CN108410929B - 阿尼芬净前体的制备方法 - Google Patents
阿尼芬净前体的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108410929B CN108410929B CN201810536351.2A CN201810536351A CN108410929B CN 108410929 B CN108410929 B CN 108410929B CN 201810536351 A CN201810536351 A CN 201810536351A CN 108410929 B CN108410929 B CN 108410929B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- echinocandin
- deacylase
- enzyme
- stirring
- crosslinking
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 10
- 108010064760 Anidulafungin Proteins 0.000 title description 9
- 229960003348 anidulafungin Drugs 0.000 title description 9
- JHVAMHSQVVQIOT-MFAJLEFUSA-N anidulafungin Chemical compound C1=CC(OCCCCC)=CC=C1C1=CC=C(C=2C=CC(=CC=2)C(=O)N[C@@H]2C(N[C@H](C(=O)N3C[C@H](O)C[C@H]3C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N3C[C@H](C)[C@H](O)[C@H]3C(=O)N[C@H](O)[C@H](O)C2)[C@@H](C)O)[C@H](O)[C@@H](O)C=2C=CC(O)=CC=2)[C@@H](C)O)=O)C=C1 JHVAMHSQVVQIOT-MFAJLEFUSA-N 0.000 title description 9
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title description 5
- FAUOJMHVEYMQQG-HVYQDZECSA-N echinocandin B Chemical compound C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N3C[C@H](C)[C@H](O)[C@H]3C(=O)N[C@H](O)[C@H](O)C[C@@H](C(N[C@H](C(=O)N3C[C@H](O)C[C@H]3C(=O)N2)[C@@H](C)O)=O)NC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC)[C@@H](C)O)=CC=C(O)C=C1 FAUOJMHVEYMQQG-HVYQDZECSA-N 0.000 claims abstract description 62
- 108010062092 echinocandin B Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 36
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 16
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 24
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 11
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 9
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 20
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 19
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 6
- 241000187759 Streptomyces albus Species 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 108010049047 Echinocandins Proteins 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 description 3
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 description 3
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 3
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 3
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 3
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 2
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 2
- 108010020326 Caspofungin Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010021062 Micafungin Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical compound C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JYIKNQVWKBUSNH-WVDDFWQHSA-N caspofungin Chemical compound C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N3CC[C@H](O)[C@H]3C(=O)N[C@H](NCCN)[C@H](O)C[C@@H](C(N[C@H](C(=O)N3C[C@H](O)C[C@H]3C(=O)N2)[C@@H](C)O)=O)NC(=O)CCCCCCCC[C@@H](C)C[C@@H](C)CC)[C@H](O)CCN)=CC=C(O)C=C1 JYIKNQVWKBUSNH-WVDDFWQHSA-N 0.000 description 2
- 229960003034 caspofungin Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229960002159 micafungin Drugs 0.000 description 2
- PIEUQSKUWLMALL-YABMTYFHSA-N micafungin Chemical compound C1=CC(OCCCCC)=CC=C1C1=CC(C=2C=CC(=CC=2)C(=O)N[C@@H]2C(N[C@H](C(=O)N3C[C@H](O)C[C@H]3C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N3C[C@H](C)[C@H](O)[C@H]3C(=O)N[C@H](O)[C@H](O)C2)[C@H](O)CC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](O)C=2C=C(OS(O)(=O)=O)C(O)=CC=2)[C@@H](C)O)=O)=NO1 PIEUQSKUWLMALL-YABMTYFHSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-(2,6-diethylphenyl)-n-(methoxymethyl)acetamide;2,6-dinitro-n,n-dipropyl-4-(trifluoromethyl)aniline Chemical compound CCC1=CC=CC(CC)=C1N(COC)C(=O)CCl.CCCN(CCC)C1=C([N+]([O-])=O)C=C(C(F)(F)F)C=C1[N+]([O-])=O CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 241000187844 Actinoplanes Species 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 1
- 241000725101 Clea Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 125000005313 fatty acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000010025 steaming Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
- C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
- C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种全新的棘白菌素B转化为棘白菌素B母核的方法。该方法将交联酶聚体技术应用于棘白菌素B转化为棘白菌素B母核的过程中。该方法为通过将脱酰酶制备成脱酰酶交联酶聚体,该交联酶聚体将棘白菌素B转化为棘白菌素B母核。通过该方法,摩尔转化率能达到85%~90%,同时简化生产过程,降低了成本。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域,具体涉及抗真菌的发酵半合成药物前体的制备,更具体涉及阿尼芬净前体棘白菌素B母核的制备。
背景技术
近年来,由于免疫低下患者逐年增多,真菌感染发病率明显升高,尤其是深部真菌感染的发病率和病死率显著增加。棘白菌素类抗生素是20世纪70年代发现的一组天然产物,具有类似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链,能够非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性,从而达到抗真菌的目的。与传统抗真菌药物相比,该类药物具有作用机制独特,毒副作用低,且对一些唑类和两性霉素B耐药的真菌具有很强的抗菌活性,是目前临床治疗深部真菌感染的常用药物。FDA已批准上市的这类药物包括卡泊芬净(Caspofungin)、米卡芬净(Micafungin)和阿尼芬净(Anidulafungin)。
阿尼芬净的制备过程包括以下三步:(1)构巢曲霉(Aspergilus nidulans)发酵产生棘白菌素B(Echinocandin B,ECB);(2)通过微生物转化——游动放线菌发酵产生的脱酰化酶对棘白菌素B进行催化,使侧链断裂,生成阿尼芬净的前体-棘白菌素B母核(Echinocandin B Nucleus,ECBN);(3)在母核的基础上采用化学修饰的方法加入新的侧链——戊氧-三苯羧基。其中前体母核的制备是关键步骤。目前对于ECB母核的制备,化学方法成本较高,微生物转化具有以下优点:反应条件温和、产物单一、高度的化学选择性、区域选择性和对映体选择性、易于纯化、不污染环境且能完成一些化学合成难以进行的反应。
美国专利US7785826B2披露了ECB转化ECBN的工艺。此工艺主要流程包括:将ECB发酵完成以后,离心获得菌丝体,把菌丝体重新悬浮于水中然后加入脱酰酶进行转化,ECB脱酰酶仅利用一次。但该方法操作较为繁琐,工艺转化耗时20~30h,且转化率低,摩尔转化率仅为30%。
CN102618606公开了一种利用放线菌全细胞或发酵液作为催化剂的棘白菌素生物转化方法。该方法在转化体系添加了一种助溶剂,提高底物在转化体系中的溶解度,该助溶剂为β-环糊精或其衍生物,该方法的优点是提高了转化速度和转化率,缺点是全细胞转化,体系中带有大量菌体,酶与底物接触效率不高,后续分离纯化步骤复杂成本较高,没有解决酶在含有机溶剂体系中易失活的问题。
CN103074403公开了一种将ECB转化为ECBN的方法,涉及发酵完成后通过加磷酸盐、超声、离心、旋蒸浓缩,得到棘白菌素B脱酰酶酶液,然后加入ECB底物进行转化。该方法不足之处在于粗酶提取过程繁琐,不利于工业化放大生产;使用旋蒸的方式提取粗酶,由于温度偏高,易造成蛋白质变性,脱酰酶的活力有负面影响。
CN103374593公开了一种在发酵过程中添加棘白菌素B底物转化为棘白菌素B母核的方法,该方法将底物添加到脱酰酶产生菌发酵液中转化,反应体系存在大量微生物,后续分离纯化步骤复杂,成本高。
CN103387975公开了一种固定化环脂肽酰基转移酶的制备方法,所述环脂肽酰基转移酶固定于载体上;所述环脂肽酰基转移酶来源于天然或人工突变体、或者变种及由通过导入外来的环状酰基转移酶基因后转化得到的。利用固定化环脂肽酰基转移酶将ECBN转化为阿尼芬净。通过该方法,虽然转化率较高,但操作复杂,成本较高,固定化过程的化学反应容易导致酶部分失活。
CN105648000公开了一种棘白菌素B微生物酶转化方法,具体涉及棘白菌素B转化为棘白菌素B母核的方法。包括在微生物发酵生成棘白菌素B脱酰酶后提取粗酶,然后通过分批添加粗酶及棘白菌素B的方式进行转化,该方法分批添加粗酶和底物进行转化,没有解决酶暴露在有机溶剂体系中容易失活的问题。
基于对扩大生产,降低成本的需要,在阿尼芬净的生产领域,仍然需要更优的ECBN转化成阿尼芬净的方法。
2000年荷兰Delft理工大学的Cao等在交联酶和交联酶晶体的基础上提出一种新型的固定化酶技术,交联酶聚体(cross-linked enzyme aggregates,CLEAs)。此通过改变性质使酶分子靠近而形成聚集体从溶剂中沉淀出来,之后将聚集体进行交联,形成交联酶聚体。交联酶聚体是酶本身作为载体的固定化酶,单位体积酶浓度高,稳定、可回收、催化活性高,生产成本低,具有潜在的应用前景。
目前报道的交联酶聚体使用的酶包括水解酶、裂合酶、氧化还原酶,目前未见在发酵半合成药物的发酵领域有报道,也未见将此技术应用于脱酰酶的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种全新的棘白菌素B转化为棘白菌素B母核的方法。该方法将交联酶聚体技术应用于棘白菌素B转化为棘白菌素B母核的过程中。
该方法为通过将脱酰酶制备成脱酰酶交联酶聚体,该交联酶聚体将棘白菌素B转化为棘白菌素B母核。通过该方法,可达到85~90%的摩尔转化率,同时简化生产过程,降低了成本。
本发明方法包括以下步骤:
1).发酵能将棘白菌素B脱酰酶表达在胞外的基因工程菌,获得棘白菌素B脱酰酶粗酶;
2).将脱酰酶粗酶制备为脱酰酶交联酶聚体;
3).棘白菌素B与脱酰酶交联酶聚体反应,转化为棘白菌素B母核。
其中,步骤1)中脱酰酶粗酶是由产生菌发酵制得,粗酶产生菌的发酵可使用表达在胞外的基因工程菌株,例如白色链霉菌基因工程菌株(Streptomyces albus),(参见“Efficient Bioconversion of Echinocandin B to Its Nucleus by Overexpressionof Deacylase Genes in Different Host Strains[J].Appl Environ Microbiol,2013Feb;79(4):1126-33),采用本领域技术人员熟知的条件进行发酵制备,例如包括但不限于CN102618606中公开的发酵方法。
按照上述方法制备得到的脱酰酶发酵液过滤或离心,向上清液加入硫酸铵进行盐析,通入空气,搅拌后静置,过滤或离心,收集沉淀,得到脱酰酶粗酶。
其中,所述的硫酸铵的用量为发酵上清液的40~80%(w/v),优选50%;通入空气的每分钟流量相当于加入硫酸铵后料液总体积的10~30%(v/v),优选20%;搅拌时间为20~60分钟,优选30分钟;搅拌速度为50~150rpm;静置条件为温度4~15℃、时间8~16小时,优选的静置条件为8℃静置12小时。
步骤2)中,脱酰酶交联酶聚体的制备具体方法为:将步骤1)制备得到的脱酰酶粗酶加入磷酸缓冲液后,再加入牛血清白蛋白(BSA)作为交联保护剂,通入空气,搅拌后静置。再向上述反应液中加入交联剂戊二醛,搅拌,以形成脱酰酶交联酶聚体。
其中,所述的磷酸缓冲液含磷酸二氢钾2~2.5g/L,磷酸氢二钠1~1.5g/L,pH用盐酸或氢氧化钠调节为5.5~6.5;优选磷酸二氢钾2.24g/L,磷酸氢二钠1.24g/L,pH为6.0。粗酶的加入量为1~3%,优选粗酶加入量2%。
所述的牛血清白蛋白(BSA)的加入量为1~3g/L,优选2g/L,通入空气的每分钟流量相当于料液体积的10~30%(v/v),优选20%;搅拌时间为20~60分钟,优选30分钟;搅拌速度为50~150rpm,优选80rpm;静置条件为温度4~15℃、时间0.5~2小时,优选的静置条件为8℃静置1小时。
所述的戊二醛加入量为10~30mmol/L,优选20mmol/L;搅拌温度为28~32℃;搅拌速度为50~150rpm,优选100rpm;搅拌时间1~3小时,优选2小时。
步骤3)中,向上述步骤2)得到的反应液中加入棘白菌素B,搅拌,使棘白菌素转化为棘白菌素B母核,监测转化体系中棘白菌素B和棘白菌素B母核的浓度,当棘白菌素B浓度不再减少,棘白菌素B母核浓度不再增加时,结束转化。
其中,所述的棘白菌素B溶于二甲亚砜,得到质量浓度为10%的棘白菌素B溶液,使得棘白菌素B的加入量为5~20g/L,优选20g/L,搅拌温度为28~32℃,搅拌速度为50~150rpm,优选150rpm,转化时间为12~48小时,结束转化的指标为HPLC检测反应体系中棘白菌素B浓度不再减少,棘白菌素B母核浓度不再增加。
本发明通过添加牛血清白蛋白(BSA)作为交联保护剂,同时控制空气的流量和搅拌速度、时间,形成粒径大小合适的酶聚体,既避免了交联酶聚体粒径过大使得内部的酶分子不能很好地和底物接触,又避免了酶分子过多暴露在有机溶剂体系中导致失活。本发明脱酰酶交联后酶活更高。本发明成本低廉,操作简便,大幅提高转化速度和酶的稳定性,降低分离纯化的成本。
具体实施例
在下面将对本发明进行详细描述。然而,本发明可能具体体现为许多不同的形式,而且它不应该被局限于此处所描述的实施例中,提供这些实施例中的目的是使所披露内容更完整与全面。所用试剂和原料,除了提供制备方法的除外,其余均为市售。除非另有定义,否则本文中所有科技术语具有的含义与权利要求主题所属技术领域人员通常理解的含义相同。
实施例1产脱酰酶菌株的发酵及粗酶制备
菌种:白色链霉菌(Streptomyces albus),保藏号:ATCC21725;-80℃冷冻管保存;
种子培养基:热炸黄豆饼粉0.5%(w/v,下同),酵母粉0.5%,蛋白胨0.5%,葡萄糖1%,pH约6.8~7.2,30℃培养1~2天;
发酵培养基:热炸黄豆饼粉1%,酵母粉1%,蛋白胨1%,葡萄糖3%,氯化钠0.5%,七水硫酸镁0.2%,磷酸氢二钾0.1%,pH约6.8~7.2,30℃培养2~3天;
将白色链霉菌基因工程菌株接种于种子培养基,30℃培养1~2天,然后按照发酵体积的5%接种于发酵培养基,30℃培养2~3天;
发酵完成后,将发酵液过滤得到上清液,按照上清液体积的50%加入硫酸铵,通入空气,每分钟流量相当于料液体积的20%,同时搅拌30分钟,8℃静置12小时,过滤收集沉淀,得到粗酶。
实施例2脱酰酶交联转化生产棘白菌素B母核
在反应罐内配制磷酸盐缓冲液1000L,含磷酸二氢钾2.24g/L和磷酸氢二钠1.24g/L,用盐酸或氢氧化钠调节pH为6.0。
向磷酸缓冲液中加入20kg粗酶,2kg牛血清白蛋白(BSA),通入空气,每分钟流量为200L,同时搅拌30分钟,搅拌速度为80rpm,8℃静置1小时。
向反应液中加入戊二醛20mmol/L,30℃搅拌2小时,搅拌速度为100rpm。
向反应液中加入含有20kg棘白菌素B的10%棘白菌素B二甲亚砜溶液,30℃搅拌反应12~48小时,搅拌的速度为150rpm,转化过程中HPLC监测转化体系中棘白菌素B和棘白菌素B母核浓度,当棘白菌素浓度不再减少,棘白菌素B母核浓度不再增加时,结束转化。反应液过滤,取滤液HPLC定量检测棘白菌素B母核含量,计算摩尔转化率为89.72%。
Claims (6)
1.一种棘白菌素B转化为棘白菌素B母核的方法,该方法为棘白菌素B和脱酰酶交联酶聚体反应,转化为棘白菌素B母核;脱酰酶交联酶聚体的制备方法为将脱酰酶粗酶加入磷酸缓冲液后,再加入牛血清白蛋白作为交联保护剂,通入空气,搅拌后静置,再向上述反应液中加入交联剂戊二醛,搅拌,以形成脱酰酶交联酶聚体,所述磷酸缓冲液含磷酸二氢钾2~2.5g/L,磷酸氢二钠1~1.5g/L,pH为5.5~6.5,粗酶的加入量为1~3%,牛血清白蛋白的加入量为1~3g/L,通入空气的每分钟流量相当于料液体积的10~30%,搅拌时间为20~60分钟,搅拌速度为50~150rpm,静置条件为温度4~15℃、时间0.5~2小时,戊二醛加入量为10~30mmol/L,加入戊二醛后的搅拌条件为温度28~32℃、时间1~3小时;
所述棘白菌素B为将棘白菌素B溶于二甲亚砜,得到质量浓度为10%的棘白菌素B溶液;
所述棘白菌素B的加入量为20g/L。
2.如权利要求1所述的方法,磷酸缓冲液含磷酸二氢钾2.24g/L,磷酸氢二钠1.24g/L,pH用为6.0。
3.如权利要求1所述的方法,粗酶的加入量为2%。
4.如权利要求1所述的方法,牛血清白蛋白的加入量为2g/L。
5.如权利要求1所述的方法,戊二醛加入量为20mmol/L。
6.如权利要求1所述的方法,转化温度为28~32℃,反应搅拌的速度为150rpm。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810536351.2A CN108410929B (zh) | 2018-05-30 | 2018-05-30 | 阿尼芬净前体的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810536351.2A CN108410929B (zh) | 2018-05-30 | 2018-05-30 | 阿尼芬净前体的制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108410929A CN108410929A (zh) | 2018-08-17 |
CN108410929B true CN108410929B (zh) | 2024-01-26 |
Family
ID=63140887
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810536351.2A Active CN108410929B (zh) | 2018-05-30 | 2018-05-30 | 阿尼芬净前体的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108410929B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20240067913A (ko) * | 2021-09-07 | 2024-05-17 | 바이오콘 리미티드 | 에키노칸딘 핵의 제조 방법 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5573936A (en) * | 1990-06-07 | 1996-11-12 | Eli Lilly And Company | Process for purifying echinocandin B deacylase |
CN103074403A (zh) * | 2011-10-26 | 2013-05-01 | 上海医药工业研究院 | 微生物酶转化棘白菌素b的方法 |
WO2016056022A2 (en) * | 2014-10-07 | 2016-04-14 | Alaparthi Lakshmi Prasad | Intermediates and processes to prepare anidulafungin |
CN105648000A (zh) * | 2014-11-19 | 2016-06-08 | 重庆乾泰生物医药有限公司 | 一种棘白菌素b微生物酶转化方法 |
-
2018
- 2018-05-30 CN CN201810536351.2A patent/CN108410929B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5573936A (en) * | 1990-06-07 | 1996-11-12 | Eli Lilly And Company | Process for purifying echinocandin B deacylase |
CN103074403A (zh) * | 2011-10-26 | 2013-05-01 | 上海医药工业研究院 | 微生物酶转化棘白菌素b的方法 |
WO2016056022A2 (en) * | 2014-10-07 | 2016-04-14 | Alaparthi Lakshmi Prasad | Intermediates and processes to prepare anidulafungin |
CN105648000A (zh) * | 2014-11-19 | 2016-06-08 | 重庆乾泰生物医药有限公司 | 一种棘白菌素b微生物酶转化方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Immobilised enzymes: carrier-bound or carrier-free?;Linqiu Cao等;《Current Opinion in Biotechnology》;20031231;第389-392页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN108410929A (zh) | 2018-08-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10428362B2 (en) | Enzymatic hydrolysis of disaccharides and oligosaccharides using alpha-glucosidase enzymes | |
JP4986038B2 (ja) | 高加水分解活性セルラーゼおよびヘミセルラーゼの製造方法 | |
EP3110958A1 (en) | Enzymatic hydrolysis of disaccharides and oligosaccharides using alpha-glucosidase enzymes | |
JP4998991B2 (ja) | セルラーゼの製造方法 | |
US11286472B2 (en) | Variants of exoglucanases having improved activity and uses thereof | |
CN107208085B (zh) | 固定化细胞及其制备方法 | |
Brady et al. | Ethanol production at 45 C by alginate-immobilized Kluyveromyces marxianus IMB3 during growth on lactose-containing media | |
CN108410929B (zh) | 阿尼芬净前体的制备方法 | |
CN102220244B (zh) | 一种哈茨木霉菌株及其用该菌株制备右旋糖酐酶的方法 | |
CN108753880A (zh) | 米卡芬净钠前体的新的制备方法 | |
CN108441529A (zh) | 一种米卡芬净钠前体fr179642的发酵方法 | |
CN109136313B (zh) | 利用密西根克雷伯氏菌合成2’-脱氧腺苷的方法 | |
CN112725386A (zh) | 一种同步糖化发酵生产l-乳酸的方法 | |
CN108676831A (zh) | 棘白菌素b母核的制备方法 | |
CN108441534B (zh) | 一种米卡芬净钠前体的新的制备方法 | |
CN108753881A (zh) | Fr179642的制备方法 | |
WO2013122549A1 (en) | A method for enzymatic hydrolysis of cellulose | |
CN110358687B (zh) | 一株产d泛解酸内酯水解酶的赤霉菌及应用、发酵方法 | |
CN105420307A (zh) | 一种制备(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法 | |
CN115404172B (zh) | 塔宾曲霉菌株Yw-4及其应用 | |
Paranthaman et al. | Production on tannin acyl hydrolase from pulse milling by-products using solid state fermentation | |
JP5461026B2 (ja) | β−グルコシダーゼ産生菌及びβ−グルコシダーゼの製造方法 | |
CN108467880A (zh) | 米卡芬净钠前体的制备方法 | |
Adelabu | The Cellulase production by immobilized cells of Candida tropicalis isolated from grasshopper Zonocerus variegatus in Saw dust and rice husk medium: Production of cellulase enzyme by immobilized yeast cell | |
CA2003767A1 (en) | Biocatalysts and processes for the manufacture thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: Building C25, nanotechnology Park, 218 Xinghu street, Suzhou Industrial Park, Jiangsu Province Applicant after: BRIGHTGENE BIO-MEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Applicant after: Borui Pharmaceutical (Suzhou) Co.,Ltd. Address before: Building C25, nanotechnology Park, 218 Xinghu street, Suzhou Industrial Park, Jiangsu Province Applicant before: BRIGHTGENE BIO-MEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Applicant before: XINTAI PHARMACEUTICAL (SUZHOU) Co.,Ltd. |
|
CB02 | Change of applicant information | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |