适宜的抗-C5抗体是本领域公知的。这种抗体包括但不限于依库丽单抗(Eculizumab)。
抗体
抗体指保留了与亲本抗体结合至相同抗原靶点的能力的抗体或其片段的任何部分。
抗体可以是嵌合抗体。嵌合抗体可以由将来自一个物种(例如，小鼠)的抗体可变结构域移植到来自另一物种(例如，人)的抗体恒定结构域上生产。
抗体可以是全长的经典抗体。例如，抗体可以是IgG、IgM或IgA分子。
抗体可以是功能性抗体片段。特异性抗体片段包括但不限于(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段，(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段，(iii)由单链抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段，(iv)dAb片段，其由单一可变结构域组成，(v)分离的CDR区，(vi)F(ab')2片段，一种包含两个连接的Fab片段的二价片段，(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，该接头使得这两个结构域能够结合以形成抗原结合位点，(viii)双特异性单链Fv二聚体，以及(ix)“双体”或“三体”，其是通过基因融合构建的多价或多特异性片段。可以对抗体片段进行修饰。例如，可以通过引入将VH与VL结构域相连接的二硫键使分子稳定化。
本申请所述的抗体可以是多特异性抗体，特别是双特异性抗体，有时也将其称为“双体”。这些抗体与两个(或多个)不同的抗原结合。抗体可以是微型抗体。微型抗体是最小化的抗体样蛋白，其包含与CH3结构域连接的scFv。在一些情况下，scFv可以与Fc区连接，并且可以包含铰链区的一些和全部。
抗体可以是域抗体(也称为单域抗体或纳米抗体)。这是含有单一单体单可变抗体结构域的抗体片段。单域抗体的实例包括但不限于最初从骆驼中发现的VHH片段和最初从软骨鱼类中发现的VNAR片段。单域抗体还可以通过将来自常见IgG分子的二聚体可变结构域分成单体产生。
抗体可以是合成抗体(也称为抗体模拟物)。抗体模拟物包括但不限于Affibody、DARPin、Anticalin、Avimer、Versabody和Duocalin。
年龄相关的黄斑变性(AMD)
根据黄斑改变所处的阶段对AMD的临床进展进行表征。早期AMD的标志是玻璃膜疣，其是视网膜下累积的细胞外碎片，在临床检查和眼底照片上显示为视网膜上的黄色斑点。按照尺寸将玻璃膜疣分为小型(<63μm)、中型(63-124μm)和大型(>124μm)。根据眼科检查中其边缘的外观，还将其判定为硬的或软的。硬的玻璃膜疣具有清楚的边界，而软的具有不清楚且流动的边界。年龄相关的眼部疾病研究(AREDS)眼底照片严重程度分级是用于这种病况的主要分类***之一。
将AMD分类为“干”型和“湿”(渗出或新生血管)型。干性AMD比湿性AMD更为常见，但干型能够进展为湿型，且在很多情况下这两种情况同时发生。干性AMD的典型特征是上覆感光细胞的RPE层中的细胞进行性凋亡，以及通常脉络膜毛细血管层以下的细胞也进行性凋亡。将伴有上覆光感受器萎缩的RPE细胞死亡的汇合区域称为地图状萎缩(GA)。这种形式AMD患者的中央视觉经历缓慢且进行性的恶化。
湿性AMD的特征是从RPE和黄斑下的脉络膜血管(脉络膜毛细血管)生长的异常血管出血和/或流体渗漏，其可能会导致突然的视力丧失。据估计，患者出现的大部分视力丧失是由于这种脉络膜新生血管形成(CNV)及其继发性并发症所致。
本申请所述的AMD的治疗或预防可以减少或阻止上文所述的AMD表型的出现。优选地，AMD的治疗能够保持或改善视功能。
在一个实施方式中，AMD的治疗或预防导致地图状萎缩的形成被阻止或减少。在另一个实施方式中，AMD的治疗或预防导致地图状萎缩的进展减慢。例如，其结果是相对于同一时期的未治疗眼，在向对象的治疗眼施用后12个月内，GA面积的增加减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在另一个实施方式中，AMD的治疗或预防导致了地图状萎缩的治疗，例如地图状萎缩的量减少。
在一个实施方式中，AMD的治疗或预防导致玻璃膜疣的形成被阻止或减少。在另一个实施方式中，AMD的治疗或预防导致现有的玻璃膜疣被减少，例如现有玻璃膜疣的尺寸和/或数量减少。
在一个实施方式中，AMD的治疗或预防导致补体沉积被阻止或减少。在另一个实施方式中，AMD的治疗或预防导致现有的补体沉积被减少。
在一个实施方式中，AMD的治疗或预防导致视力或视敏度的改善或恢复。在另一个实施方式中，AMD的治疗或预防减轻了视力或视敏度的丧失。
在一个实施方式中，AMD的治疗或预防导致对象阅读速度的改善或恢复。在另一个实施方式中，AMD的治疗或预防减轻了对象阅读速度的降低。
在一个实施方式中，AMD的治疗或预防导致光感受器和/或视网膜色素上皮细胞(RPE)的丧失减少或被阻止。
糖尿病视网膜病变
糖尿病视网膜病变是一种以视网膜血管损伤为特征的病况，该病况由与糖尿病相关的高血糖水平引起。如果不及时治疗，糖尿病视网膜病变会导致失明。
尽管轻度糖尿病视网膜病变的对象可能具有良好的视力，但是两种类型的糖尿病视网膜病变，即糖尿病性黄斑水肿(DMO)和增生性糖尿病视网膜病变(PDR)可能威胁对象的视力。
糖尿病性黄斑水肿的特征为流体从眼后部的受损血管中渗漏。渗漏的流体在黄斑中累积，导致肿胀和视力模糊。这最终能够导致中央视觉较差以及不能阅读或驾驶。侧视力通常保持正常。
增生性糖尿病视网膜病变的特征为视网膜血管闭合，导致视网膜表面异常的、脆弱血管生长。这可能会导致因眼内出血、疤痕和视网膜脱落引起的永久性视力丧失。
眼的结构
据信可以将本申请所公开的药物向哺乳动物(优选人)的眼部递送，以治疗或预防年龄相关的黄斑变性(AMD)。
本领域技术人员在对眼部疾病的治疗中将对眼部的结构有一个详细且全面的了解。但是，仅描述了与本发明特别相关的以下结构。
视网膜
视网膜是多层膜，其排列在眼内后房并感知通过视神经传达给大脑的视觉世界的图像。按照从眼内侧到外侧的顺序，视网膜包括神经感觉视网膜层和视网膜色素上皮细胞，后者具有位于视网膜色素上皮细胞外侧的脉络膜。神经感觉视网膜和感光细胞
神经感觉视网膜具有直接感光的感光细胞。其包括以下几层：内界膜(ILM)；神经纤维层；神经节细胞层；内丛状层；内核层；外丛状层；外核层(光感受器的核)；外界膜(ELM)；和光感受器(视杆和视锥的内段和外段)。
本领域技术人员将会对感光细胞有一个详细的了解。简言之，感光细胞是位于视网膜中的将光转化为生物信号的特化神经元。感光细胞包括视杆细胞和视锥细胞，其在视网膜上的分布不同。
视杆细胞主要分布在视网膜外部。其非常敏感并在低光照条件下提供视力。在正常人视网膜中平均有大约1.25亿个视杆细胞。
视锥细胞也存在于视网膜上，但是其主要集中在中央凹处，中央凹是神经感觉视网膜上负责中央高分辨率视觉的一个凹陷。视锥细胞的敏感性不及视杆细胞。在正常人视网膜中平均有大约6-7百万个视锥细胞。
视网膜色素上皮细胞
视网膜色素上皮细胞(RPE)是紧邻神经感觉视网膜外部的有色细胞层。RPE具有多种功能，包括向感光细胞输送营养和其他物质，以及吸收散射光以改善视力。
脉络膜
脉络膜是位于RPE与眼外侧巩膜之间的血管层。脉络膜的血管***能够向视网膜提供氧气和营养物质。
腺相关病毒(AAV)载体
在一个方面中，本发明提供了一种AAV载体，所述AAV载体包含编码因子I或者其片段或衍生物，和/或因子H或者其片段或衍生物的核苷酸序列。
优选地，AAV载体是AAV颗粒形式。
制备和修饰病毒载体和病毒载体颗粒(如来自AAV的那些)的方法是本领域所熟知的。
AAV载体可以含有AAV基因组或者其片段或衍生物。
AAV基因组是编码生产AAV颗粒所需功能的核苷酸序列。这些功能包括在宿主细胞中在AAV的复制和包装循环中操作的那些功能，包括将AAV基因组衣壳化成AAV颗粒。天然存在的AAV是复制缺陷的，并且依靠反式提供的辅助功能完成复制和包装循环。因此，本发明AAV载体的AAV基因组通常是复制缺陷的。
AAV基因组可以是单链形式，其可以是正义链也可以是负义链，或者是双链形式。使用双链形式使得能够在靶细胞中进行DNA复制步骤的旁路，从而能够加快转基因表达。
AAV基因组可以来自于AAV任何天然来源的血清型、分离物或进化枝。因此，AAV基因组可以是天然存在的AAV的全基因组。如本领域技术人员公知的，可以根据不同生物***对自然界中存在的AAV进行分类。
通常，根据其血清型对AAV命名。血清型与AAV的变体亚种相对应，根据其衣壳表面抗原的表达谱，使得不同血清型具有独特的反应性，可以将其用于与其他变体亚种相区分。通常，具有特定AAV血清型的病毒不能有效地与特异性针对任何其他AAV血清型的中和抗体交叉反应。
AAV的血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11，以及还包括最近从灵长类的脑中鉴定得到的重组血清型，如Rec2和Rec3。任何这些AAV血清型均可以用于本发明。因此，在本发明的一个实施方式中，AAV载体颗粒是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rec2或Rec3AAV载体颗粒。
在一个实施方式中，AAV可以是AAV1、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8或AAV8血清型。
在一个实施方式中，AAV可以是AAV2或AAV8血清型。
衣壳蛋白可以是突变衣壳蛋白，如在WO 2008/124724中所公开的，其通过引用在此并入。
在一个实施方式中，AAV载体包含具有Y733F突变的AAV8衣壳。
对AAV血清型的综述可以参见Choi et al.(2005)Curr.Gene Ther.5:299-310和Wu et al.(2006)Molecular Therapy 14:316-27。在本发明中使用的AAV基因组的序列或包括ITR序列、rep或cap基因在内的AAV基因组的元件可以来自下述AAV全基因组序列的登记号：腺相关病毒1NC_002077，AF063497；腺相关病毒2NC_001401；腺相关病毒3NC_001729；腺相关病毒3B NC_001863；腺相关病毒4NC_001829；腺相关病毒5Y18065，AF085716；腺相关病毒6NC_001862；禽类AAV ATCC VR-865AY186198，AY629583，NC_004828；禽类AAV株DA-1NC_006263，AY629583；牛AAV NC_005889，AY388617。
还可以用进化枝或克隆对AAV进行命名。其指天然来源AAV的***进化关系，其通常指能够追溯到共同祖先并包括其所有后代的AAV***进化组。此外，可以根据特定分离物对AAV进行命名，即在自然界中发现的特定AAV的遗传分离物。术语遗传分离物描述了一个AAV群，其与其他天然存在的AAV经历了有限的遗传混合，从而在遗传水平上定义了可识别的不同的群。
本领域技术人员能够根据其普通常识选择在本发明中使用的适宜的AAV的血清型、进化枝、克隆或分离物。例如，已发现AAV5衣壳能够有效地转导灵长类的视锥光感受器，已证实其能够成功校正遗传学色觉缺陷(Mancuso et al.(2009)Nature 461:784-7)。
AAV血清型决定了AAV病毒感染或(嗜性)的组织特异性。因此，用于根据本发明的向患者施用的AAV优选对眼内的靶细胞具有天然嗜性或能够高效的对其进行感染的AAV血清型。在一个实施方式中，在本发明中使用的AAV血清型是能够转导神经感觉视网膜细胞、视网膜色素上皮细胞和/或脉络膜的那些。
通常地，AAV的天然来源血清型、分离物或进化枝的AAV基因组包含至少一个反向末端重复序列(ITR)。顺式作用的ITR序列提供了功能性复制原点并能够将载体从细胞的基因组上整合和切除。在优选的实施方式中，一个或多个ITR序列在编码因子I和/或因子H(或者其片段或衍生物)的核苷酸序列的翼侧。AAV基因组通常还包含包装基因，如rep和/或cap基因，其编码AAV颗粒的包装功能。Rep基因编码蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40或其变体中的一个或多个。Cap基因编码一个或多个衣壳蛋白，如VP1、VP2和VP3或其变体。这些蛋白组成了AAV颗粒的衣壳。在下文中对衣壳变体进行讨论。
启动子将与每个包装基因可操作连接。这种启动子的具体实例包括p5、p19和p40启动子(Laughlin et al.(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:5567-5571)。例如，p5和p19启动子通常用于表达rep基因，而p40启动子通常用于表达cap基因。
如上文所讨论的，在本发明的AAV载体中使用的AAV基因组因此可以是天然存在的AAV的全基因组。例如，可以将包含AAV全基因组的载体用于在体外制备AAV载体或载体颗粒。然而，尽管原则上可以向患者施用这种载体，但是在实践中很少这样做。优选地，将对AAV基因组进行衍生化以用于向患者施用的目的。这种衍生化在本领域中是标准的，并且本发明包括使用任何公知的AAV基因组的衍生物，以及可以通过应用本领域公知的适宜技术产生衍生物。在Coura and Nardi(2007)Virology Journal 4:99以及上文引用的Choi etal.和Wu et al.中综述了AAV基因组和AAV衣壳的衍生化。
AAV基因组的衍生物包括能够在体内从本发明的AAV载体表达转基因的AAV基因组的任何截短或修饰形式。通常地，有可能显着截短AAV基因组以包含最小的病毒序列，但仍保留上述功能。出于安全原因，这是优选的，以降低载体与野生型病毒重组的风险，还避免了由于在靶细胞中存在病毒基因蛋白而触发细胞免疫应答。
通常地，衍生物将包含至少一个反向末端重复序列(ITR)，优选一个以上ITR，如两个或更多个ITR。ITR的一个或多个可以来自于具有不同血清型的AAV基因组，或者可以是嵌合的或突变的ITR。优选的突变ITR是trs(末端分辨位点)缺失的突变ITR。这种缺失使得基因组能够连续复制以产生含有编码序列和互补序列的单链基因组，即自身互补AAV基因组。这提供了在靶细胞中的DNA复制旁路，这样能够加速转基因表达。
一个或多个ITR将优选地在编码因子I和/或因子H(或者其片段或衍生物)的核苷酸序列任一末端的翼侧。包含一个或多个ITR是优选的，其有助于本发明载体在宿主细胞核中的串联体形成，例如在通过宿主细胞DNA聚合酶的作用将单链载体DNA转化为双链DNA之后。这种游离基因串联体的形成在宿主细胞生命过程中保护了载体构建体，从而能够延长转基因在体内的表达。
在优选的实施方式中，ITR元件将是在衍生物中从天然AAV基因组保留的唯一序列。因此，衍生物优选地将不包含天然基因组的rep和/或cap基因以及天然基因组的任意其他序列。出于上述原因，这是优选的，并且也是为了降低载体整合进入宿主细胞基因组的可能性。此外，缩小AAV基因组的尺寸使得能够增加除了转基因以外在载体中引入其他序列元件(如调控元件)的灵活性。
因此可以将下述部分从本发明的衍生物中除去：一个反向末端重复(ITR)序列、复制(rep)和衣壳(cap)基因。然而，在一些实施方式中，衍生物还可以额外地包含rep和/或cap基因或者AAV基因组的其他病毒序列。天然存在的AAV在人染色体19的特定位点上以高频率整合，并且显示出可以忽略不计的随机整合频率，从而在治疗设置中可以耐受在载体中保留的整合能力。
当衍生物包含衣壳蛋白(即，VP1、VP2和/或VP3)时，衍生物可以是一个或多个天然存在的AAV的嵌合的、打乱的或衣壳修饰的衍生物。特别地，本发明包括在同一载体内(即，假型载体)提供来自AAV的不同血清型、进化枝、克隆或分离体的衣壳蛋白序列。
通常将选择嵌合的、打乱的或衣壳修饰的衍生物以提供AAV载体的一种或多种所需的功能性。因此，与包含天然存在的AAV基因组的AAV载体(如AAV2)相比，这些衍生物可以显示出提高的基因递送效率、降低的免疫原性(体液或细胞)、改变的嗜性范围和/或对特定细胞类型改善的靶向性。基因递送效率提高可以被改善受体或共受体在细胞表面的结合、改善内化、改善在细胞内和向细胞核的运输、改善病毒颗粒的脱壳和改善单链基因组向双链形式转化所影响。效率提高还可能与嗜性范围或对特定细胞群的靶向性改变相关，以使得载体剂量不会被向不需要其的组织施用而被稀释。
嵌合的衣壳蛋白包括通过在天然存在的AAV血清型的两个或多个衣壳编码序列之间重组产生的那些。这可以通过例如标记物挽救方法进行，其中将一种血清型的非感染性衣壳序列与不同血清型的衣壳序列共转染，并使用定向选择选出具有所需性质的衣壳序列。可以通过在细胞内进行同源重组以改变不同血清型的衣壳序列，以产生新的嵌合的衣壳蛋白。
嵌合的衣壳蛋白还包括通过将衣壳蛋白序列进行工程化改造以便在两个或多个衣壳蛋白之间(例如，在不同血清型的两个或多个衣壳蛋白之间)转移特定衣壳蛋白结构域、表面环或特定氨基酸残基产生的那些。
还可以通过DNA打乱或通过易错PCR产生打乱的或嵌合的衣壳蛋白。可以通过将相关AAV基因(例如，编码多种不同血清型的衣壳蛋白的那些)的序列随机片段化形成杂交的AAV衣壳基因，然后接下来在自引发聚合酶反应中将片段重新组装，其还可能导致序列同源性区域中的交叉。可以对打乱几种血清型的衣壳基因进行筛选以这种方式建立杂交AAV基因文库以鉴定具有所需功能性的病毒克隆。类似地，可以使用易错PCR随机突变AAV衣壳基因以产生一个多样的变体文库，然后可以针对所需性质对该文库进行选择。
还可以对衣壳基因的序列进行进行基因修饰以引入相对于天然野生型序列的特定缺失、取代或***。特别地，可以通过在衣壳编码序列的开放阅读框架内，或者在衣壳编码序列的N-末端和/或C-末端***无关蛋白或肽的序列对衣壳基因进行修饰。
无关蛋白或肽可以有利地是其作用是作为特定细胞类型的配体的蛋白或肽，从而改善其与靶细胞的结合或者改善载体对特定细胞群的靶向特异性。实例可以包括使用RGD肽以阻断在视网膜色素上皮细胞中的摄取，从而增强其在周围视网膜组织中的转导(Cronin et al.(2008)ARVO Abstract:D1048)。无关蛋白还可以是作为生产工艺的一部分辅助病毒颗粒纯化的蛋白，即表位或亲和标签。通常将对***位点进行选择以使其不会干扰病毒颗粒的其他功能，例如病毒颗粒的内化、运输。本领域技术人员可以根据其普通的技术知识鉴定适宜的位点。在上文中引用的Choi et al.中公开了特定的位点。
本发明还包括提供了与天然AAV基因组具有不同顺序和构型的AAV基因组序列。本发明还包括使用另一种病毒的序列或使用由一种以上病毒的序列组成的嵌合基因取代一个或多个AAV序列或基因。这种嵌合基因可以由来自不同病毒物种的两种或多种相关病毒蛋白的序列组成。
本发明的AAV载体可以是包含AAV基因组或其衍生物以及编码因子I和/或因子H转基因或其衍生物的序列的核苷酸序列形式。
本发明的AAV颗粒包括转壳形式，其中将具有ITR的一种血清型的AAV基因组或衍生物包装在不同血清型的衣壳中。本发明的AAV颗粒还包括镶嵌形式，其中来自两种或多种不同血清型的未经修饰衣壳蛋白的混合物组成了病毒衣壳。AAV颗粒还包括携带吸附在衣壳表面上的配体的化学修饰形式。例如，这种配体可以包括靶向特定细胞表面受体的抗体。
因此，例如，本发明的AAV颗粒包括具有AAV2基因组和AAV2衣壳蛋白的那些(AAV2/2)、具有AAV2基因组和AAV5衣壳蛋白的那些(AAV2/5)和具有AAV2基因组和AAV8衣壳蛋白的那些(AAV2/8)以及具有AAV2基因组和一个以上血清型的衣壳蛋白的那些。
AAV载体可以包含本申请所述的核苷酸序列的多个拷贝(例如，2个、3个等)。
启动子和调控序列
本发明的AAV载体还可以包括使得因子I和/或因子H转基因(或者其片段或衍生物)能够在体外或体内表达的元件。可以将这些称为表达控制序列。因此，AAV载体通常包含与编码转基因的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列(例如，包含启动子序列)。
可以使用任意适宜的启动子，本领域技术人员可以容易地对其进行选择。启动子序列可以是具有组成性活性的(即，在任何宿主细胞背景下是可操作的)，或者可以仅在特定宿主细胞环境中具有活性，从而使得能够在特定细胞类型中对转基因进行靶向表达(例如，组织特异性启动子)。在对另一种因子的存在(例如，在宿主细胞中存在的因子)产生应答时，启动子可以显示出诱导性表达。在任何情况下，当施用载体进行治疗时，优选的是启动子应在靶细胞背景下是功能性的。
在一些实施方式中，优选的是启动子显示出视网膜细胞特异性表达，以使得转基因能够仅在视网膜细胞群中表达。因此，启动子的表达可以是视网膜细胞特异性的，例如仅限于神经感觉视网膜细胞和视网膜色素上皮细胞。
优选的非视网膜细胞特异性启动子包括任选地与巨细胞病毒(CMV)增强子元件组合的鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。在本发明中使用的示例性启动子是CAG启动子，例如在rAVE表达盒中使用的启动子(GeneDetect.com)。在本发明中使用的另一个示例性启动子具有下述序列：
ATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATT
(SEQ ID NO:5)
在一个实施方式中，AAV载体包含具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的启动子。在另一个实施方式中，AAV载体包含具有与SEQ ID NO:5所示核苷酸序列具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的启动子，其中该核苷酸序列基本上保留了如SEQ ID NO:5所示的启动子的功能性活性。
基于可诱导视网膜特异性基因表达的人序列的启动子实例包括针对视杆和视锥的视紫红质激酶(Allocca et al.(2007)J.Virol.81:11372-80)，仅针对视锥的PR2.1(Mancuso et al.(2009)Nature 461:784-7)和/或针对视网膜色素上皮细胞的RPE65(Bainbridge et al.(2008)N.Engl.J.Med.358:2231-9)或VMD2(Esumi et al.(2004)J.Biol.Chem.279:19064-73)。
本发明的AAV载体还可以包含一个或多个可以在转录之前或转录之后起作用的其他调控序列。调控序列可以是天然转基因基因座的一部分或者可以是异源性调控序列。本发明的AAV载体可以包含天然转基因转录物的5'-UTR或3'-UTR的一部分。
调控序列可以是促进转基因表达的任何序列，即用于增加转录物表达，改善mRNA的核输出或增强其稳定性。这种调控序列包括例如增强子元件、转录后调控元件和多聚腺苷酸化位点。优选的多聚腺苷酸化位点可以是如下文所示的牛生长激素poly-A信号：
TCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGG
(SEQ ID NO:6)
在一个实施方式中，AAV载体包含具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的多聚腺苷酸化位点。在另一个实施方式中，AAV载体包含具有与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的多聚腺苷酸化位点，其中该核苷酸序列基本上保留了如SEQ ID NO:6所示的多聚腺苷酸化位点的功能性活性。
在本发明的AAV载体的背景下，这种调控序列将是顺式作用的。然而，本发明还包括使用位于其他基因构建体上的反式作用调控序列。
在本发明的AAV载体中使用的优选的转录后调控元件是土拨鼠肝炎转录后调控元件(WPRE)或其变体。WPRE的示例性序列如下所示：
ATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGC
(SEQ ID NO:7)
在一个实施方式中，AAV载体包含具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的转录后调控元件。在另一个实施方式中，AAV载体包含具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的转录后调控元件，其中该核苷酸序列基本上保留了如SEQ ID NO:7所示的转录后调控元件的功能性活性。
本发明包括WPRE任何变体序列的用途，其与无WPRE的AAV载体相比增加转基因的表达。优选地，变体序列在其整个序列上显示出与SEQ ID NO:7具有至少70％同一性，更优选地，在其整个序列上显示出与SEQ ID NO:7具有75％、80％、85％、90％以及更优选地至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
可以在本发明的AAV载体中使用的另一种调控序列是支架附着区(SAR)。本领域技术人员可以容易地选择其他调控序列。
施用方法
在一个优选的实施方式中，AAV载体是眼内施用的。
术语“眼内”指眼内部，因此眼内施用指向对象的眼内部施用。
在本发明的一个实施方式中，通过视网膜下、直接视网膜、脉络膜上或玻璃体内注射向对象的眼部施用AAV载体。在一个实施方式中，所述施用是由机器人执行的。
注射的药物组合物的体积可以是例如约10-500μL，例如约50-500、100-500、200-500、300-500、400-500、50-250、100-250、200-250或50-150μL。体积可以是例如约10、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500μL。优选地，注射的药物组合物的体积是100μL。
本领域技术人员将熟悉并且能够很好地进行每次视网膜下、直接视网膜、脉络膜上或玻璃体内注射。
优选地，通过视网膜下注射施用AAV载体。
在一个实施方式中，在对象的一生之中，AAV载体或者含有其的药物组合物的施用不超过一次，或者不超过两次。
视网膜下注射
视网膜下注射是向视网膜下空间(即，神经感觉视网膜下方)中的注射。在视网膜下注射过程中，将所注射的物质直接注射进入感光细胞和视网膜色素上皮(RPE)层之间并在其间形成一个空间。
当通过小型视网膜切开术进行注射时，可能会产生视网膜分离。将由所注射的物质产生的视网膜的分离的、凸起的层称为“泡状物”。
由视网膜下注射产生的孔必须足够小以使得所注射的溶液在施用后不会显着回流到玻璃体腔中。当注射药物时，这种回流是特别有问题的，因为药物的作用将被引导远离靶向区域。优选地，在神经感觉视网膜中的注射产生自密封的入口点，即一旦将注射针拔出，由针头产生的孔重新密封，以使得非常少或基本上没有注射物质通过孔释放出来。
为了便于进行这一过程，专门的视网膜下注射针是市售的(例如，DORC41G Teflon视网膜下注射针，Dutch Ophthalmic Research Center International BV,Zuidland,TheNetherlands)。设计这些针以进行视网膜下注射。
除非在注射期间发生视网膜损伤，否则只要使用足够小的针，则基本上所有的注射物质均保留在位于分离的神经感觉视网膜和局部视网膜分离部位处的RPE之间(即，不返流到玻璃体腔内)。事实上，在短时间内典型的泡状物持续存在表明注射物质通常很少逃逸到玻璃体内。随着注射物质被吸收，泡状物可能在更长时间内消散。
例如，使用光学相干断层扫描可以在手术前对眼(特别是视网膜)进行可视化。
注射的药物组合物的体积可以是例如约10-500μL，例如约50-500、100-500、200-500、300-500、400-500、50-250、100-250、200-250或50-150μL。体积可以是例如约10、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500μL。优选地，注射的药物组合物的体积是100μL。体积较大可能会增加视网膜伸展的风险，而体积较小可能难以看清。
两步视网膜下注射
可以使用两步法以增加的准确度和安全性递送本发明的载体，其中通过视网膜下注射第一溶液形成局部视网膜分离。第一溶液不包含载体。然后将第二视网膜下注射剂用于将包含载体的药物递送进入由第一视网膜下注射剂形成的泡状物中的视网膜下流体中。由于不使用注射递送的药物分离视网膜，因而在第二步中可以注射特定体积的溶液。
在本发明的一个实施方式中，载体的视网膜下注射包括步骤：
(a)以使视网膜至少部分地分离以形成视网膜下泡状物的有效量通过视网膜下注射向对象施用溶液，其中溶液不包含载体；以及
(b)通过视网膜下注射将药物组合物注入由步骤(a)形成的泡状物，其中药物包含载体。
在步骤(a)中注射以使得视网膜至少部分地分离的溶液的体积可以是例如约10-1000μL，例如约50-1000、100-1000、250-1000、500-1000、10-500、50-500、100-500、250-500μL。体积可以是例如约10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000μL。
在步骤(b)中注射的药物组合物的体积可以是例如约10-500μL，例如约50-500、100-500、200-500、300-500、400-500、50-250、100-250、200-250或50-150μL。体积可以是例如约10、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500μL。优选地，在步骤(b)中注射的药物组合物的体积是100μL。体积较大可能会增加视网膜伸展的风险，而体积较小可能难以看清。
可以将不包含药物的溶液(即，步骤(a)的“溶液”)配制成与包含药物的溶液类似的，如下文所述。优选的不包含药物的溶液是pH和渗透压与视网膜下空间匹配的平衡盐溶液(BSS)或类似的缓冲溶液。
在手术过程中的视网膜可视化
在某些情况下，例如在终末期视网膜变性过程中，鉴别视网膜是困难的，因为视网膜很薄、透明并且难以看清位于其上的被破坏的和严重色素沉着的上皮。使用蓝色活体染料(例如，Brilliant Geuder；MembraneBlue-Dorc)可以便于对在视网膜分离操作中(即，在本发明的两步视网膜下注射法的步骤(a)中)产生的视网膜孔进行鉴定，以使得可以通过相同的孔施用药物，而不会产生回流到玻璃体腔的风险。
使用蓝色活体染料还能够识别具有增厚的内界膜或视网膜前膜的任何区域的视网膜，因为通过这些结构中的任意一个注射均将会妨碍清楚地进入视网膜下空间。而且，这些结构中的任何一个在手术后立即收缩都可能导致视网膜进入孔的拉伸，这可能导致药物回流到玻璃体腔内。
脉络膜上注射
可以使用利用微导管的外路小梁(ab externo)法将本发明的载体递送到脉络膜上空间(参见，例如，Peden et al.(2011)PLoS One 6(2):e17140)。在这种方法中，进行角膜缘结膜切开术以暴露裸露的巩膜，然后进行巩膜切开术以暴露裸露的脉络膜。将微导管(如来自iScience Interventional的iTrack 250A，其任选地与照明***连接，如基于iLumin激光二极管的微型照明***(iScience Interventional))引入脉络膜上空间并向后朝向视盘前进。在将微导管的尖端操作到所需位置之后，注射的载体在视网膜和脉络膜内形成泡状物。
因此，在一个实施方式中，通过包括下述步骤的方法脉络膜上递送载体：(i)将微导管引入脉络膜上空间；(ii)使微导管在所述空间内前进直至其尖端到达视网膜受累区域附近；以及(iii)从微导管尖端注射载体以形成泡状物。
在一个实施方式中，上述施用程序直接由机器人进行。
药物组合物和注射溶液
可以将本发明的药物(例如，AAV载体)制成药物组合物。除了药物以外，这些组合物还可以包含药学上可接受的运载体、稀释剂、赋形剂、缓冲剂、稳定剂或本领域熟知的其他物质。这种物质应是无毒的，并且不应干扰活性成分的功效。本领域技术人员根据施用途径可以确定运载体或其他物质的精确性质，例如视网膜下、直接视网膜、脉络膜上或玻璃体内注射。
药物组合物通常是液体形式。液体药物组合物通常包含液体运载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或者合成油。可以包含生理盐水溶液、氯化镁、葡萄糖或其他糖溶液，或者二醇，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。在一些情况下，可以使用表面活性剂，如0.001％的普朗尼克酸(PF68)。
用于向受累部位注射时，活性成分可以是无热源且具有适宜的pH、等渗性和稳定性的水溶液形式。本领域技术人员使用例如等渗载剂(如氯化钠注射液、林格氏注射液或乳酸林格氏注射液)完全能够制备适宜的溶液。可以根据需要加入防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧剂和/或其他添加剂。
对于延迟释放，可以将药物包含在配制成用于缓慢释放的药物组合物中，如根据本领域公知的方法由生物相容性聚合物形成的微囊中或脂质体载药***中。
治疗方法
应当意识到的是，在本申请中提及的所有治疗包括治愈性、姑息性和预防性治疗；但是在本发明背景下提及的预防更通常与预防性治疗相关。治疗还可以包括阻止疾病严重程度的进展。
优选对哺乳动物(特别是人)进行治疗。然而，对人和动物的治疗均在本发明范围内。
变体、衍生物、类似物、同源物和片段
除了在本申请中提及的特定蛋白和核苷酸以外，本发明还包括其变体、衍生物、同源物和片段的用途。
在本发明的背景下，任何给定序列的变体是其残基(无论是氨基酸还是核酸残基)的特定序列以这样一种方式被修饰的序列，在该方式中所讨论的多肽或多核苷酸的功能基本上被保留。变体序列可以通过添加、缺失、取代、修饰、替代和/或改变天然存在的蛋白中存在的至少一个残基来获得。
如在本申请中所使用的，与本发明的蛋白或多肽相关的术语“衍生物”包括对序列上的一个(或多个)氨基酸残基进行的任何取代、改变、修饰、替代、缺失和/或加入，以使得所得到的蛋白或多肽基本上保留了至少一个其内源性功能。
如在本申请中所使用的，与多肽或多核苷酸相关的术语“类似物”包括任何模拟物，即具有其所模拟的多肽或多核苷酸的至少一种内源性功能的化学化合物。
通常地，可以进行氨基酸取代(例如1、2或3至10或20个取代)，只要经修饰的序列基本上保留了所需的活性或能力即可。氨基酸取代可以包括使用非天然存在的类似物。
在本发明中使用的蛋白还可以具有产生沉默改变的氨基酸残基的缺失、***或取代，并且产生功能上等同的蛋白。只要内源性功能被保留，就可以根据极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或残基两亲性性质的相似性进行刻意的氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；以及具有相似亲水性值的不带电极性头基的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
例如，可以根据下表进行保守性取代。在第二列同一框中的氨基酸以及优选地在第三列同一行中的氨基酸可以彼此之间进行取代：
如在本申请中所使用的，术语“同源物”指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有一定的同源性的实体。可以将术语“同源性”等同于“同一性”。
同源序列可以包括与主题序列可以至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％相同(优选至少95％或97％或99％相同)的氨基酸序列。通常地，同源物与主题氨基酸序列将包含相同的活性位点等。尽管也可以将同源性认为是术语相似性(即，具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，但是在本发明的背景下，优选以术语序列同一性表示同源性。
同源序列可以包括与主题序列可以至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％相同(优选至少95％或97％或99％相同)的核苷酸序列。尽管也可以将同源性认为是术语相似性，但是在本发明的背景下，优选以术语序列同一性表示同源性。
优选地，所提及的与本申请详述的任何一个SEQ ID NO具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。
可以通过肉眼，或者更常见的借助于容易获得的序列比较程序进行同源性比较。这些市售的计算机程序能够计算两条或更多条序列之间的同源性或同一性百分比。
可以在连续序列上计算同源性百分比，即将一条序列与其他序列进行比对，并将一条序列上的每个氨基酸与其他序列上的相应氨基酸进行直接比较，每次一个残基。将其称为“无空位”比对。通常地，仅在残基数量相对较少时进行这种无空位比对。
虽然这是一种非常简单和一致的方法，但是其没有考虑到，例如，在其他相同的一对序列中，核苷酸序列中的一个***或缺失可能导致其后的密码子失去对齐性，因此可能导致全局比对时同源性百分比大幅降低。因此，将大多数序列比对方法设计为产生最佳比对，其考虑了可能的***和缺失，而不会过度进行总体同源性罚分。这是通过在序列比对中***“空位”实现的，以尽量扩大局部同源性。
然而，这些更复杂的方法为比对中出现的每个空位分配“空位罚分”，以便对于相同数量的相同氨基酸，以尽可能少的空位进行序列比对，其反映了两个比较序列之间更高的相关性，将实现比有很多空位的比对方法更高的得分。通常使用“仿射空位成本(Affinegap cost)”，其使得现有空位具有相对较高的成本以及在空位中的每个随后的残基具有更低的罚分。这是最常用的空位评分***。高空位罚分当然会产生具有更少空位的最佳比对。大部分比对程序允许对空位罚分进行修改。然而，当使用这种软件进行序列比对时，使用默认值是优选的。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit软件包时，对于氨基酸序列的默认空位罚分针对空位是-12和针对每个延伸是-4。
因此，计算最大同源性百分比首先需要产生考虑了空位罚分的最佳比对。进行这种比对的适宜计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(University of Wisconsin,U.S.A.；Devereux et al.(1984)Nucleic Acids Res.12:387)。能够进行序列比对的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel et al.(1999)ibid–Ch.18)、FASTA(Atschul et al.(1990)J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比对工具套装。BLAST和FASTA均可以用于离线和在线检索(参见Ausubel et al.(1999)ibid，第7-58至7-60页)。然而，对于一些应用，使用GCG Bestfit程序是优选的。还可以将称为BLAST 2序列的另一种工具用于比较蛋白和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol.Lett.(1999)174:247-50；FEMSMicrobiol.Lett.(1999)177:187-8)。
尽管可以使用同一性来衡量最终的同源性百分比，但是比对过程本身通常不是基于全或无的配对比较的。相反地，通常使用经缩放的相似性评分矩阵，其根据化学相似性或进化距离为每个配对比较分配评分。这种常用矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵–BLAST程序套件的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公共默认值或者如有提供使用自定义符号比较表(更多详细信息请参阅用户手册)。对于一些应用，优选使用GCG软件包的公共默认值，或者在使用其他软件的情况下，使用默认矩阵(如BLOSUM62)。
一旦使用软件产生了最佳比对，就可以计算同源性百分比，优选地序列同一性百分比。软件通常将其作为序列比较的一部分并产生数值结果。
全长因子I或因子H的“片段”也是变体，并且该术语通常指在功能上或者例如在测定中被关注的多肽或多核苷酸的选定区域。因此，“片段”指是全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。
可以使用标准重组DNA技术(如位点定向诱变)制备这种变体。当进行***时，可以制备编码***片段的合成DNA以及与任意一侧***位点的天然存在的序列对应的5’和3’翼侧区。翼侧区将包含与天然存在的序列中的位点对应的方便的限制性酶切位点，以便可以用适宜的酶对序列进行切割并将合成DNA与切割物相连接。然后，根据本发明表达DNA以制备其所编码的蛋白。这些方法仅是本领域公知的用于操纵DNA序列的多种标准技术的示例，还可以使用其他公知的技术。
现将通过非限制性实施例描述本发明的各种优选特征和实施方式。
除非另有说明，否则本发明的实践将使用在本领域普通技术人员能力范围之内的化学、生物化学、分子生物学、微生物学和免疫学的常规技术。在文献中对这些技术进行了解释。参见，例如，Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989)MolecularCloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel,F.M.et al.(1995和定期增刊)Current Protocols in Molecular Biology,Ch.9,13and 16,John Wiley&Sons；Roe,B.,Crabtree,J.and Kahn,A.(1996)DNAIsolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；Polak,J.M.andMcGee,J.O’D.(1990)In Situ Hybridization:Principles and Practice,OxfordUniversity Press；Gait,M.J.(1984)Oligonucleotide Synthesis:A PracticalApproach,IRL Press；and Lilley,D.M.and Dahlberg,J.E.(1992)Methods inEnzymology:DNA Structures Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA,Academic Press。这些一般性教科书中的每一个均通过引用并入本申请。
实施例
实施例1
人CFI cDNA的克隆，CBA-CFI-WPRE表达盒的产生，
pAAV-CBA-CFI-WPRE-bGHpA的构建和AAV-CFI病毒的包装
从Genbank下载最常见的人CFI序列变体的cDNA，登记号NM_000204.4。该cDNA具有如SEQ ID NO:2所示的序列，并且以基因片段形式从Integrated DNATechnologies订购。还订购了另一个CFI构建体，其中对CFI基因的cDNA序列进行了密码子优化以便在人细胞中表达。经密码子优化的序列(“CFIco”)具有如SEQ ID NO:8所示的序列，并且其从GeneWiz订购(在质粒pUC57中的CFIco)。
将这些cDNA序列***称为pAM的pAAV顺式质粒。pAM是最初来源于pBR322的高拷贝数质粒，但是其包括位于所选择的表达盒翼侧的用于稳定AAV-2的左侧和右侧反向末端重复序列。对于AAV-CFI和AAV-CFIco载体，使用经修饰的CBA/CAG启动子(具有CMV增强子的鸡β-肌动蛋白启动子，在本申请中称为“CBA”)以驱动CFI和CFIco的表达，以及在cDNA的3’端提供经修饰的WPRE序列和bGH polyA。将这两个质粒称为pAAV2.CBA-hCFI-WPRE-bGH(pAAV-CFI)和pAAV2.CBA-hCFIco-WPRE-bGH(pAAV-CFIco)。
图2显示了CFI和CFIco的限制性消化物的琼脂糖凝胶。将CFI的1752bp条带切下并克隆进入pAAV-CBA-WPRE-bGHpA骨架。
比较pAAV.CFI和pAAV.CFIco的CFI表达水平，将pAAV-CFI或pAAV.CFIco与pCMV.GFP在ARPE-19细胞系中共转染以及CFI的免疫印迹
ARPE-19(CRL-2302TM)是一种自发产生的视网膜色素上皮细胞(RPE)的细胞系，该细胞系是由Amy Aotaki-Keen于1986年从一名死于机动车事故导致的头部创伤的19岁男性的正常眼中获得。这些细胞形成稳定的贴壁单层，当接种在使用层粘连蛋白包被的Transwell-COL滤器中使用低血清浓度的培养基时显示出极化的形态。ARPE-19细胞来自于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。在补充了10％热灭活胎牛血清(Gibco)、1％200mM L-谷氨酰胺(Sigma Aldrich)和1％青霉素-链霉素(Sigma Aldrich，10,000单位青霉素，10mg链霉素/ml)的DMEM/F12(Thermo Fisher Scientific)中培养细胞。
根据生产厂商提供的方案，使用Lipofectamine LTX(Life Technologies)在ARPE-19中进行共转染。将0.5μg pAAV-CFI或pAAV.CFIco与0.5μg pCMV.GFP(PlasmidFactory)共转染。将pAAV-CBA-WPRE-bGHpA(pAAV[无转基因表达盒])的共转染作为阴性对照。转染24小时后，使用PBS(磷酸盐缓冲液，pH 7.2，GibcoTM)洗涤细胞，并将其在无血清培养基中培养72小时。取上清液，离心澄清并在-80℃下保存。使用TrypLE Express(Gibco)使ARPE-19细胞脱壁并计数以确保每孔中具有相等的细胞数。将细胞球团在-20℃下冷冻30分钟。将添加了cOmpleteTM无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的1xRIPA裂解缓冲液(MerckMillipore)加入细胞球团中并通过超声破碎细胞。将不溶性蛋白离心沉淀并将上清液(＝裂解物)在-80℃下保存。
通过将30μl未经稀释的上清液加入4x Laemmli缓冲液(250mM Tris-HCl(pH6.8)，8％SDS，40％甘油和0.02％溴酚蓝)中上样并在10％预制聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白(Bio-Rad)进行CFI的免疫印迹。通过半干转移将蛋白转印到PVDF膜上(Bio-Rad)，随后在封闭缓冲液(1xTBS pH 8[Sigma]，0.05％吐温-20和5％干燥脱脂奶粉[Marvel])中对膜进行封闭。使用在封闭缓冲液中稀释的OX21(表1)和抗-小鼠IgG HRP偶联的抗体(表1)检测CFI。使用Clarity Western ECL底物(Bio-Rad)使蛋白条带可视化并使用Fc成像***对其进行分析。通过将5μl未经稀释的上清液加入添加了50μl/mlβ-巯基乙醇的4xLaemmli缓冲液中上样对GFP进行免疫印迹。如上所述进行免疫印迹。使用针对TurboGFP的抗体(表1)和抗-家兔IgG HRP偶联的抗体(表1)检测GFP。
表1：在免疫印迹或免疫沉淀中使用的一抗和二抗
*克隆9抗体是使用EZ-LinkTM NHS-LC-LC-生物素(Thermo Fisher Scientific)生物素化的。
图3显示了CFI(图3A)和GFP(图3B)的免疫印迹。3A：CFI表现为70kDa条带(非还原)，并且在使用pAAV.CFI或pAAV.CFIco转染ARPE-19后以相等的比率表达。使用pAAV转染后无CFI表达。使用10％正常人血清(NHS)作为CFI免疫印迹的阳性对照。3B：通过将ARPE-19细胞与pCMV.GFP共转染对转染效能进行分析。GFP表现为30kDa条带并且免疫印迹证实细胞以相似的效能转染。
AAV.CFI和AAV.CFIco的制备
通过将pAAV.CFI或pAAV.CFIco与提供了腺病毒辅助序列和包装序列(Rep/Cap)的pDG(Plasmid Factory)在HEK-293(CRL-1573TM)或HEK-293T(CRL-3216TM)细胞系(均为贴壁细胞)中双转染制备AAV2病毒。在补充了10％热灭活胎牛血清(Gibco)、1％200mM L-谷氨酰胺(Sigma Aldrich)和1％青霉素-链霉素(Sigma Aldrich，10,000单位青霉素，10mg链霉素/ml)的DMEM(Sigma)中培养HEK-293和HEK-293T细胞。72小时后收集细胞并裂解以纯化病毒颗粒。使用碘克沙醇梯度纯化AAV颗粒并从40％的级分中对其进行回收。在Amicon Ultra-15离心过滤装置(Merck Millipore)上对病毒进行浓缩并且分装后在-80℃下保存。利用SDS PAGE评价病毒纯度并通过qPCR确定其滴度。
使用AAV.CFI、AAV.CFIco和AAV.GFP对HEK-293和ARPE-19细胞系进行转导的体外表达分析，对组织培养物上清液进行免疫印迹以分析CFI的表达
使用在仅补充了1％热灭活胎牛血清的正常生长培养基中感染复数(MOI)为1x104的AAV.CFI、AAV.CFIco和AAV.GFP转导70％融合的HEK-293(“293”)和ARPE-19细胞系。7天后，收集上清液并通过离心澄清。将上清液分装后在-80℃下保存。
如上文所述进行免疫印迹，将30μl上清液与4x Laemmli缓冲液混合并上样到10％预制聚丙烯酰胺凝胶上。使用在封闭缓冲液中稀释的OX21(表1)和抗-小鼠IgG HRP偶联的抗体(表1)(当上清液在非还原条件下上样时)或者针对人CFI(表1)的抗血清和抗-山羊IgG(全细胞)-过氧化物酶抗体(表1)(当上清液在还原条件下上样时)对CFI进行检测。
图4显示了在病毒转导的HEK-293和ARPE-19细胞系的上清液中CFI的免疫印迹。4A：在非还原条件下将上清液上样并且使用针对人CFI的小鼠单克隆抗体(OX21,ThermoFisher Scientific)和驴抗小鼠IgG HRP偶联的抗体(Abcam)对CFI进行检测。在这两种细胞系中表达CFI和CFIco。将使用AAV.GFP转导的细胞系作为阴性对照，同时将0.5μg从血浆中纯化的人CFI(在本申请中称为“CFIpl”)(Comptech)作为阳性对照。4B：在非还原条件下将上清液上样并使用针对人CFI的山羊抗血清(Comptech)和家兔抗山羊IgG(全分子)过氧化物酶抗体(Sigma)检测CFI。CFI出现在80kDa(酶原)、50kDa(经加工的；重链)和35kDa(经加工的；轻链)。将AAV.GFP作为阴性对照，同时将0.5μg从血浆中纯化的人CFI(Comptech)和10％正常人血清(在本申请中称为“NHS”)作为阳性对照。在这两种细胞系中表达CFI和CFIco。
对CFI表达进行定量分析，进行C3b裂解测定以测量功能性活性
为进行定量分析，根据生产厂商提供的方案使用Pierce免疫共沉淀(Co-IP)试剂盒(Thermo Fisher Scientific)对CFI进行免疫沉淀。将30μg针对人CFI(Ox21,ThermoFisher Scientific)的亲和纯化单克隆抗体与25μl AminoLink Plus偶联树脂在室温下孵育2小时。将HEK-293或ARPE-19转导细胞上清液与所制备的树脂在4℃下孵育过夜。次日，使用试剂盒提供的IP裂解/洗涤缓冲液将树脂洗涤几次。使用试剂盒提供的洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸，pH 2.7)洗脱结合的CFI并立刻使用1M Tris(pH 9.5)中和。通过测量在280nm下的吸光度以及通过进行SDS PAGE分析对CFI的免疫沉淀情况进行评估。将CFI直接用于C3b裂解测定或者分装后在-80℃下保存。
在C3b裂解测定中，将1mg血浆中纯化的C3b与0.5μg血浆中纯化的补体因子H(CFH)和血浆中纯化的补体因子I(CFIpl)(所有从血浆中纯化的蛋白均来自Comptech)，AAV.CFI转导细胞的细胞培养物上清或经免疫沉淀的CFI/CFIco在37℃下孵育1小时。加入含β-巯基乙醇的4x Laemmli缓冲液终止反应。对样品进行稀释并将其上样到10％预制聚丙烯酰胺SDS PAGE凝胶(Bio-Rad)上。在转移到PVDF膜(Bio-Rad)上并在封闭缓冲液(1xTBS pH 8[Sigma]/0.05％吐温-20和5％干燥脱脂奶粉[Marvel])中封闭后，使用生物素化的克隆9(表1)和Extravidin-HRP偶联的抗体(表1)对C3b裂解进行检测。该抗体与C3g中的表位反应并且在还原SDS PAGE上识别为C3的α-链、C3b的α’链以及iC3b和C3dg的C3α’1-链。因此，可以将其用于分析CFI对C3b的降解。CFH是C3b降解的辅因子，并且由于该测定在较低离子强度下进行，因此其也是iC3b向C3dg二次裂解的辅因子。所使用的缓冲液是使用1M Tris(pH9.5)进行中和的Pierce免疫共沉淀(Co-IP)试剂盒(Thermo Fisher Scientific)中的“洗脱缓冲液”。
图5显示了C3b裂解测定的典型结果。第1道显示了仅使用CFH孵育的C3b。第2道显示了使用CFH和CFIpl孵育的C3b。C3b被CFIpl降解为iC3b和C3dg。第3道显示了使用CFH和使用AAV.CFI转导的HEK-293的上清液孵育的C3b。第4-5道显示了使用CFH和来自使用AAV.CFI(第4道)或AAV.CFIco(第5道)转导的ARPE-19细胞的免疫沉淀的CFI(称为“IP CFI”)孵育的C3b。第6-7道显示了使用CFH和来自使用AAV.CFI(第6道)或AAV.CFIco(第7道)转导的HEK-293细胞的免疫沉淀的CFI孵育的C3b。由转导细胞系分泌的CFI具有功能性活性并且能够将C3b的α-链裂解为iC3b。CFI的免疫沉淀导致CFI总量的增加，除了iC3b的α’1片段以外，其还反映在出现了C3dg条带上。这种二次裂解仅发生在低离子强度和低速率下，其需要存在更多的CFI。
对在可穿透transwell滤器上培养的转导的ARPE-19中CFI表达情况的体外分析
RPE细胞是一种有色的、非***细胞，当接种在使用层粘连蛋白包被的Transwell-COL滤器中使用低血清浓度的培养基时其显示出极化的形态。Transwell滤器(聚酯膜***物，孔径0.4μm，膜直径12mm)用于将培养孔分成两个室，顶部(上部)区域对应于RPE单层的视网膜面一侧和底部(下部)区域对应于RPE单层的脉络膜面一侧。当置于低血清培养基条件下时，ARPE-19细胞将分化并变成六边形的、轻度色素沉着的细胞。可以将transwell模型用于评价在静态细胞中的表达以反映体内的状态。
使用8μg/ml层粘连蛋白(Sigma)包被Transwell并以单层形式将ARPE-19细胞接种在transwell的10％FBS-培养基中。48小时后，将培养基换成1％FBS培养基并以MOI 105/细胞(AAV.CFI、AAV.CFIco和AAV.GFP)对细胞进行转导。7天后，从两个室中收集上清液并通过离心对其进行澄清。由于上室和下室的体积是不同的，即上室中为500μl培养基和下室中为1500μl培养基，因而将其归一化为下述总体积对上清液进行分析：将30μl下室的上清液与4x Laemmli缓冲液混合以及将10μl上室的上清液与4x Laemmli缓冲液混合。将样品上样到10％预制聚丙烯酰胺凝胶上。使用在封闭缓冲液中稀释的OX21(表1)和抗-小鼠IgG HRP偶联的抗体(表1)对CFI进行检测。对于核染色，使用PBS(Gibco)洗涤细胞2次，使用含4％多聚甲醛(Sigma)的PBS将细胞固定15分钟并使用含1％BSA(Thermo Fisher Scientific)-0.1％Triton X-100(Sigma)的PBS穿透细胞45分钟。使用1:5000的含Hoechst(ThermoFisher Scientific)的穿透缓冲液孵育15分钟并对核染色情况进行评估。
图6显示了由transwell培养的ARPE-19细胞分泌的CFI的免疫印迹。细胞未分化为六边形细胞，而是以融合的单层细胞形式培养，并且通过加入含1％血清的培养基而将细胞***降至最低。6A：将来自两个小室的上清液在非还原条件下上样并使用针对CFI的小鼠单克隆抗体进行western印迹分析(Ap＝顶室和Bl＝底室)。结果表明，在这两个小室中均检测到由融合的单层细胞和分泌的蛋白表达的CFI。6B：对细胞核进行Hoechst染色已证实存在单层细胞(在收集上清液后进行染色)。
对C57/Black 6小鼠进行视网膜下注射后AAV.CFI和AAV.CFIco的体内表达分析，通过免疫印迹、qPCR和免疫组化进行CFI表达分析。
视网膜下注射
在所有实验中使用雌性8-10周龄C57BL/6J小鼠(Charles River Laboratories)。根据英国内政部的规定(项目许可证30/3363)对本研究中使用的所有动物进行人道处理。将小鼠保持在12:12-h明暗交替循环下。
使用含甲苯噻嗪(10mg/kg)/***(80mg/kg)混合物的无菌盐水对小鼠进行麻醉；盐酸苯肾上腺素(2.5％)和托品酰胺(1％)散瞳。将***美卡因(0.5％)滴眼液用于额外的局部麻醉。进行前房穿刺(anterior chamber tap)，然后使用无菌33G针头(TSKLaboratory)和卡波姆凝胶(Viscotears,Novartis Pharmaceuticals Ltd)进行视网膜下注射，并使用小圆形玻璃盖玻片实现良好的眼底可视化。使用10μl NanoFil注射器和35G斜面NanoFil针(World Precision Instruments Ltd)从视网膜后注射。用含阿替美唑(2mg/kg)的无菌盐水逆转麻醉。
使用两个不同的剂量(107个基因组拷贝[gc]/眼和108gc/眼)和两种AAV构建体(AAV.CFI和AAV.CFIco)对小鼠进行注射。使用第三个剂量109gc/眼的AAV.CFIco注射3只小鼠；将这些小鼠用于对免疫印迹进行校正。在含0.001％PF68(Gibco)的PBS(Gibco)中对病毒进行稀释并使用相同的稀释剂进行假注射。每个条件下有12只眼进行视网膜下注射。
用于CFI免疫印迹的组织样品的制备
注射4周后，颈椎脱臼处死小鼠。取出眼并按照如下所示进行制备。使用解剖显微镜在角膜中开一个切口。将眼分成角膜/虹膜(前段)、晶状体和后眼杯。对于全眼杯样品，将后眼杯置于无菌试管中。对于一些眼，通过将视网膜从RPE/脉络膜/巩膜混合物上轻轻剥离将视网膜与RPE/脉络膜/巩膜分离。将每个条件下3只小鼠的样品混合(图7A)，但以109gc/眼注射AAV.CFIco的眼(图7B)除外，其为将2只小鼠的样品混合，并与未注射的对侧眼进行比较。将所有样品立即置于干冰上以防止蛋白降解并在-80℃下保存。对于免疫印迹，将样品在添加了cOmpleteTM无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的1xRIPA裂解缓冲液(MerckMillipore)中匀浆，并通过研钵和研杵以及通过超声对细胞进行机械破碎。将不溶性蛋白离心沉淀，分装上清液并将其在-80℃下保存。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(ThermoFisher Scientific)确定蛋白浓度并将40μg蛋白裂解物在4x Laemmli缓冲液(250mMTris-HCl(pH 6.8)，8％SDS，40％甘油和0.02％溴酚蓝)中上样。在10％预制聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)上对蛋白进行分离。通过半干转移将蛋白转印到PVDF膜上(Bio-Rad)，随后在封闭缓冲液(1xTBS pH 8[Sigma]，0.05％吐温-20和5％干燥脱脂奶粉[Marvel])中对膜进行封闭。使用下述对CFI进行检测：a)还原条件：针对人CFI的抗血清(表1)和抗-山羊IgG–HRP偶联的抗体(表1)或b)非还原条件：在封闭缓冲液中稀释的OX21(表1)和驴抗-小鼠IgGHRP偶联的抗体(Abcam)。对于β-肌动蛋白的检测，使用恢复Western印迹剥离缓冲液(Thermo Fisher Scientific)剥离膜并使用在封闭缓冲液中稀释的抗-β-肌动蛋白(表1)和抗-小鼠IgG HRP偶联的抗体(表1)重新进行检测。或者，将小鼠抗-β-肌动蛋白抗体与针对CFI的山羊抗血清联用。
图7显示了通过免疫印迹分析混合样品中CFI蛋白的表达。在所有剂量下以及来自AAV.CFI和AAV.CFIco时，CFI均在可检测水平下表达。将β-肌动蛋白上样作为上样对照。7A：在非还原条件下将40μg蛋白裂解物上样并使用针对人CFI的多克隆山羊抗血清检测CFI。检测到CFI在80kDa(酶原)、50kDa(经加工的；重链)和35kDa(经加工的；轻链)。这些条带对应于CFI的预期尺寸和经确证的加工，即存在重链和轻链。7B：将使用109gc/眼的AAV.CFIco注射眼和未注射眼的裂解物样品也以相同的蛋白裂解物量上样。使用针对CFI的小鼠单克隆抗体(左图，非还原凝胶)和针对CFI的山羊抗血清(右图，还原凝胶)检测CFI。在非还原凝胶(左图)中检测到在注射动物中CFI为75kDa的条带而在未注射眼中未检测到条带。在还原凝胶(右图)中，CFI出现在80kDa(酶原)、50kDa(经加工的；重链)和35kDa(经加工的；轻链)。
用于基因表达分析的组织样品的制备
按照如上所述将小鼠处死，并且按照如上所述保留完整的后眼杯或者将视网膜与RPE分离。将组织样品立即置于含有RNALater(Thermo Fisher Scientific)的无菌试管中。将样品在4℃下保存，直至对其进行进一步处理。使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)分离RNA并使用研钵和研杵在缓冲RLT(试剂盒提供的)中将组织匀浆。加入无RNase的DNase(Qiagen)进行补充处理以确保不存在基因组DNA。使用Superscript III第一链合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific)将100ng RNA逆转录为cDNA。逆转录之后，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)清理反应物。使用CFX ConnectTM实时PCR检测***(Bio Rad)对每种条件下每只眼的cDNA进行qPCR(假处理，CFI 107gc/眼，CFI 108gc/眼，CFIco 107gc/眼和CFIco 108gc/眼)。每个孔使用1.25ng cDNA作为使用SYBR green master mix(iTaqUniversal SYBR Green Supermix,Bio Rad)进行qPCR反应的模板。每种条件重复三次；使用所提供的软件获得Ct值。将使用小鼠β-激动蛋白作为管家基因进行的比较ΔΔCt分析用于确定与假处理对照相比CFI的相对表达。
图8显示了通过qPCR进行的基因表达分析。与预期一致的是，在假注射小鼠中无人CFI或CFIco表达。由于每种条件下仅对一只眼进行了分析，因而无法进行统计学分析。两种AAV构建体均表达CFI并且表达显然主要存在于RPE中，但是108gc/眼的注射导致视网膜组织中CFI mRNA的表达增加。在眼杯样品中，CFI mRNA占眼杯mRNA的总量预计将小于仅在RPE中的量，因为眼部的很多区域不表达CFI；结果也反映出了这一问题。
用于免疫组化的视网膜切片的制备
通过颈椎脱臼处死小鼠(注射后4周)。取出眼并按照如下所示进行制备。在锯齿缘的后部打孔并将眼球置于含4％(w/v)多聚甲醛的0.12M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中，在室温下放置1小时。然后，除去前段和晶状体并制备用于切片的眼或进行全标本包埋。将用于切片的眼杯在含浓度增加的蔗糖的0.12M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中低温保存(10％，在室温下放置1小时，30％，+4℃下过夜)，在OCT(Tissue-tek,Sakura Finetek USA inc,Ca,USA)中包埋并在-80℃下的模具中冷冻。在冰冻切片机上以10μm的厚度切片并将其封装在载玻片(uper-Frost,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)上。将切片在室温下空气干燥2小时并在-80℃下保存。对于用于全标本包埋的眼杯，通过将视网膜从RPE上轻轻剥离将视网膜与RPE/脉络膜分离并将其分别保存在+4℃下的PBS中。
免疫染色
通过在室温下在PBSGT溶液(含0.2％(w/v)明胶，0.25％(v/v)Triton-X的PBS)中孵育60min将切片封闭和透化。通过在室温下在含0.2％(w/v)明胶，1.5％(v/v)Triton-X的PBS中孵育2小时将全标本包埋物封闭和透化。随后，将切片和全标本包埋物与在PBSGT溶液中稀释的一抗体(见表1)在室温下孵育过夜。在PBST溶液(含0.1％(v/v)Triton X-100的PBS)中洗涤后，将切片和全标本包埋物与按照1:5000稀释的同Alexa Fluor594偶联的二抗(Life Technologies,Thermo Fisher Scientific,Waltham,Massachusetts,USA)孵育并使用含DAPI的PBSGT溶液染色，该过程在室温下进行1.5h。使用PBST溶液洗涤切片，随后用封固基质(Mowiol,Merck Millipore)和盖玻片封片。
表2：在本研究的免疫组化中使用的一抗
抗体 产品编号 公司 稀释
家兔抗-hCFI HPA024061 Sigma-Aldrich 1/250
Alexa Fluor 488鬼笔环肽 A12379 Life Technologies 1/5000
图9显示了在假处理、AAV.CFI和AAV.CFIco注射的眼视网膜切片中纤连蛋白和hCFI的定位。使用纤连蛋白作为共标记物区分不同的视网膜层。对于AAV.CFI和AAV.CFIco注射的眼，hCFI位于几个区室：巩膜(Scl)中存在较少量，RPE、光感受器外段(OS)和内段(IS)、外丛状层(OPL)中较强以及在神经节细胞层(GCL)和神经纤维层(NFL)中可能存在。对于假注射眼，仅可见GCL+NFL的轻微信号，表明抗体在这些层不具有完全的特异性。
图10至13显示了不同区域更高的放大倍数，其中hCFI定位于假处理和AAV.CFI注射眼的视网膜切片中。在AAV.CFIco注射眼的视网膜切片中观察到了相同的信号，但是在本申请中未示出。
图10显示了假处理和AAV.CFI注射眼的视网膜切片的RPE区域的更高放大倍数。hCFI定位于整个RPE层和RPE的微绒毛中。染色是滤泡状的，提示了hCFI的分泌途径定位。
图11显示了假处理和AAV.CFI注射眼的视网膜切片的光感受器区域的更高放大倍数。hCFI定位于光感受器的内段和外段，但是不存在于光感受器光感受器的细胞核/内质网区域。
图12显示了假处理和AAV.CFI注射眼的视网膜切片的外丛状层的更高放大倍数。hCFI定位于细胞体内，提示水平细胞染色。在不存在水平细胞标记物的情况下，下述参考文献提示了在免疫组化中在水平细胞中出现了什么样的表达：Poche et al(2009),Development,136:2141-51；Cuenca et al(2010),Exp Eye Res.,91:273-85；Ho et al(2012),PLoS One,7:e29892。
图13显示了假处理和AAV.CFI注射眼的视网膜切片的神经节细胞层的更高放大倍数。尽管在AAV.CFI注射眼的视网膜切片中hCFI标记在神经纤维层中的强度似乎高于其在假注射眼的视网膜切片中的强度，但是仍难以确定是否hCFI定位于神经纤维层中。
图14显示了在假处理、AAV.CFI和AAV.CFIco注射眼的全标本包埋RPE中纤连蛋白和hCFI的定位。对于AAV.CFI和AAV.CFIco注射眼，hCFI定位于RPE细胞中。染色被标明，其似乎定位于对hCFI进行加工的分泌途径的囊泡中。
实施例2
AAV.CFI或AAV.CFIco减轻光诱导的视网膜损伤能力的体内功能测定
将白化BALB/c小鼠饲养在12小时明暗交替的动物房中，动物自由摄食饮水。在动物视平线上的环境光强度为85±18lux。所有实验均按照在眼科和视觉研究中对动物使用的ARVO声明进行并经过英国内政部批准。
对于地图状萎缩模型( Rohrer；Yao Guo；Kannan Kunchithapautham；GaryS.Gilkeson,Investigative Ophthalmology&Visual Science November 2007,Vol.48,5282-5289)，将成年小鼠(约1岁)移入光处理房间和暗适应过夜。将动物每两只一笼饲养在透明丙烯酸玻璃(Plexiglas；Rohm and Haas,Philadelphia,PA)笼中，动物可自由摄食饮水。通过将动物暴露于由悬挂在笼上方约40cm的两个30W荧光灯(T30T12-CW-RS；GeneralElectric,Piscataway,NJ)所提供的1000lux白光诱导光损伤。使用光度计(ExtechInstruments,Waltham,MA)测量光强度以确保向所有动物提供相等的亮度。在白化小鼠中，在2至3周内将产生该光量的灯杆数减少为一行。
为了检测补体因子I(CFI)在光诱导的外部视网膜神经元丢失中的作用，通过视网膜下途径将小鼠暴露于CFI-AAV.CFI(或AAV.CFIco)、对照GFP-AAV.GFP或假注射中。通过每个队列使用6-8只小鼠。在AAV暴露3-4周后，开始进行如上文所述的光诱导损伤。2-3周后，进行视网膜电图(ERG)检查。使用甲苯噻嗪和***(分别为20mg/kg和80mg/kg)对小鼠进行麻醉，使用1滴盐酸苯肾上腺素(2.5％)和托品酰胺(1％)散瞳，并将其置于不透光的法拉第笼内的37℃下的加热块上。使用Micron IV(Phoenix Labs)提供的ERG设置提供光刺激。光信号由机械快门、手动操作的中性密度和500纳米带通滤光片控制。在刺激路径中提供的每10-ms闪光的光强度可以在从3.0×105至3.0×1011光子/mm2的0.3对数单位步长范围内变化。记录对于增加光强度的单次闪光刺激的应答记录暗视视网膜电图，平均记录3至5次应答。测量从基线到初始负向电压的峰值a波振幅，以及测量从a波谷值到正b波峰值的峰值b波振幅。进行ERG后，取小鼠的眼并对其进行处理以进行使用苏木精和伊红染色的组织学检查，并对外部视网膜核层的厚度进行定量。
预计使用CFI-AAV.CFI/AAV.CFIco暴露后替代补体通路的活性降低，这将保持ERG的功能并减少外部视网膜神经元的丢失。
总之，腺相关病毒是能够使补体因子I持续表达的有效载剂，补体因子I是替代补体通路的调节剂。通过AAV递送的CFI均令人吃惊的显示出在具有活性的和融合的人RPE细胞中以功能性活性形式表达、正确加工和分泌。这些数据表明人RPE含有分泌功能形式的CFI所需的前蛋白转化酶。在动物翻译实验中，CFI.AAV的视网膜下递送导致了由小鼠RPE细胞产生的具有功能的经加工形式的hCFI易于检测的表达。免疫染色还表明，尽管hCFI缺乏在小鼠光感受器细胞内的表达，但是在光感受器的内段和外段区域内存在该蛋白，这表明RPE分泌的hCFI出现了扩散并很可能在脉络膜-视网膜的广泛区域内对补体通路发挥其关键的调控作用。鉴于存在将补体失调与年龄相关的黄斑变性相关联的数据，这种新的治疗方法可能在对这种致盲性病况的持续治疗中起到至关重要的作用。
在上述说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本申请。在不脱离本发明的范围和精神的前提下，本发明所述的载体、细胞、组合物、用途和方法的各种修订和变化对本领域技术人员而言将是显而易见的。尽管已结合具体优选的实施方式对本发明进行了描述，但是应当理解的是，不应将所主张的发明不适当地限制为这些特定的实施方式。事实上，对于生物化学和生物技术或相关领域的本领域技术人员而言均是显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修订均旨在在下述权利要求的范围内。

Claims (36)

1.一种腺相关病毒(AAV)载体，所述AAV载体包含编码因子I或者其片段或衍生物的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的AAV载体，其中所述编码因子I或者其片段或衍生物的核苷酸序列包含选自下组的序列：
(a)编码与SEQ ID NO：1或9具有至少70％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列；
(b)与SEQ ID NO：2或8具有至少70％同一性的核苷酸序列；以及
(c)SEQ ID NO：2或8所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的AAV载体，其中所述病毒载体是病毒颗粒形式。
4.根据权利要求3所述的AAV载体，其中所述AAV病毒颗粒包含AAV2基因组和AAV2衣壳蛋白。
5.根据前述任意一项权利要求所述的AAV载体，其中所述编码因子I或者其片段或衍生物的核苷酸序列与CAG启动子可操作连接，优选地启动子具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
6.一种使用权利要求1-5中任意一项所述的AAV载体转染的细胞。
7.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-5中任意一项所述的AAV载体或权利要求6所述的细胞与药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂的组合。
8.权利要求1-7中任意一项所述的AAV载体、细胞或药物组合物在治疗或预防补体介导的眼部病症中的用途。
9.根据权利要求8所述的AAV载体、细胞或药物组合物的用途，其中所述病症是年龄相关的黄斑变性(AMD)或糖尿病视网膜病变，优选地AMD。
10.根据权利要求9所述的AAV载体、细胞或药物组合物的用途，其中所述AMD是干性AMD。
11.根据权利要求8-10中任意一项所述的AAV载体、细胞或药物组合物的用途，其中地图状萎缩的形成被阻止或减少和/或地图状萎缩的量减少。
12.根据权利要求8-10中任意一项所述的AAV载体、细胞或药物组合物的用途，其中地图状萎缩的进展被减慢。
13.根据权利要求12所述的AAV载体、细胞或药物组合物的用途，其中相对于同一时期的未治疗眼，在向所述对象的治疗眼施用后12个月内，地图状萎缩面积的增加减少至少10％。
14.根据权利要求8-13中任意一项所述的AAV载体、细胞或药物组合物的用途，其中所述AAV载体、细胞或药物组合物的施用使对象中或对象的眼，如视网膜色素上皮(RPE)中C3b-失活和iC3b-降解活性的水平任选地增至超过对象或者其眼或RPE中正常水平的水平。
15.根据权利要求8-14中任意一项所述的AAV载体、细胞或药物组合物的用途，其中所述AAV载体、细胞或药物组合物眼内施用。
16.根据权利要求8-15中任意一项所述的AAV载体、细胞或药物组合物的用途，其中通过视网膜下、直接视网膜、脉络膜上或玻璃体内注射向对象的眼部施用所述AAV载体、细胞或药物组合物。
17.根据权利要求8-16中任意一项所述的AAV载体、细胞或药物组合物的用途，其中通过视网膜下注射向对象的眼部施用所述AAV载体、细胞或药物组合物。
18.一种治疗或预防补体介导的眼部病症的方法，所述方法包括向需要其的对象施用权利要求1-7中任意一项所述的AAV载体、细胞或药物组合物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述病症是年龄相关的黄斑变性(AMD)或糖尿病视网膜病变，优选地AMD。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述AMD是干性AMD。
21.根据权利要求18-20中任意一项所述的方法，其中地图状萎缩的形成被阻止或减少和/或地图状萎缩的量减少。
22.根据权利要求18-20中任意一项所述的方法，其中地图状萎缩的进展被减慢。
23.根据权利要求22所述的方法，其中相对于同一时期的未治疗眼，在向所述对象的治疗眼施用后12个月内，地图状萎缩面积的增加减少至少10％。
24.根据权利要求18-23中任意一项所述的方法，其中所述AAV载体、细胞或药物组合物的施用使对象中或对象的眼，如视网膜色素上皮(RPE)中C3b-失活和iC3b-降解活性的水平任选地增至超过对象或者其眼或RPE中正常水平的水平。
25.根据权利要求18-24中任意一项所述的方法，其中所述AAV载体、细胞或药物组合物眼内施用。
26.根据权利要求18-25中任意一项所述的方法，其中通过视网膜下、直接视网膜、脉络膜上或玻璃体内注射向对象的眼部施用所述AAV载体、细胞或药物组合物。
27.根据权利要求18-26中任意一项所述的方法，其中通过视网膜下注射向对象的眼部施用所述AAV载体、细胞或药物组合物。
28.一种腺相关病毒(AAV)载体，所述AAV载体包含编码因子H或者其片段或衍生物的核苷酸序列。
29.根据权利要求28所述的AAV载体，其中所述编码因子H或者其片段或衍生物的核苷酸序列包含选自下组的序列：
(a)编码与SEQ ID NO：3具有至少70％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列；
(b)与SEQ ID NO：4具有至少70％同一性的核苷酸序列；以及
(c)SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
30.根据权利要求28或29所述的AAV载体，其中所述病毒载体是病毒颗粒形式。
31.根据权利要求30所述的AAV载体，其中所述AAV病毒颗粒包含AAV2基因组和AAV衣壳蛋白。
32.根据权利要求28-31中任意一项所述的AAV载体，其中所述编码因子H或者其片段或衍生物的核苷酸序列与CAG启动子可操作连接，优选地启动子具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
33.一种使用权利要求28-32中任意一项所述的AAV载体转染的细胞。
34.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求28-32中任意一项所述的AAV载体或权利要求33所述的细胞与药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂的组合。
35.权利要求28-34中任意一项所述的AAV载体、细胞或药物组合物在治疗或预防补体介导的眼部病症中的用途，优选地其中所述病症是年龄相关的黄斑变性(AMD)或糖尿病视网膜病变，优选地AMD，优选地干性AMD。
36.根据权利要求35所述的AAV载体、细胞或药物组合物的用途，其中所述AAV载体用于权利要求9-17中任意一项所定义的用途。
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