CN108379330A - 一种抗病毒有效部位的提取纯化技术 - Google Patents

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Abstract

本技术方案公开了一种抗病毒有效部位的提取纯化技术，所述抗病毒有效部位是按如下方法制备的：以肾叶打碗花、垂盆草、黄蜀葵花为原料，提取，分离，纯化，即得肾叶打碗花素V、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素

Description

一种抗病毒有效部位的提取纯化技术
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种抗病毒有效部位的提取纯化技术，具体是涉及一种由肾叶打碗花、垂盆草、黄蜀葵花组成的配方中抗病毒有效部位的提取纯化技术。
背景技术
中药来自植物、动物、矿物，是药物的重要组成部分。早在商代初期，人们就从中药中提取制备有效部位，用于防病治病，如中药煎汤内服或外用；明代《本草纲目》详细记载了用升华法等制备、纯化樟脑的过程；《白猿记》记述了从新鲜草乌中提取分离得到结晶形乌头碱的方法；《医学入门》中记载了用发酵法从五倍子中制备没食子酸的过程，这是世界上最早制备有机酸的记载。这些都说明了我国古代药学家在中药化学领域的突出贡献。据国外文献记载，1805年德国药师塞图尔从阿片中提取的***碱，被认为是中药中第一个天然活性成分；20世纪50年代初，从印度民间草药萝芙木中发现了降压成分利血平；20世纪50年代末期，从长春花中得到了抗癌成分长春花碱；特别是紫杉醇的问世被誉为20世纪90年代国际上抗癌三大成就之一，是一种非常有发展前途的抗癌新药。近几十年来，随着先进的科学技术、分离分析方法的不断发展，各种色谱技术的广泛应用，中药化学成分的提取、分离和纯化技术也有了很大进步，亲水性成分、微量成分、类似结构的复杂混合物成分的分离已经不再困难；同时红外、核磁共振、质谱的等波谱新技术的问世，使结构鉴定工作趋向微量、快速和准确，研究中药化学成分的周期大大缩短。
据文献报道，目前我国有中草药资源8000多种，少数民族用药3000多种，其中绝大部分是植物药，少数为动物药和矿物药，如此丰富的资源为进一步开发中药有效成分提供了雄厚的物质基础。但是建国前，受整个国家的经济实力及科学技术综合发展水平等条件的限制，中药化学研究基本没有什么突破，更没有建立起中药化学制药工业。建国以来，尤其近一、二十年来，与其它各项科学事业一样，中药化学迎来了蓬勃发展的新时代。麻黄素、芦丁、西地兰等十几种中药产品的工业生产已经进行多年，甾体激素类药物的原料——薯芋皂苷元的工业生产及其资源开发研究更取得巨大的成就，不仅保证国内需要，还有大量出口。文献报道，目前已在涉及到的500多种药材中，发现了8000多种化合物。除原有的中国科学院上海药物研究所、昆明植物所、中国医学科学院药物研究所及药用植物资源开发所外，全国各地的医药院校、***门几乎也都普遍设立了从事中药化学的研究机构。中药化学在中药现代化的进程中发挥着前所未有的作用，并成为医药高等院校的必修课程。近十年来，随着对外开放政策的贯彻执行，大大地推动了我国科学界与国外同行间的学术交流及人员交往，中药化学则是在药学及化学领域中与国外人员交往最为频繁、学术交流最为活跃的一个学科。这对提高我国研究水平，促进研究队伍的成长起到了重要作用。目前，我国中药化学研究工作的步伐已经大大加快，研究水平也有很大提高，加上我国丰富的资源，相信在21世纪一定能对人类的健康事业作出更大的贡献。
自艾滋病病毒发现以来，国际上用艾滋病病毒细胞培养和逆转录酶，蛋白酶和整合酶等体外实验方法，广泛筛选化合物的同时，也大量筛选植物和中草药提取物及其成分，也研究了一些中药复方制剂，发现在体外抑制艾滋病毒的有效药物，有的可抑制猴免疫缺陷病毒（SIV）感染猴的病毒血症。有些已在临床试用，尚未明确效果。我国自1987年派中西医结合医疗队去非洲治疗艾滋病病人。国内在2002年以前，缺乏特效抗艾滋病病毒药物，中西医在临床根据中医理论，对艾滋病病人辨病与辨证相结合，以清热解毒，扶正固本，或凉血补肾，活血化瘀等治则，按中药性能，选择中药，处方治疗。通过临床实践，认为有些中药复方治疗艾滋病可改善症状，缓解病情。近年来对实验诊断确诊的艾滋病病人，采用中药治疗，设对照组，在治疗期间，定期检测血液病毒载量（HIV-RNA）和CD4细胞水平，评价效果。有报道可改善症状，提高免疫力，大多仍在临床验证中。
肾叶打碗花，为旋花科、打碗花属肾叶打碗花Calystegia soldanella (Linn.)R. Br.的全草。属多年生草本，全体近于无毛，具细长的根。茎细长，平卧，有细棱或有时具狭翅。叶肾形，长0.9-4厘米，宽1-5.5厘米，质厚，顶端圆或凹，具小短尖头，全缘或浅波状；叶柄长于叶片，或从沙土中伸出很长。花腋生，果卵球形，种子黑色，表面无毛亦无小疣。产中国辽宁、河北、山东、江苏、浙江、台湾等沿海地区。广泛分布于欧、亚温带及大洋洲海滨。生于海滨沙地或海岸岩石缝中。多种家畜喜食，是中等牧草。
垂盆草，为景天科植物垂盆草Sedum sarmentosum Bunge 的新鲜或干燥全草。夏、秋二季采收，除去杂质。鲜用或干燥。性味甘、淡，凉。归经归肝、胆、小肠经。功能主治：清利湿热，解毒。用于湿热黄疸，小便不利，痈肿疮疡，急、慢性肝炎。
黄蜀葵花，为锦葵科植物黄蜀葵Abelmoschus manihot (L.) Medic.[Hibiscusmanihot L.]的花朵。夏季花盛开时采收，晒干。性味：《品汇精要》："无毒"；《纲目》："甘，寒，滑，无毒"。功能主治：通淋，消肿，解毒。治淋病，痈疽肿毒，汤火烫伤。《嘉佑本草》："治小便淋及催生，又主诸恶疮脓水久不瘥者，作末敷"。《纲目》："消痈肿，浸油涂汤火伤"。
发明内容
本发明的目的在于提供一种由肾叶打碗花、垂盆草、黄蜀葵花组成的配方中提取纯化抗病毒有效部位的技术。本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明所用肾叶打碗花，为旋花科、打碗花属肾叶打碗花Calystegia soldanella(Linn.) R. Br.的全草；垂盆草，为景天科植物垂盆草Sedum sarmentosum Bunge 的新鲜或干燥全草；黄蜀葵花，为锦葵科植物黄蜀葵Abelmoschus manihot (L.) Medic.[Hibiscus manihot L.]的花朵。
一种抗病毒有效部位的提取纯化技术，是通过如下步骤实现的:
（1）取肾叶打碗花8重量份、垂盆草2重量份、黄蜀葵花1重量份，混匀粉碎成粗粉，用70%乙醇为溶剂提取3次，每次室温浸泡提取4小时，70%乙醇用量为药材总重量的12倍，滤过，合并滤液得提取液A；提取后的药渣再用30%乙醇为溶剂提取2次，每次加热回流提取1.5小时，30%乙醇用量为药材总重量的10倍，滤过，合并滤液得提取液B；提取后的药渣再用水为溶剂加热回流提取1.5小时，滤过，合并滤液得提取液E；
（2）将步骤（1）得到的提取液A在50℃减压浓缩，浓缩至密度为1.18的浓缩液A，将步骤（1）得到的提取液B在80℃减压浓缩，浓缩至密度为1.18的浓缩液B，将浓缩液A与浓缩液B合并，得浓缩液C；将步骤（1）得到的提取液E在80℃减压浓缩，浓缩至密度为1.12的浓缩液C；
（3）将步骤（2）得到的浓缩液C中加入95%乙醇，使乙醇重量占比70%，放置24小时，滤过，滤液在50℃减压浓缩，浓缩至无乙醇，得浓缩液D；
（4）将步骤（3）得到的浓缩液D通过MCI 凝胶色谱柱吸附，用水洗脱，洗脱量为5个色谱柱体积，水洗脱液弃去，再用体积比8:92、15:80、25:70的乙醇-水依次洗脱，合计洗脱量为15个色谱柱体积，洗脱液直接通过与MCI 凝胶色谱柱相同色谱柱体积的硅胶色谱柱干柱，收集通过硅胶色谱柱干柱的第4-10色谱柱体积的流出液，回收溶剂，低温干燥得提取物A；
（5）将步骤（2）得到的浓缩液C加体积比1:8乙酸乙酯-氯仿萃取3次，合并萃取液，放置8小时，滤过，滤液回收溶剂，低温干燥，即得提取物B；
（6）将步骤（5）得到的提取物B通过MCI 凝胶色谱柱吸附，用水洗脱，洗脱量为5个色谱柱体积，水洗脱液弃去，再用体积比23:77的乙醇-水洗脱，洗脱量为10个色谱柱体积，洗脱液直接通过与MCI 凝胶色谱柱相同色谱柱体积的硅胶色谱柱干柱，收集通过硅胶色谱柱干柱第5-10色谱柱体积的的流出液，回收溶剂，低温干燥，得提取物F；
（7）将步骤（4）得到的提取物A与步骤（6）得到的提取物F合并，即得抗病毒有效部位。
一种抗病毒有效部位的提取纯化技术，其特征在于所述的抗病毒有效部位同时含有肾叶打碗花素V、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、异鼠李素-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷、异槲皮苷。
一种抗病毒有效部位的提取纯化技术，其特征在于用该提取纯化技术得到的抗病毒有效部位中肾叶打碗花素V、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、异鼠李素-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷及异槲皮苷的总含量占总有效部位的55%以上。
一种抗病毒有效部位的提取纯化技术，其特征在于用该提取纯化技术得到的抗病毒有效部位可以用于制备抗病毒药物。
一种抗病毒有效部位，其特征在于同时含有肾叶打碗花素V、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、异鼠李素-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷、异槲皮苷。
一种抗病毒有效部位，其特征在于抗病毒有效部位中肾叶打碗花素V、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、异鼠李素-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷及异槲皮苷的总含量占总有效部位的55%以上。
本发明首次建立了肾叶打碗花、垂盆草、黄蜀葵花配方中抗病毒有效部位的提取纯化技术，采用MCI 凝胶-硅胶干柱相结合的方法，尤其是硅胶干柱用含水乙醇洗脱技术，实现了配方中抗病毒有效部位的成功提取纯化制备，该有效部位同时含有肾叶打碗花素V、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、异鼠李素-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷、异槲皮苷，且总含量占总有效部位的55%以上。
具体实施方式
下面通过具体实验例和实施例对肾叶打碗花、垂盆草、黄蜀葵花配方中抗病毒有效部位的提取纯化技术做进一步说明，但不限于本发明。
实施例1：肾叶打碗花、垂盆草、黄蜀葵花配方中抗病毒有效部位的提取纯化
（1）取肾叶打碗花8重量份、垂盆草2重量份、黄蜀葵花1重量份，混匀粉碎成粗粉，用70%乙醇为溶剂提取3次，每次室温浸泡提取4小时，70%乙醇用量为药材总重量的12倍，滤过，合并滤液得提取液A；提取后的药渣再用30%乙醇为溶剂提取2次，每次加热回流提取1.5小时，30%乙醇用量为药材总重量的10倍，滤过，合并滤液得提取液B；提取后的药渣再用水为溶剂加热回流提取1.5小时，滤过，合并滤液得提取液E；
（2）将步骤（1）得到的提取液A在50℃减压浓缩，浓缩至密度为1.18的浓缩液A，将步骤（1）得到的提取液B在80℃减压浓缩，浓缩至密度为1.18的浓缩液B，将浓缩液A与浓缩液B合并，得浓缩液C；将步骤（1）得到的提取液E在80℃减压浓缩，浓缩至密度为1.12的浓缩液C；
（3）将步骤（2）得到的浓缩液C中加入95%乙醇，使乙醇重量占比70%，放置24小时，滤过，滤液在50℃减压浓缩，浓缩至无乙醇，得浓缩液D；
（4）将步骤（3）得到的浓缩液D通过MCI 凝胶色谱柱吸附，用水洗脱，洗脱量为5个色谱柱体积，水洗脱液弃去，再用体积比8:92、15:80、25:70的乙醇-水依次洗脱，合计洗脱量为15个色谱柱体积，洗脱液直接通过与MCI 凝胶色谱柱相同色谱柱体积的硅胶色谱柱干柱，收集通过硅胶色谱柱干柱的第4-10色谱柱体积的流出液，回收溶剂，低温干燥得提取物A；
（5）将步骤（2）得到的浓缩液C加体积比1:8乙酸乙酯-氯仿萃取3次，合并萃取液，放置8小时，滤过，滤液回收溶剂，低温干燥，即得提取物B；
（6）将步骤（5）得到的提取物B通过MCI 凝胶色谱柱吸附，用水洗脱，洗脱量为5个色谱柱体积，水洗脱液弃去，再用体积比23:77的乙醇-水洗脱，洗脱量为10个色谱柱体积，洗脱液直接通过与MCI 凝胶色谱柱相同色谱柱体积的硅胶色谱柱干柱，收集通过硅胶色谱柱干柱第5-10色谱柱体积的的流出液，回收溶剂，低温干燥，得提取物F；
（7）将步骤（4）得到的提取物A与步骤（6）得到的提取物F合并，即得抗病毒有效部位。
抗病毒有效部位的成分分离及结构鉴定：
取抗病毒有效部位，甲醇溶解， 200-300目硅胶拌样，干燥，研匀，先经过硅胶柱色谱，再结合聚酰胺柱色谱、凝胶柱色谱，分离纯化，分别得到7个化合物，经过经理化常数、质谱及核磁共振色谱等光谱数据、化学反应等方法,分别确证为肾叶打碗花素V、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、异鼠李素-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷、异槲皮苷。经HPLC检测，抗病毒有效部位中肾叶打碗花素V、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、异鼠李素-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷、异槲皮苷的总含量占总有效部位的55%以上。
实施例2：肾叶打碗花、垂盆草、黄蜀葵花配方中抗病毒有效部位的提取纯化
（1）取肾叶打碗花8重量份、垂盆草3重量份、黄蜀葵花2重量份，混匀粉碎成粗粉，用70%乙醇为溶剂提取3次，每次室温浸泡提取4小时，70%乙醇用量为药材总重量的12倍，滤过，合并滤液得提取液A；提取后的药渣再用30%乙醇为溶剂提取2次，每次加热回流提取1.5小时，30%乙醇用量为药材总重量的10倍，滤过，合并滤液得提取液B；提取后的药渣再用水为溶剂加热回流提取1.5小时，滤过，合并滤液得提取液E；
（2）将步骤（1）得到的提取液A在50℃减压浓缩，浓缩至密度为1.18的浓缩液A，将步骤（1）得到的提取液B在80℃减压浓缩，浓缩至密度为1.18的浓缩液B，将浓缩液A与浓缩液B合并，得浓缩液C；将步骤（1）得到的提取液E在80℃减压浓缩，浓缩至密度为1.12的浓缩液C；
（3）将步骤（2）得到的浓缩液C中加入95%乙醇，使乙醇重量占比70%，放置24小时，滤过，滤液在50℃减压浓缩，浓缩至无乙醇，得浓缩液D；
（4）将步骤（3）得到的浓缩液D通过MCI 凝胶色谱柱吸附，用水洗脱，洗脱量为5个色谱柱体积，水洗脱液弃去，再用体积比8:92、15:80、25:70的乙醇-水依次洗脱，合计洗脱量为15个色谱柱体积，洗脱液直接通过与MCI 凝胶色谱柱相同色谱柱体积的硅胶色谱柱干柱，收集通过硅胶色谱柱干柱的第4-10色谱柱体积的流出液，回收溶剂，低温干燥得提取物A；
（5）将步骤（2）得到的浓缩液C加体积比1:8乙酸乙酯-氯仿萃取3次，合并萃取液，放置8小时，滤过，滤液回收溶剂，低温干燥，即得提取物B；
（6）将步骤（5）得到的提取物B通过MCI 凝胶色谱柱吸附，用水洗脱，洗脱量为5个色谱柱体积，水洗脱液弃去，再用体积比23:77的乙醇-水洗脱，洗脱量为10个色谱柱体积，洗脱液直接通过与MCI 凝胶色谱柱相同色谱柱体积的硅胶色谱柱干柱，收集通过硅胶色谱柱干柱第5-10色谱柱体积的的流出液，回收溶剂，低温干燥，得提取物F；
（7）将步骤（4）得到的提取物A与步骤（6）得到的提取物F合并，即得抗病毒有效部位。
抗病毒有效部位的成分分离及结构鉴定：
取抗病毒有效部位，甲醇溶解， 200-300目硅胶拌样，干燥，研匀，先经过硅胶柱色谱，再结合聚酰胺柱色谱、凝胶柱色谱，分离纯化，分别得到6个化合物，经过经理化常数、质谱及核磁共振色谱等光谱数据、化学反应等方法,分别确证为肾叶打碗花素V、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、异鼠李素-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷、异槲皮苷。经HPLC检测，抗病毒有效部位中肾叶打碗花素V、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、异鼠李素-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷、异槲皮苷的总含量占总有效部位的45%以上。
实施例3：肾叶打碗花、垂盆草、黄蜀葵花配方中抗病毒有效部位的提取纯化
（1）取肾叶打碗花8重量份、垂盆草4重量份、黄蜀葵花3重量份，混匀粉碎成粗粉，用70%乙醇为溶剂提取3次，每次室温浸泡提取4小时，70%乙醇用量为药材总重量的12倍，滤过，合并滤液得提取液A；提取后的药渣再用30%乙醇为溶剂提取2次，每次加热回流提取1.5小时，30%乙醇用量为药材总重量的10倍，滤过，合并滤液得提取液B；提取后的药渣再用水为溶剂加热回流提取1.5小时，滤过，合并滤液得提取液E；
（2）将步骤（1）得到的提取液A在50℃减压浓缩，浓缩至密度为1.18的浓缩液A，将步骤（1）得到的提取液B在80℃减压浓缩，浓缩至密度为1.18的浓缩液B，将浓缩液A与浓缩液B合并，得浓缩液C；将步骤（1）得到的提取液E在80℃减压浓缩，浓缩至密度为1.12的浓缩液C；
（3）将步骤（2）得到的浓缩液C中加入95%乙醇，使乙醇重量占比70%，放置24小时，滤过，滤液在50℃减压浓缩，浓缩至无乙醇，得浓缩液D；
（4）将步骤（3）得到的浓缩液D通过MCI 凝胶色谱柱吸附，用水洗脱，洗脱量为5个色谱柱体积，水洗脱液弃去，再用体积比8:92、15:80、25:70的乙醇-水依次洗脱，合计洗脱量为15个色谱柱体积，洗脱液直接通过与MCI 凝胶色谱柱相同色谱柱体积的硅胶色谱柱干柱，收集通过硅胶色谱柱干柱的第4-10色谱柱体积的流出液，回收溶剂，低温干燥得提取物A；
（5）将步骤（2）得到的浓缩液C加体积比1:8乙酸乙酯-氯仿萃取3次，合并萃取液，放置8小时，滤过，滤液回收溶剂，低温干燥，即得提取物B；
（6）将步骤（5）得到的提取物B通过MCI 凝胶色谱柱吸附，用水洗脱，洗脱量为5个色谱柱体积，水洗脱液弃去，再用体积比23:77的乙醇-水洗脱，洗脱量为10个色谱柱体积，洗脱液直接通过与MCI 凝胶色谱柱相同色谱柱体积的硅胶色谱柱干柱，收集通过硅胶色谱柱干柱第5-10色谱柱体积的的流出液，回收溶剂，低温干燥，得提取物F；
（7）将步骤（4）得到的提取物A与步骤（6）得到的提取物F合并，即得抗病毒有效部位。
抗病毒有效部位的成分分离及结构鉴定：
取抗病毒有效部位，甲醇溶解， 200-300目硅胶拌样，干燥，研匀，先经过硅胶柱色谱，再结合聚酰胺柱色谱、凝胶柱色谱，分离纯化，分别得到5个化合物，经过经理化常数、质谱及核磁共振色谱等光谱数据、化学反应等方法,分别确证为肾叶打碗花素V、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、异鼠李素-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷、异槲皮苷。经HPLC检测，抗病毒有效部位中肾叶打碗花素V、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、异鼠李素-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷、异槲皮苷的总含量占总有效部位的40%以上。
实验例1：对艾滋病小鼠治疗作用
1.材料与方法
药物：实施例1抗病毒有效部位、实施例2抗病毒有效部位、实施例3抗病毒有效部位，试验时以30g/L的二甲基亚砜(DMSO)溶解，再用蒸馏水稀释至所需浓度；阳性对照药物齐多呋定(AZT)由厦门制药厂生产。
动物：SPF级BALB/C小鼠5O只，雌性，体质量l3-15g。
毒种：Friend型鼠白血病病毒(FriendLeukemia virus，FLV)引自美国典型培养物收藏中心(American Typical Culture Centre，ATCC)，经小鼠传代增强毒力后制成100 g/L脾悬液，-70℃冻存备用。
主要试剂:PE/Cy5 anti-mouse CD3e单克隆双标抗体；PE/Cy5 Mouse IgG1，KIsotype Ctrl同型对照；FITC anti-mouse CD4/PE anti-mouse CD8a单克隆单标抗体；FITC Mouse IgG1，K Isotype Ctrl/PEMouse IgG1，K Isotype Ctrl同型对照，以上均为美国Biolegend公司产品。
病毒半数感染量(ID50) 滴定：腹腔注射FLV，制成0.1g/L脾悬液，收集脾悬液按文献方法计算ID50，实验时以60倍ID50为小鼠艾滋病模型的实验浓度。
抗病毒有效部位对FLV致小鼠脾肿大的抑制作用：将小鼠分为正常组、模型组、实施例1抗病毒有效部位组、实施例2抗病毒有效部位组、实施例3抗病毒有效部位组、AZT组，每组各10只；除正常组外，均采用FLV腹腔注射感染小鼠。正常组和模型组每天以蒸馏水0.2mL/只灌胃，实施例1抗病毒有效部位组、实施例2抗病毒有效部位组、实施例3抗病毒有效部位组剂量均为10mg/kg， AZT组剂量为100mg/kg，均以蒸馏水配成2mL溶液，在病毒攻击后l d开始以灌胃方式给药，0.2mL/只，1次/d，连续给药21d；给药21d后剖杀小鼠，计算小鼠脾指数与脾指数抑制率，脾指数(质量比) ω脾=m脾(mg)/mbody(g)，p脾指数抑制= (ω平均，模型组-ω平均，给药组)/ω平均，模型组×100％。对所得实验数据用统计软件SPSS 10．0进行分析，各组间比较采用单因素方差分析(LSD)。
血象检查：摘眼球抗凝取血，以全自动血球计数仪进行红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数。
对细胞免疫功能的影响：测定小鼠胸腺指数(质量比)，ω胸腺=m胸腺(mg)/mbody (g)；外周血T细胞亚群水平检测，采用流式细胞仪测定BALB/C小鼠外周血T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD4 +/CD8+ 的水平。
2. 结果
2．1 各组对FLV致小鼠脾肿大的抑制作用的比较
实施例1抗病毒有效部位组的脾指数与模型组相比具有极显著性差异(P<0.001)，显示实施例1抗病毒有效部位对FLV致小鼠脾肿大具有抑制作用，抑制率分别为92.5%。实施例2抗病毒有效部位组的脾指数与模型组相比无显著性差异，显示对FLV致小鼠脾肿大无抑制作用。实施例3抗病毒有效部位组的脾指数与模型组相比无显著性差异，显示对FLV致小鼠脾肿大无抑制作用。
2.2 各组细胞免疫功能的比较
实施例1抗病毒有效部位组胸腺得到较好保护。未出现明显萎缩，可拮抗病毒感染后引起的胸腺指数的下降，显示了较好的免疫保护作用。外周血T淋巴细胞分析(TLC)显示，实施例1抗病毒有效部位能明显提高外周血CD3+ 、CD4+ 、CD8+ T淋巴细胞水平，并能一定程度调整CD4+ /CD8+ 比值趋向正常。实施例2抗病毒有效部位组、实施例3抗病毒有效部位组胸腺未得到较好保护，外周血CD3+ 、CD4+ 、CD8+ T淋巴细胞水平无提高作用。

Claims (6)

1.一种抗病毒有效部位的提取纯化技术，其特征在于按如下步骤制备:
（1）取肾叶打碗花8重量份、垂盆草2重量份、黄蜀葵花1重量份，混匀粉碎成粗粉，用70%乙醇为溶剂提取3次，每次室温浸泡提取4小时，70%乙醇用量为药材总重量的12倍，滤过，合并滤液得提取液A；提取后的药渣再用30%乙醇为溶剂提取2次，每次加热回流提取1.5小时，30%乙醇用量为药材总重量的10倍，滤过，合并滤液得提取液B；提取后的药渣再用水为溶剂加热回流提取1.5小时，滤过，合并滤液得提取液E；
（2）将步骤（1）得到的提取液A在50℃减压浓缩，浓缩至密度为1.18的浓缩液A，将步骤（1）得到的提取液B在80℃减压浓缩，浓缩至密度为1.18的浓缩液B，将浓缩液A与浓缩液B合并，得浓缩液C；将步骤（1）得到的提取液E在80℃减压浓缩，浓缩至密度为1.12的浓缩液C；
（3）将步骤（2）得到的浓缩液C中加入95%乙醇，使乙醇重量占比70%，放置24小时，滤过，滤液在50℃减压浓缩，浓缩至无乙醇，得浓缩液D；
（4）将步骤（3）得到的浓缩液D通过MCI 凝胶色谱柱吸附，用水洗脱，洗脱量为5个色谱柱体积，水洗脱液弃去，再用体积比8:92、15:80、25:70的乙醇-水依次洗脱，合计洗脱量为15个色谱柱体积，洗脱液直接通过与MCI 凝胶色谱柱相同色谱柱体积的硅胶色谱柱干柱，收集通过硅胶色谱柱干柱的第4-10色谱柱体积的流出液，回收溶剂，低温干燥得提取物A；
（5）将步骤（2）得到的浓缩液C加体积比1:8乙酸乙酯-氯仿萃取3次，合并萃取液，放置8小时，滤过，滤液回收溶剂，低温干燥，即得提取物B；
（6）将步骤（5）得到的提取物B通过MCI 凝胶色谱柱吸附，用水洗脱，洗脱量为5个色谱柱体积，水洗脱液弃去，再用体积比23:77的乙醇-水洗脱，洗脱量为10个色谱柱体积，洗脱液直接通过与MCI 凝胶色谱柱相同色谱柱体积的硅胶色谱柱干柱，收集通过硅胶色谱柱干柱第5-10色谱柱体积的的流出液，回收溶剂，低温干燥，得提取物F；
（7）将步骤（4）得到的提取物A与步骤（6）得到的提取物F合并，即得抗病毒有效部位。
2.根据权利要求1所述一种抗病毒有效部位的提取纯化技术，其特征在于所述的抗病毒有效部位同时含有肾叶打碗花素V、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、异鼠李素-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷、异槲皮苷。
3.根据权利要求1所述一种抗病毒有效部位的提取纯化技术，其特征在于用该提取纯化技术得到的抗病毒有效部位中肾叶打碗花素V、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、异鼠李素-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷及异槲皮苷的总含量占总有效部位的55%以上。
4.根据权利要求1所述一种抗病毒有效部位的提取纯化技术，其特征在于用该提取纯化技术得到的抗病毒有效部位可以用于制备抗病毒药物。
5.一种抗病毒有效部位，其特征在于同时含有肾叶打碗花素V、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、异鼠李素-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷、异槲皮苷。
6.根据权利要求5所述一种抗病毒有效部位，其特征在于抗病毒有效部位中肾叶打碗花素V、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、肾叶打碗花素、异鼠李素-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷及异槲皮苷的总含量占总有效部位的55%以上。
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