CN108410890A - 木聚糖酶基因、重组表达质粒、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法和应用 - Google Patents

木聚糖酶基因、重组表达质粒、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种木聚糖酶基因、重组表达质粒、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法和应用，所述木聚糖酶基因laXynA用于编码木聚糖酶，所述木聚糖酶基因laXynA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，由所述木聚糖酶基因laXynA编码的木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明提供的木聚糖酶基因laXynA，通过载体转入大肠杆菌后，获得重组表达菌株，然后重组表达菌株经过高密度发酵工艺、亲和纯化方法后，制得的木聚糖酶laXynA在低温下具有高活性，且耐盐性良好，可有效地将木聚寡糖及山毛榉木聚糖水解为2～4个残基的木聚寡糖，可用于益生素木聚寡糖的制备以及食品加工。

Description

木聚糖酶基因、重组表达质粒、重组表达菌株、木聚糖酶及其 制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种木聚糖酶基因、重组表达质粒、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法和应用。
背景技术
利用木聚糖酶专一性地催化木聚糖的降解具有巨大的应用价值，目前，木聚糖酶在食品、饲料、纺织、造纸，医药、能源等行业中广泛使用。但是跟许多其他类型的工业酶一样，木聚糖酶的活性对反应的温度、pH以及盐离子浓度都有很强的依赖性。这是因为不同来源的木聚糖酶编码的蛋白质序列有所差异，这些差异导致其在不同的温度、pH以及盐离子浓度下催化活性不尽相同。近些年来，一大批具有较高热稳定性以及在高温下(往往大于80℃) 具有较高活性的高温木聚糖酶被开发出来，广泛应用于对高温有特殊需求的工业过程中，然而对于低温木聚糖酶的基因资源开发，酶学性质鉴定以及应用研究则关注较少。
低温木聚糖酶一般指在体温(37℃)、环境温度(25℃)以及更低温度下具有较好催化活性的木聚糖酶，其也有极为广泛的应用场景以及许多常温木聚糖酶和高温木聚糖酶所不具有的优点。低温木聚糖酶可以应用于对低温有需求的工业化过程中，例如，面团发酵、果汁生产等。由于在低温条件下催化，可以在保证食品中营养物质不被破坏。同时，由于在使用过程中不需要加热，低温木聚糖酶具有节能的优点。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种木聚糖酶基因、重组表达质粒、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法和应用，旨在提供一种低温、耐高盐的木聚糖酶。
为实现上述目的，本发明提出一种木聚糖酶基因laXynA，用于编码木聚糖酶，所述木聚糖酶基因laXynA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提出一种木聚糖酶，由如上所述的木聚糖酶基因laXynA编码，所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提出一种重组表达质粒，包括如上所述的木聚糖酶基因laXynA。
本发明还提出一种重组表达菌株，包括如上所述的木聚糖酶基因laXynA。
本发明还提出一种如上所述的重组表达质粒的制备方法，包括以下步骤：
将木聚糖酶基因laXynA通过酶切位点EcoR1和Not1连接到载体pET-28a 上，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，用试剂盒提取质粒，获得重组表达质粒pET-28a-laXynA。
本发明还提出一种如上所述的重组表达菌株的制备方法，包括以下步骤：
将木聚糖酶基因laXynA通过酶切位点EcoR1和Not1连接到载体pET-28a 上，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，用试剂盒提取质粒，获得重组表达质粒pET-28a-laXynA；
将重组表达质粒pET-28a-laXynA采用CaCl2法转化大肠杆菌BL21 (Rosetta)，得到含有质粒pET-28a-laXynA的重组大肠杆菌BL21(Rosetta)，即为重组表达菌株。
本发明还提出一种如上所述木聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：
将木聚糖酶基因laXynA通过酶切位点EcoR1和Not1连接到载体pET-28a 上，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，用试剂盒提取质粒，获得重组表达质粒pET-28a-laXynA；
将重组表达质粒pET-28a-laXynA采用CaCl2法转化大肠杆菌BL21 (Rosetta)，得到含有质粒pET-28a-laXynA的大肠杆菌BL21(Rosetta)；
将含有质粒pET-28a-laXynA的大肠杆菌BL21(Rosetta)按1:90～110的比例接种至ZYP-5052培养基中，于37℃、180～220rpm条件下培养至OD600为0.95～1.05，然后将温度降低至18～22℃，继续培养20～26h后，离心收集菌体，将菌体悬浮于HisTrap A缓冲液，然后通过压力破碎后离心取上清液；
在8～10℃的温度环境下，将上清液通过HisTrap亲和层析柱后，使用 HisTrap B缓冲液在AKTA蛋白纯化仪上梯度洗脱层析柱上的重组蛋白，然后使用截留分子量为10kDa的Millipore浓缩管将重组蛋白换液至磷酸盐缓冲液中浓缩至蛋白浓度为1mg/mL，得到纯化的木聚糖酶。
优选地，所述HisTrap A缓冲液的pH值为7.4，所述HisTrap A缓冲液包括以下摩尔浓度的组分：500mM的NaCl、20mM的咪唑和20mM的Na2HPO4；
所述HisTrap B缓冲液的pH值为7.4，所述HisTrap B缓冲液包括以下摩尔浓度的组分：500mM的NaCl、500mM的咪唑和20mM的Na2HPO4；
所述ZYP-5052培养基包括以下浓度的组分：1％蛋白胨，5％酵母提取物， 50mMNa2HPO4，50mM KH2PO4，25mM(NH4)2SO4，0.5％丙三醇，0.05％葡萄糖，0.2％乳糖，2mM MgSO4，100μg/ml卡那霉素，34μg/ml氯霉素；
所述磷酸盐缓冲液包括以下摩尔浓度的组分：137mM NaCl，2.7mM KCl， 10mMNa2HPO4，1.8mM KH2PO4。
本发明还提出如上所述的木聚糖酶在益生素木聚寡糖制备中的应用。
本发明还提出如上所述的木聚糖酶在食品加工中的应用。
本发明提供的木聚糖酶基因laXynA，通过载体转入大肠杆菌后，获得重组表达菌株，然后重组表达菌株经过高密度发酵工艺、亲和纯化方法后，制得木聚糖酶laXynA，所制得的木聚糖酶laXynA在低温下具有高活性，且耐盐性良好，可有效地将木聚寡糖及山毛榉木聚糖水解为2～4个残基的木聚寡糖，可用于益生素木聚寡糖的制备以及食品加工。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的木聚糖酶laXynA的SDS-PAGE测试结果图；
图2为本发明提供的木聚糖酶laXynA在不同pH值下的酶活测定结果图；
图3本发明提供的木聚糖酶laXynA在不同pH值下的稳定性测试结果图；
图4为本发明提供的木聚糖酶laXynA在不同温度下的酶活测定结果图；
图5为本发明提供的木聚糖酶laXynA在不同温度下的稳定性测试结果图；
图6为本发明提供的木聚糖酶laXynA在不同金属离子环境中的酶活测定结果图；
图7为本发明提供的木聚糖酶laXynA在不同NaCl浓度下的稳定性测试结果图；
图8为本发明提供的木聚糖酶laXynA水解木聚寡糖和山毛榉木聚糖的薄层层析测试结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提出一种木聚糖酶基因laXynA，用于编码木聚糖酶，所述木聚糖酶基因laXynA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明提供的木聚糖酶基因laXynA在GenBank基因数据库中通过对比搜索(BLASTp，为美国国立生物信息研究中心开发的免费序列相似性搜索程序，网址为：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)找到一种来源于海洋微生物(藤黄单胞菌，Luteimonas)的木聚糖酶编码基因，然后通过人工合成得到其密码子并优化核苷酸，得到如SEQ ID NO：1所示的木聚糖酶基因laXynA 的核苷酸序列，所述木聚糖酶基因laXynA共1098个碱基。
具体操作时，可以通过以下方式实现：首先，以Thermotoga maritima木聚糖酶TmxB蛋白质序列为查询序列，用BLASTp程序搜索嗜冷微生物基因组编码的蛋白质产物，找到本发明所提出的木聚糖酶基因；然后根据大肠杆菌密码子的偏爱性，对该木聚糖酶基因密码子进行优化设计，得到木聚糖酶基因laXynA，木聚糖酶基因laXynA在苏州金维智公司合成，合成的木聚糖酶基因laXynA位于pU57载体上，合成基因的5’端和3’端带有限制性酶切位点EcoR1和Not1。该两个限制性酶切位点将用于把木聚糖酶基因laXynA克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a。
需要说明的是，上述来源于海洋微生物的木聚糖酶编码基因序列虽然已经存在于公用、免费基因资源库(GenBank)中，并且被自动基因组注释预测为编码某种木聚糖酶的序列(GenKank中没有其登录号)，但是该基因所编码蛋白质的功能并没有通过任何试验进行证实。而本发明中根据大肠杆菌作为表达载体的特性，为了使该基因更好地在大肠杆菌中表达，对该基因序列的密码子进行人工优化设计，进而得到如SEQ ID NO：1所示的木聚糖酶基因 laXynA的核苷酸序列，然后将所述木聚糖酶基因laXynA导入大肠杆菌后进行发酵培养和提纯，得到由木聚糖酶基因laXynA所编码的木聚糖酶laXynA，且其内切型、低温酶活、最适反应温度、最适pH、耐盐特征以及酶的各项动力参数在本发明中均为第一次证实。
本发明进一步提出一种木聚糖酶，由如上所述的木聚糖酶基因laXynA编码，所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
由上述木聚糖酶基因laXynA所编码的木聚糖酶laXynA，含有365个氨基酸残基，理论分子量为39590.24道尔顿，等电点为4.41，其序列如SEQ ID NO：2所示。通过信号肽预测发现，所述木聚糖酶laXynA的前24个氨基酸为信号肽序列，因此成熟的木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明所提供的木聚糖酶laXynA为全长阅读框编码的蛋白质，即含有信号肽序列。本发明所提供的木聚糖酶laXynA与现有报道中的同糖苷水解酶家族的低温木聚糖酶的氨基酸序列(NCBI登录号为：Q21HD6，WP_013072455.1， WP_012025843.1，AFE82288.1，AEB69780.1，AGA16736.1，ADN44261.1， AAY98787.1)的一致性较低，约为20～26％，说明本发明提供的木聚糖酶 laXynA是一种全新的低温木聚糖酶。
本发明提供的木聚糖酶基因laXynA，通过载体转入大肠杆菌后，获得重组表达菌株，然后重组表达菌株经过高密度发酵工艺、亲和纯化方法后，制得木聚糖酶laXynA，所制得的木聚糖酶laXynA在低温下具有高活性，且耐盐性良好，可有效地将木聚寡糖及山毛榉木聚糖水解为2～4个残基的木聚寡糖，可用于益生素木聚寡糖的制备以及食品加工。
本发明还提出一种重组表达质粒，包括如上所述的木聚糖酶基因laXynA。
基于上述重组表达质粒，本发明还提出一种重组表达质粒的制备方法，包括以下步骤：通过人工合成获得木聚糖酶基因laXynA，所合成的木聚糖酶基因laXynA位于pU57载体上，通过酶切位点EcoR1和Not1将木聚糖酶基因laXynA从pU57载体上切下来，酶切获得的DNA片段再连接至经同样酶切(EcoR1和Not1酶切)的大肠杆菌表达载体pET-28a上，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，试剂盒提取质粒，用EcoR1和Not1双酶切质粒进行鉴定，酶切正确的即为重组质粒pET-28a-laXynA。
本发明还提出一种重组表达菌株，包括如上所述的木聚糖酶基因laXynA。
将上述的重组表达质粒pET-28a-laXynA导入表达细胞中获得重组表达菌株，目的基因即可随着宿主细胞的繁殖而复制。通常来说，所述表达细胞可以是大肠杆菌，也可以是酵母等细胞，或者是其他类型的细胞例如动物细胞等。
基于上述重组表达菌株，本发明还提出一种重组表达菌株的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、将木聚糖酶基因laXynA通过酶切位点EcoR1和Not1连接到载体pET-28a上，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，用试剂盒提取质粒，通过 EcoR1和Not1双酶切进行鉴定，酶切正确的即为重组表达质粒 pET-28a-laXynA；
步骤S2、将重组表达质粒pET-28a-laXynA采用CaCl2法转化大肠杆菌 BL21(Rosetta)，得到含有质粒pET-28a-laXynA的重组大肠杆菌BL21 (Rosetta)，即为重组表达菌株。
基于上述重组表达菌株，本发明还提出一种木聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：
S10、将木聚糖酶基因laXynA通过酶切位点EcoR1和Not1连接到载体 pET-28a上，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，用试剂盒提取质粒，通过 EcoR1和Not1双酶切进行鉴定，酶切正确的即为重组表达质粒 pET-28a-laXynA；
S20、将重组表达质粒pET-28a-laXynA采用CaCl2法转化大肠杆菌BL21(Rosetta)，得到含有质粒pET-28a-laXynA的大肠杆菌BL21(Rosetta)(即为重组表达菌株)；
S30、将含有质粒pET-28a-laXynA的大肠杆菌BL21(Rosetta)按1:90～110 的比例(优选为1:100)接种至ZYP-5052培养基中，于37℃、180～220rpm(优选为200rpm)条件下培养至OD600为0.95～1.05，然后将温度降低至18～22℃ (优选为20℃)，继续培养20～26h(优选为24h)后，离心收集菌体，将菌体悬浮于HisTrap A缓冲液，然后通过压力破碎后离心取上清液(上清液中即包含由重组表达菌株发酵形成的重组蛋白)；
S40、在8～10℃的温度环境下，将上清液通过HisTrap亲和层析柱后，使用HisTrapB缓冲液在AKTA蛋白纯化仪上梯度洗脱层析柱上的重组蛋白，然后使用截留分子量为10kDa的Millipore浓缩管将重组蛋白换液至磷酸盐缓冲液中浓缩至蛋白浓度为1mg/mL，得到纯化的木聚糖酶laXynA。
其中，所述HisTrap A缓冲液的pH值为7.4，所述HisTrap A缓冲液包括以下摩尔浓度的组分：500mM的NaCl、20mM的咪唑和20mM的Na2HPO4；所述HisTrap B缓冲液的pH值为7.4，所述HisTrap B缓冲液包括以下摩尔浓度的组分：500mM的NaCl、500mM的咪唑和20mM的Na2HPO4。
ZYP-5052培养基的具体配方如下：1％蛋白胨，5％酵母提取物，50mM Na2HPO4，50mMKH2PO4，25mM(NH4)2SO4，0.5％丙三醇，0.05％葡萄糖， 0.2％乳糖，2mM MgSO4，卡那霉素100μg/ml，氯霉素34μg/ml。
所述磷酸盐缓冲液含有以下摩尔浓度的组分：137mM NaCl，2.7mM KCl， 10mMNa2HPO4，1.8mM KH2PO4。
所制得的木聚糖酶laXynA的生化特征表现为：由于其可以将山毛榉木聚糖水解为2～4个残基的木聚寡糖(而不是水解成为单糖(即木糖))，说明木聚糖酶laXynA为内切型；最适反应温度为40℃，在10℃的低温环境中能够维持高达50％的酶活；最适反应pH为7.0，在pH为5～9区间都具有较高的催化活性；稳定性方面，在50℃温度下孵育1h后保持约30％的酶活，在 pH为6～10条件下孵育1h后能够维持约90％的酶活。说明所制备的木聚糖酶laXynA具有低温木聚糖酶所有的典型特征，即低温高活性，不耐热。
所制得的木聚糖酶laXynA的生化特征还表现为：一些常见的金属离子在5mM的浓度下对木聚糖酶laXynA没有明显的抑制或激活效果，但高浓度的 NaCl对木聚糖酶laXynA的活性具有极大促进效应，具体地，在NaCl浓度为 0.5M的条件下，木聚糖酶laXynA表现出的活性是没有NaCl条件下酶活的近4倍；在NaCl浓度为4M的条件下，木聚糖酶laXynA表现出几近100％的酶活，具有良好的耐盐性。
此外，所制得的木聚糖酶laXynA的酶促动力学测定分别在10℃、25℃和40℃条件下测定。在40℃条件下，木聚糖酶laXynA的最大反应速度(Vmax)、转换数(kcat)和催化效率(kcat/Km)最高，分别为49U/mg、35s-1和11ml/s/mg； Michaelis-Menten常数(Km)在25℃条件下最小，为1.6mg/ml。
需要说明的是，上述涉及到基因合成、重组表达质粒及重组表达菌株制备、以及重组表达菌株发酵培养获得重组蛋白等实施方式中，未说明具体实验方式、实验原材料者，均按照基因工程及基于基因工程进行微生物发酵培养制备蛋白质的常规方法进行。
基于上述木聚糖酶laXynA的内切型、低温高活性以及耐盐性的特征，本发明还提出如上所述的木聚糖酶在益生素木聚寡糖制备或食品加工中的应用。
具体地，基于其内切型的特征，所述木聚糖酶laXynA可用于益生素木聚寡糖的制备，例如将木聚寡糖(木二糖、木三糖等等)及山毛榉木聚糖水解为2～4个残基的木聚寡糖；基于其低温条件下高活性的特征，所述木聚糖酶 laXynA可用于食品工业生产中需要维持低温的应用场景中，例如面团发酵、果汁生产等；基于其耐盐性的特征，所述木聚糖酶在海产品或高盐食品加工中的应用，其中，海产品包括海藻类(例如紫菜、海带等)、虾类(例如龙虾、基围虾等)、鱼类(例如三文鱼、沙丁鱼等)以及贝类(例如海螺、文蛤等)等，高盐食品包括腌菜、酱菜、培根、腊肉等食品。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1木聚糖酶基因laXynA的获得
以Thermotoga maritima木聚糖酶TmxB蛋白质序列为查询序列，用Blastp 程序搜索嗜冷微生物基因组编码的蛋白质产物，找到本发明所涉及的木聚糖酶基因；然后根据大肠杆菌密码子的偏爱性，对木聚糖酶基因密码子进行优化设计，得到木聚糖酶基因laXynA，木聚糖酶基因laXynA在苏州金维智公司合成，合成的木聚糖酶基因laXynA位于pU57载体上，合成基因的5’端和 3’端带有限制性酶切位点EcoR1和Not1。
实施例2重组表达质粒的制备
(1)用限制性内切酶EcoR1和Not1(均购自Takara公司)将实施例1 获得的木聚糖酶基因laXynA从pU57载体上切下来，胶回收切下的laXynA DNA片段；
(2)将laXynA DNA片段通过T4DNA连接酶(购自Takara公司)连接到pET-28a载体(一种用于在大肠杆菌中重组表达外源基因的商业化载体，购自Novagen公司，该载体上带有卡那霉素抗性基因)上；
(3)将连接产物通过CaCl2法转化到大肠杆菌DH5α(一种生物学实验室常规的克隆菌株，购自Invitrogen公司，保存于武汉轻工大学实验室)感受态细胞中。将转化的细胞涂布在含有100μg/ml卡那霉素(购自Sigma公司) 的LB琼脂平板上进行阳性转化子筛选；其中涉及到的大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及CaCl2转化方法是生物学实验室的常规操作，具体方法可参考 Current Protocols in Molecular Biology一书中关于DNA转化的章节(doi.org/10.1002/0471142727.mb0108s37)；其中用到的LB琼脂平板是通过在LB培养基(每升中含有10g NaCl，5g酵母提取液和10g蛋白胨)加入2.5％的琼脂制备而成。
(4)挑取单克隆接种至含有100μg/ml卡那霉素的LB培养基中，过夜培养，然后用试剂盒提取质粒，通过EcoR1和Not1双酶切进行鉴定，酶切结果正确的即为重组laXynA表达质粒pET-28a-laXynA。
实施例3重组表达菌株的制备
(1)将实施例2获得的重组表达质粒pET-28a-laXynA采用CaCl2法转化大肠杆菌BL21(Rosetta)(购自Novagen公司，为实验室常见的基因工程表达菌，该菌株自带有氯霉素抗性，保存于武汉轻工大学实验室)感受态细胞；其中感受态大肠杆菌BL21(Rosetta)的制备及转化方法与实施例2(3)中的方法相同；
(2)将转化后的大肠杆菌BL21(Rosetta)涂布在含有卡那霉素(100μg/ml) 和氯霉素(34μg/ml,购自Sigma公司)的LB琼脂平板上。在此双抗性平板上生长的菌落为重组laXynA表达菌株。
实施例4木聚糖酶laXynA的制备
(1)将实施例2制备的重组laXynA表达菌株过夜培养后(培养基中加 100μg/ml卡那霉素和34μg/ml的氯霉素)，按1:100的比例接种至ZYP-5052 培养基中，于37℃、200rpm条件下培养至OD600(600nm处的吸光度)为 0.95～1.05，然后将温度降低至20℃，继续培养24h后，5000r/min离心收集菌体，将菌体悬浮于HisTrap A缓冲液，然后通过压力破碎后离心取上清液(含有由重组表达菌株发酵形成的重组蛋白)；其中，HisTrap A缓冲液的pH值为7.4，包括以下摩尔浓度的组分：500mM的NaCl、20mM的咪唑和20mM 的Na2HPO4；ZYP-5052培养基的具体配方如下：1％蛋白胨，5％酵母提取物， 50mM Na2HPO4，50mM KH2PO4，25mM(NH4)2SO4，0.5％丙三醇，0.05％葡萄糖，0.2％乳糖，2mM MgSO4，卡那霉素100μg/ml，氯霉素34μg/ml；
(2)在8～10℃的温度环境下，取步骤(1)制得的上清液通过HisTrap 亲和层析柱(购自通用公司)后，使用HisTrap B缓冲液在AKTA上梯度洗脱上清液中的重组蛋白，然后使用Millipore浓缩管将重组蛋白换液至磷酸盐缓冲液中浓缩至蛋白浓度为1mg/mL，得到纯化的木聚糖酶laXynA；其中， HisTrap B缓冲液的pH值为7.4，包括以下摩尔浓度的组分：500mM的NaCl、 500mM的咪唑和20mM的Na2HPO4；磷酸缓冲液含有以下摩尔浓度的组分：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4。
对实施例4制备的木聚糖酶laXynA的蛋白表达、酶活、最适反应条件、耐盐性及酶促动力学的分析测定，测定方法及结果如下：
1、木聚糖酶laXynA的蛋白表达分析
对实施例4步骤(1)中细胞破碎制得的上清液和步骤(2)中纯化后的木聚糖酶laXynA，分别进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)测试，结果如图1所示(图1中：泳道1为细胞破碎后的上清液，泳道2 至11为上清液经过层析柱梯度洗脱得到的收集管样品，泳道12为蛋白质 Marker)。
由图1可知，纯化后的木聚糖酶laXynA在大肠杆菌中得到了高效的表达。
2、木聚糖酶laXynA的酶活分析(还原糖法，也即DNS法)
配制标准的反应体系为2mL，包括：0.5mL约1:20稀释的木聚糖酶 laXynA、1mL反应缓冲液以及0.5mL山毛榉木聚糖(购自Megazyme公司) 溶液(10mg/mL)；将该反应体系在水浴中孵育15min后加入DNS试剂(3， 5-二硝基水杨酸)，沸水水浴5min，然后冷却至室温；再将该反应体系定容至25mL，在520nm测定吸光度。还原糖的定量采用木糖标准品做标准曲线， 1单位(U)木聚糖酶活的活性定义为每分钟能够释放1μmol还原糖所需的木聚糖酶毫克数。
经DNS法测定，纯化后的木聚糖酶laXynA的酶活约为30U/mg。
3、木聚糖酶laXynA最适反应pH温度分析
将木聚糖酶laXynA分散在pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、 9.0、10.0和11.0的缓冲液(pH 3～8的缓冲液由McIlvaine缓冲液制备，pH 9～11 的缓冲液由甘氨酸-氢氧化钠(50mM)缓冲液制备)中，于30℃温度下，分别通过上述DNS法测定酶活，以测得的最高酶活值设定为100％，计算其他各pH反应区间的相对酶活。
其中，pH 3～8的缓冲液由McIlvaine缓冲液制备的方法如下：用摩尔浓度为200mM的Na2HPO4溶液和摩尔浓度为100mM的柠檬酸溶液进行勾对配制至所需要的pH值，具体比例如下表1所示：
表1由McIlvaine缓冲液制备对应pH值缓冲液的比例
pH 9～11的缓冲液由甘氨酸-氢氧化钠(50mM)缓冲液制备的方法如下：将甘氨酸溶解在水中，用氢氧化钠滴定到需要的pH(9.0，10.0，11.0)。
各pH反应区间的相对酶活的计算结果如图2所示。由图2可知，本实施例制备的木聚糖酶laXynA在pH值为5～9区间都具有较高的活性，其最适pH 为7.0。
4、木聚糖酶laXynA的pH稳定性分析
将木聚糖酶laXynA分散在不同pH(pH值为3～11)的缓冲液体系中，于 25℃温度下孵育1h后，在40℃、pH值为7.0的条件下，通过上述DNS法测定酶活，以测得的最高酶活值设定为100％，计算其他各pH反应区间的相对酶活，结果如图3所示。
由图3可知，本实施例制备的木聚糖酶laXynA在pH为6～10条件下，孵育1h后能够维持约90％的酶活。
5、木聚糖酶laXynA最适反应温度分析
将木聚糖酶laXynA分散在pH值为7.0的缓冲液体系中，分别于10℃、 20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃温度下，通过上述DNS法测定酶活，以测得的最高酶活值设定为100％，计算其他各温度反应区间的相对酶活，结果如图4所示。
由图4可知，本实施例制备的木聚糖酶laXynA在10～50℃温度区间都具有较高的活性，其最适温度为40℃。
6、木聚糖酶laXynA的温度稳定性分析
将木聚糖酶laXynA分散在pH值为7.0的缓冲液体系中，分别置于50℃、 60℃、70℃、80℃和90℃温度下孵育1h后，在40℃、pH值为7.0的条件下，通过上述DNS法测定酶活，以测得的最高酶活值设定为100％，计算其他各 pH反应区间的相对酶活，结果如图5所示。
由图5可知，本实施例制备的木聚糖酶laXynA在50℃温度下孵育1h后保持约30％的酶活。
7、木聚糖酶laXynA的耐盐性分析
按照上述酶活分析中的方法配制标准反应体系10份，向标准反应体系中分别加入终浓度为5mM的FeSO、4MnSO4、CaCl2、CoCl2和MgSO4溶液、以及浓度分别为0.5M、1M、2M、3M和4M的NaCl溶液，以不含有金属离子或盐溶液的标准反应体系作为对照组，通过上述DNS法测定酶活，以测得的最高酶活值设定为100％，计算其他各pH反应区间的相对酶活，结果如图6和图7所示，图6为不同金属离子对木聚糖酶laXynA活性的影响，图7为不同NaCl浓度为木聚糖酶laXynA活性的影响。
由图6和图7可知，上述常见的金属离子(Fe2+、Mn2+、Ca2+、Co2+和 Mg2+)在5mM的浓度下对木聚糖酶laXynA没有明显的抑制或激活效果，但高浓度的NaCl对木聚糖酶laXynA的活性具有极大促进效应，其中，在NaCl 浓度为0.5M的条件下，木聚糖酶laXynA表现出的活性是没有NaCl条件下酶活的近4倍，在NaCl浓度为4M的条件下，木聚糖酶laXynA表现出几近100％的酶活，说明本实施例制备的木聚糖酶laXynA具有良好的耐盐性。
8、木聚糖酶laXynA的酶促动力学测定
以浓度分别为0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、 5.0mg/mL和6.0mg/mL的山毛榉木聚糖为底物，分别在20℃、25℃、40℃温度和pH值为7.0的条件下进行酶促反应，然后采用双倒数作图法计算其动力学参数，包括Michaelis-Menten常数(Km)、最大反应速度(Vmax)、转换数 (kcat)以及催化效率(kcat/Km)，计算结果如下表2所示。
表2木聚糖酶laXynA的酶促动力学参数
由表2中的计算结果可知，在40℃条件下，木聚糖酶laXynA的最大反应速度(Vmax)、转换数(kcat)和催化效率(kcat/Km)最高，分别为49U/mg、 35s-1和11ml/s/mg；Michaelis-Menten常数(Km)在25℃条件下最小，为 1.6mg/ml。
实施例5木聚糖酶laXynA水解木聚寡糖和山毛榉木聚糖能力测试
将不同长度的木聚寡糖(X2～X6)和山毛榉木聚糖(木聚寡糖和山毛榉木聚糖均购自Megazyme公司)作为底物，在标准反应体系(上述酶活分析中提供的标准反应体系)和40℃、pH 7.0的反应条件下反应1h后，进行薄层层析分析(薄层层析硅胶板购自Merck公司)。每一种底物都设一个阴性对照(同样的反应体系和发育条件，但是木聚糖酶laXynA经100℃、10min灭活处理)，薄层层析所用的展开剂为正丁醇：异丙醇：乙酸：水＝7：5：2：4 (体积比)，条带显影剂为3％的尿素溶于正丁醇：乙醇：水：磷酸＝80：8： 5：7(体积比)，喷洒显影剂后将薄层板置于115℃、20min。
分析结果如图8所示，图8中：泳道1和2分别为灭活木聚糖酶laXynA 以及未灭活木聚糖酶laXynA水解山毛榉木聚糖的产物，泳道3为木糖(X1) 标准品，泳道4和5分别为灭活木聚糖酶laXynA以及未灭活木聚糖酶laXynA 水解木二糖(X2)的产物，泳道6和7分别为灭活木聚糖酶laXynA以及未灭活木聚糖酶laXynA水解木三糖(X3)的产物，泳道8和9分别为灭活木聚糖酶laXynA以及未灭活木聚糖酶laXynA水解木四糖(X4)的产物，泳道10 和11分别为灭活的木聚糖酶laXynA以及为灭活木聚糖酶laXynA水解木五糖 (X5)的产物，泳道12和13分别为灭活的木聚糖酶laXynA以及为灭活木聚糖酶laXynA水解木六糖(X6)的产物；木聚寡糖(X1～X6)简写字符的位置和大小指示水解产物中木聚寡糖在平板中迁移的位置。
由图8可知，本发明实施例制备的木聚糖酶laXynA可有效地将木聚寡糖 (X2～X6)及山毛榉木聚糖水解为2～4个残基的木聚寡糖.
综上所述，本发明提供的木聚糖酶基因laXynA，通过载体转入大肠杆菌后，获得重组表达菌株，然后重组表达菌株经过高密度发酵工艺、亲和纯化方法后，制得高纯度的木聚糖酶laXynA，所制得的木聚糖酶laXynA在低温下具有高活性，且耐盐性良好，可有效地将木聚寡糖及山毛榉木聚糖水解为 2～4个残基的木聚寡糖，可用于益生素木聚寡糖的制备、以及海产品或高盐食品的加工。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉轻工大学
<120> 木聚糖酶基因、重组表达质粒、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法和应
用
<130> 0515
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1098
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgaccccga gcacaattgg tctgctgagc ggcttactgg ccctgccgat cgttctgatt 60
ggttgtggcg gtgatcctcc gacccctacc ggccctcata caccggcagc agccgaaacc 120
gcagcagcaa ccgatgccgc aagcacagcc ctggcagcag gtctggaccg cttcattggt 180
agtgcacaca gcccgccgca gcacgatggt tttgcccgct attggaacaa ggtgaccccg 240
gaaaacggtg gtaaatgggg cgaagttgag gccgaacgcg gtgttatggt ttgggatgag 300
ctggatgcag catgggaaat ggcccaggcc catggcctgc cgtttcagat gcacgtgatg 360
gtttggggca accagcagcc ggaatggatt aaaaccctgc ctccggatgc ccagcgtgcc 420
gaaatcgaac gctggtttgc agccgtggcc gaacgttatc cgggcatcga ctatgtggag 480
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<210> 2
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Thr Pro Ser Thr Ile Gly Leu Leu Ser Gly Leu Leu Ala Leu Pro
1 5 10 15
Ile Val Leu Ile Gly Cys Gly Gly Asp Pro Pro Thr Pro Thr Gly Pro
20 25 30
His Thr Pro Ala Ala Ala Glu Thr Ala Ala Ala Thr Asp Ala Ala Ser
35 40 45
Thr Ala Leu Ala Ala Gly Leu Asp Arg Phe Ile Gly Ser Ala His Ser
50 55 60
Pro Pro Gln His Asp Gly Phe Ala Arg Tyr Trp Asn Lys Val Thr Pro
65 70 75 80
Glu Asn Gly Gly Lys Trp Gly Glu Val Glu Ala Glu Arg Gly Val Met
85 90 95
Val Trp Asp Glu Leu Asp Ala Ala Trp Glu Met Ala Gln Ala His Gly
100 105 110
Leu Pro Phe Gln Met His Val Met Val Trp Gly Asn Gln Gln Pro Glu
115 120 125
Trp Ile Lys Thr Leu Pro Pro Asp Ala Gln Arg Ala Glu Ile Glu Arg
130 135 140
Trp Phe Ala Ala Val Ala Glu Arg Tyr Pro Gly Ile Asp Tyr Val Glu
145 150 155 160
Val Val Asn Glu Pro Ile Asn Asp Pro Pro Ser Gln Asp Asp Glu Gly
165 170 175
Gly Gly Asn Tyr Ile Glu Ala Leu Gly Gly Thr Gly Asp Thr Gly Trp
180 185 190
Asp Trp Val Leu Glu Ala Phe Arg Leu Gly Arg Ala His Phe Pro Asp
195 200 205
Ser Val Leu Met Ile Asn Glu Tyr Ser Val Thr Ser Thr Pro Asp Thr
210 215 220
Thr Ala Arg Tyr Leu Glu Ile Ile Arg Leu Leu Gln Ala Glu Gly Leu
225 230 235 240
Ile Asp Ala Ile Gly Val Gln Gly His Ala Phe Ser Thr Thr Pro Glu
245 250 255
Thr Pro Met Asp Val His Arg Thr His Leu Asp Ala Leu Gly Ala Thr
260 265 270
Gly Leu Pro Val Tyr Val Thr Glu Phe Asp Ile Asp Gly Pro Asp Asp
275 280 285
Asp Ala Gln Leu Ala Ser Tyr Gln Arg Val Phe Pro Val Phe Trp Glu
290 295 300
His Pro Ala Val Arg Gly Val Thr Leu Trp Gly Phe Arg Pro Gly Leu
305 310 315 320
Trp Arg Thr Glu Gln Gly Ala His Leu Val Arg Glu Asp Gly Ser Glu
325 330 335
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<213> 人工序列
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Val Trp Gly Asn Gln Gln Pro Glu Trp Ile Lys Thr Leu Pro Pro Asp
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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275 280 285
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290 295 300
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340

Claims (10)

1.一种木聚糖酶基因laXynA，用于编码木聚糖酶，其特征在于，所述木聚糖酶基因laXynA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种木聚糖酶，由如权利要求1所述的木聚糖酶基因laXynA编码，其特征在于，所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种重组表达质粒，其特征在于，包括如权利要求1所述的木聚糖酶基因laXynA。
4.一种重组表达菌株，其特征在于，包括如权利要求1所述的木聚糖酶基因laXynA。
5.一种如权利要求3所述的重组表达质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将木聚糖酶基因laXynA通过酶切位点EcoR1和Not1连接到载体pET-28a上，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，用试剂盒提取质粒，获得重组表达质粒pET-28a-laXynA。
6.一种如权利要求4所述的重组表达菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将木聚糖酶基因laXynA通过酶切位点EcoR1和Not1连接到载体pET-28a上，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，用试剂盒提取质粒，获得重组表达质粒pET-28a-laXynA；
将重组表达质粒pET-28a-laXynA采用CaCl2法转化大肠杆菌BL21(Rosetta)，得到含有质粒pET-28a-laXynA的重组大肠杆菌BL21(Rosetta)，即为重组表达菌株。
7.一种如权利要求2所述木聚糖酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将木聚糖酶基因laXynA通过酶切位点EcoR1和Not1连接到载体pET-28a上，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，用试剂盒提取质粒，获得重组表达质粒pET-28a-laXynA；
将重组表达质粒pET-28a-laXynA采用CaCl2法转化大肠杆菌BL21(Rosetta)，得到含有质粒pET-28a-laXynA的大肠杆菌BL21(Rosetta)；
将含有质粒pET-28a-laXynA的大肠杆菌BL21(Rosetta)按1:90～110的比例接种至ZYP-5052培养基中，于37℃、180～220rpm条件下培养至OD600为0.95～1.05，然后将温度降低至18～22℃，继续培养20～26h后，离心收集菌体，将菌体悬浮于HisTrap A缓冲液，然后通过压力破碎后离心取上清液；
在8～10℃的温度环境下，将上清液通过HisTrap亲和层析柱后，使用HisTrap B缓冲液在AKTA蛋白纯化仪上梯度洗脱层析柱上的重组蛋白，然后使用截留分子量为10kDa的Millipore浓缩管将重组蛋白换液至磷酸盐缓冲液中浓缩至蛋白浓度为1mg/mL，得到纯化的木聚糖酶。
8.如权利要求7所述的木聚糖酶的制备方法，其特征在于，
所述HisTrap A缓冲液的pH值为7.4，所述HisTrap A缓冲液包括以下摩尔浓度的组分：500mM的NaCl、20mM的咪唑和20mM的Na2HPO4；
所述HisTrap B缓冲液的pH值为7.4，所述HisTrap B缓冲液包括以下摩尔浓度的组分：500mM的NaCl、500mM的咪唑和20mM的Na2HPO4；
所述ZYP-5052培养基包括以下浓度的组分：1％蛋白胨，5％酵母提取物，50mM Na2HPO4，50mM KH2PO4，25mM(NH4)2SO4，0.5％丙三醇，0.05％葡萄糖，0.2％乳糖，2mM MgSO4，100μg/ml卡那霉素，34μg/ml氯霉素；
所述磷酸盐缓冲液包括以下摩尔浓度的组分：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4。
9.一种如权利要求2所述的木聚糖酶在益生素木聚寡糖制备中的应用。
10.一种如权利要求2所述的木聚糖酶在食品加工中的应用。
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