CN108369234A - 基于标志物分子将个体鉴定为待通过化疗治疗的方法和相关用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于标志物分子细胞角蛋白‑19片段(CYFRA 21‑1)和癌胚抗原(CEA)鉴定具有待通过化疗治疗的非小细胞肺癌的个体的方法以及所述标志物分子用于鉴定待通过化疗治疗的个体的用途。

Description

基于标志物分子将个体鉴定为待通过化疗治疗的方法和相关 用途
本发明涉及基于标志物分子细胞角蛋白-19片段(CYFRA 21-1)和癌胚抗原(CEA)鉴定具有待通过化疗治疗的非小细胞肺癌的个体的方法以及所述标志物分子用于鉴定待通过化疗治疗的个体的用途。
肺癌是全世界最常见的癌症，其中在2012年有约180万新病例和160万新死亡。肺癌的治疗取决于癌症的特定细胞类型、其已传播多远和患者的表现状态。常见的治疗包括姑息护理、手术、化疗和放疗。肺癌的靶向疗法对于晚期肺癌的重要性日益增加。成功治疗后，需要仔细监测患者的复发。非小细胞肺癌(NSCLC)的预后因素包括是否存在肺部症状、肿瘤大小、细胞类型(组织学)、扩散程度(分期)和至多个***的转移，以及血管侵袭。目前，对于NSCLC，IA期疾病的完全手术切除实现最佳预后，其中五年存活率高至70％。然而，一些患者可能进一步从化疗受益。
接受的早期NSCLC中的患者预后和辅助化疗决定的护理标准是肿瘤大小。然而，甚至一些具有小肿瘤的患者可能需要辅助化疗，而另一方面，具有较大II期肿瘤的患者可能仅用手术治愈(Morgensztern D等人, 2015, J Clin Oncol 33 (suppl): Abstr 7520)。因此，使用临床护理标准，一些患者可能治疗不足，而其他患者可能过度治疗。
因此，仍然需要用于鉴定待通过化疗治疗的具有肺癌的个体的合适方法。
令人惊讶地，据发现，如果标志物细胞角蛋白-19片段(CYFRA 21-1)和癌胚抗原(CEA)升高(高风险组)，肺癌患者的亚组，即被诊断为具有非小细胞肺癌亚型鳞状细胞癌(SCC-NSCLC) I或II期的患者，的确从化疗受益，而没有升高水平的那些(低风险组)没有从化疗受益。
目前，没有基于血液生物标志物的护理标准来决定具有I期或II期的SCC-NSCLC患者是否应当接受辅助化疗(AC)以降低其复发风险。先前的出版物已表明肿瘤-标志物-指数(TMI)可能定义了可能从AC受益的具有所有NSCLC的患者中的高风险组(Muley T, 2010,Tumor Biology 31, Suppl. 1: S87)。如本实施例中所示，区分不同的NSCLC组织学亚型是重要的。Cyfra21-1和CEA的标记物组合与分期信息(I期或II期)在SCC-NSCLC中建立了无复发存活率(RFS)，但在非小细胞肺癌亚型腺癌中没有额外的化疗益处，即标志物对于该亚组不是预测性的。本发明的创新性发现是SCC组织学的焦点，T期的加入和I期和II期的适用性，其中所有都与上述方法不同，并且仅基于肿瘤标志物指数。
本发明人能够显示，当前的护理标准，即单独的T期，在SCC-NSCLC患者(参见图1A)和腺癌NSCLC患者(参见图3A)中不是预后性的或预测性的。如图2A中所示，单独的肿瘤分期无法区分SCC-NSCLC中的不同预后组，且单独的T期也无法预测哪组患者应当接受化疗，因为在两组(称为T1-2，N0和T3，N0或T1-2，N1)中，使用化疗RFS仅略有改善(参见图2A)。这意味着目前的临床标准对于SCC-NSCLC中的化疗的患者选择不是最佳的。
基于本发明的标志物组合(Cyfra21-1和CEA)，被诊断有(具有)SCC-NSCLC I或II期的个体可被分为具有不同复发或无复发存活率风险/概率的两个预后组(参见图1B)如图2B中所示，低风险组(分别为实线和虚线)在手术后不需要化疗，但高风险组将显著受益于辅助化疗(点线相比于虚/点线)。实线(用化疗的低风险患者)和虚线(无化疗的低风险患者)之间无显著差异，即辅助化疗不改变低风险患者中的RFS，但点线(用化疗的高风险患者)和虚/点线(无化疗的高风险患者)之间存在大的差异，显示在高风险患者中在添加辅助化疗的情况下的RFS的显著改善。
与上述被诊断为具有SCC-NSCLC I或II期的个体组相比，被诊断为具有非小细胞肺癌亚型腺癌的个体不显示来自化疗的额外益处，即标志物无法预测该亚组。如图3B中所示，低风险组(分别为实线和虚线)和高风险组(点线相比于虚/点线)都不会从辅助化疗显著受益。实线(用化疗的低风险患者)和虚线(无化疗的低风险患者)之间没有显著差异，并且点线(用化疗的高风险患者)和虚/点线(无化疗的高风险患者)之间也没有显著差异，即辅助化疗不改变任一风险组中的RFS。
总之，本方法的重要优势在于其可以鉴定应该(高风险组)和不应该(低风险组)在非小细胞肺癌亚型鳞状细胞癌(SCC-NSCLC)的手术后接受化疗的个体。
因此，在第一个方面，本发明涉及将具有非小细胞肺癌亚型鳞状细胞癌(SCC-NSCLC) I期或II期的个体鉴定为待通过化疗治疗的方法，所述方法包括
a) 在获得自个体的样品中测量标志物分子细胞角蛋白-19片段(CYFRA 21-1)和癌胚抗原(CEA)的量或浓度，
b) 通过步骤(a)中测量的标志物分子的量或浓度的加权计算来获得组合值；和
c) 通过比较步骤(b)中获得的标志物的组合值与如参照群体中建立的组合值的截止值来将受试者鉴定为待通过化疗治疗，其中高于截止值的组合物表明该个体将通过化疗来治疗。
肺癌也被称为肺癌(carcinoma of the lung)或肺癌(pulmonary carcinoma)，并且是特征在于肺组织中不受控制的细胞生长的恶性肺肿瘤。如果保持不进行治疗，则该生长可通过转移到附近组织或身体的其它部分的过程扩散到肺外。在肺中开始的，被称为原发性肺癌的大多数癌症，是源自上皮细胞的癌。肺癌的四种主要组织学类型是鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌和小细胞癌(SCLC)。前三种亚型通常被称为非小细胞癌(NSCLC)，并且占肺癌的大约80％。肺部肿瘤的诊断一般基于成像方法和活检样品的分析。2004年世界卫生组织(WHO)的肺部肿瘤纲要是肺癌分类的基础。这并入了许多发展，包括对肺癌异质性的认识，用于一些神经内分泌肿瘤的常规诊断的诊断性免疫组织化学染色(IHC)技术的介绍，以及识别新描述的实体诸如胎儿腺癌、囊性粘液性肿瘤和大细胞神经内分泌癌。
在2011年，代表国际肺癌研究协会(IASLC)、美国胸科学会(ATS)和欧洲呼吸学会(ERS)的多学科专家小组提议对分类***进行重大修订。这些变化主要影响腺癌的分类及其与鳞状细胞癌的区别。肿瘤学家和病理学家对肿瘤进行分类的现行国际标准由“WHOClassification of Tumours of the Lung, Pleura, Thymus and Heart”(Travis等人,2015, WHO Classification of Tumours，第7卷，第4版)提供。在本发明的上下文中有疑问的情况下，应用上述标准。
鳞状细胞肺癌是由储备细胞(即替代支气管(肺的主要气道)的内层中受伤或受损细胞的圆形细胞)形成的非小细胞肺癌的类型。鳞状细胞肿瘤通常发生在肺的中央位置或主要气道分支之一。如果这些肿瘤生长至大尺寸，则它们可以在肺中形成空腔。占所有肺癌的25％至30％，鳞状细胞癌可以扩散至骨骼、肾上腺、肝脏、小肠或脑部。这种类型的肺癌的晚期预后很差。然而，对于具有已经鉴定并在早期被移除的局部肺癌的那些，五年存活率可以高达35％至40％。对于30岁以下的患者，这些五年存活率接近85％。这种类型的癌症几乎总是由吸烟引起。次要危险因素包括年龄、家族史和对二手烟雾、矿物和金属粉尘、石棉或氡的暴露。
根据肿瘤细胞和/或细胞间桥粒(称为“细胞间桥”)产生角蛋白的存在来预测鳞状细胞癌的组织学诊断。主要为梭形(多形性癌的梭形细胞变体)或具有外周栅栏样的特征性模式的一些肿瘤也可以被归类为鳞状细胞癌。历史上，大多数鳞状细胞癌(60％至80％)通过鳞状化生、异常增生、原位癌序列(原位鳞状癌)出现在气管支气管树的近端部分。少数病例在外周发生，并且可以与支气管扩张腔或疤痕相关。中央和外周鳞状细胞癌可以显示广泛的中央坏死，其具有所得的空腔形成。中央的、分化良好的鳞状细胞癌的小亚组作为外生型、支气管内、***状病变出现。具有这种鳞状细胞癌的不寻常变体的患者通常与持续性咳嗽、反复咯血或由于气道阻塞导致的复发性肺部感染一起存在。
腺癌是当代系列中最常见的肺癌类型，占肺癌病例的大约一半。腺癌是当代系列中最常见的肺癌类型，占肺癌病例的大约一半。其为在整个身体分泌粘液的腺体中形成的肺癌类型。腺癌通常见于肺的外部，倾向于比其他类型的肺癌更慢生长，并且在其在肺外扩散前更可能发现。其主要出现在目前或过去的吸烟者中，但其也是非吸烟者中看到的大多数肺癌类型。其在女性中比在男性中更常见，并且其比其他类型的肺癌更可能在更年轻人中出现。腺癌发病率增加被认为是由于在1960年代引入低焦油滤嘴香烟，尽管这种因果关系未经证实。
目前，NSCLC的肿瘤分期基于“修订的国际肺癌分期***”。肺癌已经考虑来自超过5,000个患者的临床数据库的信息进行分类，在2010年由美国癌症联合委员会(AmericanJoint Committee on Cancer, AJCC)和国际抗癌联盟(Union Internationale Contre leCancer)采用。
T(原发性肿瘤)分类如下：
- T1 = 肿瘤大小≤3 cm
- T2 = 肿瘤大小>3–7 cm
- T3 = 肿瘤大小> 7 cm或同一肺叶中有多个肿瘤结节
- T4 = 同一肺、但不同肺叶中有多个肿瘤结节。
N/M(转移)分类如下：
- N0 = 没有区域性***转移
- N1 = 同侧支气管周和/或同侧肺门***和肺内结中的转移，包括通过直接延伸而涉及
- N2 = 同侧纵隔和/或隆突下腹***中的转移
- N3 = 对侧纵隔、对侧肺门、同侧或对侧斜角肌或锁骨上***中的转移
- M0 = 无远端转移
- M1 = 远端转移。
肿瘤I至IV期根据上述TNM分类如下分类：
关于分期的仍更详细的信息可以获得自“Lung”，于：Edge SB, Byrd DR, ComptonCC,等人, 编: AJCC Cancer Staging Manual. 第7版，New York, NY: Springer, 2010,pp 253-70。
本发明的方法涉及具有SCC-NSCLC I或II期的个体。SCC-NSCLC I或II期的诊断在医师的技能之内。作为额外方式，本文给出了关于SCC-NSCLC诊断和分期的细节。
如本文详述，具有SCC-NSCLC I或II期的个体群体可以基于标志物Cyfra21-1和CEA的水平分为高风险组(复发的高风险)和低风险组(复发的低风险) (参见图1B)。如实施例(例如图2B)中所示，仅高风险组的个体从化疗受益。
为了将个体鉴定为待通过化疗治疗，在获得自个体的样品中测量标志物分子Cyfra21-1和CEA的量或浓度。
Cyfra21-1属于细胞角蛋白家族。细胞角蛋白是形成上皮中间丝的亚基的结构蛋白，其是细胞骨架的主要组分。迄今为止，已经鉴定了分子量范围为40至70千道尔顿(kD)的20种不同的细胞角蛋白多肽。由细胞合成的细胞角蛋白的类型也受生长和分化率的影响。由于其特定的分布模式，它们非常适合于用作肿瘤病理学中的分化标志物。CYFRA21-1是细胞角蛋白19的片段，其是上皮细胞中的细胞骨架的一部分，并且可以在上皮来源的肿瘤中以过表达的方式被发现。完整的细胞角蛋白多肽溶解性较差，但可以在血清中检测到可溶性片段(Bodenmueller等人, 1994, Int. J. Biol. Markers 9: 75-81)。CYFRA21-1是非小细胞肺癌(NSCLC)的充分确定的标志物。CYFRA21-1的主要适应症是监测非小细胞肺癌(NSCLC)的进程(Sturgeon, 2001, Clinical Chemistry 48: 1151-1159)。在初步诊断中，高CYFRA21-1血清水平指示具有非小细胞肺癌的患者中的晚期肿瘤阶段和不良预后(vander Gaast等人, 1994, Br. J. Cancer 69: 525-528)。正常或仅稍微升高的值不排除肿瘤的存在。CYFRA21-1血清水平迅速下降至正常范围内证明了成功的疗法。恒定的CYFRA21-1值或CYFRA21-1值的轻微或仅缓慢下降指示肿瘤切除不完全或多个肿瘤的存在，以及相应的治疗和预后后果。
CEA是一种单体糖蛋白(分子量近似180.000道尔顿)，其具有近似45-60%的可变碳水化合物组分。与AFP一样，CEA属于在胚胎期和胎儿期期间产生的癌胎抗原组。CEA基因家族由两个亚组中的约17个活性基因组成。第一组含有CEA和非特异***叉反应抗原(NCA)；第二组含有妊娠特异性糖蛋白(PSG)。CEA主要发现于胎儿消胃肠道和胎儿血清中。其也在健康成人的肠道、胰腺和肝脏组织中以少量存在。CEA的形成在出生后被抑制，且因此血清CEA值在健康成人中难以测量。在结肠直肠腺癌的病例中频繁发现高CEA浓度(Fateh-Modhadam, A. 等人 (编), Tumormarker und ihr sinnvoller Einsatz, JuergenHartmann Verlag GmbH, Marloffstein-Rathsberg (1993), ISBN-3-926725-07-9)。在20-50％的肠道、胰腺、肝脏和肺脏的良性疾病(例如肝硬化、慢性肝炎、胰腺炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、肺气肿)中发生轻微至中度的CEA升高(很少> 10ng/mL)(Fateh-Moghadam，A.,等人，同上)。吸烟者也具有升高的CEA值。CEA测定的主要指标是具有结肠直肠癌的患者的疗法管理和随访。不推荐CEA测定用于在普通群体中的癌症筛选。正常范围内的CEA浓度不排除恶性疾病的可能存在。
为了将个体鉴定为待通过化疗治疗，从个体获得样品。根据本发明的个体可以是任何人或非人动物，尤其是哺乳动物。因此，本文描述的方法和用途适用于人和兽医疾病。显然，特别感兴趣的非人哺乳动物包括家养动物、宠物和具有商业价值(例如家养动物，诸如马)或个人价值(例如宠物，诸如狗、猫)的动物。该方法特别优选用于人受试者，对此，通常采用诊断方法。在一个特别优选的实施方案中，所述个体因此是人。
样品可以是适合于测量根据本发明的标志物的任何样品，并且是指为了体外评估的目的而获得的生物样品。其包含可以与个体特异性地相关的材料，并且从其中可以测定、计算或推断关于个体的特定信息。样品可以全部或部分由来自患者的生物材料(例如，从肺活检样品获得的实体组织样品)构成。样品也可以是允许在样品上进行测试的方式接触患者的材料，其提供关于个体的信息(例如，支气管灌流液)。所述样品可以优选包含任何体液。示例性测试样品包括血液、血清、血浆、尿液、唾液和来自肺部的流体(诸如上皮衬液)，例如，通过支气管镜检或支气灌洗获得。所述样品可以从个体取得并立即使用或在测量步骤a)之前进行处理。处理可以包括纯化(例如分离，诸如离心)、浓缩、稀释、裂解细胞组分、冷冻、酸化、保存等。优选的样品是全血、血清、血浆或来自肺的上皮衬液，其中血浆、血清或全血代表最方便的样品类型。
通常，血液相关的样品是用于本发明上下文中的优选的测试样品。为此，血液可以抽取自静脉，通常取自肘部内侧或手背。具体地，在婴儿或年幼儿童中，可以使用被称为刺血针的尖锐工具以刺穿皮肤并使其流血。可以收集血液，例如至移液管中，或至载片或测试条上。因此，在本发明的一个优选实施方案中，获得自个体的样品是血液样品，特别是选自血清、血浆和全血。
在本发明的一个优选实施方案中，在诊断后、但在疗法前获取个体的样品。疗法可能对个体中的标志物水平具有影响。因此，希望代表疗法前状态的标志物水平不受影响，并且应当更好地反映个体从化疗受益。接受的NSCLC I和II期的标准治疗是SCC-NSCLC的手术，尤其是手术切除。典型的实例包括完整肺叶或更大切除，其优于亚肺叶切除。因此，优选在治疗前，尤其是在手术前，尤其是手术切除SCC-NSCLC前，取个体的样品。可以在疗法前21天至临疗法前的范围内，特别是疗法前14天至临疗法前的范围内，尤其是在疗法前7天至临疗法前的范围内取样品。在一个优选实施方案中，疗法是手术；在这种情况下，可以在诱导麻醉用于手术前21天至临诱导麻醉用于手术前(即，在导致全身麻醉状态的麻醉开始时施用药物(组合)前)的范围内，特别是在诱导麻醉用于手术前14天至临诱导麻醉用于手术前的范围内，尤其是在诱导麻醉用于手术前7天至临诱导麻醉用于手术前的范围内取样品。
根据本发明，测定标志物的量或浓度以鉴定待用化疗治疗的高风险个体。物质的量是标准定义的量(standards-defined quantity)，其测量基本实体(诸如原子、分子、电子和其他粒子)的装配体的大小。其有时被称为化学量。国际单位***(SI)将物质的量定义为与存在的基本实体的数量成正比。物质的量的SI单位是摩尔。其具有单位符号mol。物质的浓度是组分的量除以混合物的总体积。可以区分几种类型的数学描述：质量浓度、摩尔浓度、数量浓度和体积浓度。术语浓度可以应用于任何种类的化学混合物，但最频繁地，其是指溶液中的溶质和溶剂。摩尔(量)浓度具有变体，诸如当量浓度(normal concentration)和渗透浓度。
用于测量标志物分子(特别是Cyfra21-1和CEA)的各种方法是本领域中已知的，并且可以使用这些中的任一种。
优选地，通过使用特异性结合剂，从液体样品中特异性测量一种或多种标志物。
特异性结合剂是例如标志物的受体或标志物的抗体或与标志物蛋白相关核酸互补的核酸(例如与标志物的mRNA或其相关部分互补的核酸)。优选地，在蛋白水平上测量所述一种或多种标志物分子。
作为标志物多肽的结合配偶体的蛋白的测定可以使用许多已知的用于鉴定和获得与蛋白或多肽特异性相互作用的蛋白的方法中的任一种(例如酵母双杂交筛选***，诸如美国专利号5,283,173和美国专利号5,468,614中所述，或等同方案)进行。特异性结合剂对其相应的靶分子具有优选至少107 l/mol的亲和力。特异性结合剂对其靶分子优选地具有108 l/mol的亲和力或甚至更优选109 l/mol的亲和力。如技术人员将理解，术语特异性用于表明存在于样品中的其它生物分子不显著地结合对标志物特异性的结合剂。优选地，与除靶分子以外的生物分子结合的水平导致的结合亲和力分别为与靶分子的亲和力的仅10%或更低、更优选仅5%或更低。优选的特异性结合剂将满足以上亲和力以及特异性二者的最低标准。
优选地，特异性结合剂为与标志物(特别是Cyfra21-1和CEA)反应的抗体。术语抗体是指多克隆抗体、单克隆抗体、此类抗体的抗原结合片段、单链抗体以及包含抗体的结合结构域的基因构建体。
术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、其片段诸如F(ab')2和Fab片段以及任何天然存在或重组产生的结合配偶体，其为特异性结合Cyfra21-1或CEA多肽的分子。可以使用仍符合以上特异性结合剂的标准的任何抗体片段。抗体通过现有技术程序产生，例如，如Tijssen (Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays, ElsevierScience Publishers B.V., Amsterdam (1990), 全书，特别是第43-78页)中所述。此外，技术人员应完全知晓，可用于抗体的特异性分离的基于免疫吸附剂的方法。通过这些方式，可以增强多克隆抗体的质量并由此增强其在免疫测定法中性能(Tijssen, P., 同上, 第108-115页)。
对于如本发明中所公开的成果，可使用在例如山羊中产生的多克隆抗体。然而，显然还可以使用来源于不同物种(例如，大鼠、兔或豚鼠)的多克隆抗体，以及单克隆抗体。由于单克隆抗体可以以任何所需的量和恒定特性生产，所以其代表了用于临床常规的测定法的开发的理想工具。
对于测量，将获得自个体的样品与所讨论的标志物的特异性结合剂在适于形成结合剂标志物-复合物的条件下孵育。此类条件不必是特定的，因为技术人员在无需任何创造性努力的情况下就可以容易地鉴定此类适当的孵育条件。测量结合剂标志物-复合物的量并将其用于本发明的方法和用途中。如技术人员将理解，存在测量特异性结合剂标志物-复合物的量的许多方法，其均在相关教科书中详细描述(参见，例如，Tijssen P., 同上, 或Diamandis, E.P. 与 Christopoulos, T.K.(编撰), Immunoassay, Academic Press,Boston (1996))。
具体地，在定量(测定一种或多种标志物的量或浓度)免疫测定法中，使用标志物(Cyfra21-1或CEA)的单克隆抗体。
优选地，以夹心型测定法的形式来检测所讨论的标志物。在这种测定法中，在一侧上使用第一特异性结合剂以捕获所讨论的标志物，并在另一侧上使用被标记以可直接或间接检测的第二特异性结合剂(例如第二抗体)。第二特异性结合剂可以含有可检测的报道部分或标记，诸如酶、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团或生物素等。任何报道部分或标记都可以与本文公开的方法一起使用，只要这样的信号与洗涤后保留在支持物上的结合剂的量直接相关或成正比。然后，使用对于特定可检测的报道部分或标记适当的方法，测定保持与固体支持物结合的第二结合剂的量。对于放射性基团，闪烁计数或放射自显影方法通常是适当的。可以使用各种偶联技术制备抗体酶缀合物(对于综述，参见例如Scouten, W.H., Methods in Enzymology 135:30-65, 1987)。光谱学方法可用于检测染料(包括，例如，酶反应的比色产物)、发光基团和荧光基团。可以使用与不同的报道基团(通常是放射性或荧光基团或酶)偶联的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白检测生物素。通常可以通过添加底物(通常持续特定时间段)，随后光谱法、分光光度法或反应产物的其他分析来检测酶报道基团。可以使用众所周知的技术，将标准品和标准添加物用于测定样品中的抗原的水平。
如上所述，存在各种测量Cyfra21-1水平的方法。用于“CYFRA21-1”的测定法特异性测量存在于循环中的细胞角蛋白19的可溶性片段。CYFRA21-1的测量通常基于两种单克隆抗体(Bodenmueller等人, 1994, Int. J. Biol. Markers 9: 75-81)。商购可得的用于测量Cyfra21-1的产品包括Enzymum-Test CYFRA 21-1 (Boehringer Mannheim,Mannheim, Germany)、细胞角蛋白19片段(CYFRA 21-1)免疫放射测定试剂盒(CisboAssays, Codolet, France)、细胞角蛋白片段抗原21-1的ELISA试剂盒(Wuhan USCNBusiness Co., Ltd., China)和ARCHITECT Cyfra21-1测定法(Abbott, Wiesbaden,Germany)。在来自德国Roche Diagnostics的CYFRA21-1测定法中，使用两种特异性单克隆抗体(KS 19.1和BM 19.21)，并且测量具有大约30,000道尔顿的分子量的细胞角蛋白19的可溶性片段。优选地，根据制造商的说明在使用Roche产品号11820966160的Elecsys®分析仪上测量CYFRA21-1。
同样对于CEA水平的测量，存在各种测定法。市售的用于测量CEA的产品包括ADVIACentaur® CEA免疫测定法(Siemens Healthcare, Erlangen, Germany)和ARCHITECT CEA测定法(Abbott, Wiesbaden, Germany)。优选地，使用“Elecsys® CEA”(材料号：11731629160, Roche Diagnostics, Ltd, Rotkreuz, Switzerland)(其为用于定量测定CEA的电化学发光免疫测定法(ECLIA))测量CEA。
测量标志物的水平的步骤可以如下实施：可以使样品和任选校准物和/或对照与结合剂(其可以固定在例如固相上)在允许试剂结合标志物的条件下接触。可以通过分离步骤(例如一个或多个洗涤步骤)移除未结合的结合剂。可以添加第二试剂(例如标记的试剂)以检测结合的结合剂以允许对其进行结合和定量。可以移除未结合的第二试剂。可以(例如，基于标记)定量与标志物的量成正比的第二结合剂的量。定量可以基于校准曲线来进行，其中通过对每种校准物的测量值相比于浓度作图，而构建用于每个测定法的校准曲线。然后，可以从校准曲线读取样品中的标志物的浓度或量。
在测定标志物的量或浓度(步骤a)之后，通过步骤(a)中测量的标志物分子的量或浓度的加权计算来组合Cyfra21-1和CEA的值，以获得组合值(步骤b)，并将步骤(b)中获得的值与如在参照群体中建立的组合值的截止值进行比较(步骤c)。表述“将组合值…与如参照群体中建立的组合值的截止值进行比较”仅用于进一步说明无论如何对于技术人员都是显而易见的内容。根据本发明，将外部对照用作参照群体。对于外部对照，将源自个体的样品中的标志物的值与已知具有特定病况的个体的群体(特别是诊断为具有SCC-NSCLC I或II期的患者的高风险组或低风险组)中获得的相应值进行比较。优选地，参照组由在疗法、特别是手术前已知Cyfra和CEA的值的具有SCC-NSCLC I或II期的患者组成。将患者的参照群体分成亚组，其中之一接受化疗，而另一亚组不接受化疗。受益于化疗、例如无复发存活率必须是已知的。例如，可以将患者样品中的标志物水平(量或浓度)与已知与高风险患者或低风险患者相关的水平进行比较。通常，样品的标志物水平与诊断直接或间接相关，并且该标志物水平，例如，用于测定个体是否应当接受化疗。选择用于在其中建立的标志物的适当的对照或参照值是在技术人员的技术能力之内。示例性群体在实施例中给出。技术人员将理解，在一个实施方案中，此类对照获得自年龄匹配并且被适当地归类为具有SCC-NSCLCI期或II期的患者的高和低风险组的参照群体。如技术人员同样清楚的是，在对照中建立的绝对标志物值将取决于所用的测定法。优选地，使用来自适当参照群体中的100个或更多个充分表征个体的样品，来建立对照(参照)值。还优选的是，可以选择参照群体，使其由至少20、30、50、100、200、500或1000个个体组成。优选地，参照群体被诊断为具有SCC-NSCLC I或II期，并且不包括被诊断为具有非小细胞癌亚型腺癌的个体。
如参照组或参照群体中测量的Cyfra21-1和CEA的值例如用于建立中值或截止值。高于这种中值或截止值的值被认为是化疗治疗的指示。在一个实施方案中，建立中值或固定的截止值。选择这种中值或截止值以匹配目标诊断问题。优选地，截止值是参照群体的中值。
根据希望选择多少患者用于化疗，可以选择合适的中值或截止值。更高数目的选择用于接受化疗的患者降低了拒绝会受益于化疗的化疗患者的风险。另一方面，其增加了治疗不能受益于化疗的患者的风险。对于较低数目的选择的患者也是如此，反之亦然。
在本情况下，在本发明的方法中使用两种标志物，即CEA和Cyfra21-1。因此，使用CEA的量/浓度以及Cyfra21-1的量/浓度来计算组合值。将组合值与已使用相同的数学程序获得的参照的组合值进行比较。在一个优选实施方案中，通过样品中的标志物分子的量或浓度的加权计算来获得组合值。这意味着标志物之一被给予比另一者更高的权重。可以例如通过以下方程获得基于CEA的水平(量或浓度)([CEA])和Cyfra21.1的水平(量或浓度)([Cyfra21.1])计算的组合值C：C = a * [CEA] + b * [Cyfra21.1]，
其中a和b代表加权因子。优选地，已经通过分析参照群体来获得加权因子。合适的程度描述于实施例中。
例如，对于参照组的每个样品测定Cyfra21-1和CEA的组合值，随后可以通过Cox比例风险回归计算中值或组合值的合适截止值。在合适的组群中，可以计算Cox氏比例风险回归模型，其具有合适的结果测量(例如无复发存活率)的作为因变量并且使用Cyfra21-1和CEA作为自变量。
然后可以将Cyfra和CEA的由Cox比例风险回归模型递送的回归系数用作加权因子a和b，以便计算组群中每个患者的组合值C。在这些组合的C值上，可以计算截止值，例如，组群中C的中值。
C值高于截止值的患者将被视为高风险患者，且等于或低于截止值的患者被视为低风险患者。为了说明的目的，可以通过Kaplan-Meier曲线比较风险组。
Cox比例风险回归(Cox, David R 1972 Journal of the Royal Statistical Society., Breslow, N. E. 1975 International Statistical Review)是存活分析中检查存活分布与协变量之间关系的典型方法。Cox模型通常在下面显示的风险模型公式方面撰写。该模型给出了个体在时间t时的风险的表示，其中一组解释变量的给定规格由X表示。X呈现正被建模以预测个体的风险的预测变量的集合。Cox模型公式说明，时间t时的风险是两个量的乘积。h0(t)被称为基准风险函数。第二量是对β i X i 的线性总和的指数表述e，其中总和在p个解释性X变量上(Gail, M.等人 1996 Statistics for Biology and Health)。
患者分类可以涉及Kaplan-Meier (KM)存活曲线。KM曲线是用于从寿命数据估计存活函数的非参数统计量(Kaplan, E. L.; Meier, P 1958 J. Amer. Statist. Assn)。KM曲线不是平滑的函数，而是逐步的估计值。X-轴显示存活持续时间的连续时间。在Y-轴上看到来自给定群体的成员将具有超过时间t的寿命的累积概率。间隔的累积概率通过乘以直到该间隔的间隔存活率来计算。(Rich JT等人 2010 Otolaryngol Head Neck Surg)。KM曲线用于显示实施例的结果(参见图1至3)。在医学统计学中，KM曲线通常应用于将患者分组至类别，例如，具有基因A概况的那些和具有基因B概况的那些。在该图中，具有基因B的患者比具有基因A的那些快得多地死亡。两年后，约80％的基因A患者存活，但少于一半的具有基因B的患者存活。在本发明中，KM曲线用于将患者分组为高复发风险和低复发风险。
为了生成Kaplan-Meier估计量，每个患者(或每个受试者)需要至少两部分数据：最后一次观察时的状态(事件发生或右删失)和到事件的时间(或到删失的时间)。如果要比较两个或更多个组之间的存活函数，则需要第三部分数据：每个受试者的组分配。使S(t)为来自特定群体中的成员将具有超过时间t的寿命的概率。对于来自该群体的大小为N的样品，使观察到的直到N个样品成员死亡的时间为
。
与每个t i 的对应是n i ，临在时间t i 前是“有风险”的数字，和d i ，在时间t i 时的死亡数目。
Kaplan-Meier估计量是S(t)的非参数最大似然估计值，其中对在事件时间t i 时具有断点的所有分段常数存活曲线的集合取最大值。其为下述形式的乘积
。
当没有删失时，n i 只是临时间t i 前的存活者的数目。在删失的情况下，n i 是存活者的数目减去损失(删失的情况)的数目。其仅为仍在观察(尚未被删失)的有(观察到的)死亡的“风险”的那些存活情况。存在有时使用的替代定义，即
。
两个定义仅在观察到的事件时间上不同。后者定义是右-连续的，而前者定义是左-连续的。
使T是测量失效时间的随机变量，且使F(t)为其累积分布函数。注意
。
因此，为了使估计值与F(t)的右-连续估计值一致，右-连续定义可以是优选的。
Kaplan-Meier估计量是统计的，并且使用几个估计量来近似其方差。最常见的此类估计量之一是Greenwood公式：
。
在一些情况下，可能希望比较不同的Kaplan-Meier曲线。这可以通过几种方法(包括对数秩检验或Cox比例风险检验)进行。
上述统计方法仅仅是用于鉴定高风险患者的统计方法的实例。熟练的统计人员将知道用于分析主流数据并提供合适的截止值的合适方法。如上所详述，具有高于截止值的个体被鉴定为高风险。
被鉴定为高风险且因此待用化疗治疗的个体比被分类为低风险的个体具有更高的复发的风险。复发是过去的医疗病况(本发明中是肺腺癌)的再次发生。病况的体征和症状在缓解后恢复。癌症的再次发生被定义为癌症在治疗后以及癌症不能被检测到的一段时间后的恢复。同一癌症再次出现在其首次发现或非常接近的同一地方。
SCC-NSCLC的标准疗法是手术，尤其是切除。“切除”是手术移除部分或全部受损器官或结构，特别是移除肿瘤。肺切除是手术移除全部或部分的肺。切除的类型将基于肿瘤位置、大小和类型，以及个体在诊断前的整体健康和肺功能。在右侧，肺具有三叶，并且在左侧存在两个叶。通常，癌症手术涉及移除肺叶，称为肺叶切除术。楔形切除或肺段切除术是指移除小于肺叶的肺部区域，通常是肿瘤和其周围的小区域的健康肺组织。这是用于早期癌症的治疗，并且有时用于移除疑似癌症、但尚未得到证实的一块肺。在肺叶切除术中，外科医生移除肺叶。这是对于肺癌进行的常规手术，因为这具有移除所有癌性组织并减少癌症复发的机会的最佳机会。肺切除术是移除整个肺。如果肿瘤特别大，或在肺部难以到达或中心位置，则考虑该选项。尽管肺切除术可以导致功能的显著损失，但许多人仅用一个肺就活得相当好。目前，切除主要是肺叶切除术，随后是肺切除术、双肺叶切除术(移除或右肺或左肺)和楔形切除。
根据本发明，高风险患者用化疗治疗。“化疗”是癌症的药物治疗。其通常是***性的，这是指它循环通过并影响您的整个身体。药物进入血液并杀死异常细胞或阻止它们***。它们最通常通过经由导管静脉内(IV)输注至静脉中或口服来给予。癌症的类型、分期和位置将决定您化疗的具体药物、强度和频率。其可以与手术或辐射组合。化疗可以在手术(有时伴随放疗)之前施用以尝试缩小肿瘤(新辅助疗法)，在手术(有时伴随放疗)之后施用以尝试杀死任何可能遗留的癌细胞(辅助治疗)，或作为主要治疗(有时伴随放射治疗)用于更晚期的癌症或一些健康水平不足以进行手术的患者。其通常周期地给予，具有治疗期(通常1至3天)，随后为休息期以给予身体恢复的时间。然而，一些化疗剂每天给予。周期通常持续约3至4周。化疗剂的实例包括顺铂、卡铂、紫杉醇(Taxol®)、白蛋白结合的紫杉醇(nab-紫杉醇，Abraxane®)、多西他赛(Taxotere®)、吉西他滨(Gemzar®)、长春瑞滨(Navelbine®)、伊立替康(Camptosar®)、依托泊苷(VP-16®)、长春花碱或培美曲塞(Alimta®)。最经常地，NSCLC的治疗使用2种化疗剂的组合。研究已显示，添加第三种药物并没有带来很多益处，并可能引起更多的副作用。单药化疗有时用于不能很好耐受联合化疗的人，诸如整体健康不佳或较年长的那些。如果使用组合，经常包括顺铂或卡铂加一种其他药物。有时可以使用不包括这些药物的组合，诸如吉西他滨与长春瑞滨或紫杉醇。对于患有晚期肺癌且符合某些标准的个体，也可以在治疗中添加靶向治疗药物诸如贝伐单抗(Avastin®)或西妥昔单抗(Erbitux®)。目前优选的辅助化疗包括顺铂或卡铂，其经常与长春瑞滨、多西他赛、依托泊苷或培美曲塞组合。在本发明中，所述化疗优选为辅助化疗。更优选地，所述个体在手术后、尤其是在手术切除SCC-NSCLC后用化疗治疗。
肺癌的进一步治疗是放疗。放疗经常与化疗一起给予，并且可以在不适合手术的具有NSCLC的患者中以治愈意图使用。这种高强度放疗的形式被称为根治性放疗。该技术的细化是连续超分割加速放疗(CHART)，其中在短时间段内给予高剂量的放疗。在用于NSCLC的意图治愈的手术后，通常不应当使用术后胸部放疗。如果癌生长阻断短的支气管的区段，可以在气道内直接给予近距离放疗(局部放疗)以打开通道。与体外放射治疗相比，近距离放疗允许减少治疗时间并减少对健康护理人员的辐射暴露。然而，近距离放疗的证据少于体外放射治疗的证据。在本发明中，化疗，特别是辅助化疗可以与放疗组合。
在第二个方面，本发明涉及CYFRA 21-1和CEA作为标志物组合用于鉴定待通过化疗治疗的个体的用途，其中获得自个体的样品中的标志物组合的组合值高于如在参照群体或参照组中建立的组合值的截止值的检测表明通过化疗治疗，其中通过样品中的标志物分子的量或浓度的加权计算来获得组合值，且其中所述个体被诊断为具有SCC-NSCLC I或II期。
可以进一步定义根据本发明的用途，如对于本发明的方法所指定的。具体地，就在本发明的第二个方面中使用的术语而言，其是指在本发明的第一个方面中使用的术语、实施例和具体实施方案，其也适用于本发明的第二个方面。
通常，本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可变化。进一步，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，且不旨在限制本发明的范围。如本文和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数的提及对象，除非上下文另有明确说明。类似地，单词“包含”、“含有”和“涵盖”应当进行包含性而非排他性解释。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语和任何缩写具有与本发明的领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的方法或材料类似或等同的任何方法或材料可以用于如本文呈现的实施中，但本文描述特定方法和材料。
本发明通过以下实施例进一步说明，但应当理解的是，实施例仅为了说明的目的而包括，而不旨在限制本发明的范围，除非另有明确说明。
附图
图1说明被诊断为具有SCC-NSCLC I和II期的患者的无复发存活率。在图1A中，根据本标准细分患者，即患者被分类为T1-2，N0(不推荐化疗；通过实线表示)和T3，N0或T1-2，N1(待通过辅助化疗治疗；通过虚线表示)。所述线表明取决于手术后的时间的两个亚组的无复发存活率。在图1B中，患者基于患者的样品中标志物Cyfra21-1和CEA的水平进行分类，并且以时间依赖性方式监测无复发存活率。发现具有升高水平的标志物的患者具有高复发风险(通过虚线表示)，而发现具有较低水平的哪些具有低复发风险(通过实线表示)。
图2说明取决于化疗的治疗的SCC-NSCLC患者的亚组的无复发存活率的比较。通过测定时间依赖性无复发存活率评价如图1A(根据接受的标准护理分类)和1B(基于根据本发明的Cyfra21-1和CEA水平分类)中所指定的患者亚组的辅助化疗的有效性。如图2A中所示，对于目前的护理标准，即仅T期，化疗不能显著改善无复发存活率。如图2B中所示，在低风险组(实线和虚线)中，化疗不会正面影响无复发存活率，但在高风险组(点线相比于虚/点线)中，化疗增加了无复发存活率，其证明了根据本发明鉴定的该患者亚组明显且显著受益于辅助化疗。
图3说明取决于化疗的治疗的腺-NSCLC患者的亚组的无复发存活率的比较。通过测定时间依赖性无复发存活率评价如图1A(根据接受的标准护理分类)和1B(基于根据本发明的Cyfra21-1和CEA水平分类)中所指定的患者亚组的辅助化疗的有效性。如图3A中所示，对于目前的护理标准，即仅T期，无复发存活率保持不变。如图3B中所示，实线(用化疗的低风险患者)和虚线(无化疗的低风险患者)之间也没有显著差异，并且点线(用化疗的高风险患者)和虚/点线(无化疗的高风险患者)之间也没有显著差异，即辅助化疗不改变任一风险组中的无复发存活率。
实施例
实施例1：参照群体中的加权因子和截止值的定义
实施例1描述了如何在合适的参照群体中获得Cyfra21-1和CEA的组合的加权因子和组合值C的截止值。
合适的参照群体应当由具有SCC-NSCLC的患者组成，对于所述患者，Cyfra21-1和CEA的基线水平(手术前)水平已知，部分患者应当已接受化疗并且合适的结果测量(例如无复发存活率)应当可用。
在合适的组群中，可以计算Cox比例风险回归模型，其具有合适的结果测量(例如无复发存活率)的作为因变量并且使用Cyfra21-1和CEA以及任选T-期作为自变量。
然后可以将Cyfra21-1、CEA和任选T-期的由Cox比例风险回归模型递送的回归系数用作加权因子，以便计算组群中每个患者的组合值C。在这些组合的C值上，可以例如通过计算组群中的C值的中值来定义截止值。
C值高于截止值的患者将被视为高风险患者，且等于或低于截止值的患者被视为低风险患者。如果确定用于计算组合值和截止值的加权因子，则可以将这些结果用于选择新的患者用于化疗。
实施例2：确定化疗在具有I期和II期SCC-NSCLC的患者的各种亚组中的有效性
使用88个具有I期和II期SCC-NSCLC的患者的群体以鉴定患者的亚组，这取决于它们的肿瘤分期和标志物水平。目的是澄清是否所有亚组都应该通过化疗来治疗。
所有患者都经历肿瘤切除，而此外这些患者中的21个接受化疗。在切除前收集的血清样品中测量Cyfra21-1和CEA的浓度。
如今在临床实践中主要用于选择患者用于化疗的标准基于肿瘤大小。为了评估分期对于在目前组群中选择患者用于化疗的适用性，具有T1-2,N0期的患者被认为是低风险的，并且具有T3,N0或T1-2,N1期的患者被认为是高风险的。评价根据分期的高风险和低风险组中有或无化疗的患者的无复发存活率的差异(表1)。
表 1：基于分期的风险组。
HR低风险组：化疗相比于无化疗 = 2.373 (p = 0.3905)
HR高风险组：化疗相比于无化疗 = 2.161 (p = 0.2211)。
为了评估Cyfra21-1和CEA对于选择患者用于化疗的适用性，则在本群体上建立Cox比例风险回归模型，其以无复发存活率作为因变量以及Cyfra21-1和CEA作为自变量。
然后通过以下计算每个患者的组合值C：
C = b1 * log2(Cyfra21-1) + b2 * log2(CEA)
其中b1、b2是从Cox比例风险回归模型推导的回归系数，且log2(…)代表以2为底的对数。在所述的组群中，b1为0.459且b2为0.017。
因此，对该群体中的每个患者分配组合值C。然后将这些C值的中值定义为截止值(在所述的组群中，中值为0.960)。所有组合值C高于截止值的患者被视为高风险患者，且等于或低于截止值的患者作被视为低风险患者。
据观察，接受化疗的高风险组中的患者与没有接受化疗的高风险中的患者相比，无复发存活率显著更长。然而，在低风险组中，可观察到的有或无化疗的患者之间的无复发存活率没有显著差异。这意味着，高风险组中的所有患者都应当接受化疗，而来自低风险组的患者不应当接受化疗。
通过风险比和1年、2年和3年后的无复发存活率的比例，估计高风险组或低风险组中有或无化疗的患者之间的无复发存活率的差异。
风险比通过第二个Cox比例风险回归模型计算，所述模型以二元因素化疗是/否作为自变量和无复发存活率作为因变量。在高风险组和低风险组中分别计算Cox比例风险回归模型。结果显示于表2中。
表 2：基于Cyfra21-1和CEA的风险组。
HR低风险组：化疗相比于无化疗 = 0.876 (p = 0.8468)
HR高风险组：化疗相比于无化疗 = 3.984 (p = 0.0627)。
实施例3：将患者鉴定为待通过化疗治疗
对于新患者，从该患者的合适样品测量Cyfra21-1和CEA，并基于定义的加权因子计算该患者的组合值C。如果对于患者，组合值C高于先前定义的截止值，则将选择该患者用于化疗。
如果期望独立地建立此类加权因子和此类截止值或者可以使用如实施例2中给出的加权因子和截止值，则可以从如实施例1中描述的任何合适的组群推导组合值C的加权因子和截止值。

Claims (13)

1.将具有非小细胞肺癌亚型鳞状细胞癌(SCC-NSCLC) I期或II期的个体鉴定为待通过化疗治疗的方法，所述方法包括
a) 在获得自个体的样品中测量标志物分子细胞角蛋白-19片段(CYFRA 21-1)和癌胚抗原(CEA)的量或浓度，
b) 通过步骤(a)中测量的标志物分子的量或浓度的加权计算来获得组合值；和
c) 通过比较步骤(b)中获得的标志物的组合值与如参照群体中建立的组合值的截止值来将受试者鉴定为待通过化疗治疗，其中高于截止值的组合物表明所述个体将通过化疗来治疗。
2.权利要求1的方法，其中在疗法前获取所述个体的样品。
3.权利要求2的方法，其中所述疗法是SCC-NSCLC的手术，尤其是手术切除。
4.权利要求3的方法，其中在疗法前21天至临疗法前的范围内，特别是疗法前14天至疗法前24小时的范围内，尤其是疗法前7天至疗法前2天的范围内，尤其是在诱导麻醉用于手术前获取所述个体的样品。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述参照群体被诊断为具有SCC-NSCLC I或II期，并且不包括被诊断为具有非小细胞肺癌亚型腺癌的个体。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述样品是血液样品，特别是选自血清、血浆和全血。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中在蛋白水平上测量所述标志物分子。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述化疗为辅助化疗。
9.权利要求8的方法，其中所述个体在SCC-NSCLC的手术后、尤其是在手术切除后用化疗治疗。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述个体是人。
11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述截止值是参照群体的中值。
12.CYFRA 21-1和CEA作为标志物组合用于鉴定待通过化疗治疗的个体的用途，其中获得自个体的样品中的标志物组合的组合值高于如在参照群体中建立的组合值的截止值的检测表明通过化疗治疗，其中通过样品中的标志物分子的量或浓度的加权计算来获得组合值，且其中所述个体被诊断为具有SCC-NSCLC I或II期。
13.权利要求12的用途，其中进一步定义所述用途为如权利要求2至11中所指定。
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