CN108387562A - 共聚焦显微***中针孔轴向位置的调节方法 - Google Patents

共聚焦显微***中针孔轴向位置的调节方法 Download PDF

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Abstract

一种共聚焦显微***中针孔位置的调节方法，利用相变材料的非线性吸收效应，通过检测透过率信号的极值点或者反射率信号的凹点来判断***精确的焦点位置，然后根据此焦点位置快速精确的确定共聚焦显微***中反射光探测模块中的针孔位置。本发明实现快速精确的确定共聚焦显微***中针孔位置，可以达到纳米级别精度，且只需要一片镀膜材料，成本低廉。

Description

共聚焦显微***中针孔轴向位置的调节方法
技术领域
本发明涉及共聚焦显微***技术领域，具体是一种基于相变材料的非线性吸收特性的中针孔位置的调试方法。
背景技术
激光共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划时代的高科技产品，它在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，将光学成像的分辨率提高了30％-40％，已经被广泛运用在了医学、生物化学、材料学等等领域。
传统光学显微镜是宽场成像，即利用物像关系实时的将样品一部分的图像反应在成像面上。激光共聚焦技术则是建立在扫描显微技术上的，扫描显微技术采用的是点扫描模式，它是将一束平行光束经过物镜聚焦到样品上，形成一个衍射极限大小的光斑，然后逐点扫描，利用探测器逐点接收返回光路中的反射信号，最后将信号转换成一幅图像。激光共聚焦技术与扫描显微技术最大的不同在于它在反射信号探测器前方设置了一个针孔，此针孔大小与物镜聚焦的衍射极限光斑相匹配，此针孔的设置不仅能够滤掉大部分杂散信号，而且由于位置大小与物镜匹配，可以实现高信噪比三维成像，因为针孔可以滤除来自聚焦点空间上下反射回来的杂散信号，这个功能使其广泛运用在了生物化学研究领域，最后，针孔的设置还能将横向分辨率调高30％-40％。
激光共聚焦技术功能强大，运用广泛，很多实验室会针对不同的需要自己搭建激光共聚焦显微***，此时针孔轴向位置的调节成为装置搭建的最难点，因为只有当入射光严格平行，且聚焦在样品表面刚好是其衍射极限大小的时候，反射光才是严格的平行光，在反射光路中将反射光聚焦，然后调节针孔的轴向位置，让在针孔后方的探测器检测到的信号最强的时候，才是真正的共轭位置，成像效果才最好。然而实际操作时，很难保证入射光严格平行，更难保证入射光聚焦在样品表面刚好是焦点位置，从而无法让反射回来的光束严格平行，此时设置的针孔位置，虽然也按照探测器检测到信号最大的位置来判断，但实际上其不是真正理想的位置。所以调节针孔的轴向位置，首先要借助一些方法来准确判断样品焦点的位置。
现在比较常用的方法一是假定反射回来的光是平行光的前提下，根据针孔前方聚焦透镜的焦距来准确定位针孔轴向位置，但此方法对***要求太过于理想化，难以让***达到最优成像效果。另一种常用的方法是在针孔后方加一个光纤光源，让光纤光源发出的光经过反射光路中的聚集透镜后变成平行光，然后再经过光学***聚集到焦面上，属于基于光路可逆的一种操作，但此操作主要是调节针孔轴向位置，让光纤光源在焦面上所成的像点最小，然后以此位置确定小孔的位置。但是检测像点的时候因为存在噪声，判断其为最小时存在很大误差，而且不能进行定量判断。
相变材料，例如Sb、Te、Sb2Te3、Sb70Te30、InSb、Ge2Sb2Te5、或AgInSbTe材料具有较强的非线性吸收效应，当照射到材料表面的激光强度发生变化时，其透过率与反射率也会发生变化。饱和吸收的材料，当入射光强增强时，其光束透过率增强，反射率降低；反饱和吸收的材料，当入射光强增强时，其光束透过率减弱，反射率增强。共聚焦成像***中，其物镜将平行光束聚焦成一个衍射极限大小的点去扫描样品，所以其光束在光轴方向有一个先聚焦后放大的过程，让相变薄膜材料在聚焦点附近沿着轴向方向移动时，其表面的光强会发生变化，从而薄膜材料对光束的透过率和反射率均会发生变化。采用透射光探测方法时，沿着同一方向让相变材料经过***焦点位置，然后收集光束透过相变材料后的信号，透过率信号会呈现先递增后递减(饱和吸收)，或者先递减后递增(反饱和吸收)的状态。由于焦点处光强最强，所以其透过率是透过率曲线中的极值点，对于饱和吸收材料，焦点位置就是最大值位置，对于反饱和吸收材料，焦点位置就是最小值位置。根据此，就能判断光路中焦点的精确位置，接着将薄膜材料移动到此位置，此时调节光路反射探测模块中的针孔轴向位置，使针孔后方探测器接收到的光强最大，此时的针孔位置就是共聚焦***要求的共轭位置。从而实现快速准确定位共聚焦显微***中的针孔位置。
采用反射光探测方法时，由于在反射光路中反射光束的扩散角变化很大，针孔前物镜只能聚焦照射在物镜入瞳上的光束，所以其检测到的信号不管针孔轴向位置设置在哪，都是一个逐渐增大后减小的信号，利用相变材料的特性，即入射光越强，则反射率越弱，此时会在反射曲线上的某一处出现一个凹口，从而判断光路中焦点的精确位置，接着将样品移动到此位置，调节针孔轴向距离，此时反射光最强的位置就是针孔的轴向位置，也能实现快速准确定位共聚焦显微***中的针孔位置。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术不足，提供一种精确调试共聚焦显微***中针孔位置的方法。利用相变材料的非线性吸收效应，当照射到材料表面的激光强度发生变化时，材料透过率与反射率也会发生变化。采用透射光探测方法时，沿着同一方向让相变材料经过***焦点位置，然后收集光束透过相变材料后的信号，透过率信号会呈现先递增后递减(饱和吸收)，或者先递减后递增(反饱和吸收)的状态。由于焦点处光强最强，所以其透过率是透过率曲线中的极值点，对于饱和吸收材料，焦点位置就是最大值位置，对于反饱和吸收材料，焦点位置就是最小值位置，根据此，就能判断光路中焦点的精确位置。采用反射光探测方法时，同样沿着同一方向让相变材料经过***焦点位置，探测反射信号，由于相变材料的特性，会在反射曲线上的某一处出现一个凹口，此凹口就是由于靠近焦点处入射光强增强，导致反射率降低，从而判断光路中焦点的精确位置。找到准确焦点位置以后，将薄膜材料移动到此焦点位置，此时调节光路反射探测模块中的针孔轴向位置，使针孔后方探测器接收到的光强最大，此时的针孔位置就是共聚焦***要求的共轭位置。
为达到上述目的，本发明的技术解决方案是：
一种共聚焦显微***针孔位置的透射探测式调节方法，其步骤包括：
a)在盖玻片上用磁控溅射的方法镀上一层相变薄膜材料；
b)将该盖玻片置于样品台上，利用一束功率密度小于5×109W/m2的平行光经过物镜聚焦照射该盖玻片；
c)沿着入射光方向移动样品台，使盖玻片经过入射光焦点。
d)通过探测器测量盖玻片透射光的光强信号，根据光强信号的极值判断焦点位置：
当相变薄膜材料为饱和吸收材料时，选取光强信号曲线上的最大值作为焦点位置；
当相变薄膜材料为反饱和吸收材料时，选取光强信号曲线上的最小值作为焦点位置；
e)将盖玻片移动到焦点位置，此时调节光路反射探测模块中的针孔轴向位置，使针孔后方探测器接收到的光强最大，此时的针孔位置就是共聚焦***要求的共轭位置；
所述的步骤a)中的相变材料是Sb、Te、Sb2Te3、Sb70Te30、InSb、Ge2Sb2Te5、或AgInSbTe材料。
所述的步骤a)中的相变材料的厚度在10到100nm之间。
所述的步骤b)中的平行光波长为405nm。
一种共聚焦显微***针孔位置的反射探测式调节方法，其其步骤包括：
a)在盖玻片上用磁控溅射的方法镀上一层相变薄膜材料；
b)将该盖玻片置于样品台上，利用一束功率密度小于5×109W/m2的平行光经过物镜聚焦照射该盖玻片；
c)沿着入射光方向移动样品台，使盖玻片经过入射光焦点。
d)通过探测器测量盖玻片反射光的光强信号，选取光强信号曲线上的最大值附近凹口的最低点作为焦点位置；
e)将盖玻片移动到焦点位置，此时调节光路反射探测模块中的针孔轴向位置，使针孔后方探测器接收到的光强最大，此时的针孔位置就是共聚焦***要求的共轭位置；
所述的步骤a)中的相变薄膜材料是Sb、Te、Sb2Te3、Sb70Te30、InSb、Ge2Sb2Te5、或AgInSbTe。
所述的步骤a)中的相变材料的厚度在10到100nm之间。
所述的步骤b)中的平行光波长为405nm。
本发明在共聚焦显微镜***中，利用Sb、Te、Sb2Te3、Sb70Te30、InSb、Ge2Sb2Te5、或AgInSbTe材料的非线性吸收特性，让镀以上其中一种材料的盖玻片在***焦点附近沿着Z轴移动时，通过检测透过率信号的极值点或者反射率信号的凹点来判断***精确的焦点位置，然后根据此焦点位置快速精确的确定共聚焦显微***中反射光探测模块中的针孔位置。其优点是：
1)精度高，可以达到纳米级别。
2)速度快，实现一次性确定针孔轴向位置。
3)成本低廉，只需要一片镀膜材料。
附图说明
图1是本发明盖玻片镀上相变材料薄膜后示意图
图2是本发明盖玻片放置在光路中示意图
图3是本发明典型的经过焦点附近移动的透射信号变化示意图
图4是本发明点阵结构成像样品模板图
图5是本发明根据透射变化数据上不同位置调试针孔位置后的成像情况图，其中，a为使用SB薄膜材料经过焦点附近移动的透射信号变化示意图，b为a中以b处为焦点位置调试针孔位置后的成像情况图，c为a中以c处为焦点位置调试针孔位置后的成像情况图，d为a中以d处为焦点位置调试针孔位置后的成像情况图，e为a中以e处为焦点位置调试针孔位置后的成像情况图，f为a中以f处为焦点位置调试针孔位置后的成像情况图。
图6是本发明使用INSB薄膜材料经过焦点附近移动的透射信号变化示意图
图7是本发明使用INSB薄膜材料经过焦点附近移动的高精度透过率信号测试图
图8是本发明使用INSB薄膜材料测得的反射信号和透射信号对比图
图9是为偏移针孔最佳位置后测得的反射信号和透射信号对比图
图中：1-盖玻片，2-相变材料层，3-激光光源，4-入射光光束，5-聚焦物镜，6-透射聚焦透镜，7-透射光探测器，8-反射光光束，9-反射聚焦透镜，10-针孔，11-反射光探测器，12-样品台
具体实施方式
下面通过实施例和附图对本发明作进一步说明，但不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1：
一种共聚焦显微***针孔位置的透射探测式调节方法，其步骤包括：：
a)在盖玻片1上用磁控溅射的方法镀上一层相变薄膜材料2；
b)将该盖玻片1置于样品台上，利用一束功率密度小于5×109W/m2的平行光经4过物镜5聚焦照射该盖玻片1；
c)沿着入射光4方向移动样品台12，使盖玻片1经过入射光4的焦点。
d)通过透射光探测器7测量盖玻片1透射光的光强信号，根据光强信号的极值判断焦点位置：
当相变薄膜材料2为饱和吸收材料时，选取光强信号曲线上的最大值作为焦点位置；
当相变薄膜材料2为反饱和吸收材料时，选取光强信号曲线上的最小值作为焦点位置；
e)将盖玻片1移动到焦点位置，此时调节光路反射探测模块中的针孔10轴向位置，使针孔后方反射光探测器11接收到的光强最大，此时的针孔10的位置就是共聚焦***要求的共轭位置；
盖玻片1镀完相变材料薄膜2以后如图1所示，采用SB材料为镀膜材料，厚度为20nm。接着将盖玻片1放在共聚焦***中样品台12如图2所示，也就是***焦点附近处，使样品台从下往上沿着Z轴(纵轴)运动40um的距离，选取数值孔径为0.8的物镜5，并利用透射光探测器7测量透过率信号的变化。
图5a为透过率信号变化情况，其中横轴为Z轴方向的扫描点，一共800个点，每个点间距50nm，纵轴为强度幅值，可以观察到强度变化先是平稳，而后有一个渐渐升高的过程，其慢慢接近焦点位置，所以此时非线性饱和吸收效应开始显现，当相变材料薄膜2位于焦点位置时，其强度最大，而后相变材料薄膜2开始远离焦点，表面功率密度降低，非线性效应又减弱。从此图可以判断***真实焦点位置。
图4为点阵结构成像样品模板图，图5b、5c、5d、5e、5f为根据透射变化数据上不同位置调试针孔10位置后的成像情况图,其中图5b点对于图5a上离峰值较远距离b处，将***平台12移动到该位置以后，调节反射探测模块中针孔10位置，使针孔10后方的反射光探测器11接收到的强度最大，然后放入图4所示点阵结构成像样品模板，测得结果如图5b所示，可以隐约分辨出相邻针孔，但是整体成像较模糊。选取图5a中离极值更近一点的c点位置，待重复之前的步骤调整好针孔10位置后，其成像结果如图5c所示，很明显其成像清晰度高于b点位置。再选取图5a中离极值更近一点的d点位置，待重复之前的步骤调整好针孔10位置后，其成像结果如图5d所示，很明显其成像清晰度再次提高，高于c点位置。接着选取图5a中极大值点处的位置，待重复之前的步骤调整好针孔10位置后，其成像结果如图5e所示，很明显其成像清晰度再次提高，高于d点位置。最后选取极大值之后图5a中f处的位置，待重复之前的步骤调整好针孔10位置后，其成像结果如图5f所示，其成像分辨率很大程度的降低，样品上的点阵结构不再能分辨，分辨率下降如此之快，很可能是因为平台12是从下往上沿着Z轴移动的，所以f点处的聚焦点位置位于点阵结构成像样品模板里面，从而导致成像分辨率很大程度上降低。
以上各个位置的成像结果可以很明显的呈现不同透过率曲线上点对应的成像结果情况，从而可以通过测试相变薄膜材料沿着轴向的透过率曲线快速确定焦点位置，进而准确确定反射探测模块中针孔的位置，更进一步说明此方法可以快速精确的确定共聚焦显微***中针孔位置。
实施例2：
一种共聚焦显微***针孔位置的透射探测式调节方法，其步骤包括：：
a)在盖玻片1上用磁控溅射的方法镀上一层相变薄膜材料2；
b)将该盖玻片1置于样品台上，利用一束功率密度小于5×109W/m2的平行光经4过物镜5聚焦照射该盖玻片1；
c)沿着入射光4方向移动样品台12，使盖玻片1经过入射光4的焦点。
d)通过透射光探测器7测量盖玻片1透射光的光强信号，根据光强信号的极值判断焦点位置：
当相变薄膜材料2为饱和吸收材料时，选取光强信号曲线上的最大值作为焦点位置；
当相变薄膜材料2为反饱和吸收材料时，选取光强信号曲线上的最小值作为焦点位置；
e)将盖玻片1移动到焦点位置，此时调节光路反射探测模块中的针孔10轴向位置，使针孔后方反射光探测器11接收到的光强最大，此时的针孔10的位置就是共聚焦***要求的共轭位置；
盖玻片1镀完相变材料薄膜2以后如图1所示，采用INSB材料为镀膜材料，厚度为20nm。然后如图2所示，将盖玻片1放在共聚焦***中样品台12，也就是***焦点附近处，使样品台12从下往上沿着Z轴运动60um的距离，选取数值孔径为0.65的物镜5，并利用透射光探测器7测量透过率信号的变化。
图6为使用INSB薄膜材料经过焦点附近移动的透射信号变化示意图，其中横轴为Z轴方向的扫描点，运动距离为60um，每个点间距100nm，纵轴为强度幅值，可以观察到强度变化先是平稳，而后有一个渐渐降低的过程，其慢慢接近焦点位置，所以此时非线性反饱和吸收效应开始显现，当相变材料薄膜2位于焦点位置时，其透过率强度最小，而后相变材料薄膜2开始远离焦点，表面功率密度降低，非线性效应又减弱。从此图可以判断***真实焦点位置，不过其相对精度较低，如果以极值变化95％的点来衡量判断精度的话，其精度在500nm附近。
图7为本发明使用INSB薄膜材料经过焦点附近移动的高精度透过率信号测试图，其中横轴为Z轴方向的扫描点，运动35um的距离，每个点间距20nm，纵轴为强度幅值，如果以极值变化95％的点来衡量判断精度的话，其精度在100nm附近，远小于***焦深。
实施例3：
一种共聚焦显微***针孔位置的反射探测式调节方法，其步骤包括：
a)在盖玻片1上用磁控溅射的方法镀上一层相变薄膜材料2；
b)将该盖玻片1置于样品台上，利用一束功率密度小于5×109W/m2的平行光经4过物镜5聚焦照射该盖玻片1；
c)沿着入射光4方向移动样品台12，使盖玻片1经过入射光4的焦点。
d)通过反射探测模块的探测器11测量盖玻片反射光8的光强信号，选取光强信号曲线上的最大值附近凹口的最低点作为焦点位置；
e)将盖玻片1移动到焦点位置，此时调节光路反射探测模块中的针孔轴向位置，使针孔后方探测器接收到的光强最大，此时的针孔位置就是共聚焦***要求的共轭位置；
盖玻片1镀完相变材料薄膜2以后如图1所示，采用INSB材料为镀膜材料，厚度为20nm。然后如图2所示，将盖玻片1放在共聚焦***中样品台12，也就是***焦点附近处，使样品台12从下往上沿着Z轴运动1000个点，每个点间距100nm，选取数值孔径为0.65的物镜5，并分别利用透射光探测器7和反射光探测器11测量透过光和反射光8信号的变化。
反射信号是反射聚焦透镜9聚焦到针孔10后由反射光探测器11接收的，反射聚焦透镜9相当于光阑的作用，所以当薄膜材料2随着Z轴(轴向)移动时，反射信号由于不能收集全所有的信号，本身就存在一个逐渐变大再变小的过程，就算材料没有非线性效应，从而不能用极大值来进行判断。
图8中为测得的反射信号和透射信号。可以发现在反射信号的峰值附近存在一个凹坑，此凹坑是由于相变材料特性所引起：当照射在薄膜材料2表面的光强度逐渐增加时，其反射率会下降，而且越靠近焦点处越明显，从而会在反射信号上形成一个凹坑，可以作为判断焦点的依据。图8中还测得了同一条件下的透过率信号变化情况，根据两者对比，发现反射信号中的凹坑最低点和透射信号中的极值点相对应，更进一步证明反射信号的凹坑也是焦点判断的依据。
为了更进一步验证反射信号中凹坑确定焦点位置的正确性，人为的将针孔10位置偏移最佳位置，然后同时检测反射信号和透射信号，测得的结果如图9所示。可见在反射信号中，其凹坑位置有所偏移，不在反射信号峰值的最大处，而透射信号极值点也有了一定偏移，但仍和凹坑最低点位置保持一致，从而验证反射对准的正确性。
所以将反射信号的凹坑对准反射信号的最大点的位置，即可以快速精确的确定共聚焦显微***中针孔位置。

Claims (8)

1.一种共聚焦显微***中针孔位置的透射探测式调节方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
a)在盖玻片上用磁控溅射的方法镀上一层相变薄膜材料；
b)将该盖玻片置于样品台上，利用一束功率密度小于5×109W/m2的平行光经过物镜聚焦照射该盖玻片；
c)沿着入射光方向移动样品台，使盖玻片经过入射光焦点；
d)通过探测器测量盖玻片透射光的光强信号，根据光强信号的极值判断焦点位置：
当相变薄膜材料为饱和吸收材料时，选取光强信号曲线上的最大值作为焦点位置；
当相变薄膜材料为反饱和吸收材料时，选取光强信号曲线上的最小值作为焦点位置；
e)将盖玻片移动到焦点位置，此时调节光路反射探测模块中的针孔轴向位置，使针孔后方探测器接收到的光强最大，此时的针孔位置就是共聚焦***要求的共轭位置。
2.根据权利要求1所述的一种共聚焦显微***针孔位置的透射探测式调节方法，其特征在于，所述的步骤a)中的相变材料是Sb、Te、Sb2Te3、Sb70Te30、InSb、Ge2Sb2Te5、或AgInSbTe。
3.根据权利要求1所述的一种共聚焦显微***针孔位置的透射探测式调节方法，其特征在于，所述的步骤a)中的相变材料的厚度在10到100nm之间。
4.根据权利要求1所述的一种共聚焦显微***针孔位置的透射探测式调节方法，其特征在于，所述的步骤b)中的平行光波长为405nm。
5.一种共聚焦显微***针孔位置的反射探测式调节方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
a)在盖玻片上用磁控溅射的方法镀上一层相变薄膜材料；
b)将该盖玻片置于样品台上，利用一束功率密度小于5×109W/m2的平行光经过物镜聚焦照射该盖玻片；
c)沿着入射光方向移动样品台，使盖玻片经过入射光焦点。
d)通过探测器测量盖玻片反射光的光强信号，选取光强信号曲线上的最大值附近凹口的最低点作为焦点位置；
e)将盖玻片移动到焦点位置，此时调节光路反射探测模块中的针孔轴向位置，使针孔后方探测器接收到的光强最大，此时的针孔位置就是共聚焦***要求的共轭位置。
6.根据权利要求4所述的一种共聚焦显微***针孔位置的反射探测式调节方法，其特征在于，所述的步骤a)中的相变薄膜材料是Sb、Te、Sb2Te3、Sb70Te30、InSb、Ge2Sb2Te5、或AgInSbTe。
7.根据权利要求4所述的一种共聚焦显微***针孔位置的反射探测式调节方法，其特征在于，所述的步骤a)中的相变材料的厚度在10到100nm之间。
8.根据权利要求4所述的一种共聚焦显微***针孔位置的反射探测式调节方法，其特征在于，所述的步骤b)中的平行光波长为405nm。
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