CN108383830B - 一种吖啶酮类稳定同位素巯基化合物标记试剂及其合成方法与应用 - Google Patents

一种吖啶酮类稳定同位素巯基化合物标记试剂及其合成方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种吖啶酮类稳定同位素巯基化合物标记试剂及其合成方法与应用，属于有机小分子稳定同位素标记技术应用领域。所述的稳定同位素标记试剂为N‑(4‑(吖啶酮‑10‑基)‑苯基)‑N‑[d0]/[d2]马来酰亚胺，其合成方法是将吖啶酮与4‑溴乙酰苯胺进行取代反应，得到中间体Ⅰ10‑((4‑乙酰氨基)‑苯基)‑吖啶酮，然后中间体Ⅰ在碱性条件下加热水解，得到中间体Ⅱ10‑((4‑氨基)‑苯基)‑吖啶酮；将中间体Ⅱ与[d0]/[d2]马来酸酐进行酰化缩合反应，生成目标产物N‑(4‑(吖啶酮‑10‑基)‑苯基)‑N‑[d0]/[d2]马来酰亚胺。本发明合成方法简便，易于实现，得到的稳定同位素氘代巯基化合物标记试剂，同位素标记位置稳定，能选择性地标记各类巯基化合物，具有标记产物产率高、标记反应速率快以及对巯基化合物选择性高等优点。

Description

一种吖啶酮类稳定同位素巯基化合物标记试剂及其合成方法 与应用
技术领域
本发明属于有机小分子稳定同位素标记技术应用领域，具体涉及一种吖啶酮类稳定同位素巯基化合物标记试剂及其合成方法与应用。
背景技术
高效液相色谱-质谱串联技术(简称HPLC-MS/MS)由于其高灵敏度和高选择性而被广泛应用于生命分析、环境检测、食品评估等研究领域。采用HPLC-MS/MS的选择反应监测(简称SRM)或多级反应离子监测(简称MRM)模式可以选择性的监测样品中的靶向以及半靶向分析物。然而，基质效应的存在使HPLC-MS/MS的分析性能大打折扣，在Journal ofChromatography A,2010.1217(25):3929-3937中对此类缺陷有详细论述，却并没有给出行之有效的完整解决方案。
近年来，稳定的同位素编码技术受到了很大的关注，尤其是稳定同位素编码衍生技术，借助轻/重同位素编码衍生试剂，可获得具有相同官能团的一类分析物的同位素衍生物。其通常以重型同位素衍生物作为内标物进行H P L C-M S/M S定量分析。然而，迄今所有的化学标记方法都有诸多缺陷，如标记反应速率慢、标记产率低、标记产物信号弱、标记准确性和灵敏性较差等等，并且很多标记试剂的合成复杂，不易获得相应的同位素产物，因此限制了此类技术的广泛使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种标记反应速率快、标记产物信号高、质谱检测巯基化合物准确性强和灵敏性高且合成简便的稳定同位素巯基化合物标记试剂；本发明同时提供其具体合成方法与应用。
本发明所提供的吖啶酮类稳定同位素巯基化合物标记试剂是以吖啶酮为母体环，马来酰亚胺为反应基团与同位素标记基团，其化学名称为：N-(4-(吖啶酮-10-基)-苯基)-N-[d0]/[d2]马来酰亚胺，其化学结构式为：
Figure BDA0001612117020000021
其中：当X＝H时，为N-(4-(吖啶酮-10-基)-)苯基)-N-[d0]马来酰亚胺，简写为NAPM-[d0]；当X＝D时，为N-(4-(吖啶酮-10-基)-)苯基)-N-[d2]马来酰亚胺，简写为NAPM-[d2]。在本发明中，H指氢的同位素氕，D指氢的同位素氘。
所提供的稳定同位素巯基化合物标记试剂的合成方法，包括以下步骤：
1)取代反应：将吖啶酮和4-溴乙酰苯胺溶解到二甲亚砜中，并与碘化亚铜、二叔戊酰甲烷和碳酸钾混合，油浴130℃反应12h，反应结束待反应液冷却至室温后抽滤，得抽滤液，然后将抽滤液与(10-30)wt％的NaCl水溶液混合析出沉淀，回收沉淀固体并干燥，得到中间体Ⅰ10-((4-乙酰氨基)-苯基)-吖啶酮；
2)水解反应：将中间体Ⅰ溶解于溶有氢氧化钾水溶液的二甲亚砜溶液中，于100℃反应2小时，冷却后，将反应液与(10-30)wt％的NaCl水溶液混合，回收析出固体并干燥，用N,N-二甲基甲酰胺和乙腈按照体积比v:v＝5:1重结晶制得中间体Ⅱ10-((4-氨基)-苯基)-吖啶酮；
3)酰化反应：将[d0]/[d2]马来酸酐溶解到N,N-二甲基甲酰胺中，滴加溶有中间体Ⅱ的N,N-二甲基甲酰胺溶液，于25℃反应1小时，反应结束后将反应液倒入冰水中，回收固体并干燥；固体干燥后加入乙酸酐溶解，再加入无水乙酸钠，于85℃下反应1小时，待反应液冷却到室温后慢慢倒入冰水中，回收固体并干燥，用N,N-二甲基甲酰胺重结晶得目标产物N-(4-(吖啶酮-10-基)-苯基)-N-[d0]/[d2]马来酰亚胺。
进一步，在步骤1)的所述取代反应中，吖啶酮与4-溴乙酰苯胺摩尔比为1:1.5，碘化亚铜、二叔戊酰甲烷和碳酸钾的加入量分别为吖啶酮质量的25％、22％和50％。
进一步，在步骤2)的所述水解反应中，氢氧化钾的加入量为10-((4-氨基)-苯基)-吖啶酮质量的30％。
进一步，在步骤3)的所述酰化反应中，10-((4-氨基)-苯基)-吖啶酮与[d0]/[d2]马来酸酐的摩尔比为1:1.1，乙酸钠的加入量为10-((4-氨基)-苯基)-吖啶酮质量的10％。
本发明还提供一种上述稳定同位素巯基化合物标记试剂的应用，用于检测样品中硫醇的浓度，步骤为：
a.配制醋酸铵-氢氧化钠缓冲溶液和硫醇标准品乙腈溶液；配制浓度为1×10-4mol/L的N-(4-(吖啶酮-10-基)-苯基)-N-[d0]马来酰亚胺的乙腈溶液作为轻型标记试剂溶液；配制浓度为1×10-4mol/L的N-(4-(吖啶酮-10-基)-苯基)-N-[d2]马来酰亚胺的乙腈溶液作为重型标记试剂溶液；
b.依次将体积比1:2:1的醋酸铵-氢氧化钠缓冲溶液、硫醇标准品溶液和轻型标记试剂溶液混合，于40℃的水浴中反应10min；依次将体积比1:2:1的醋酸铵-氢氧化钠缓冲溶液、经柱纯化或膜过滤后的样品和重型标记试剂溶液混合，于40℃的水浴中反应10min；反应完成后，将上述两个反应液按体积比为1:1进行混合，进样进行高效液相色谱-质谱串联技术分析；
c.轻型标记试剂衍生后所得轻型衍生物的峰面积表示为A1，硫醇的浓度表示为C1；重型标记试剂衍生后所得重型衍生物的峰面积记为A2，样品中硫醇的浓度表示为C2，则根据公式C1/C2＝A1/A2，即可求得样品中硫醇的浓度。
优选的，在步骤a中，醋酸铵-氢氧化钠缓冲溶液的pH＝7.4、浓度为0.01mol/L，硫醇标准品乙腈溶液的浓度为1×10-6mol/L。
优选的，在步骤b中，硫醇标准品溶液为100μL，经柱纯化或膜过滤后的样品为100μL。
本发明所带来的综合有益效果如下：
①本发明得到的稳定同位素氘标记试剂，经分离提纯后，同位素标记位置稳定，化学纯度达99.5％以上，同位素丰度在99.0％以上。本发明轻型标记衍生物与重型同位素衍生物在质谱分析中具有相同的色谱保留行为，样品与标准品之间的基质效应也相同，能有效地校准基质效应的影响。②本发明的同位素标记试剂中的马来酰亚胺标记基团，通过与巯基化合物中所含巯基的迈克尔加成反应，可选择性地标记巯基化合物，具有合成方法简便，易于实现；标记反应速率快、标记产物的信号强、标记产率高、对巯基选择性高的优点，增强质谱检测巯基化合物准确性和灵敏性。③该试剂能选择性地标记各类巯基化合物，广泛适用于生命分析、环境分析和食品分析等研究领域，用于多种实际样品中巯基化合物的分析检测。
具体地，本发明试剂在pH为7.4的醋酸铵-氢氧化钠缓冲溶液中能够迅速标记巯基化合物，对巯基化合物显示了高的灵敏性和选择性，检测巯基化合物简便、灵敏、快速，结果准确。
附图说明
图1是实施例1制备的标记试剂的合成反应路线图。
图2是实施例1制备的重型标记试剂的核磁1HNMR图谱。
图3是实施例1制备的轻型标记试剂的核磁1HNMR图谱。
图4是实施例1制备的标记试剂与巯基化合物的反应路线图。
图5是实施例2本发明轻型标记试剂和重型标记试剂衍生7种硫醇标准品的质谱多反应监测(简称MRM)离子色谱流图。
图6是实施例3采用本发明标记试剂标记的2-甲基噻吩硫醇和糠基硫醇的轻型衍生物的二级质谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
如图1所示，本发明所述吖啶酮类稳定同位素巯基化合物标记的合成共有3步。
重型标记试剂以[d2]-马来酸酐为基础原料，具体合成操作如下：
1、中间体Ⅰ 10-((4-乙酰氨基)-苯基)-吖啶酮的制备
250mL三口烧瓶中加入10g吖啶酮和16.5g4-溴乙酰苯胺，加入150mL二甲亚砜作为溶剂，加入5g碳酸钾、2.5g碘化亚铜与3mL二叔戊酰甲烷，油浴130℃反应12h过夜；反应结束待反应液冷却至室温25℃后抽滤，然后将抽滤液倒入600mL15wt％的NaCl水溶液中析出沉淀，回收沉淀固体并干燥，得到中间体Ⅰ 10-((4-乙酰氨基)-苯基)-吖啶酮，收率为85wt％。
2、中间体Ⅱ 10-((4-氨基)-苯基)-吖啶酮的制备
250mL三口烧瓶中加入10g中间体Ⅰ，加入100mL二甲亚砜与20mL50％的氢氧化钾溶液，油浴加热并控制反应温度在100℃，搅拌反应2小时；冷却后将反应液沿着烧杯壁慢慢倒入600mL10wt％的NaCl水溶液中，并搅拌5分钟；将析出的固体过滤并干燥，用N,N-二甲基甲酰胺和乙腈按照体积比v:v＝5:1重结晶制得中间体Ⅱ10-((4-氨基)-苯基)-吖啶酮，收率为90wt％。
3、目标产物N-(4-(吖啶酮-10-基)-苯基)-N-[d2]马来酰亚胺的制备
在100mL的圆底烧瓶中加入2.5g氘代马来酸酐和20mLN,N-二甲基甲酰胺，搅拌至氘代马来酸酐完全溶解后，滴加约25mL含有4g中间体Ⅱ的N,N-二甲基甲酰胺溶液，继续搅拌1小时后，将反应液沿着烧杯壁慢慢倒入500mL冰水中，回收析出的固体并干燥，加入0.5g无水乙酸钠，然后用85℃的油浴加热反应1小时，待反应液冷却到室温后沿烧杯壁慢慢倒入500mL冰水中，将析出的固体过滤并干燥，用N,N-二甲基甲酰胺重结晶三次，得到N-(4-(吖啶酮-10-基)-苯基)-N-[d2]马来酰亚胺纯品，收率为60wt％。
产物表征：
1H NMR(500MHz,DMSO,ppm)δ8.39(dd,J＝8.0,1.5Hz,2H),7.78(d,J＝8.6Hz,2H),7.73–7.66(m,4H),7.36(dd,J＝11.3,4.2Hz,2H),6.76(d,J＝8.6Hz,2H)；(如图2所示).
Found:C 75.0,H 4.34,N 7.61,O 13.04；C alculated:C 74.99,H 4.38,N 7.60,O 13.03.
M S:m/z:[M+H]+＝368.1.
轻型标记试剂以[d0]-马来酸酐为基础原料，其合成步骤与重型标记试剂合成步骤相同，产物表征：
核磁1H NMR(500MHz,DMSO,ppm)δ8.39(d,J＝8.0Hz,2H),7.78(d,J＝8.2Hz,2H),7.73–7.66(m,4H),7.36(t,J＝7.5Hz,2H),7.30(s,2H),6.76(d,J＝8.6Hz,2H)；(如图3所示).
Found:C 75.40,H 3.82,N 7.65,O 13.10；C alculated:C 75.40,H 3.85,N7.65,O 13.11.
质谱M S:m/z:[M+H]+＝366.1.
实施例2
本实施例采用实施例1所述方法合成本发明稳定同位素巯基化合物标记试剂，同时将其应用于巯基样品检测。
配制pH＝7.4、浓度为0.01mol/L的醋酸铵-氢氧化钠缓冲溶液；分别配制浓度为1×10-4mol/L的NAPM-[d0]和NAPM-[d2]的乙腈溶液；配制浓度为1×10-6mol/L的7中硫醇标准品，2-甲基-3-呋喃硫醇、糠基硫醇、2-甲基-3-噻吩硫醇、2-噻吩甲基硫醇、苯乙硫醇、甲酸-3-巯基-3-甲基丁酯和巯基乙酸乙酯，的乙腈溶液。
依次将50μL醋酸铵-氢氧化钠缓冲溶液、100μL硫醇标准品溶液和50μL轻型标记试剂NAPM-[d0]的乙腈溶液加到2mL的安剖瓶中，于40℃的水浴中反应10min。同时，于同样的条件下用重型标记试剂NAPM-[d2]标记经柱纯化或膜过滤后的芝麻实际样品。反应完成后将上述两个轻/重标记后的反应液按体积比为1:1进行混合，然后进行HPLC-MS/MS分析。本发明柱纯化可采用常规纯化分离柱进行处理或者采用现有0.22μm有机滤膜过滤，在本实施例中具体采用LiC hrolut-EN固相小柱进行分离纯化。
轻型标记试剂衍生后所得轻型衍生物的峰面积表示为A1，硫醇的浓度表示为C1；重型标记试剂衍生后所得重型衍生物的峰面积记为A2，芝麻实际样品中硫醇的浓度表示为C2，则根据公式C1/C2＝A1/A2，即可求得芝麻实际样品中硫醇的浓度。
本发明所述标记试剂与硫醇反应为迈克尔加成反应，选择性强，且反应速度快，具体化学反应式如图4所示。
图5示出了标号A-G的7种硫醇标准品的离子色谱流图，图中
A：2-疏基乙酸乙酯，B:甲酸-3-疏基-3-甲基丁酯，C:糠基硫醇，D:2-噻吩甲基硫醇，E：2-甲基-3-呋喃硫醇，F:2-甲基-3-噻吩硫醇，G:苯乙硫醇
其中轻型标记衍生物与重型标记衍生物浓度比为5:1，在8分钟内实现了分析的7种硫醇标准品衍生物的完全分离，轻/重衍生物保留时间差异小于0.05分钟，完全符合质谱定量的要求。
实施例3
本实施例采用实施例2所述方法进行标记与检测，并进一步对样品进行硫醇的定量分析。
本实施例硫醇的定量分析采用安捷伦1290型超高效液相色谱***，6460型三重四级杆串联质谱仪，配备电喷雾电离源(ESI)。
色谱条件：流动相A为5％乙腈+95％水，流动相B为100％乙腈，流动相中添加浓度为0.1％的甲酸以增强分析物的离子化效率；采用梯度洗脱，设置流动相B初始梯度为65％，6分钟后变为80％，并保持2分钟；进样量为1μL，流速为0.2mL/min。质谱条件：ESI：正离子模式，干燥气温度：300℃，流速：10L/min，雾化压力：40psi，鞘气温度：250℃，流速：8L/min，毛细管电压：3.5KV。以上条件中百分比均为体积百分比。
碰撞电压(Fragm entor)和裂解能(CE)参数如下表所示：
Figure BDA0001612117020000071
衍生物均显示较强的[M+H]+信号，轻型衍生物主要产生m/z 366.2的碎片离子，重型衍生物主要产生368.2的碎片离子，图6示出了以2-噻吩甲基硫醇和糠基硫醇的轻型衍生物为代表的质谱裂解图。

Claims (7)

1.一种吖啶酮类稳定同位素巯基化合物标记试剂的应用，其特征在于：以吖啶酮为母体环，马来酰亚胺为反应基团与同位素标记基团，其化学名称为：N-(4-(吖啶酮-10-基)-苯基)-N-[d0]/[d2]马来酰亚胺，其化学结构式为：
Figure FDA0002272051650000011
其中：当X＝H时，为N-(4-(吖啶酮-10-基)-)苯基)-N-[d0]马来酰亚胺；当X＝D时，为N-(4-(吖啶酮-10-基)-)苯基)-N-[d2]马来酰亚胺；
其中，该标记试剂用于检测样品中巯基化合物的浓度；
包括以下步骤：
a.配制醋酸铵-氢氧化钠缓冲溶液和硫醇标准品乙腈溶液；配制浓度为1×10-4mol/L的N-(4-(吖啶酮-10-基)-苯基)-N-[d0]马来酰亚胺的乙腈溶液作为轻型标记试剂溶液；配制浓度为1×10-4mol/L的N-(4-(吖啶酮-10-基)-苯基)-N-[d2]马来酰亚胺的乙腈溶液作为重型标记试剂溶液；
b.依次将体积比1:2:1的醋酸铵-氢氧化钠缓冲溶液、硫醇标准品溶液和轻型标记试剂溶液混合，于40℃的水浴中反应10min；依次将体积比1:2:1的醋酸铵-氢氧化钠缓冲溶液、经柱纯化或膜过滤后的样品和重型标记试剂溶液混合，于40℃的水浴中反应10min；反应完成后，将上述两个反应液按体积比为1:1进行混合，进样进行高效液相色谱-质谱串联技术分析；
c.轻型标记试剂衍生后所得轻型衍生物的峰面积表示为A1，硫醇的浓度表示为C1；重型标记试剂衍生后所得重型衍生物的峰面积记为A2，样品中硫醇的浓度表示为C2，则根据公式C1/C2＝A1/A2，即可求得样品中硫醇的浓度。
2.根据权利要求1所述吖啶酮类稳定同位素巯基化合物标记试剂的应用，其特征在于，将吖啶酮与4-溴乙酰苯胺进行取代反应，得到中间体Ⅰ10-((4-乙酰氨基)-苯基)-吖啶酮，然后中间体Ⅰ在碱性条件下加热水解，得到中间体Ⅱ10-((4-氨基)-苯基)-吖啶酮；将中间体Ⅱ与[d0]/[d2]马来酸酐进行酰化缩合反应，生成目标产物N-(4-(吖啶酮-10-基)-苯基)-N-[d0]/[d2]马来酰亚胺。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该合成方法具体包括以下步骤：
1)取代反应：将吖啶酮和4-溴乙酰苯胺溶解到二甲亚砜中，并与碘化亚铜、二叔戊酰甲烷和碳酸钾混合，油浴130℃反应12h，反应结束待反应液冷却至室温后抽滤，得抽滤液，然后将抽滤液与(10-30)wt％的NaCl水溶液混合析出沉淀，回收沉淀固体并干燥，得到中间体Ⅰ10-((4-乙酰氨基)-苯基)-吖啶酮；
2)水解反应：将中间体Ⅰ溶解于溶有氢氧化钾水溶液的二甲亚砜溶液中，于100℃反应2小时，冷却后，将反应液与(10-30)wt％的NaCl水溶液混合，回收固体并干燥，用N,N-二甲基甲酰胺和乙腈按照体积比v:v＝5:1重结晶制得中间体Ⅱ10-((4-氨基)-苯基)-吖啶酮；
3)酰化反应：将[d0]/[d2]马来酸酐溶解到N,N-二甲基甲酰胺中，滴加溶有中间体Ⅱ的N,N-二甲基甲酰胺溶液，于25℃反应1小时，反应结束后将反应液倒入冰水中，回收固体并干燥；固体干燥后加入乙酸酐溶解，再加入无水乙酸钠，于85℃下反应1小时，待反应液冷却到室温后慢慢倒入冰水中，回收固体并干燥，用N,N-二甲基甲酰胺重结晶得目标产物N-(4-(吖啶酮-10-基)-苯基)-N-[d0]/[d2]马来酰亚胺。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤1)的所述取代反应中，吖啶酮与4-溴乙酰苯胺摩尔比为1:1.5，碘化亚铜、二叔戊酰甲烷和碳酸钾的加入量分别为吖啶酮质量的25％、22％和50％。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤3)的所述酰化反应中，10-((4-氨基)-苯基)-吖啶酮与[d0]/[d2]马来酸酐的摩尔比为1:1.1，乙酸钠的加入量为10-((4-氨基)-苯基)-吖啶酮质量的10％。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在步骤a中，醋酸铵-氢氧化钠缓冲溶液的pH＝7.4、浓度为0.01mol/L，硫醇标准品乙腈溶液的浓度为1×10-6mol/L。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在步骤b中，硫醇标准品溶液为100μL，经柱纯化或膜过滤后的样品为100μL。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN101274909A (zh) * 2007-03-27 2008-10-01 中国科学院化学研究所 溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵及其制备方法与应用
CN106518846A (zh) * 2016-09-18 2017-03-22 曲阜师范大学 稳定同位素巯基化合物标记试剂及其合成方法和应用

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