CN108384840A - 一种口腔拭子无提取tp53snp基因分型方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种口腔拭子无提取TP53SNP基因分型方法，具体包括以下步骤：步骤一，样品制造：被检测人员首先用生理盐水进行漱口，半小时后用棉棒刮取被检测人员口腔侧壁细胞，置于2mL保存管中，制得口腔拭子样品，若被检测人员刮取的口腔细胞样本在一周内进行检测，则放置于4摄氏度冰箱，超过一周需放置于‑20摄氏度冰箱进行保存；步骤二，样品处理：在步骤一种制得的每个口腔拭子样品加入600微升的无核水，充分震荡混匀，瞬离15秒。本发明首先将口腔细胞进行重悬处理，然后直接qPCR，整体流程只需要普通qPCR实验室即可进行，操作简单，只需要一人便可完成全部工作，从而省去了DNA提取过程，达到节约时间、降低检测成本的目的。

Description

一种口腔拭子无提取TP53SNP基因分型方法
技术领域
本发明涉及肿瘤基因检测、SNP基因分型技术领域，特别涉及一种口腔拭子无提取TP53 SNP基因分型方法。
背景技术
一般利用PCR或qPCR的方法对人组织样本进行基因分型需要对样本进行一个提取纯化过程，得到纯净gDNA，而如果样本数量较多将会耗费大量人力与时间，而如果不进行提取过程将会大大节约时间降低项目成本，但人组织样本中多种因子会降低DNA聚合酶活性，从而抑制PCR反应。
因此，发明一种口腔拭子无提取TP53 SNP基因分型方法来解决上述问题很有必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种口腔拭子无提取TP53 SNP基因分型方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种口腔拭子无提取TP53SNP基因分型方法，具体包括以下步骤：
步骤一，样品制造：被检测人员首先用生理盐水进行漱口，半小时后用棉棒刮取被检测人员口腔侧壁细胞，置于2mL保存管中，制得口腔拭子样品，若被检测人员刮取的口腔细胞样本在一周内进行检测，则放置于4摄氏度冰箱，超过一周需放置于-20摄氏度冰箱进行保存；
步骤二，样品处理：在步骤一种制得的每个口腔拭子样品加入600微升的无核水，充分震荡混匀，瞬离15秒；
步骤三，配制qPCR Mix：按1:1.1的比例配制qPCR Mix，反应体系配制完成后，分别将88个样本、6个PTC、2个NTC分别加入96孔板，然后使用光学膜进行封膜处理，然后将96孔板充分振荡混匀，完成后振荡混匀，若5微升体系中分型失败的样品可用10微升体系重复一次，体系各组分体积是5微升体系的2倍，详细配置步骤如下：
a、从4摄氏度或-20摄氏度冰箱将经过步骤二处理的试剂取出，置于冰盒上解冻，探针注意避光；
b、配置qPCR Mix完成后振荡混匀，在96孔板的每个孔内加入2.92微升Mix；
c、将混匀后的样品依次加入已加有qPCR Mix的96孔板，每孔2.08微升，注意不要混样；
d、PTC用已知Tp53基因型的human sample，2个GG，2个GC，2个CC。NTC使用无核水；
步骤四，QPCR程序设置：96孔板准备完成后，在StepOne上设置PCR程序、运行程序、矫正分型结果，详细流程如下：
a、开启StepOne软件：启动软件，在出现的“login”界面下直接点击“OK”或输入自己的用户名，然后点击“OK”，在下一个界面下选择“Set Up”下拉框的“Advanced Setup”，然后出现主设置界面；
b、设置实验信息：在Setup模块下填写“Experiment Properties”信息，包括“Experiment Name”，一般按照时间、实验目的进行命名；然后分别选择“StepOnePlus96wells”、“Genotyping”、“Taqman Reagents”、“Standard 2hours”；
c、设置“Plate Setup”：选中Assay，点击“Edit”，选择“Edit SNP Assay”编辑SNPAssay，包括Assay ID，每个探针代表的碱基型等信息；
d、设置Assay：多个Assay设置可点击“Create New SNP Assay”增加Assay，点击“Add New Sample”增加样品信息，实验中有多少个样本就增加到多少个样本；左下角“Select the dye to use as the passive reference”下拉菜单中选择ROX对照；鼠标选择96孔板中样品放置信息，鼠标勾选Sample名称和Assay信息；
e、设置“Run Method”：“Reaction Volume Per Well”里设置反应体积为5微升；qPCR反应程序，将默认反应程序改为三步法，其中60摄氏度1min改为55摄氏度30s，72摄氏度30s，需更改默认反应程序，方法为选中“Cycling Stage”中某个温度步骤单机右键，点击“Add Step”，选择Before或After，即可添加温度步骤，并更改温度和时间，并设置在每个循环的延伸阶段采集荧光，即“Data Collection”图标处于激活状态，通过点击图标可使荧光采集在激活和未激活状态进行转换，在“Number of Cycles”下设置循环数为45，所有设置完成后，点击“Save”保存实验，再点击“START RUN”开始运行实验，开始RUN之后，需在QPCR仪器前观察等待，直至程序进入Cycle阶段；
步骤五，下机数据分析：
a、首先将实验结果从仪器Download至电脑文件夹；
b、打开实验结果文件，按散点图离散程度将未能自动分型的样品进行人工判读，结果判读首先根据散点图区分较易判断的样本，而个别较难区分的样本需根据已知基因型的阳性对照对比判读；
c、如果不能够判读，需要对样本送一代测序检测；然后将判读完成的基因分型结果导出为Excel表格，将样品编号与客户信息进行一一对应，生成基因解读报告。
优选的，本发明实验中得到的客户基因型信息为TP53基因反义链信息，生成报告时应将基因型信息按照碱基互补配对原则转换，如分型结果为GG，则报告中结果应转换为CC。
本发明的技术效果和优点：口腔拭子的主要成分是口腔细胞，成分较为单一，影响PCR的因素较少，故本发明首先将口腔细胞进行重悬处理，然后直接qPCR，整体流程只需要普通qPCR实验室即可进行，操作简单，只需要一人便可完成全部工作，从而省去了DNA提取过程，达到节约时间、降低检测成本的目的。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种口腔拭子无提取TP53 SNP基因分型方法，具体包括以下步骤：
步骤一，样品制造：被检测人员首先用生理盐水进行漱口，半小时后用棉棒刮取被检测人员口腔侧壁细胞，置于2mL保存管中，制得口腔拭子样品，若被检测人员刮取的口腔细胞样本在一周内进行检测，则放置于4摄氏度冰箱；
步骤二，样品处理：在步骤一种制得的每个口腔拭子样品加入600微升的无核水，充分震荡混匀，瞬离15秒；
步骤三，配制qPCR Mix：按1:1.1的比例配制qPCR Mix，反应体系配制完成后，分别将88个样本、6个PTC、2个NTC分别加入96孔板，然后使用光学膜进行封膜处理，然后将96孔板充分振荡混匀，完成后振荡混匀，若5微升体系中分型失败的样品可用10微升体系重复一次，体系各组分体积是5微升体系的2倍，详细配置步骤如下：
a、从4摄氏度或-20摄氏度冰箱将经过步骤二处理的试剂取出，置于冰盒上解冻，探针注意避光；
b、配置qPCR Mix完成后振荡混匀，在96孔板的每个孔内加入2.92微升Mix；
c、将混匀后的样品依次加入已加有qPCR Mix的96孔板，每孔2.08微升，注意不要混样；
d、PTC用已知Tp53基因型的human sample，2个GG，2个GC，2个CC。NTC使用无核水；
步骤四，QPCR程序设置：96孔板准备完成后，在StepOne上设置PCR程序、运行程序、矫正分型结果，详细流程如下：
a、开启StepOne软件：启动软件，在出现的“login”界面下直接点击“OK”或输入自己的用户名，然后点击“OK”，在下一个界面下选择“Set Up”下拉框的“Advanced Setup”，然后出现主设置界面；
b、设置实验信息：在Setup模块下填写“Experiment Properties”信息，包括“Experiment Name”，一般按照时间、实验目的进行命名；然后分别选择“StepOnePlus96wells”、“Genotyping”、“Taqman Reagents”、“Standard 2hours”；
c、设置“Plate Setup”：选中Assay，点击“Edit”，选择“Edit SNP Assay”编辑SNPAssay，包括Assay ID，每个探针代表的碱基型等信息；
d、设置Assay：多个Assay设置可点击“Create New SNP Assay”增加Assay，点击“Add New Sample”增加样品信息，实验中有多少个样本就增加到多少个样本；左下角“Select the dye to use as the passive reference”下拉菜单中选择ROX对照；鼠标选择96孔板中样品放置信息，鼠标勾选Sample名称和Assay信息；
e、设置“Run Method”：“Reaction Volume Per Well”里设置反应体积为5微升；qPCR反应程序，将默认反应程序改为三步法，其中60摄氏度1min改为55摄氏度30s，72摄氏度30s，需更改默认反应程序，方法为选中“Cycling Stage”中某个温度步骤单机右键，点击“Add Step”，选择Before或After，即可添加温度步骤，并更改温度和时间，并设置在每个循环的延伸阶段采集荧光，即“Data Collection”图标处于激活状态，通过点击图标可使荧光采集在激活和未激活状态进行转换，在“Number of Cycles”下设置循环数为45，所有设置完成后，点击“Save”保存实验，再点击“START RUN”开始运行实验，开始RUN之后，需在QPCR仪器前观察等待，直至程序进入Cycle阶段；
步骤五，下机数据分析：
a、首先将实验结果从仪器Download至电脑文件夹；
b、打开实验结果文件，按散点图离散程度将未能自动分型的样品进行人工判读，结果判读首先根据散点图区分较易判断的样本，而个别较难区分的样本需根据已知基因型的阳性对照对比判读；
c、如果不能够判读，需要对样本送一代测序检测；然后将判读完成的基因分型结果导出为Excel表格，将样品编号与客户信息进行一一对应，生成基因解读报告，本发明实验中得到的客户基因型信息为TP53基因反义链信息，生成报告时应将基因型信息按照碱基互补配对原则转换，如分型结果为GG，则报告中结果应转换为CC。
实施例2：
一种口腔拭子无提取TP53 SNP基因分型方法，所述步骤一中，若被检测人员刮取的口腔细胞样本超过一周后再进行检测，则需放置于-20摄氏度冰箱进行保存。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种口腔拭子无提取TP53 SNP基因分型方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤一，样品制造：被检测人员首先用生理盐水进行漱口，半小时后用棉棒刮取被检测人员口腔侧壁细胞，置于2mL保存管中，制得口腔拭子样品，若被检测人员刮取的口腔细胞样本在一周内进行检测，则放置于4摄氏度冰箱，超过一周需放置于-20摄氏度冰箱进行保存；
步骤二，样品处理：在步骤一种制得的每个口腔拭子样品加入600微升的无核水，充分震荡混匀，瞬离15秒；
步骤三，配制qPCR Mix：按1:1.1的比例配制qPCR Mix，反应体系配制完成后，分别将88个样本、6个PTC、2个NTC分别加入96孔板，然后使用光学膜进行封膜处理，然后将96孔板充分振荡混匀，完成后振荡混匀，若5微升体系中分型失败的样品可用10微升体系重复一次，体系各组分体积是5微升体系的2倍，详细配置步骤如下：
a、从4摄氏度或-20摄氏度冰箱将经过步骤二处理的试剂取出，置于冰盒上解冻，探针注意避光；
b、配置qPCR Mix完成后振荡混匀，在96孔板的每个孔内加入2.92微升Mix；
c、将混匀后的样品依次加入已加有qPCR Mix的96孔板，每孔2.08微升，注意不要混样；
d、PTC用已知Tp53基因型的human sample，2个GG，2个GC，2个CC。NTC使用无核水；
步骤四，QPCR程序设置：96孔板准备完成后，在StepOne上设置PCR程序、运行程序、矫正分型结果，详细流程如下：
a、开启StepOne软件：启动软件，在出现的“login”界面下直接点击“OK”或输入自己的用户名，然后点击“OK”，在下一个界面下选择“Set Up”下拉框的“Advanced Setup”，然后出现主设置界面；
b、设置实验信息：在Setup模块下填写“Experiment Properties”信息，包括“Experiment Name”，一般按照时间、实验目的进行命名；然后分别选择“StepOnePlus 96wells”、“Genotyping”、“Taqman Reagents”、“Standard 2 hours”；
c、设置“Plate Setup”：选中Assay，点击“Edit”，选择“Edit SNP Assay”编辑SNPAssay，包括Assay ID，每个探针代表的碱基型等信息；
d、设置Assay：多个Assay设置可点击“Create New SNP Assay”增加Assay，点击“AddNew Sample”增加样品信息，实验中有多少个样本就增加到多少个样本；左下角“Selectthe dye to use as the passive reference”下拉菜单中选择ROX对照；鼠标选择96孔板中样品放置信息，鼠标勾选Sample名称和Assay信息；
e、设置“Run Method”：“Reaction Volume Per Well”里设置反应体积为5微升；qPCR反应程序，将默认反应程序改为三步法，其中60摄氏度1min改为55摄氏度30s，72摄氏度30s，需更改默认反应程序，方法为选中“Cycling Stage”中某个温度步骤单机右键，点击“AddStep”，选择Before或After，即可添加温度步骤，并更改温度和时间，并设置在每个循环的延伸阶段采集荧光，即“Data Collection”图标处于激活状态，通过点击图标可使荧光采集在激活和未激活状态进行转换，在“Number of Cycles”下设置循环数为45，所有设置完成后，点击“Save”保存实验，再点击“START RUN”开始运行实验，开始RUN之后，需在QPCR仪器前观察等待，直至程序进入Cycle阶段；
步骤五，下机数据分析：
a、首先将实验结果从仪器Download至电脑文件夹；
b、打开实验结果文件，按散点图离散程度将未能自动分型的样品进行人工判读，结果判读首先根据散点图区分较易判断的样本，而个别较难区分的样本需根据已知基因型的阳性对照对比判读；
c、如果不能够判读，需要对样本送一代测序检测；然后将判读完成的基因分型结果导出为Excel表格，将样品编号与客户信息进行一一对应，生成基因解读报告。
2.根据权利要求1所述的一种口腔拭子无提取TP53 SNP基因分型方法，其特征在于：本发明实验中得到的客户基因型信息为TP53基因反义链信息，生成报告时应将基因型信息按照碱基互补配对原则转换，如分型结果为GG，则报告中结果应转换为CC。
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