CN108411002A - 用于鉴别紫海胆-中间球海胆杂交种的pcr引物及鉴别方法 - Google Patents

用于鉴别紫海胆-中间球海胆杂交种的pcr引物及鉴别方法 Download PDF

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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开一种用于鉴别紫海胆‑中间球海胆杂交种的PCR引物，核苷酸序列如下：上游引物：5' ttttatctcctccctttttatytct 3'；下游引物：5' cctcwaaagtagttaagattgggac 3'；鉴别方法依次按照如下步骤进行：提取具有紫海胆外形的待鉴别海胆个体DNA；将提取的DNA稀释至10 ng/μl为模板，以上游引物及下游引物进行PCR扩增，所述PCR反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 2min，35个循环；72℃ 5min；对PCR扩增产物进行电泳，出条带则为紫海胆‑中间球海胆杂交种。

Description

用于鉴别紫海胆-中间球海胆杂交种的PCR引物及鉴别方法
技术领域
本发明涉及分子标记领域，尤其涉及一种用于鉴别紫海胆-中间球海胆杂交种的PCR引物及鉴别方法。
背景技术
中间球海胆（Strongylocentrotus intermedius）又称虾夷马粪海胆，原产于日本北方及俄罗斯远东部分沿海地区。与其它可食用海胆种类相比，中间球海胆具有性腺色泽好、不饱和脂肪酸含量高、口感甜润等特点，深受东南亚地区消费者喜爱，市场需求量逐年增加，目前已在辽宁、山东等地形成养殖规模。研究显示，中间球海胆的最适生长水温为15℃~20℃，当水温升高到23℃时，会引起中间海胆的大量死亡。紫海胆（Anthocidaris crassispina）是自然分布于我国南方海域的海胆种类，对高温环境具有较高的耐受性。实验证实，以紫海胆(♀)和中间球海胆(♂)为亲本杂交产生的紫海胆-中间球海胆杂交种，相较于紫海胆具有优于母本的性腺品质，相较于中间球海胆又具有明显的耐高温潜力，是一种生长快速、耐高温性好、性腺品质卓越的海胆新品种。然而，由于紫海胆-中间球海胆杂交种与紫海胆具有相似的外观，很难用肉眼区别，容易在养殖中出现混淆问题。因此，有效地鉴别紫-中杂交海胆和紫海胆是海胆养殖与市场经营中亟待解决的重要问题。
目前，鉴定海胆种类的方法主要有两种：一种是根据海胆的外部形态特征，如壳形、体型对称性、口的位置、步间带和间步带幅宽比例及弧度，管足孔数及其排列方式等，该方法属于传统分类鉴定方法，不仅需杀死海胆，鉴定效率低，而且不适合具有相似外观的紫海胆-中间球海胆杂交种与紫海胆的鉴定；另一种是通过分子生物学方法，通常是利用基因组测序，通过比较基因组学的方法，大规模筛选特定的分子标记，这种方法的优势是鉴定的准确率较高，不足是花费巨大、耗时长，对操作分析人员的专业性和仪器设备精密度都有很高的要求。
线粒体基因组是真核生物细胞核基因组以外的遗传***，是研究分子进化和物种***发生的重要对象。相比复杂的核基因组而言，线粒体基因组所含的基因数目较少，获取容易，操作相对简单。但是，迄今为止并没有应用线粒体DNA序列对紫海胆-中间球海胆杂交种进行鉴别的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种用于鉴别紫海胆-中间球海胆杂交种的PCR引物及鉴别方法。
本发明的技术解决方案是：一种用于鉴别紫海胆-中间球海胆杂交种的PCR引物，其特征在于核苷酸序列如下：
上游引物：5' ttttatctcctccctttttatytct 3'
下游引物：5' cctcwaaagtagttaagattgggac 3'。
一种上述用于鉴别紫海胆与紫海胆-中间球海胆杂交种的PCR引物的鉴别方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
a. 提取具有紫海胆外形的待鉴别海胆个体DNA；
b. 将提取的DNA稀释至10 ng/μl为模板，以上游引物及下游引物进行PCR扩增，所述PCR反应条件为： 94℃ 5min；94℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 2min，35个循环；72℃ 5min；
c. 对PCR扩增产物进行电泳，出条带则为紫海胆-中间球海胆杂交种。
本发明提供了扩增海胆线粒体DNA序列的通用引物及以该引物鉴别紫海胆-中间球海胆杂交种的方法，可以随时进行活体取样（管足等），快速准确地鉴别紫海胆-中间球海胆杂交种及其母本—紫海胆。
附图说明
图1是本发明实施例1以中间球海胆DNA为模板①~⑤组引物PCR产物电泳图。
图2是本发明实施例1以紫海胆DNA为模板①~⑤组引物PCR产物电泳图。
图3是本发明实施例1以紫海胆-中间球海胆杂交种DNA为模板①~⑤组引物PCR产物电泳图。
图4 为本发明实施例2鉴别紫海胆与紫海胆-中间球海胆杂交种的电泳检测图。
具体实施方式
实施例1：
1. 登录NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），分别获得中间球海胆（GenBank Accession No. KC490912.1）和马粪海胆（Hemicentrotus pulcherrimus）（GenBank Accession No. KC490911.1）的线粒体基因组序列全长，通过序列比对，设计出①~⑤共5组通用性较高的PCR引物对，核苷酸序列如下：
①上游引物：5' taacggattaaagcacagcactgaa 3'；
下游引物：5' cgcatagagcttgaagggaatttaa 3'；
②上游引物：5' tcttgttttcttgtttttgtgagtt 3'；
下游引物：5' ctcgtgtatcaacatccattcc 3'；
③上游引物：5' tgccatgattgcaataggagt 3'；
下游引物：5' atctacaaagtgtcagtatcaggca 3'；
④上游引物：5' ccacttctcaacccatcaccacttt 3'；
下游引物：5' ctattccttgggggcctatttcttc 3'；
⑤上游引物：5' ttttatctcctccctttttatytct 3'；
下游引物：5' cctcwaaagtagttaagattgggac 3'。
2. 分别以中间球海胆、紫海胆及紫海胆-中间球海胆杂交种的DNA为模板，再分别以每一组PCR引物进行PCR反应；
2.1 DNA的提取
紫海胆、紫-中杂交海胆及中间球海胆各取3只个体，分别取30mg管足组织，在研钵中加入液氮研磨成粉末，使用试剂盒法提取DNA。试剂盒购自TianGen公司，型号为海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）（目录号：DP324）。
2.2将提取的DNA稀释至10 ng/μl为模板，以每一组PCR引物进行PCR反应；
PCR反应体系为10μl体系：
ddH2O 6.2μl
TAKARA La Taq(5U/μl) 0.2μl
10×LA PCR bufferⅡ(Mg2+Plus) 1.0μl
dNTP Mixture (2.5mM each) 0.8μl
上游引物 0.4μl
下游引物 0.4ul
模板DNA 1.0μl
其中，TAKARA La Taq(5U/μl)、10×LA PCR bufferⅡ(Mg2+Plus)及dNTP Mixture(2.5mM each)均购自宝生物工程（大连）有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
①~⑤组引物PCR反应条件分别为：
① 94℃ 5min；94℃ 30s、61℃ 30s、72℃ 3min30s，35个循环；72℃ 5min。
② 94℃ 5min；94℃ 30s、54℃ 30s、72℃ 4min，35个循环；72℃ 5min。
③ 94℃ 5min；94℃ 30s、57℃ 30s、72℃ 4min，35个循环；72℃ 5min。
④ 94℃ 5min；94℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 4min，35个循环；72℃ 5min。
⑤ 94℃ 5min；94℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 2min，35个循环；72℃ 5min。
3. 分别对所得到的PCR产物进行电泳，结果分别如图1、图2、图3所示。
图1是以中间球海胆DNA为模板①~⑤组引物PCR产物电泳图。从图1可以看出，①至⑤号引物对均出现条带。
图2是以紫海胆DNA为模板①~⑤组引物PCR产物电泳图。从图2可以看出，①、④号引物对出现条带。
图3是以紫海胆-中间球海胆杂交种DNA为模板①~⑤组引物PCR产物电泳图。从图3可以看出，①、②、④、⑤号引物对出现条带。
同时可以从图2~图3可以看出，在外形相似的紫海胆与紫海胆-中间球海胆杂交种中只扩增紫海胆-中间球海胆杂交种DNA的PCR引物为第②、⑤组，即第②、⑤组引物具有特异性，但⑤组引物比②组引物对鉴定特异性更强，扩增时间更短，故⑤组引物可作为鉴别紫海胆和紫海胆-中间球海胆杂交种的PCR引物。
⑤组引物对核苷酸序列如下：
上游引物：5' ttttatctcctccctttttatytct 3'；
下游引物：5' cctcwaaagtagttaagattgggac 3'。
实施例2：
本发明的用于鉴别紫海胆与紫海胆-中间球海胆杂交种的PCR引物的鉴别方法，依次按照如下步骤进行：
a. 取具有紫海胆外形的紫-中杂交海胆3只和紫海胆个体3只，随机打乱顺序至无法区分，作为待鉴别海胆并分别提取每个个体DNA；
b. 将提取的DNA稀释至10 ng/μl为模板，分别以上游引物及下游引物进行PCR扩增，引物的核苷酸如下：
上游引物：5' ttttatctcctccctttttatytct 3'；
下游引物：5' cctcwaaagtagttaagattgggac 3'。
PCR反应体系为10μl体系：
ddH2O 6.2μl
TAKARA La Taq(5U/μl) 0.2μl
10×LA PCR bufferⅡ(Mg2+Plus) 1.0μl
dNTP Mixture (2.5mM each) 0.8μl
上游引物 0.4μl
下游引物 0.4ul
模板DNA 1.0μl
其中，TAKARA La Taq(5U/μl)、10×LA PCR bufferⅡ(Mg2+Plus)及dNTP Mixture(2.5mM each)均购自宝生物工程（大连）有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
PCR反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 2min，35个循环；72℃5min。
c. 对PCR扩增产物进行电泳，电泳结果如图4所示。
图4中，Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ号样本扩增失败，为紫海胆；Ⅰ、Ⅳ、Ⅵ号样本扩增成功，出现条带，为紫海胆-中间球海胆杂交种。
序列表
<110> 大连海洋大学
<120> 用于鉴别紫海胆-中间球海胆杂交种的PCR引物及鉴别方法
<160> 10
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(25)
<223> 上游引物
<400> 1
taacggattaaagcacagcactgaa 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(25)
<223> 下游引物
<400> 2
cgcatagagcttgaagggaatttaa 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(25)
<223> 上游引物
<400> 3
tcttgttttcttgtttttgtgagtt 25
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(22)
<223> 下游引物
<400> 4
ctcgtgtatcaacatccattcc 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(21)
<223> 上游引物
<400> 5
tgccatgattgcaataggagt 21
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(25)
<223> 下游引物
<400> 6
atctacaaagtgtcagtatcaggca 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(25)
<223> 上游引物
<400> 7
ccacttctcaacccatcaccacttt 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(25)
<223> 下游引物
<400> 8
ccacttctcaacccatcaccacttt 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(25)
<223> 上游引物
<400> 9
ttttatctcctccctttttatytct 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(25)
<223> 下游引物
<400> 10
cctcwaaagtagttaagattgggac 25

Claims (2)

1.一种用于鉴别紫海胆-中间球海胆杂交种的PCR引物，其特征在于核苷酸序列如下：
上游引物：5' ttttatctcctccctttttatytct 3'
下游引物：5' cctcwaaagtagttaagattgggac 3'。
2.一种以权利要求1所述用于鉴别紫海胆与紫海胆-中间球海胆杂交种的PCR引物的鉴别方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
a. 提取具有紫海胆外形的待鉴别海胆个体DNA；
b. 将提取的DNA稀释至10 ng/μl为模板，以上游引物及下游引物进行PCR扩增，所述PCR反应条件为： 94℃ 5min；94℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 2min，35个循环；72℃ 5min；
c. 对PCR扩增产物进行电泳，出条带则为紫海胆-中间球海胆杂交种。
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