CN108392633B - Pcsk9抑制剂在恶性肿瘤免疫治疗中的应用 - Google Patents

Pcsk9抑制剂在恶性肿瘤免疫治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及PCSK9抑制剂在恶性肿瘤免疫治疗中的应用。本发明揭示了PCSK9抑制剂可以有效地抑制肿瘤。所述的PCSK9抑制剂通过升高免疫细胞活化相关基因的表达，增强免疫细胞的活性，从而抑制肿瘤。本发明还揭示了联合应用PCSK9抑制剂和PD‑1抑制剂在进一步提高免疫细胞活性及抑制肿瘤方面的显著作用。

Description

PCSK9抑制剂在恶性肿瘤免疫治疗中的应用
技术领域
本发明涉及化学药物领域，更具体地，本发明涉及PCSK9抑制剂在抗肿瘤免疫治疗中的应用。
背景技术
肿瘤的免疫治疗是近年来兴起的最有前景的新疗法，该疗法能增强免疫***的反应能力，激发特异性免疫反应，从而达到延缓肿瘤进展和抑制肿瘤复发转移，甚至完全治愈肿瘤的目的。
目前肿瘤的免疫治疗可分为以下几类：(1)非特异性免疫治疗，指应用一些免疫调节剂通过非特异性地增强机体的免疫功能，激活机体的抗肿瘤免疫应答，以达到***的目的。目前在肿瘤治疗中应用的有细胞因子(1L-2、IFN、TNF等)、微生物及其产物、维生素K、热休克蛋白(HSP)等。(2)免疫检查点阻断治疗，研究发现在肿瘤细胞可通过免疫检查点分子，对肿瘤微环境中的免疫细胞进行负向调控，抑制其抗肿瘤的活性，而阻断免疫检查点的作用则可以恢复免疫细胞的杀伤能力，抑制肿瘤的进展。如已经被FDA批准用于恶性肿瘤治疗的抗PD1药物，以及抗CTLA-4药物等。(3)过继免疫治疗，指向恶性肿瘤患者输入具有抗瘤活性的免疫细胞，直接杀伤肿瘤或激发机体抗瘤免疫效应，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。
尽管本领域技术人员致力于抗肿瘤研究，也开发了多种肿瘤免疫治疗的手段，但是仍然有较多的技术难点，例如在免疫检查点药物中还存在一些问题：由于PD-1/PD-L1信号通路仅作用于T细胞的效应阶段，抗PD-1/PD-L1药物效果的发挥需要肿瘤抗原的递呈，临床上对于大约70％的低免疫原性的肿瘤往往治疗无效，需要与化疗、放疗等药物连用；另外，癌细胞有时会通过不同途径或多种途径实现免疫逃逸，单纯阻断PD-1/PD-L1途径对一些癌细胞的免疫逃逸可能并无作用。靶向CD47的抗体具有激活巨噬细胞、增强T细胞抗原递呈等功能，与抗PD-1/PD-L1在功能上互补，然而CD47的表达并非严格意义上的肿瘤特异性，体内使用CD47抗体往往会引起贫血等不良反应。
因此，仍然需要进一步地找到效果显著且易于实施的肿瘤免疫治疗方法以及治疗药物。
发明内容
本发明的目的在于提供PCSK9抑制剂在恶性肿瘤免疫治疗中的应用。
在本发明的第一方面，提供PCSK9抑制剂在制备抑制肿瘤或增强免疫细胞活性的药物中的应用。
在本发明的另一方面，提供PCSK9抑制剂以及PD-1抑制剂在制备抑制肿瘤或增强免疫细胞活性的药物中的应用。
在另一优选例中，所述的肿瘤是能被免疫细胞识别的肿瘤；较佳地，所述的肿瘤包括(但不限于)：白血病、淋巴瘤、黑色素瘤，肺癌，肝癌、***癌、结直肠癌、胃癌、食管癌、胆管癌、胆囊癌等。
在另一优选例中，所述的PCSK9抑制剂或所述的PCSK9抑制剂以及PD-1抑制剂通过升高免疫细胞活化相关基因的表达，增强免疫细胞的抑制肿瘤的活性，从而抑制肿瘤；较佳地，所述的免疫细胞活化相关基因包括：GZMB，IFNγ，TNFα，NOS2，NCR1，PRF，IL15，CCL3，CXCL10，CD8，NK1.1，FOXP3。
在另一优选例中，所述的免疫细胞包括：NK细胞，T细胞。
在另一优选例中，所述的PCSK9抑制剂包括：抗PCSK9抗体；干扰PCSK9基因表达的干扰分子；特异性下调PCSK9的基因编辑或基因沉默试剂；或PCSK9小分子抑制剂，如SBC-110736、SBC-115076、R-IMPP，购自MCE公司；或所述的PD-1抑制剂包括：抗PD-1抗体，干扰PD-1基因表达的干扰分子，特异性下调PD-1的基因编辑或基因沉默试剂。
在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包括：PCSK9抑制剂以及PD-1抑制剂。
在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤的药盒，所述的药盒中含有PCSK9抑制剂以及PD-1抑制剂；或所述的药盒中含有所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述的药盒中还包括选自下组的一种或多种：肿瘤化疗药物；肿瘤放疗药物；使用说明书。
在另一优选例中，所述的药物组合物或所述的药盒中，所述的PCSK9抑制剂包括：抗PCSK9抗体，干扰PCSK9基因表达的干扰分子，特异性下调PCSK9的基因编辑或基因沉默试剂；或PCSK9小分子抑制剂，如SBC-110736、SBC-115076、R-IMPP，购自MCE公司；或所述的PD-1抑制剂包括：抗PD-1抗体，干扰PD-1基因表达的干扰分子，特异性下调PD-1的基因编辑或基因沉默试剂。
在本发明的另一方面，提供一种增强免疫细胞的活性的方法，所述方法包括：抗PCSK9抑制剂处理免疫细胞；或以PCSK9抑制剂以及PD-1抑制剂联合处理免疫细胞。
在一个优选例中，所述的方法为非诊断性及非治疗性的方法。例如，所述的方法为一种离体的方法。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、对照组，PCSK9抗体组小鼠黑色素瘤细胞B16F10荷瘤的肿瘤生长曲线。
图2、对照组，PCSK9抗体组小鼠黑色素瘤细胞B16F10皮下荷瘤的代表性图片。
图3、对照组，PCSK9抗体组小鼠肝癌细胞Hepa1-6、肺癌细胞LLC、***癌细胞RM-1皮下荷瘤的代表性图片。
图4、对照组(PBS)，PCSK9小分子抑制剂组(SBC-110738)组小鼠黑色素瘤细胞B16皮下荷瘤的代表性图片。
图5、对照组，PCSK9抗体组小鼠血液胆固醇相关指标。
图6、对照组，PCSK9抗体组小鼠肿瘤组织，各免疫细胞标志物表达量检测图。
图7、对照组，PCSK9抗体组肿瘤浸润NK细胞以及CD8+T细胞的胆固醇含量检测图。
图8、对照组，PCSK9抗体组肿瘤浸润NK细胞以及CD8+T细胞活化相关基因的检测结果，其中图8A是NK细胞活化相关基因，图8B是CD8+T细胞活化相关基因。
图9、对照组，PD-1抗体组，PCSK9抗体+PD-1抗体联用组的小鼠荷瘤生长曲线，其中图9A是黑色素瘤B16的生长曲线，图9B是肺癌细胞LLC(即Lewis肺癌细胞，购自中科院)的肿瘤生长曲线。
图10、对照组，PD-1抗体组，PCSK9抗体+PD-1抗体联用组的小鼠皮下肿瘤代表性图片。其中图10A是黑色素瘤代表性图片，图10B是肺癌细胞LLC代表性图片。
图11、对照组，PD-1抗体组，PCSK9抗体+PD-1抗体联用组皮下肿瘤中，用流式方法检测NK细胞以及CD8+T细胞的浸润情况。
图12、对照组，PD-1抗体组，PCSK9抗体+PD-1抗体联用组中，肿瘤浸润NK细胞以及CD8+T细胞活化相关基因的检测结果。其中图12A是NK细胞活化相关基因检测结果，图12B是CD8+T细胞活化相关基因检测结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示PCSK9抑制剂(如抗体)可以有效地抑制肿瘤。所述的PCSK9抑制剂通过升高免疫细胞活化相关基因的表达，增强免疫细胞的活性，从而抑制肿瘤。本发明还揭示了联合应用PCSK9抑制剂和PD-1抑制剂(如抗体)在进一步提高免疫细胞活性及抑制肿瘤方面的显著作用。
如本文所用，所述的“肿瘤”是能被免疫细胞识别的“肿瘤”。“肿瘤”这一术语即包括了实体瘤，又包括了非实体瘤；例如，包括但不限于：黑色素瘤、肺癌、白血病、肝癌、胃癌、食管癌、胆管癌、胆囊癌、结直肠癌、***癌、乳腺癌。
如本文所用，所述的“免疫细胞”包括：T细胞，NK细胞，NKT细胞，调节性T细胞(Regulatory cell，简称Treg)。
PCSK9抑制剂
PCSK9是由肝细胞合成的一种肝源性分泌蛋白，首先在内质网中合成PCSK9酶原，其在内质网或者高尔基体内发生自我催化反应，裂解释放出前肽，形成成熟的蛋白酶，并立即分泌入血，它与细胞表面的低密脂蛋白受体(LDLR)的胞外区结合，介导LDLR的内化和降解，从而抑制肝细胞及外周细胞对低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的摄取，升高血液中的LDL-C及总胆固醇水平。研究表明，PCSK9水平与胆固醇、ox-LDL、甘油三酯等显著相关。其不仅能影响血浆胆固醇的水平，调节神经细胞的凋亡，还与炎症反应有一定的相关性。目前，关于抗PCSK9抗体药物的降胆固醇作用已经有了实验及临床研究，而关于其调节免疫细胞功能以及抗肿瘤作用未见报道。
如本文所用，所述的“PCSK9抑制剂”包括了核酸抑制物、拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等，只要它们能够下PCSK9的表达水平、抑制PCSK9的活性或功能。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。
所述的PCSK9抑制剂是指任何可降低PCSK9的活性、降低PCSK9的稳定性、下调PCSK9的表达、减少PCSK9有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调PCSK9有用的物质，从而可用于抑制肿瘤。例如，所述的下调剂是：核酸抑制物、蛋白抑制剂、抗体、配体、化合物、核酸酶、核酸结合分子等，只要其能够下调PCSK9的表达、抑制其活性或功能。所述的核酸抑制物包括但不限于：以PCSK9基因或其转录本为抑制或沉默靶标的干扰分子如shRNA，反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述shRNA，反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。
所述的PCSK9抑制剂还可以是抑制PCSK9活性的一些小分子物质，如小分子化合物。本领域的一些抑制PCSK9活性的小分子可以被应用到本发明中，用于抑制肿瘤或增强免疫细胞活性。作为本发明的优选方式，所述的所述的PCSK9抑制剂如SBC-110736、SBC-115076、R-IMPP(购自MCE公司)。
另外，现在也有一些基因编辑手段，能够通过定向的基因编辑来定向地抑制或下调基因的表达，这种手段以及试剂也可被应用于本发明中，制备PCSK9抑制剂。
作为本发明的优选方式，所述的PCSK9抑制剂是抗PCSK9抗体。
所述的特异性抑制PCSK9的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可用PCSK9蛋白免疫动物，如家兔小鼠，大鼠等生产的多克隆抗体；多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的，表达PCSK9或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体，此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。
PD-1抑制剂
如本文所用，所述的“PD-1抑制剂”包括了核酸抑制物、拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等，只要它们能够下PD-1的表达水平、抑制PD-1的活性或功能。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。
所述的PD-1抑制剂是指任何可降低PD-1的活性、降低PD-1的稳定性、下调PD-1的表达、减少PD-1有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调PD-1有用的物质，从而可用于抑制肿瘤。例如，所述的下调剂是：核酸抑制物、蛋白抑制剂、抗体、配体、化合物、核酸酶、核酸结合分子等，只要其能够下调PD-1的表达、抑制其活性或功能。所述的核酸抑制物包括但不限于：以PD-1基因或其转录本为抑制或沉默靶标的干扰分子如shRNA，反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述shRNA，反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。
另外，现在也有一些基因编辑手段，能够通过定向的基因编辑来定向地抑制或下调基因的表达，这种手段以及试剂也可被应用于本发明中，制备PD-1抑制剂。
作为本发明的优选方式，所述的PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。
所述的特异性抑制PD-1的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可用PD-1蛋白免疫动物，如家兔小鼠，大鼠等生产的多克隆抗体；多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的，表达PD-1或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体，此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。
应用
在本发明的较佳实施例中，本发明人利用PCSK9抗体作为单独成分在小鼠肿瘤荷瘤模型中进行了实验。通过皮下注射小鼠来源的黑色素瘤细胞系以及肺癌细胞系，建立小鼠荷瘤模型，观察小鼠皮下肿瘤的生长情况和小鼠的生存情况，发现对照组皮下肿瘤生长迅速，而给予PCSK9抗体治疗小鼠肿瘤生长明显减慢。通过对小鼠血液检测发现小鼠血总胆固醇水平降低，低密度脂蛋白胆固醇水平也有所降低，通过对肿瘤组织进行PCR检测发现CD8+T细胞及NK细胞浸润增多，通过磁珠分选方法分选免疫细胞发现其胆固醇含量增加，抗肿瘤活性明显增加。而通过将PCSK9抗体与PD1抗体联用，治疗荷瘤小鼠发现，合并治疗对肿瘤生长的抑制作用优于单纯应用PD1抗体，流式检测发现联合治疗可进一步提高NK细胞和CD8+T细胞的浸润，PCR检测发现NK细胞和CD8+T细胞抗肿瘤类细胞因子的分泌也明显增加。
基于本发明人的上述新发现，本发明提供了PCSK9抑制剂的用途，用于制备抑制肿瘤或增强免疫细胞活性的药物。所述的PCSK9抑制剂或所述的PCSK9抑制剂以及PD-1抑制剂通过升高免疫细胞活化相关基因的表达，增强免疫细胞的抑制肿瘤的活性，从而抑制肿瘤；较佳地，所述的免疫细胞活化相关基因包括：GZMB，IFNγ，TNFα，NOS2，NCR1，PRF，IL15，CCL3，CXCL10，CD8，NK1.1，FOXP3。
进一步地，本发明还提供了PCSK9抑制剂以及PD-1抑制剂作为药物组合，在制备抑制肿瘤或增强免疫细胞活性的药物中的应用。
药物组合物及药盒
本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的PCSK9抑制剂，以及药学上可接受的载体。
本发明所述的PCSK9抑制剂可作为单独成分制备抗肿瘤药物，还可作为单独成分与PD1抑制剂联合用于肿瘤的综合治疗。因此，较佳地，所述的药物组合物中还包括有效量的(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)所述的PD-1抑制剂。所述的药物组合物可用于抑制肿瘤。
如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。
合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在药物组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。
在得知了所述PCSK9抑制剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的PCSK9抑制剂或其药物组合物给药于哺乳动物；较佳地，还同时给予所述的PD-1抑制剂。给药的方式包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。
本发明所述的PCSK9抑制剂和/或PD-1抑制剂，或含有所述抑制剂成分的药物组合物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的PCSK9抑制剂和/或PD-1抑制剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
本发明还提供了含有所述的药物组合物或直接含有所述的PCSK9抑制剂和/或PD-1抑制剂的药盒。此外，所述的药盒中还可包括选自下组的一种或多种：肿瘤化疗药物，肿瘤放疗药物，以及说明药盒中药物的使用方法的说明书。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
用于qPCR进行基因检测的引物探针如表1。
表1
Figure BDA0001530676230000091
Figure BDA0001530676230000101
实施例1：小鼠肿瘤荷瘤模型的建立
首先，PCSK9抗体(购自BPS Bioscience公司)组小鼠荷瘤实验中，选取6～8周龄、雄性C57BL/6J小鼠20只，采用皮下注射方式每只接种2×106个黑色素瘤B16F10细胞、肝癌细胞Hepa1-6、肺癌细胞LLC、***癌细胞RM-1(购自中科院)，8天后观察成瘤情况。选取肿瘤大小相近的小鼠16只，随即将它们分为对照组(8只)、PCSK9抗体组(8只)。
其次，PCSK9抗体组小鼠荷瘤实验中，选取6～8周龄、雄性C57BL/6J小鼠30只，采用皮下注射方式每只接种2×106个黑色素瘤B16F10细胞或肺癌细胞LLC，8天后观察成瘤情况。选取肿瘤大小相近的小鼠24只，随即将它们分为对照组(8只)、PD-1抗体组(8只)和PCSK9抗体+PD-1抗体(购自Bio X Cell公司)联用组(8只)。
实施例2：PCSK9抑制剂对于小鼠肿瘤生长的影响
1、PCSK9抗体对于小鼠肿瘤生长的影响
小鼠分组后，对照组小鼠给予同型对照IgG、实验组小鼠给予PCSK9抗体(溶于生理盐水)，10mg/Kg，每隔3天一次，腹腔注射，或给予PD-1抗体，每次每只200μg(约10mg/Kg)，每隔3天一次，腹腔注射，或者二者联用。给药后每周测量各组小鼠皮下肿瘤大小，计算肿瘤体积(肿瘤体积＝肿瘤长径×肿瘤短径2/2)。最大小鼠肿瘤体积达到2cm3左右时，处死各组小鼠，取出皮下肿瘤并绘制肿瘤生长曲线。
如图1，2，3所示，对照组小鼠皮下肿瘤生长较迅速，体积明显增大。给予PCSK9抗体的实验组，小鼠皮下肿瘤生长速度明显减慢，体积明显缩小。上述实验证实，注射PCSK9抗体可明显抑制小鼠体内多种肿瘤细胞的生长。
如图9，10所示，在移植黑色素瘤(图9A、10A)或肺癌细胞(图9B、10B)后，对照组小鼠皮下肿瘤生长较迅速，体积明显增大。给予PD-1抗体后，小鼠皮下肿瘤生长速度减慢，体积缩小；联合给予PD-1抗体和PCSK9抗体后，小鼠皮下肿瘤生长速度进一步减慢，体积进一步缩小。
上述实验证实，PCSK9抗体可与PD-1抗体协同用于抗肿瘤治疗。
2、PCSK9小分子抑制剂对于小鼠肿瘤生长的影响
小鼠分组后，对照组小鼠给予PBS、实验组小鼠给予PCSK9小分子抑制剂SBC-110736(溶于PBS)，8mg/Kg，每天一次，腹腔注射。给药后每周观测小鼠皮下肿瘤大小，最大小鼠肿瘤体积达到2cm3左右时，处死各组小鼠，取出皮下肿瘤。
结果如图4所示，对照组小鼠皮下肿瘤体积明显大于给予PCSK9小分子抑制剂组。
上述结果证实，给予PCSK9小分子抑制剂处理可明显抑制体内肿瘤细胞的生长。
实施例3：小鼠血液胆固醇相关指标检测
各组小鼠处死前用抗凝管收集血液，离心后取上清进行血液总胆固醇含量、低密度脂蛋白胆固醇含量检测。
如图5所示，给予PCSK9抗体注射小鼠，其血液总胆固醇含量以及低密度脂蛋白胆固醇含量明显降低，而甘油三酯及高密度脂蛋白胆固醇无明显变化，与PCSK9抗体的药用效果相符。
实施例4：小鼠荷瘤组织相关检测
各组小鼠处死后收集荷瘤组织，抽提RNA后进行逆转录得cDNA，通过qPCR的方法检测荷瘤组织中各免疫细胞标志物(CD4、CD8、NK1.1、CD19、CD209、CD68、FOXP3)的表达水平。
如图6所示，给予PCSK9抗体注射小鼠，其荷瘤组织中CD8及NK1.1的表达水平明显升高，表明肿瘤组织中CD8+T细胞以及NK细胞的浸润有所增加。
实施例5：小鼠肿瘤浸润NK及CD8+T细胞相关检测
小鼠处死后，肿瘤组织通过胶原酶消化方法分离得到单细胞悬液，一部分悬液通过流式染色方法检测组织内免疫细胞比例，剩余细胞通过磁珠分选方法得到NK细胞以及CD8+T细胞。通过胆固醇检测试剂盒检测两种免疫细胞内的胆固醇水平，并抽提RNA逆转录得cDNA，通过qPCR方法检测活化相关基因(GZMB，IFNγ，TNFα，NOS2，NCR1，NRG2D，PRF，IL15，CCL3，CXCL10)的表达水平。
如图7所示，给予小鼠PCSK9抗体注射后，肿瘤浸润NK及CD8+T细胞胆固醇水平均有显著性增加，说明PCSK9抗体药物对于升高免疫细胞胆固醇水平有明显效果。
如图8所示，其中图8A是NK细胞活化相关基因，图8B是CD8+T细胞活化相关基因。可见，肿瘤浸润NK及CD8+T细胞活化相关基因的表达在PCSK9组显著升高，说明免疫细胞的抗肿瘤活性也有所升高。
用流式方法检测NK细胞以及CD8+T细胞的浸润情况，如图11所示，对比对照组，PD-1抗体组，PCSK9抗体+PD-1抗体联用组的肿瘤浸润NK和CD8+T细胞的比例明显升高，联用组的NK细胞比例比PD-1抗体组有进一步上升，而CD8+T细胞比例并无明显差异。
在活化相关基因检测方面，如图12A-B，PD-1抗体组，PCSK9抗体+PD-1抗体联用组的肿瘤浸润NK和CD8+T细胞活性对比对照组有明显升高。且，联用组在IFNγ、Perforin(即PRF)、GZMB表达升高更为明显，说明PCSK9抗体与PD-1抗体联用能实现进一步的增效作用，进一步升高NK细胞以及CD8+T细胞的活性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院
<120> PCSK9抑制剂在恶性肿瘤免疫治疗中的应用
<130> 179526
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcctagctgt cactcaaggg a 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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acatccatct cgtgctactt gt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttctctgtac catgacactc tgc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ggctcgcagg gatgatttca a 21

Claims (2)

1.一种增强免疫细胞的活性的方法，所述方法为非诊断性和非治疗性的方法，其特征在于，所述方法包括：以PCSK9抑制剂以及PD-1抑制剂联合处理免疫细胞；其中，所述PCSK9抑制剂为抗PCSK9抗体；所述PD-1抑制剂为抗PD-1抗体；所述免疫细胞为NK细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PCSK9抑制剂以及PD-1抑制剂升高免疫细胞活化相关基因的表达，所述的免疫细胞活化相关基因为：GZMB，IFNγ，TNFα，PRF。
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