CN108368505B - 改善的flare(流式细胞术减弱报道蛋白表达)技术用于快速批量分选 - Google Patents
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Abstract
本文提供了使用荧光激活的细胞分选(FACS)分批生产生产者细胞的方法和组合物。在一些方面，本公开提供了使用FACS分批生产生产者细胞的无药物选择方法。这样的分批生产方法和组合物可进一步用来生成生产者细胞的克隆群体，例如，用于大规模制造感兴趣的多肽。
Description
相关申请
本申请要求于2015年10月9日提交的美国临时专利申请号62/239,515的优先权的权益。前述申请的内容通过提及以其整体由此并入。
背景技术
用于选择生产者细胞群体和细胞克隆的方法对制造生物制剂如抗体和融合蛋白是必要的。这样的方法通常依靠选择剂如甲氨喋呤(MTX)或甲硫氨酸砜亚胺(MSX)的使用，以偏置和扩增生物制剂的产生。基于选择剂的方法可能影响选择的群体的存活力或生长速率，或可能对克隆稳定性具有负面影响。这样基于药物的选择还可能是耗费时间的，经常需要多轮选择以获得含有适合于生物制造的克隆的群体。这仍然需要生成产生高效价生物制剂和对宿主较小负面影响的大细胞群体和克隆的快速和可靠的方法。
发明内容
在一些方面，本公开提供了生产者细胞的分批选择和克隆选择的方法。如本文所述，开发用于分批选择的方法，其依赖于使用荧光激活的细胞分选(FACS)而不使用MTX作为扩增剂的生产者细胞的异质群体的快速批量分选。令人惊奇地发现本文所述的方法比传统MTX扩增更快且更有效。本文所述的方法例如对生成用于筛选感兴趣的多肽(如在早期临床开发中)和用于生成高效价克隆的生产者细胞的有效汇集物是有用的，其可用于产生用于小规模和大规模制造的感兴趣的多肽。
因此，在一些方面，本公开提供了一种荧光激活的细胞分选(FACS)以分批选择表达靶多肽的生产者细胞的方法，所述方法包括(a)提供生产者细胞的异质群体，其中所述群体中的所述生产者细胞表达不同水平的由相同多顺反子mRNA编码的FACS可选多肽和靶多肽，(b)使用FACS从所述生产者细胞的异质群体选择生产者细胞的第一异质亚群，其中，所述第一异质亚群中的所述生产者细胞以高于(a)中所述异质群体中的所述生产者细胞的至少80％的水平的水平表达FACS可选多肽，和(c)在无药物选择培养基中扩大所述生产者细胞的第一异质亚群，由此产生生产者细胞的扩大的第一异质亚群。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括(d)使用FACS从步骤(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群选择生产者细胞的第二异质亚群，其中所述第二异质亚群中的所述生产者细胞以高于(c)中所述生产者细胞的扩大的异质亚群中的所述生产者细胞的至少80％的水平的水平表达FACS可选多肽，和(e)在无药物选择培养基中扩大所述生产者细胞的第二异质亚群，由此产生生产者细胞的扩大的第二异质亚群。
在提供的方法的任一个的一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述扩大的第一或第二异质亚群分离所述靶多肽。在提供的方法的任一个的一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述扩大的第一或第二异质亚群分离一个或多个单个生产者细胞，并且单独地培养所述一个或多个单个生产者细胞以产生所述一个或多个单个生产者细胞的克隆群体。在提供的方法的任一个的一些实施方案中，与(a)中所述生产者细胞的异质群体的情况相比，所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群在所述靶多肽产生中得到1.2至5倍改善。在提供的方法的任一个的一些实施方案中，与(c)中所述生产者细胞的扩大的异质亚群的情况相比，所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群在所述靶多肽产生中得到1.2至2.5倍改善。在提供的方法的任一个的一些实施方案中，与(a)中所述生产者细胞的异质群体的情况相比，所述一个或多个单个细胞的至少一个克隆群体在所述靶多肽产生中得到5至30倍改善。
在提供的方法的任一个的一些实施方案中，在(b)中经受FACS的所述生产者细胞的异质群体含有80-120x 106个细胞。在提供的方法的任一个的一些实施方案中，在步骤(c)或(e)中的扩大之前，所述生产者细胞的第一和/或第二异质亚群含有0.5-6.0x 106个细胞。
在提供的方法的任一个的一些实施方案中，步骤c)中的所述扩大持续7-14天。在提供的方法的任一个的一些实施方案中，步骤e)中的所述扩大持续7-14天。
在提供的方法的任一个的一些实施方案中，所述无药物选择培养基为无甲氨喋呤培养基或无甲硫氨酸砜亚胺培养基。
在提供的方法的任一个的一些实施方案中，(a)中所述生产者细胞的异质群体通过用编码所述多顺反子mRNA的载体转染细胞和使转染的细胞经受一轮基于培养基的选择以选择表达不同水平的所述多顺反子mRNA的细胞来产生。在提供的方法的任一个的一些实施方案中，所述载体进一步含有二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。在提供的方法的任一个的一些实施方案中，所述基于培养基的选择为含有甲氨喋呤的培养基或核苷酸缺乏培养基。
在提供的方法的任一个的一些实施方案中，(a)中所述生产者细胞的异质群体通过用编码所述多顺反子mRNA的载体转染细胞和使所述转染的细胞经受FACS以选择表达不同水平的所述多顺反子mRNA的细胞来产生。在提供的方法的任一个的一些实施方案中，所述多顺反子mRNA包含编码所述FACS可选多肽的第一开放读码框(ORF)，和编码所述靶多肽的第二ORF，其中，所述第一ORF位于所述第二ORF的5’。
在提供的方法的任一个的一些实施方案中，所述第一ORF具有非AUG起始密码子。在提供的方法的任一个的一些实施方案中，所述第二ORF具有AUG起始密码子。在提供的方法的任一个的一些实施方案中，所述非AUG起始密码子为Kozak共有序列中的UUG、GUG或CUG。在提供的方法的任一个的一些实施方案中，编码所述FACS可选多肽的ORF没有任何AUG序列。
在提供的方法的任一个的一些实施方案中，所述FACS可选多肽为CD52或CD59。在提供的方法的任一个的一些实施方案中，所述靶多肽为治疗剂。在提供的方法的任一个的一些实施方案中，所述靶多肽为分泌蛋白。在提供的方法的任一个的一些实施方案中，所述靶多肽为抗体或Fc融合蛋白。
在提供的方法的任一个的一些实施方案中，所述生产者细胞为CHO细胞、HEK293细胞或HeLa细胞。
本公开的其他方面涉及一种生产者细胞的克隆群体，其表达通过上述方法中的任一个可获得的FACS可选多肽和靶多肽。在一些实施方案中，与(a)中所述生产者细胞的异质群体相比，所述克隆群体在所述靶多肽产生中得到5至30倍改善。
本公开的还另一方面涉及一种在荧光激活的细胞分选(FACS)后增加细胞的存活力的方法，所述方法包括：基于存活力标记使用第一轮FACS从表达靶多肽的细胞的群体选择细胞的第一亚群，和基于所述存活力标记使用第二轮FACS从所述细胞的第一亚群选择细胞的第二亚群，其中，所述第一轮和第二轮FACS在彼此的8小时内发生。在一些实施方案中，所述存活力标记为前向散射/侧向散射群体分化和/或碘化丙啶染色。在一些实施方案中，与开始的亚群分选后存活力相比，所述第二亚群具有1.2至4倍的分选后存活力改善。在一些实施方案中，所述方法进一步包括扩大所述第二亚群。在一些实施方案中，所述方法进一步包括单独培养来自所述第二亚群的细胞以生成一个或多个克隆群体。
在某些实施方案中，所述步骤(b)中的选择在用编码所述多顺反子mRNA的载体转染所述生产者细胞的异质群体后2-约15天进行。在某些实施方案中，所述步骤(b)中的选择在转染后约2-约10天、约2-约6天、约2-月4天进行。在一个示例性实施方案中，所述步骤(b)中的选择在转然后2天进行。在另一个示例性实施方案中，所述步骤(b)中的选择在转然后3天进行。
在示例性方面，本公开提供了一种荧光激活的细胞分选(FACS)以分批选择表达sFc融合多肽的生产者细胞的方法，所述方法包括：(a)提供生产者细胞的异质群体，其中，所述群体中的所述生产者细胞表达不同水平的通过所述相同多顺反子mRNA编码的FACS可选CD52多肽和sFc融合多肽，(b)使用FACS从所述生产者细胞的异质群体选择生产者细胞的第一异质亚群，其中所述第一异质亚群中的所述生产者细胞以高于(a)中所述异质群体中的所述生产者细胞的90％的水平的水平表达所述CD52多肽，和(c)在无药物选择培养基中扩大所述生产者细胞的第一异质亚群的130万个细胞7天，由此产生生产者细胞的扩大的第一异质亚群，其中，(a)中所述生产者细胞的异质亚群通过用编码所述多顺反子mRNA的载体转染细胞和使转染的细胞经受一轮基于培养基的选择以选择表达不同水平的所述多顺反子mRNA的细胞来产生，其中，所述基于培养基的选择为含有50nM甲氨喋呤的培养基，其中，所述多顺反子mRNA包含编码所述CD52多肽的第一开放读码框(ORF)和编码所述sFc融合多肽的第二ORF，其中，所述第一ORF位于所述第二ORF的5’，其中，所述第一ORF具有UUG起始密码子，其中，所述第二ORF具有AUG起始密码子，其中，所述第一ORF没有任何AUG序列，并且其中，所述多顺反子mRNA在表达载体中，所述表达载体进一步包含二氢叶酸还原酶(DHFR)盒。
在另一个示例性方面，本公开提供了一种荧光激活的细胞分选(FACS)以分批选择表达IgG重链多肽和IgG轻链多肽的生产者细胞的方法，所述方法包括：(a)提供生产者细胞的异质群体，其中，所述群体中的所述生产者细胞表达不同水平的由相同第一多顺反子mRNA编码的FACS可选CD52多肽和所述IgG重链多肽，和其中，所述群体中的所述生产者细胞表达不同水平的由相同第二多顺反子mRNA编码的FACS可选CD52多肽和所述IgG轻链多肽，(b)使用FACS从所述生产者细胞的异质群体选择生产者细胞的第一异质亚群，其中，所述第一异质亚群中的所述生产者细胞以高于(a)中所述异质群体中的所述生产者细胞的90％的水平的水平表达所述CD52多肽，和(c)在无药物选择培养基中扩大所述生产者细胞的第一异质亚群的130万个细胞7天，由此产生生产者细胞的扩大的第一异质亚群，其中，(a)中所述生产者细胞的异质群体通过用编码编码所述IgG重链多肽的第一多顺反子mRNA的第一载体和编码编码所述IgG轻链多肽的第二多顺反子mRNA的第二载体转染细胞和使转染的细胞经受一轮基于培养基的选择以选择表达不同水平的所述多顺反子mRNA的细胞来产生，其中，所述基于培养基的选择为含有5nM甲氨喋呤的培养基，其中，所述第一多顺反子mRNA包含编码所述CD52多肽的第一开放读码框(ORF)和编码所述IgG重链多肽的第二ORF，其中，所述第二多顺反子mRNA包含编码所述CD52多肽的第一开放读码框(ORF)和编码所述IgG轻链多肽的第二ORF，其中，在所述第一和第二多顺反子mRNA的每一个中(i)所述第一ORF位于所述第二ORF的5’，(ii)所述第一ORF具有UUG起始密码子，(iii)所述第二ORF具有AUG起始密码子，(iv)所述第一ORF没有任何AUG序列，和(v)所述多顺反子mRNA在表达载体中，所述表达载体进一步包含二氢叶酸还原酶(DHFR)盒。
在另一个示例性方面，本公开提供了一种荧光激活的细胞分选(FACS)以分批选择表达sFc融合多肽的生产者细胞的方法，所述方法包括：(a)提供生产者细胞的异质群体，其中，所述群体中的所述生产者细胞表达不同水平的由相同多顺反子mRNA编码的FACS可选CD52多肽和所述sFc融合多肽，(b)使用FACS从所述生产者细胞的异质群体选择生产者细胞的第一异质亚群，其中，所述第一异质亚群中的所述生产者细胞以高于(a)中所述异质群体中的所述生产者细胞的90％的水平的水平表达所述CD52多肽，(c)在无药物选择培养基中扩大所述生产者细胞的第一异质亚群12天，由此产生生产者细胞的扩大的第一异质亚群，(d)使用FACS从(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群选择生产者细胞的第二异质亚群，其中，所述第二亚群中的所述生产者细胞以高于(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群中的所述生产者细胞的至少90％的水平的水平表达所述FACS可选多肽，和(e)在无药物选择培养基中扩大所述生产者细胞的第二异质亚群9天，由此产生生产者细胞的扩大的第二异质亚群，其中，(a)中所述生产者细胞的异质群体通过用编码所述多顺反子mRNA的载体转染细胞和使转染的细胞经受一轮基于培养基的选择以选择表达不同水平的所述多顺反子mRNA的细胞来产生，其中，所述基于培养基的选择为含有5nM甲氨喋呤的培养基，其中，所述多顺反子mRNA包含编码所述CD52多肽的第一开放读码框(ORF)和编码所述sFc融合多肽的第二ORF，其中，所述第一ORF位于所述第二ORF的5’，其中，所述第一ORF具有UUG起始密码子，其中，所述第二ORF具有AUG起始密码子，其中，所述第一ORF没有任何AUG序列，并且其中，所述多顺反子mRNA在表达载体中，所述表达载体进一步包含二氢叶酸还原酶(DHFR)盒。
在另一个示例性方面，本公开提供了一种荧光激活的细胞分选(FACS)以分批选择表达IgG重链多肽和IgG轻链多肽的生产者细胞的方法，所述方法包括：(a)提供生产者细胞的异质群体，其中，所述群体中的所述生产者细胞表达不同水平的由相同第一多顺反子mRNA编码的FACS可选CD52多肽和所述IgG重链多肽，和其中，所述群体中的所述生产者细胞表达不同水平的由相同第二多顺反子mRNA编码的FACS可选CD52多肽和所述IgG轻链多肽，(b)使用FACS从所述生产者细胞的异质群体选择生产者细胞的第一异质亚群，其中，所述第一异质亚群中的所述生产者细胞以高于(a)中所述异质群体中的所述生产者细胞的90％的水平的水平表达所述CD52多肽，(c)在无药物选择培养基中扩大所述生产者细胞的第一异质亚群11天，由此产生生产者细胞的扩大的第一异质亚群，(d)使用FACS从(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群选择生产者细胞的第二异质亚群，其中，所述第二亚群中的所述生产者细胞以高于(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群中的所述生产者细胞的至少90％的水平的水平表达所述FACS可选多肽，和(e)在无药物选择培养基中扩大所述生产者细胞的第二异质亚群9天，由此产生生产者细胞的扩大的第二异质亚群，其中，(a)中所述生产者细胞的异质群体通过用编码编码所述IgG重链多肽的第一多顺反子mRNA的第一载体和编码编码所述IgG轻链多肽的第二多顺反子mRNA的第二载体转染细胞和使转染的细胞经受一轮基于培养基的选择以选择表达不同水平的所述多顺反子mRNA的细胞来产生，其中，所述基于培养基的选择为含有5nM甲氨喋呤的培养基，其中，所述第一多顺反子mRNA包含编码所述CD52多肽的第一开放读码框(ORF)和编码所述IgG重链多肽的第二ORF，其中，所述第二多顺反子mRNA包含编码所述CD52多肽的第一开放读码框(ORF)和编码所述IgG轻链多肽的第二ORF，其中，在所述第一和第二多顺反子mRNA的每一个中(i)所述第一ORF位于所述第二ORF的5’，(ii)所述第一ORF具有UUG起始密码子，(iii)所述第二ORF具有AUG起始密码子，(iv)所述第一ORF没有任何AUG序列，和(v)所述多顺反子mRNA在表达载体中，所述表达载体进一步包含二氢叶酸还原酶(DHFR)盒。
在另一个示例性方面，本公开提供了一种荧光激活的细胞分选(FACS)以分批选择表达IgG重链多肽和IgG轻链多肽的生产者细胞的方法，所述方法包括：(a)提供生产者细胞的异质群体，其中，所述群体中的所述生产者细胞表达不同水平的由相同第一多顺反子mRNA编码的FACS可选CD52多肽和所述IgG重链多肽，和其中，所述群体中的所述生产者细胞表达不同水平的由相同第二多顺反子mRNA编码的FACS可选CD52多肽和所述IgG轻链多肽，(b)使用FACS从所述生产者细胞的异质群体选择生产者细胞的第一异质亚群，其中，所述第一异质亚群中的所述生产者细胞以高于(a)中所述异质群体中的所述生产者细胞的90％的水平的水平表达所述CD52多肽，(c)在无药物选择培养基中扩大所述生产者细胞的第一异质亚群10天，由此产生生产者细胞的扩大的第一异质亚群，(d)使用FACS从(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群选择生产者细胞的第二异质亚群，其中，所述第二亚群中的所述生产者细胞以高于(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群中的所述生产者细胞的至少90％的水平的水平表达所述FACS可选多肽，和(e)在无药物选择培养基中扩大所述生产者细胞的第二异质亚群11天，由此产生生产者细胞的扩大的第二异质亚群，其中，(a)中所述生产者细胞的异质群体通过用编码编码所述IgG重链多肽的第一多顺反子mRNA的第一载体和编码编码所述IgG轻链多肽的第二多顺反子mRNA的第二载体转染细胞和使转染的细胞经受一轮基于培养基的选择以选择表达不同水平的所述多顺反子mRNA的细胞来产生，其中，所述基于培养基的选择为含有5nM甲氨喋呤的培养基，其中，所述第一多顺反子mRNA包含编码所述CD52多肽的第一开放读码框(ORF)和编码所述IgG重链多肽的第二ORF，其中，所述第二多顺反子mRNA包含编码所述CD52多肽的第一开放读码框(ORF)和编码所述IgG轻链多肽的第二ORF，其中，在所述第一和第二多顺反子mRNA的每一个中(i)所述第一ORF位于所述第二ORF的5’，(ii)所述第一ORF具有UUG起始密码子，(iii)所述第二ORF具有AUG起始密码子，(iv)所述第一ORF没有任何AUG序列，和(v)所述多顺反子mRNA在表达载体中，所述表达载体进一步包含二氢叶酸还原酶(DHFR)盒。
在另一个示例性方面，本公开提供了一种荧光激活的细胞分选(FACS)以分批选择表达IgG重链多肽和IgG轻链多肽的生产者细胞的方法，所述方法包括：(a)提供生产者细胞的异质群体，其中，所述群体中的所述生产者细胞表达不同水平的由相同第一多顺反子mRNA编码的FACS可选CD52多肽和所述IgG重链多肽，和其中，所述群体中的所述生产者细胞表达不同水平的由相同第二多顺反子mRNA编码的FACS可选CD52多肽和所述IgG轻链多肽，(b)使用FACS从所述生产者细胞的异质群体选择生产者细胞的第一异质亚群，其中，所述第一异质亚群中的所述生产者细胞以高于(a)中所述异质群体中的所述生产者细胞的90％的水平的水平表达所述CD52多肽，(c)在无药物选择培养基中扩大所述生产者细胞的第一异质亚群10天，由此产生生产者细胞的扩大的第一异质亚群，(d)使用FACS从(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群选择生产者细胞的第二异质亚群，其中，所述第二亚群中的所述生产者细胞以高于(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群中的所述生产者细胞的至少90％的水平的水平表达所述FACS可选多肽，(e)在无药物选择培养基中扩大所述生产者细胞的第二异质亚群11天，由此产生生产者细胞的扩大的第二异质亚群，和(f)从所述扩大的第一或第二异质亚群分离单个生产者细胞，并单独地培养所述单个生产者细胞以产生所述单个生产者细胞的克隆群体，其中，所述分离的单个生产者细胞以高于单个生产者细胞的97-99％的水平的水平表达所述FACS可选多肽，其中，(a)中所述生产者细胞的异质群体通过用编码编码所述IgG重链多肽的第一多顺反子mRNA的第一载体和编码编码所述IgG轻链多肽的第二多顺反子mRNA的第二载体转染细胞和使转染的细胞经受一轮基于培养基的选择以选择表达不同水平的所述多顺反子mRNA的细胞来产生，其中，所述基于培养基的选择为含有5nM甲氨喋呤的培养基，其中，所述第一多顺反子mRNA包含编码所述CD52多肽的第一开放读码框(ORF)和编码所述IgG重链多肽的第二ORF，其中，所述第二多顺反子mRNA包含编码所述CD52多肽的第一开放读码框(ORF)和编码所述IgG轻链多肽的第二ORF，其中，在所述第一和第二多顺反子mRNA的每一个中(i)所述第一ORF位于所述第二ORF的5’，(ii)所述第一ORF具有UUG起始密码子，(iii)所述第二ORF具有AUG起始密码子，(iv)所述第一ORF没有任何AUG序列，和(v)所述多顺反子mRNA在表达载体中，所述表达载体进一步包含二氢叶酸还原酶(DHFR)盒。
在另一个示例性方面，本公开提供了一种荧光激活的细胞分选(FACS)以分批选择表达sFc融合多肽的生产者细胞的方法，所述方法包括：(a)提供生产者细胞的异质群体，其中，所述群体中的所述生产者细胞表达不同水平的由相同多顺反子mRNA编码的FACS可选CD52多肽和所述sFc融合多肽，(b)使用FACS从所述生产者细胞的异质群体选择生产者细胞的第一异质亚群，其中，所述第一异质亚群中的所述生产者细胞以高于(a)中所述异质群体中的所述生产者细胞的90％的水平的水平表达所述CD52多肽，(c)在无药物选择培养基中扩大3-4x 106个生产者细胞的第一异质亚群8天，由此产生生产者细胞的扩大的第一异质亚群，(d)使用FACS从(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群选择生产者细胞的第二异质亚群，其中，所述第二亚群中的所述生产者细胞以高于(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群中的所述生产者细胞的至少90％的水平的水平表达所述FACS可选多肽，和(e)在无药物选择培养基中扩大3-4x 106个生产者细胞的第二异质亚群8天，由此产生生产者细胞的扩大的第二异质亚群，其中，(a)中所述生产者细胞的异质群体通过用编码所述多顺反子mRNA的载体转染细胞和使转染的细胞经受一轮基于培养基的选择以选择表达不同水平的所述多顺反子mRNA的细胞来产生，其中，所述基于培养基的选择为补充有谷氨酰胺和5nM甲氨喋呤的核苷酸缺乏培养基，其中，所述多顺反子mRNA包含编码所述CD52多肽的第一开放读码框(ORF)和编码所述sFc融合多肽的第二ORF，其中，所述第一ORF位于所述第二ORF的5’，其中，所述第一ORF具有UUG起始密码子，其中，所述第二ORF具有AUG起始密码子，其中，所述第一ORF没有任何AUG序列，并且其中，所述多顺反子mRNA在表达载体中，所述表达载体进一步包含二氢叶酸还原酶(DHFR)盒。
在另一个示例性方面，本公开提供了一种荧光激活的细胞分选(FACS)以分批选择表达sFc融合多肽的生产者细胞的方法，所述方法包括：(a)提供生产者细胞的异质群体，其中，所述群体中的所述生产者细胞表达不同水平的由相同多顺反子mRNA编码的FACS可选CD52多肽和所述sFc融合多肽，(b)使用FACS从所述生产者细胞的异质群体选择生产者细胞的第一异质亚群，其中，所述第一异质亚群中的所述生产者细胞以高于(a)中所述异质群体中的所述生产者细胞的90％的水平的水平表达所述CD52多肽，(c)在无药物选择培养基中扩大3-4x106个生产者细胞的第一异质亚群8天，由此产生生产者细胞的扩大的第一异质亚群，(d)使用FACS从(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群选择生产者细胞的第二异质亚群，其中，所述第二亚群中的所述生产者细胞以高于(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群中的所述生产者细胞的至少90％的水平的水平表达所述CD52多肽，(e)在无药物选择培养基中扩大3-4x106个生产者细胞的第二异质亚群8天，由此产生生产者细胞的扩大的第二异质亚群，和(f)从所述扩大的第一或第二异质亚群分离单个生产者细胞，并单独地培养所述单个生产者细胞以产生所述单个生产者细胞的克隆群体，其中，所述分离的单个生产者细胞以高于单个生产者细胞的99％的水平的水平表达所述CD52多肽，其中，(a)中所述生产者细胞的异质群体通过用编码所述多顺反子mRNA的载体转染细胞和使转染的细胞经受一轮基于培养基的选择以选择表达不同水平的所述多顺反子mRNA的细胞来产生，其中，所述基于培养基的选择为补充有谷氨酰胺和5nM甲氨喋呤的核苷酸缺乏培养基，其中，所述多顺反子mRNA包含编码所述CD52多肽的第一开放读码框(ORF)和编码所述sFc融合多肽的第二ORF，其中，所述第一ORF位于所述第二ORF的5’，其中，所述第一ORF具有UUG起始密码子，其中，所述第二ORF具有AUG起始密码子，其中，所述第一ORF没有任何AUG序列，并且其中，所述多顺反子mRNA在表达载体中，所述表达载体进一步包含二氢叶酸还原酶(DHFR)盒。
附图说明
图1为显示FLARE(流式细胞术减弱的报道基因表达)怎样工作的实例的示意图。
图2为显示FLARE可怎样用来鉴定细胞的低或高生产者群体的示意图。
图3为显示具有FLARE的荧光激活的细胞分选(FACS)富集表达高水平的报道蛋白的细胞的示意图。
图4显示即刻重复分选和FACS分选改善分选后群体的存活力并且因此改善克隆功效的示意图。
图5为示意图，其显示使用FLARE生成和筛选表达高水平的IgG的克隆；这优于有限稀释克隆(LDC)。
图6显示使用快速批量分选(比对标准MTX选择方法)的多个可替换的方法生成表达高水平的感兴趣的蛋白质的生产者细胞的汇集物的示意图。通过电穿孔转染细胞，允许其恢复2天，然后使其经受选择策略或分选方法生成生产者细胞的汇集物。
图7显示从用5nM MTX生成的分选前细胞群体快速批量分选前10％的报道蛋白表达细胞。
图8为显示在靶向来自分选前细胞群体的前1、5或10％的报道基因蛋白表达细胞的快速批量分选后感兴趣的蛋白质(单克隆抗体，mAb#2，或Fc融合蛋白,sFc融合#1)的第14天分批效价富集的图。并且在图的上部显示的为针对分选收集的细胞的#和扩大每个富集的分选后群体的时间。效价来自未补料分批培养。
图9为显示用于顺序快速批量分选的方法的一系列的示意图。
图10为显示表达Fc融合蛋白(sFc融合#2)或单克隆抗体(mAb#3或mAb#1)的细胞的顺序前10％快速批量分选的流式细胞术数据的表格和一系列示意图。
图11为在通过顺序快速批量分选或MTX扩增产生的细胞汇集物中Fc融合蛋白或单克隆抗体的第14天分批效价的图。
图12为两幅图，显示Fc融合蛋白的第14天效价的左图，和显示表达Fc融合蛋白的细胞的％存活力的右图，在通过50nM MTX后，其通过快速批量分选或5nM MTX选择生成。
图13为两幅图，显示单克隆抗体的第14天效价的左图，和显示表达单克隆抗体的细胞的％存活力的右图，在通过50nM MTX后，其通过快速批量分选或5nM MTX选择生成。
图14为两幅图，显示单克隆抗体的第14天效价的左图，和显示表达单克隆抗体的细胞的％存活力的右图，在通过50nM MTX后，其通过快速批量分选或5nM MTX生成。
图15为一系列的FACS直方图叠加，其显示来自通过顺序快速批量分选或MTX扩增产生的细胞汇集物的流式细胞术数据，并显示感兴趣的蛋白质的各自的第14天效价。
图16为两个FACS直方图叠加，其显示来自用核苷酸缺乏培养基最初选择的并经过两轮快速批量分选的细胞的流式细胞术数据，并显示感兴趣的蛋白质的各自的第14天效价。
图17为比较通过MTX独立分选或通过MTX扩增产生的细胞群体的第14天效价的图。
图18为显示来自通过MTX独立快速批量分选(MTX Indy 10-10汇集物1)或通过MTX扩增(20nM汇集物1或100nM汇集物2)产生的细胞汇集物和克隆的Fc融合蛋白的分选前(汇集物)和分选的(克隆)的效价。还显示克隆功效和克隆扩大存活能力。
图19为两幅图，其显示来自通过MTX扩增或MTX独立分选产生的克隆的Fc融合蛋白的第14天效价。
图20为显示来自核苷酸缺乏选择过程的第3至21天的细胞的转染群体的报道基因表达的示意图(与模拟转染群体相比)。转染的细胞在转染后不久(第3-4天)表现出可见表达，然后在完成选择时(第18-20天)转变成稳定表达。
图21为显示第一分选后的％存活力和随后获得的以即刻第二分选实现的存活力的图示和图。
图22为两幅图，其第一幅图显示快速批量汇集物和MTX扩增的汇集物的第14天未补料分批效价(加星号的汇集物表示靶向汇集物用于分选以生成克隆)，第二幅图显示快速批量分选的克隆和MTX生成的克隆的所得第14天未补料分批效价。
图23为一系列的FACS直方偏移，其描绘来自相同载体(pGZ729-RFP)的红色荧光蛋白(RFP)和细胞表面报道蛋白CD52表达的早期表达。无选择压力施加于转染的细胞。RFP和CD52的峰值早期表达发生在2-3天。
图24显示一系列的FACS直方偏移，其描绘在用pGZ729-RFP(编码可选多肽CD52和靶多肽RFP)或pGZ700-RFP(仅编码靶多肽RFP)转染的细胞中RFP和CD52的第3天早期表达。
图25是示意图，其显示EPIC在转染后不久生成用于选择的细胞的亚群的方法和在分选富集的群体的分离/扩大时报道基因表达和单克隆抗体(mAb)效价的有益作用。模拟指模拟转染。
图26为描绘与传统MTX方法相比，EPIC生成的汇集物的第14天未补料分批效价的图。
图27为描绘来自EPIC生成的克隆的第14天未补料分批效价(其达到范围1.5-2.0g/L的最高表达)的图。最左侧条带(0.5g/L)表示克隆前EPIC分选的汇集物的效价。所有其他垂直条带表示个体克隆的效价。
图28为一系列直方偏移，其描绘EPIC靶向以生成转染有pGZ729-RFP的稳定汇集物的比较益处。EPIC被用来靶向第2天的早期RFP表达，其产生了与传统传染/选择方法(0nMMTX)相比具有改善的RFP(和CD52报道蛋白表达)的稳定汇集物。
图29是示意图，其说明与传统转染/选择方法相比的EPIC方法(与流式细胞术分选一起使用)。
具体实施方式
在描述本发明前，应该理解的是本发明不局限于本文所公开的具体方法和实验条件；因为这样的方法和条件可能改变。还应该理解的是本文所使用的术语仅用于描述具体的实施方案的目的，并不意图是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求来限制。
此外，除非另有说明，否则本发明的实践采用本领域技术中的常规分子和细胞生物学以及免疫学技术。这样的技术是技术人员已知的，并且在文献中充分地解释的。参见，例如，Ausubel等编,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008)，包括所有增补,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第四版)MR Green和J.Sambrook和Harlow等著,Antibodies:A Laboratory Manual,Chapter 14,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(2013,第2版)。
I.定义
除非本文另有定义，否则本文所使用的科学和技术术语具有由本领域普通技术人员通常理解的含义。在任何潜在歧义的情况下，本文所提供的定义优先于任何字典或外在定义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。术语“包括”以及其他形式(如“包括(includes)”和“包括(included)”)的使用不是限制性的。
通常，连同本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交使用的命名是本领域中已知的和通常使用的那些。除非另有说明，否则本文所提供的方法和技术通常根据本领域已知的常规方法进行，并如贯穿本说明书引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域中通常完成的或如本文所述的。连同本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的术语以及试验程序和技术是本领域中已知的和通常使用的那些。标准技术用于化学合成，化学分析，药物制备、配制和递送，以及患者的治疗。
公开内容可更容易地理解，选择术语在下面定义。
如本文所使用的，术语“多核苷酸”意图指任何长度的核苷酸的多聚形式，其实例包括，但不限于，基因或基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。
如本文所使用的，术语“多肽”意图指任何长度的核酸的多聚形式，其实例包括，但不限于，蛋白质、蛋白质片段、多聚蛋白、融合蛋白、抗体(包括其片段)和肽。
如本文所使用的，“荧光激活的细胞分选”或“FACS”指基于由细胞表达的一个或多个FACS可选多肽的存在、不存在或水平，将细胞的群体分成一个或多个亚群的方法。FACS依赖于个体细胞的光学特性，其包括荧光性，以将细胞分选为亚群。
如本文所使用的，“FACS可选多肽”是可以通过流式细胞术直接或间接检测的多肽。FACS可选多肽的实例包括包含胞外结构域的多肽(例如，CD52或CD59)，其能够与可检测的结合配偶体(例如荧光标记的抗体)结合以通过流式细胞术间接检测多肽。FACS可选多肽的其他实例包括荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)及它们的变体，所述变体包括eGFP、Venus、mCherry、mTomato等，其可以通过流式细胞术直接检测。
如本文所使用的，“靶多肽”指可在宿主细胞中产生的蛋白质、蛋白质片段、多聚蛋白、融合蛋白、抗体(包括其片段)或肽，而且在本文示例的方面，靶多肽由于其作为治疗剂例如抗体(包括其片段)、Fc融合蛋白、激素或酶的潜力而被选择。在一些实施方案中，靶多肽是分泌蛋白。然而，本文所述的方法不限于治疗性多肽的选择和放大。例如，还涵盖诊断多肽或用于环境的多肽以在本文所公开的方法中用作靶多肽。
如本文所使用的，术语“抗体”指对感兴趣的抗原具有重要已知特异性免疫反应活性的这样的装配体(例如，完整抗体分子、抗体片段或它们的变体)。抗体和免疫球蛋白包含轻链和重链，在它们之间具有或没有链间共价键。脊椎动物***中的基础免疫球蛋白结构相对充分理解。
如本文所使用的，术语“抗体”包括全长抗体以及这样的抗体的抗原结合片段和变体。抗体可以是任何类型，如IgG、IgA或IgM；和任何亚类，如IgG1或IgG4。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，或其可以是多克隆抗体或单克隆抗体的片段。抗体可以是嵌合的、人源化的、全长人类的、双特异性的或双功能的。还涵盖是抗体的任何抗原结合片段或变体，如Fab、Fab′、F(ab′)2、它们的单链可变区(scFv)和变型。
“Fc融合蛋白”指包含与多肽如蛋白质或肽直接或间接连接的免疫球蛋白Fc结构域的蛋白。连接的多肽可以是感兴趣的任何蛋白质分子，如配体、受体或抗原性肽。
如本文所使用的，“生产者细胞”指适合于例如以用于产生生物制剂的小规模或大规模制造方法产生蛋白质的细胞。在某些实施方案中，生产者细胞是哺乳动物或昆虫细胞。生产者细胞在本文中进一步讨论。
如本文所使用的，“生产者细胞的异质群体”是表达不同水平的一个或多个多肽(例如由相同多顺反子mRNA编码的FACS可选多肽和靶多肽)的细胞的群体。在一些实施方案中，不同水平包括群体中的一个或多个多肽的至少10倍、至少100倍、至少1,000倍或至少10,000倍的变化(例如一个范围)。在一些实施方案中，不同水平包括在如通过流式细胞术(例如在BD InfluxTM细胞分选仪上)检测的群体中的FACS可选多肽的至少10倍、至少100倍、至少1,000倍或至少10,000倍的变化(例如相对荧光的范围)。用于生成生产者细胞的异质群体的方法在本文中描述。
如本文所使用的，“多顺反子mRNA”是含有至少两个能够编码两个或更多个多肽的开放读码框(ORF)的mRNA。
如本文所使用的，“无药物选择培养基”是没有药物(例如甲氨喋呤(MTX))的培养基，其用来选择表达赋予亚群药物抗性的蛋白质的细胞的亚群。
如本文所使用的，“基于培养基的选择”是由此将培养基改为包括选择剂(例如MTX)或排除培养基的组分的选择过程，这引起亚群的选择，所述亚群对选择剂有抗性或在不存在培养基组分中能够存活。
如本文所使用的，“核苷酸缺陷型培养基”是没有或含有低水平(例如小于10微克/mL)的核苷酸的培养基，所述核苷酸具有核苷碱基(腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、次黄嘌呤或胸苷)的一个或多个。在一些实施方案中，核苷酸缺陷型培养基是没有次黄嘌呤或胸苷的培养基。示例性的核苷酸缺陷型培养基包括CD CHO培养基(Gibco,LifeTechnologies,目录编号10743(液体)和12490(颗粒))。
如本文所使用的，“存活力标记”是表示细胞存活力的细胞特征，并且可通过FACS检测。示例性的存活力标记包括前向散射、侧向散射、碘化丙锭染色或它们的组合。
如本文所使用的，术语“非AUG起始密码子”意图包括任何非AUG多核苷酸(一般是三联体)，其作为翻译起始的起始位点起作用，相对于AUG起始密码子的效率降低。天然存在的可替换的起始密码子用法是本领域已知的，并且例如在Kozak(1991)J.Cell Biol.115(4):887-903；Mehdi等(1990)Gene91:173-178；Kozak(1989)Mol.Cell.Biol.9(11):5073-5080中描述。一般地，与AUG的翻译效率相比，非AUG起始密码子具有降低的翻译效率；例如，与AUG的翻译效率(100％)相比，可替换的起始密码子GUG可具有3-5％翻译效率。非AUG起始密码子的翻译效率还可以被其序列上下文影响；例如，报道最佳Kozak共有序列对非AUG起始密码子处的翻译起始有积极的作用(Mehdi等(1990)Gene 91:173-178；Kozak(1989)Mol.Cell.Biol.9(11):5073-5080)。完整Kozak DNA共有序列是GCCRCCATGG(SEQ ID NO:1)，其中起始密码子ATG(在RNA中是AUG)是下划线的，称ATG起始密码子的A为+1位，并且在-3位的“R”是嘌呤(A或G)。两个最高保守位是嘌呤，优选地，A在-3，并且G在+4(Kozak(1991)JCell Biol 115(4):887-903)。在美国专利公开2006/0172382和美国专利公开2006/0141577中描述了用于可选标记的减弱表达的可替换的起始密码子用法。本领域技术人员会认识到，本文描述为DNA的序列会具有与RNA分子相关的序列，例如，DNA序列ATG会对应于RNA序列AUG，而且反之亦然。
如本文所使用的，术语“分选前”当连同细胞的群体一起使用时指尚未经过如本文所述的，例如使用FLARE的FACS选择的细胞的群体，并且任选地在经过FACS选择前，已经经受MTX(例如5nM MTX)或无MTX(例如0nM MTX)培养基的初始选择。
如本文所使用的，术语“FLARE”指“流式细胞术减弱的报道蛋白表达”。FLARE是利用多顺反子mRNA的表达***，其含有至少两个开放读码框(ORF)，含有非AUG起始密码子并编码FACS可选多肽的一个上游ORF，和含有AUG起始密码子并编码靶多肽的第二下游ORF。
如本文所使用的，术语“约”应指在规定值附近的10％的容许范围。因此，当术语“约”用来修饰规定值时，表示的范围会涵盖规定值的±0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％中的任何数字。
II.用于分批选择生产者细胞的FACS的方法
在一些方面，本公开涉及荧光激活的细胞分(FACS)选分批选择表达靶多肽的生产者细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：
(a)提供生产者细胞的异质群体，其中所述群体中的所述生产者细胞表达不同水平的由相同多顺反子mRNA编码的FACS可选多肽和靶多肽，
(b)使用FACS从所述生产者细胞的异质群体选择生产者细胞的第一异质亚群，其中，所述第一异质亚群中的所述生产者细胞以高于(a)中所述异质群体中的所述生产者细胞的至少80％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)的水平的水平表达FACS可选多肽，和
(c)在无药物选择培养基中扩大所述生产者细胞的第一异质亚群，由此产生生产者细胞的扩大的第一异质亚群。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括：
(d)使用FACS从(c)中的所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群选择生产者细胞的第二异质亚群，其中所述第二异质亚群中的所述生产者细胞以高于(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群中的所述生产者细胞的至少80％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)的水平的水平表达FACS可选多肽，和
(e)在无药物选择培养基中扩大所述生产者细胞的第二异质亚群，由此产生生产者细胞的扩大的第二异质亚群。在一些实施方式中，重复步骤(d)和(e)至少两次(例如，2次、3次、4次、5次或更多次)产生生产者细胞的扩大的第3个、第4个、第5个、第6个等异质亚群。
适合于进行本文所述的方法的FACS细胞分选仪是本领域中熟知的，并且是可商购的。示例性的FACS细胞分选仪包括BD InfluxTM(BD Biosciences)和通过其他商业供应商如Sony、Bio-Rad和Beckman Coulter生产的其他等同细胞分选仪。
在一些实施方案中，生产者细胞在促进细胞中FACS可选多肽的表达的条件下培养。在一些实施方案中，FACS可选标记为细胞表面标记。细胞表面标记多肽的实例包括，但不限于CD2、CD20、CD52和CD59。CD52和CD59细胞表面标记多肽的示例性、非限制性氨基酸序列在下面提供。
示例性人CD52多肽的氨基酸序列(剪接受体突变体)：
LERFLFLLLTISLLVLVQIQTGLSGQNDTSQTSSPSASSNISGGIFLFFVANAIIHLFCFS*(SEQ IDNO:1)
示例性人CD59多肽的氨基酸序列(剪接受体突变体)：
LGIQGGSVLFGLLLVLAVFCHSGHSLQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNNCWKFEHCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLENGGTSLSEKTVLLLVTPFLAAAWSLHP*(SEQ ID NO:2)
示例性小鼠CD52多肽的氨基酸序列(剪接受体突变体)：
LKSFLLFLTIILLVVIQIQTGSLGQATTAASGTNKNSTSTKKTPLKSGASSIIDAGACSFLFFANTLICLFYLS*(SEQ ID NO:6)
用于检测细胞表面标记的本领域中已知的任何方法可以连同本公开的方法使用。例如，抗体或其他细胞表面标记特异性结合剂在有利于抗体与FACS可选多肽结合的条件下直接或间接与生产者细胞接触，并且由此生产则细胞。结合剂或抗体的选择通过以下确定：1)其选择性结合在宿主细胞上表达的FACS可选多肽的能力；和2)其使用可检测的标记标记或结合例如用于流式细胞术或FACS的可检测的标记的能力。
在可替换的实施方案中，第一试剂可为结合FACS可选多肽的蛋白质或肽，其中第一试剂继而又结合能够被可检测地标记(例如，并入荧光标记、酶标记、比色标记或其他可检测标记)的第二试剂。尽管并不总是明确说明，意图是“间接”结合FACS可选多肽包括使用任何数量的中间配偶体。
在一些实施方案中，试剂或抗体直接结合细胞表面标记，而且包含荧光标记。适合的荧光标记包括，但不限于，荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘(pyrene)、孔雀石绿(Malachite green)、芪(stilbene)、萤光黄、级联蓝和德克萨斯红。其他适合的光染料在Molecular
Handbook,第11版,2010中描述。
在一些实施方案中，将荧光标记功能化以促进与试剂或多个试剂的共价附接。适合的官能团，包括，但不限于异硫氰酸盐/酯基、氨基、卤代乙酰基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺酯和磺酰卤，其全部可用来使荧光标记与第二分子附接。荧光标记的官能团的选择会取决于与接头、试剂、FACS可选多肽或第二标记剂的附接的位点。
荧光标记的附接可直接或经由接头到抗体或试剂。一方面，接头是相对短的偶联部分，其通常用来附接分子。在该实施方案中，第一标记部分与候选试剂的附接会如本领域技术人员通常所理解的那样进行，而且可包括以上概述用于并入荧光标记的技术。
用于设计和构建用于细胞计数的标记的抗体和其他试剂的材料和技术是本领域中已知的，并例如在Bailey等(2002)Biotechnol.Bioeng.80(6)；670-676；Carroll和Al-Rubeai(2004)Expt.Opin.Biol.Therapy4:1821-1829；Yoshikawa等(2001)Biotechnol.Bioeng.74:435-442；Meng等(2000)Gene 242:201-207；Borth等(2001)Biotechnol.Bioeng.71(4):266-273；Zeyda等(1999)Biotechnol.Prog.15:953-957；Klucher等(1997)Nucleic Acids Res.25(23):4853-4860；和Brezinsky等(2003)J.Imumunol.Methods277:141-155中描述。
用于间接连接标记与试剂(其继而结合可选多肽)的合适的结合对包括，但不限于，抗原/抗体，其包括地高辛/抗体、二硝基酚(DNP)/抗DNP、丹酰-X/抗丹酰、荧光素/抗荧光素、萤光黄/抗萤光黄、罗丹明/抗罗丹明和生物素/抗生物素蛋白(或生物素/抗生蛋白链菌素)。结合对应该彼此具有高亲和力，在FACS分选或与本公开相关使用的其他检测***期间足以经受剪切力。
因此，在一些方面，第一标记部分(当使用第二标记部分时)包括，但不限于，半抗原如生物素。靶分子的生物素化是已知的，例如，已知大量生物素化试剂，其包括用于蛋白质、核酸、碳水化合物和羧酸的生物素化的胺反应剂和硫醇反应剂。相似地，还已知大量其他半抗原化试剂。
用于本文所述的方法的抗体可在细胞培养物中、在噬菌体中或在多种动物(其包括但不限于牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、绵羊、狗、猫、猴、黑猩猩、猿等)中产生，只要抗体保留对FACS可选多肽的结合的特异性。可以通过在一组给定的条件下比较结合适当的抗原与结合无关的抗原或抗原混合物来测试抗体的结合特异性。
在没有直接标记针对FACS可选多肽的抗体或试剂的实施方案中，抗体或试剂还优选含有并保留结合经由FACS可选多肽结合细胞后可检测的第二试剂的能力。
在一些实施方案中，当FACS可选多肽是CD59时，FACS可选多肽可使用抗CD59抗体检测。“抗CD59抗体”指特异性识别并结合CD59的抗体。可通过本领域已知的方法生成抗CD59抗体。见例如，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel,等编,1987至当前版本)和ANTIBODIES A LABORATORY MANUAL,第二版(Greenfield编2013)。另外，几个抗CD59抗体是可商购的(例如，与荧光标记缀合的抗体，如由商业供应商AbCam、SeroTec和BioLegend售卖的那些)。
在一些实施方案中，当FACS可选多肽是CD52时，FACS可选多肽可使用抗CD52抗体检测。“抗CD52抗体”指特异性识别并结合CD52的抗体。可通过本领域已知的方法生成抗CD52抗体。另外，几个抗CD52抗体是可商购的(例如，与荧光标记缀合的抗体，如由商业供应商AbCam、SeroTec和BioLegend售卖的那些)。
在具体的实施方案中，当可选多肽是CD20时，可选多肽可使用抗CD20抗体检测。“抗CD20抗体”指特异性识别并结合CD20的抗体。可以通过本领域已知的方法产生抗CD20抗体。另外，几个抗CD20抗体是可从供应商，如BD Pharmingen；Beckman Coulter,Inc.(Fullerton,Calif.,多个克隆，包括目录号6604106克隆H299(B1)；同种型IgG2a和目录号IM1565克隆L26,同种型IgG2a)；Invitrogen(Carlsbad,Calif.,克隆:BH-20,同种型:IgG2a和克隆:B-H20,同种型:IgG2a)；BioLegend(San Diego,Calif.,目录号302301,克隆:21-7,同种型:IgG2b,κ)；EMD Biosciences,Inc.,
Brand(San Diego,Calif.,目录号217670克隆2H7,同种型:IgG2b)和Anaspec(San Jose,Calif.,目录号29587)商购的。
在示例性的、非限制性的方法中，如本文所述的生产者细胞的异质群体与识别并直接或间接结合(如果存在的话)细胞表面上的FACS可选多肽的试剂接触。接触在有利于或适合于试剂或抗体与FACS可选多肽的特异性结合(直接或间接)的条件下进行。然后使用合适的方法如FACS(例如，通过门限(gating)以高水平如群体水平的至少80％的水平表达FACS可选多肽的细胞)选择结合试剂或抗体的细胞并用来创造生产则细胞的异质亚群。然后生产者细胞的异质亚群在导致扩大群体以产生足够细胞来进行第二轮的FACS(如果希望的话)或以产生分批群体来产生靶多肽的条件下生长。至少一轮的FACS后，生产者细胞的异质亚群可进一步被分选以产生克隆群体。可通过本领域已知的任何方法来进行克隆群体的制备。例如，在一个实施方案中，选择的细胞可以每孔一个细胞的密度铺板在96孔(或其他大小)的板中，并且允许生长一段时间(例如一般是7-28天)这允许单个细胞生长成子细胞的多个细胞集落(即克隆群体)。该方法可接着包括通过检测在所述克隆群体上的FACS可选多肽和/或靶多肽表达的水平分析一个或多个克隆群体和选择具有高表达水平的FACS可选多肽和/或靶多肽的一个或多个克隆群体，由此选择稳定表达靶多肽的一个或多个克隆群体。在某些实施方案中，在以单个细胞密度铺板之后分析克隆群体之前将克隆群体培养7-28天。该方法可进一步包括在有利于试剂与FACS可选多肽结合的条件下使克隆群体与识别并直接或间接结合克隆细胞表面上的FACS可选多肽(如果存在的话)的可检测试剂接触；和选择或检测直接或间接结合试剂或抗体的一个或多个细胞。还可分离并培养这样选择的这些细胞。该方法可进一步包括例如使用蛋白质A筛选(如当把多肽为抗体或Fc融合物时)、Western印迹、用考马斯蓝或银色染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳或酶活性测定分析一个或多个克隆的靶多肽表达。
因此，在一些实施方式中，本文提供的方法可进一步包括从扩大的第一或第二(或者第三个或第四个或第五个或第六个)异质亚群分离一个或多个单个生产者细胞，并单独培养一个或多个单个生产者细胞以产生一个或多个单个生产者细胞的克隆群体。
在提供的任一方法的一些实施方式中，与生产者细胞的异质群体的情况相比，生产者细胞的扩大的第一异质亚群在产生靶多肽中产生1.2至5倍、1.2至4倍、1.2至3倍、1.2至2.5倍、1.5至10倍、1.5至9倍、1.5至8倍、1.5至7倍、1.5至6倍、1.5至5倍、1.5至4倍、1.5至3倍或1.5至2.5倍、2至10倍、2至9倍、2至8倍、2至7倍、2至6倍或2至5倍改善。
在提供的任一方法的一些实施方式中，与生产者细胞的扩大的第一异质亚群的情况相比，生产者细胞的扩大的第二异质亚群在产生靶多肽中产生1.2至5倍、1.2至4倍、1.2至3倍、1.2至2.5倍、1.5至5倍、1.5至4倍、1.5至3倍或1.5至2.5倍改善。
在提供的任一方法的一些实施方式中，与生产者细胞的异质群体的情况相比(例如，与生产则细胞的异质群体中平均产生靶多肽相比)，一个或多个单个细胞的至少一个克隆群体在产生靶多肽中产生3至30倍、5至30倍、5至20倍、3至20倍、5至10倍、3至10倍或3至5倍改善。
在提供的任一方法的一些实施方式中，该方法进一步包含从扩大的第一或第二(或者第三个或第四个或第五个或第六个)异质亚群或克隆群体分离靶多肽。靶多肽可使用本领域中已知的任何方法分离并且可例如根据用于重组蛋白质和抗体的目前的良好生产规范(CGMP)进一步纯化到至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.9％或更大的纯度水平。
在提供的任一方法的一些实施方式中，经受FACS的生产者细胞的异质群体含有1-500x 106个细胞、1-400x 106个细胞、1-300x 106个细胞、1-200x106个细胞、1-150x 106个细胞、10-500x 106个细胞、10-400x 106个细胞、10-300x 106个细胞、10-200x 106个细胞、10-150x 106个细胞、50-500x 106个细胞、50-400x 106个细胞、50-300x 106个细胞、50-200x106个细胞、50-150x 106个细胞、80-500x 106个细胞、80-400x 106个细胞、80-300x 106个细胞、80-200x 106个细胞、80-150x 106个细胞或80-120x 106个细胞。
在提供的任一方法的一些实施方式中，在扩大前，生产者细胞的第一和/或第二(和/或第三个和/或第四个和/或第五个和/或第六个)异质亚群含有0.1-10.0x 106个细胞、0.2-10.0x 106个细胞、0.3-10.0x 106个细胞、0.4-10.0x106个细胞、0.5-10.0x 106个细胞、0.1-9.0x 106个细胞、0.2-9.0x 106个细胞、0.3-9.0x 106个细胞、0.4-9.0x 106个细胞、0.5-9.0x 106个细胞、0.1-8.0x 106个细胞、0.2-8.0x 106个细胞、0.3-8.0x 106个细胞、0.4-8.0x 106个细胞、0.5-8.0x 106个细胞、0.1-7.0x 106个细胞、0.2-7.0x 106个细胞、0.3-7.0x 106个细胞、0.4-7.0x 106个细胞、0.5-7.0x 106个细胞、0.1-6.0x 106个细胞、0.2-6.0x 106个细胞、0.3-6.0x 106个细胞、0.4-6.0x 106个细胞或0.5-6.0x 106个细胞。
在提供的任一方法的一些实施方式中(例如步骤c)或步骤c))，本文所述的扩大步骤在5-21天、5-14天、6-21天、6-14天、7-21天或7-14天进行。
在提供的任一方法的一些实施方式中，无药物选择培养基为无甲氨喋呤培养基或无甲硫氨酸砜亚胺培养基。
III.生产者细胞及其产生的方法
本公开的各方面涉及在本文所述的方法中使用的生产细胞和生产细胞的群体。生产者细胞可以使用适合从多顺反子mRNA产生靶多肽的任何细胞类型生成。在一些实施方案中，细胞是真核细胞。产生靶多肽的合适真核细胞的实例包括但不限于，中国仓鼠卵巢细胞系，其包括命名为CHO-DBX11、CHO-DG44、CHO-S、CHO-K1和仓鼠细胞系BHK-21的那些；鼠细胞系，其被命名为NIH3T3、NS0、C127、猿猴细胞系COS、Vero；和人细胞系HeLa，HEK293(也称为293)、NIH-3T3、U-937和Hep G2。其他实例包括酵母细胞、昆虫细胞(例如果蝇Schnieder S2细胞、Sf9昆虫细胞，WO 94/126087，BTI-TN-5B1-4(High FiveTM)昆虫细胞(Invitrogen))、植物细胞、禽类细胞、真菌细胞和牛细胞。对表达有用的酵母的实例包括但不限于酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、耶氏酵母属(Yarrowia)或毕赤酵母属(Pichia)。参见，例如，美国专利号4,812,405；4,818,700；4,929,555；5,736,383；5,955,349；5,888,768和6,258,559。生产者细胞的其他实例可为原核生物，其包括细菌细胞如大肠杆菌(E.coli)(例如菌株DH5aTM)(Invitrogen,Carlsbad,CA),PerC6(Crucell,Leiden,NL)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和/或其他合适的细菌。细胞可以购自商业供应商，如美国典型培养物保藏中心(ATCC,Rockville,Md.USA)或使用本领域已知的方法从分离物中培养。
在一些实施方案中，提供了生产者细胞的异质群体。可以使用本领域已知或本文所述的任何方法产生生产者细胞的异质群体。在提供的任一方法的一些实施方案中，通过使用编码多顺反子mRNA的载体转染细胞并使转染的细胞经受少于或等于一轮基于培养基的选择来选择表达不同水平(例如，至少10倍、100倍、1,000倍或10,000倍的变异)的多顺反子mRNA的细胞而产生生产者细胞的异质群体。在一些实施方案中，载体进一步含有例如二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，而且基于培养基的选择是甲氨喋呤(MTX，例如1nM-100nM MTX)、核苷酸缺陷型培养基或它们的组合。在一些实施方案中，载体进一步含有谷氨酰胺合成酶(GS)基因，而且基于培养基的选择是甲硫氨酸磺酰亚胺(MSX，25-100μM MSX)。在一些实施方案中，FACS用来例如通过使用FACS可选多肽水平选择细胞来选择表达不同水平的多顺反子mRNA的细胞。在一些实施方案中，载体缺乏药物选择标记，例如缺乏DHFR基因或GS基因。
本公开的生产者细胞含有编码多顺反子mRNA分子的重组多核苷酸(例如，重组cDNA)，从中，从不同的ORF分别翻译靶多肽和FACS可选多肽。在一些实施方案中，提供了编码FACS可选多肽如CD59或CD52的第一ORF。以下提供了CD52和CD59的示例性的、非限制性的第一ORF序列。
示例性CD52人ORF(剪接受体突变体)：
ttggagcgcttcctcttcctcctactcaccatcagcctcctcgttttggtacaaatacaaaccggactctccggacaaaacgacaccagccaaaccagcagcccctcagcatccagcaacataagcggaggcattttccttttcttcgtcgccaacgccataatccacctcttctgcttcagttga(SEQ ID NO:3)
示例性CD59人ORF(剪接受体突变体)：
ttgggaatccaaggagggtctgtcctgttcgggctgctgctcgtcctcgctgtcttctgccattccggtcatagcctgcagtgctacaactgtcctaacccaactgctgactgcaaaacagccgtcaattgttcatctgattttgacgcgtgtctcattaccaaagctgggttacaagtgtataacaactgttggaagtttgagcattgcaatttcaacgacgtcacaacccgcttgagggaaaacgagctaacgtactactgctgcaagaaggacctgtgtaactttaacgaacagcttgaaaacggagggacatccttatcagagaaaacagttcttctgctggtgactccatttctggcagctgcttggagccttcatccctaa(SEQ IDNO:4)
示例性CD52小鼠ORF(剪接受体突变体)：
ttgaagagcttcctcctcttcctcactatcattcttctcgtagtcattcagatacaaacaggatccttaggacaagccactacggccgcttcaggtactaacaaaaacagcacctccaccaaaaaaacccccttaaagagcggggcctcatccatcatcgacgcgggcgcttgcagtttcctcttcttcgccaatacccttatttgcctcttctacctcagctaactgagtaa(SEQID NO:8)
在一些实施方案中，提供编码靶多肽(如抗体、酶或Fc融合蛋白)的第二ORF。在一些实施方案中，通过使用非AUG起始密码子用于FACS可选多肽的翻译起始以及使用AUG起始密码子用于靶多肽的翻译起始来完成单独的翻译。在该实施方案中，通常编码靶多肽的多核苷酸位于编码FACS可选多肽的多核苷酸的下游。也可使用内部核糖体进入位点(IRES)实现单独的翻译。在一些实施方案中，IRES元件位于编码靶多肽的多核苷酸的上游和编码FACS可选多肽的多核苷酸的下游。在一些实施方案中，IRES元件位于编码FACS可选多肽的多核苷酸的上游和位于编码靶多肽的多核苷酸的下游。
在一些实施方案中，非AUG起始密码子以这样的方式位于编码FACS可选多肽的DNA内，即FACS可选多肽的翻译比靶多肽的翻译效率更低。为了实现降低的翻译效率，可将FACS可选多肽的AUG起始密码子改变为可替换的非AUG起始密码子，其实例包括但不限于：CUG、GUG、UUG、AUU、AUA或ACG。
因此，当使用可替换的非AUG起始密码子时，相对于共表达的靶多肽的表达，可减弱FACS可选多肽的表达。除了改变起始密码子之外，编码FACS可选多肽的DNA可在所有内部ATG三联体处被修饰以防止翻译的内部起始。在一些实施方案中，FACS可选多肽具有短氨基酸序列(<200个氨基酸)和少数(<10)ATG三联体。
在不希望被理论束缚的情况下，为了开始编码FACS可选多肽和靶多肽两者的mRNA的翻译，核糖体开始在mRNA的5'帽结构处进行扫描，大部分扫描经过可替代的起始密码子(例如UUG)，而是在下游AUG起始密码子处开始翻译。然而，翻译起始可以以非常低的频率在可替代的起始密码子处发生，从而表达低水平的FACS可选多肽。
为了制成生产者细胞，可使用任何合适的转移技术(例如通过转化、转染、电穿孔或转导)将重组多核苷酸***细胞中。在一些实施方案中，可使用用于将多核苷酸***细胞的载体。可使用的载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子和微染色体，其中质粒是典型的实施方案。一般地，这样的载体进一步包括与编码多顺反子mRNA的基因可操作地连接的信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、启动子和转录终止序列以促进表达。合适的DNA病毒载体的实例包括腺病毒(Ad)或腺相关病毒(AAV)。用于递送多核苷酸的基于腺病毒的载体是本领域已知的，并且可商业获得或通过标准分子生物学方法构建。腺病毒(Ad)是一组病毒，其包括50多种血清型。参见例如，国际PCT申请号WO 95/27071。用于本公开的其他病毒载体包括源自痘苗病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒(HSV))和逆转录病毒的载体。基因递送载体还包括几种非病毒载体，其包括DNA/脂质体复合物，和靶向的病毒蛋白-DNA复合物。
包含启动子和多核苷酸可以可操作地连接的克隆位点的载体是本领域已知的并且可从商业供应商处获得。这样的载体能够在体外或体内转录RNA，并且可从如AgilentTechnologies和Promega Corporation的来源商购。为了优化表达和/或体外转录，可需要去除、添加或改变5'和/或3'非翻译部分以消除额外的、潜在不合适的可替换的翻译起始密码子或可干扰或减少表达的其他序列，无论是在转录或翻译的水平。或者，可紧邻起始密码子的5'端***共有核糖体结合位点以增强表达。
还进一步公开了生产者细胞，其含有如本文所述的编码多顺反子mRNA的第一重组多核苷酸，并且进一步含有编码在第一或第二启动子元件的控制下的第二靶蛋白或多肽的第二重组多核苷酸。
可提供启动子用于在生产细胞中表达。启动子可以是组成型或诱导型。例如，启动子可以可操作地连接至编码多顺反子mRNA的核酸，从而其指导编码的多肽的表达。有多种适用于原核和真核宿主的启动子可用。原核启动子包括用于大肠杆菌的lac、tac、T3、T7启动子；3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶，例如烯醇化酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖6磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶和葡糖激酶。真核启动子包括诱导型酵母启动子，如醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白和负责氮代谢或麦芽糖/半乳糖利用的酶；RNA聚合酶II启动子包括病毒启动子如多瘤病毒、禽痘病毒和腺病毒(例如腺病毒2)、牛***瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒(特别是，即刻早期基因启动子)，逆转录病毒、乙型肝炎病毒、肌动蛋白、Rous肉瘤病毒(RSV)启动子和早期或晚期猿猴病毒40和非病毒启动子如EF-1α(Mizushima和Nagata(1990)Nucleic AcidsRes.18(17):5322)。本领域技术人员会能够选择用于表达靶多肽的合适启动子。
在适当的情况下，例如为了在高等真核生物的细胞中表达，可包括另外的增强子元件而不是或位于上述启动子中发现的那些。合适的哺乳动物增强子序列包括来自球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白、金属硫蛋白和胰岛素的增强子元件。或者，可使用来自真核细胞病毒的增强子元件如SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤增强子、杆状病毒增强子或鼠IgG2a基因座(参见WO 04/009823)。虽然这样的增强子经常位于启动子上游位点处的载体，但它们也可位于其他地方，例如在非翻译区内或聚腺苷酸化信号的下游。增强子的选择和定位可基于与用于表达的宿主细胞的相容性。
另外，载体(例如表达载体)可包含用于选择携带载体的宿主细胞的选择标记，并且在可复制载体的情况下，可包含复制的起点。编码赋予抗生素或药物抗性的产物的基因是常见的选择性标记，并且可用于原核(例如，f3-内酰胺酶基因(氨苄青霉素抗性)、tet基因(四环素抗性)和真核细胞(例如新霉素(G418或遗传霉素))、gpt(霉酚酸)、氨苄青霉素或潮霉素5抗性基因)。二氢叶酸还原酶(DHFR)基因允许在多种宿主中用甲氨喋呤或核苷酸缺陷型培养基进行选择。类似地，谷氨酰胺合成酶(GS)基因允许用甲硫氨酸砜亚胺选择。编码宿主营的养缺陷型标记的基因产物(例如LEU2、URA3、HIS3)的基因经常用作酵母中的选择标记。也涵盖使用病毒(例如杆状病毒)或噬菌体载体，和能够整合到宿主细胞的基因组中的载体，如逆转录病毒载体。
在真核***中，可将聚腺苷酸化和终止信号可操作地连接至编码如本文所述的多顺反子mRNA的多核苷酸。这样的信号通常放置在开放读码框的3'。在哺乳动物***中，聚腺苷酸化/终止信号的非限制性实例包括源自生长激素、延伸因子-1α和病毒(例如SV40)基因或逆转录病毒长末端重复的那些。在酵母***中，聚腺苷酸化/终止信号的非限制性实例包括源自磷酸甘油酸激酶(PGK)和醇脱氢酶1(ADH)基因的那些。在原核***中，聚腺苷酸化信号通常不是必需的，而是通常采用更短和更明确的终止子序列。聚腺苷酸化/终止序列的选择可基于与用于表达的宿主细胞的相容性。除上述之外，可用于增加产量/得率的其他特征包括染色质重塑元件、内含子和宿主细胞特异性密码子修饰。
可在旋转瓶、摇瓶、滚瓶、波反应器(例如来自wavebiotech.com的System1000)或中空纤维***中培养生产者细胞，或为了大规模生产，使用搅拌釜反应器或袋式反应器(例如Wave Biotech,Somerset,New Jersey USA)特别用于悬浮培养。搅拌釜反应器可适用于使用例如喷雾器、挡板或低剪切叶轮进行通气。对于气泡柱和气升式反应器，可使用空气或氧气泡直接通气。当宿主细胞在无血清培养基中培养时，培养基可补充有细胞保护剂如泊洛沙姆F-68以帮助防止通气过程导致的细胞损伤。取决于宿主细胞特征，微载体可用作锚定依赖性细胞系的生长基质，或细胞可适应悬浮培养。宿主细胞，特别是脊椎动物宿主细胞的培养可利用多种操作模式，如分批、补料分批、重复分批加工(参见Drapeau等(1994)Cytotechnology 15:103-109)，扩展分批处理或灌注培养。尽管重组转化的生产者细胞可在含血清培养基如包含胎牛血清(FCS)的培养基中培养，在一些实施方案中，这样的宿主细胞在无血清培养基，如在Keen等(1995)Cytotechnology 17:153-163中公开的，或可商购的培养基如ProCHO-CDM或UltraCHOTM(Cambrex NJ,USA)中培养，必要时补充能量源如葡萄糖和合成生长因子如重组胰岛素。宿主细胞的无血清培养可需要这些细胞适应在无血清条件下生长。一种适应手段是在含有血清的培养基中培养这样的宿主细胞，并重复交换80％的培养基用于无血清培养基，从而宿主细胞学习适应无血清条件(参见例如,Scharfenberg,K.等(1995)Animal Cell Technology:Developments Towards the 21st Century(Beuvery,E.C.等编),pp.619-623,Kluwer Academic publishers)。
根据所述实施方案的靶多肽可分泌到培养基中并使用多种技术从中回收和纯化，以提供适合于预期用途的纯化程度。例如，当与包含靶多肽的培养基相比时，使用靶多肽(例如抗体或Fc-融合蛋白)来治疗人受试者通常要求至少95％的纯度，如通过还原SDS-PAGE所确定的，更通常为98％或99％的纯度。首先，可使用离心除去培养基中的细胞碎片，随后使用例如微滤、超滤和/或深度过滤对上清液进行澄清步骤。或者，可通过微滤、超滤或深度过滤来收获靶多肽，而无需事先离心。多种其他技术如透析和凝胶电泳以及层析技术如羟磷灰石(HA)、亲和层析(任选地涉及亲和标记***如聚组氨酸)和/或疏水相互作用层析(HIC)(参见US 5,429,746)是可用的。在一个实施方案中，使用蛋白A或G亲和层析，然后进行进一步层析步骤如离子交换和/或HA层析、阴离子或阳离子交换、尺寸排阻层析法和硫酸铵沉淀法捕获多个澄清步骤后的靶多肽，如抗体或Fc-融合体。也可采用多种病毒去除步骤(例如，使用例如DV-20过滤器的纳米过滤)。在这些各种步骤之后，提供了包含至少10mg/ml或更多，例如100mg/ml或更多的本文所述的靶多肽的纯化制剂。
本公开的其它方面涉及表达可通过如本文所述的方法获得的FACS可选多肽和靶多肽的生产者细胞的克隆群体。在一些实施方案中，与(a)中生产者细胞的的异质群体的情况相比，克隆群体在靶多肽产生中得到3至30倍、5至30倍、5至20倍、3至20倍、5至10倍、3至10倍，或3至5倍改善(例如与生产者细胞的异质群体中靶多肽的平均产生相比，3至30倍、5至30倍、5至20倍、3至20倍、5至10倍、3至10倍、3至5倍或1.2至5倍改善)。
IV.FACS后增加细胞的存活力的方法
本公开的其它方面涉及在荧光激活的细胞分选(FACS)后增加细胞的存活力的方法。在一些实施方案中，该方法包括基于存活力标记使用第一轮的FACS从表达靶多肽的细胞的群体选择细胞的第一亚群，并且基于存活力标记使用第二轮的FACS选择从细胞的第一亚群选择细胞的第二亚群，其中第一轮和第二轮FACS在彼此的8小时内(例如8小时内、7小时内、6小时内、5小时内、4小时内、3小时内、2小时内，1小时内，或者60分钟内或30分钟内)发生。
在一些实施方案中，存活力标记是前向散射/侧向散射群体分化和/或碘化丙锭染色。
在一些实施方案中，与初始亚群分选后存活力相比，第二亚群具有1.2至4倍、2至4倍或3至4倍的分选后存活力改善。
在一些实施方案中，经受该方法的细胞的存活力大于75％、大于80％、大于85％或大于90％存活力(例如90％的细胞包含或显示进行该方法后的存活力标记)。
在任一方法的一些实施方案中，该方法进一步包括扩大第二亚群。在任一方法的一些实施方案中，该方法进一步包括单独培养来自第二亚群的细胞以生成一个或多个克隆群体。在一些实施方案中，在如本文所述的分批选择方法(见例如，上面的部分II)之后进行荧光激活的细胞分选(FACS)后增加细胞的存活力的方法。在一些实施方案中，细胞表达如本文所述的靶多肽和FACS可选标记。在一些实施方案中，该方法进一步包括分离靶多肽。
对于本领域技术人员来说会容易地显而易见的是，在不脱离本文公开的实施方案的范围的情况下，可使用合适的等同物对本文所述的方法做出其他合适的修改和适应。在详细描述了某些实施方案后，通过参考以下实施例会更清楚地理解它们，包括所述实施例仅用于说明目的，而非意欲为限制性的。
实施例
通过以下实施例进一步说明说明本发明，所述实施例不应理解为进一步限制性的。
实施例1：介绍FLARE技术
FLARE(流式细胞术减弱报道蛋白表达)是细胞系生成过程，先前用于1)细胞分选以分离克隆和2)克隆筛选(参见例如，Cairns,V.等(2011)Utilization of Non-AUGInitiation Codons in a Flow Cytometric Method for Efficient Selection ofRecombinant Cell Lines.Biotechnol Bioeng 108(11):2611-2622)。在FLARE***中，利用非ATG起始密码子的细胞表面报道基因开放读码框(ORF)紧邻位于编码感兴趣蛋白质(例如感兴趣的抗体或融合蛋白)ORF的基因的上游。两个ORF被转录为单一mRNA，但被独立地翻译(图1)。不希望被任何理论束缚，扫描核糖体以非常低的频率识别非AUG起始密码子(与AUG相比，UUG具有大约1％的起始能力)，而大多数核糖体继续扫描至感兴趣的蛋白质的最初AUG起始密码子。这导致细胞表面报道蛋白的低水平表达和感兴趣的蛋白质的相对高水平表达。含有2个ORF的双顺反子mRNA确保细胞表面报道蛋白表达成为感兴趣的蛋白质表达的预测。
通过流式细胞术评估用FLARE***表达感兴趣的蛋白质的细胞以确定成为感兴趣的蛋白质效价的预测的细胞表面报道基因(该实施例中为CD52)的水平。细胞用FITC抗-CD52单抗染色并在流式细胞仪上获得。感兴趣的蛋白质表达细胞会具有可在直方图叠加中可视化并以相对荧光单位(RFU，图2)测量的报道蛋白表达的水平。
FLARE***也可与细胞分选仪一起使用以鉴定和分离来自作为批量富集的汇集物收集的或以96孔板形式作为单个细胞铺板的不同表达群体的单个高表达细胞(图3和图4)。分选可在短时间内评估和收集数百万个细胞，使其成为极高通量的方法。可将分选富集的细胞作为分选后群体收集并评估富集度和存活力。
通过用FLARE分选生成的克隆得到一组克隆，其具有比限制稀释克隆(LimitingDilution Cloning)方法更大频率的高生产者。FLARE生成的克隆具有广泛的生产力，具有显示最稳固的报道蛋白表达的最高表达克隆(图5)。因此可使用FLARE***非常早地(在96孔板扩大阶段中)评估个体克隆以基于报道蛋白表达消除筛选步骤中的较低生产力的克隆。
实施例2：使用FLARE的快速批量分选
使用实施例1中讨论的FLARE技术，通过靶向具有高收集量(500,000-3,000,000个细胞)的大的最高百分比(前5-20％)的转染细胞来生成几种批量富集的细胞，用于快速扩大成更高的产生群体(图6)。这些较大的％种类(例如5％、10％)允许更多数量的富集的细胞被快速收集并扩大成健康群体，这继而可以用于产生或生成克隆。增加靶多肽的生产力的先前利用的方法依赖于使用连续增加量的甲氨喋呤(MTX)来选择表达高水平的DHFR的细胞(参见图6中的不太严格的过程或直接选择过程)。选择表达高水平的DHFR的细胞增加感兴趣的蛋白质也以高水平表达的可能性。不幸地，MTX选择是一个相当缓慢的过程，通常花费至少50天来生成以高水平表达感兴趣的蛋白质(图6，不太严格的过程或直接选择过程)的适用于生成克隆的汇集物。相反，通过利用FACS分选和FLARE***以及最小选择或不选择(参见图6中的EPIC过程、MTX独立(Indy)快速批量过程或快速批量过程)，可实现生成富集用于感兴趣的蛋白质的更高表达的细胞群体的更快和更有生产力的方法。这些富集的细胞群体可用于克隆生成以用于生物制剂的大规模制造并且还用于生物制剂的早期批量供应，例如对可能相关的临床候选物进行初步测试。
对于快速批量分选，如先前所述，通过用编码IgG重链或Fc-融合蛋白的pGZ729FLARE载体的电穿孔而转染无ADC的CHO 8D6DXB11亲本宿主细胞(Cairns,V.等(2011)Utilization of Non-AUG Initiation Codons in a Flow Cytometric Methodfor Efficient Selection of Recombinant Cell Lines.Biotechnol Bioeng 108(11):2611-2622)。每个FLARE载体包含由两个ORF上游的单个β-肌动蛋白启动子驱动的两个ORF和两个ORF下游的单个SV40聚腺苷酸化位点。在每个FLARE载体中，上游ORF编码具有UUG起始密码子的CD52报道基因。CD52报道基因通过修饰任何框架内的所有内部AUG起始密码子和CD52ORF内任何框架内的Kozak上下文内的所有内部非AUG起始密码子进一步优化。将CD52的AUG起始密码子用Kozak共有序列内的单个非AUG起始密码子(UUG)代替。下游ORF编码具有AUG起始密码子的IgG重链或sFc-融合蛋白。编码IgG重链的FLARE载体在CHO细胞中与编码IgG轻链的第二载体共转染以产生单克隆抗体(mAb)。每个FLARE载体进一步含有独立的二氢叶酸还原酶(DHFR)表达盒。在快速批量分选之前通过在5nM或50nM MTX中处理选择细胞群体，这消除了不表达DHFR或低水平表达DHFR的细胞。
下面显示了pGZ729FLARE载体骨架序列，然后是该序列的注释。
pGZ729表达载体的序列(SEQ ID NO:5)：
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pGZ729表达载体的元件(和核苷酸位置)：
核苷酸1-325-SV40早期启动子(用于DHFR转录)
核苷酸347-1089-二氢叶酸还原酶(DHFR)开放读码框
核苷酸1090-1934-SV40早期内含子和polyA
核苷酸2684-3366-大肠杆菌ColE1起点
核苷酸3464-4123-氨苄青霉素抗性基因
核苷酸4528-7539-仓鼠β-肌动蛋白启动子(用于感兴趣的基因的转录)
核苷酸7568-7753-CD52开放读码框(含TTG起始密码子)
核苷酸7781-7791-3个阅读框的每一个中的终止密码子
核苷酸7813-7872-多克隆位点(用于***具有ATG起始密码子的靶多肽)
核苷酸7882-8123-SV40早期polyA
如下进行快速批量分选，并在图7中示例说明：
1.鉴定了具有合适报道基因表达概貌的候选汇集物(预分选汇集物)
2.靶向预分选汇集物中的报道蛋白表达细胞的前％用于FACS收集(5-20％)
3.收集大量分选的细胞作为批量富集的群体(0.5-5.0x106个细胞)
4.将批量分选的汇集物迅速扩大成健康富集的群体(在小到1周内)
5.评价快速批量汇集物的生产力(相对于预分选汇集物的靶多肽效价增加)
在一组实验中，使用感兴趣的单克隆抗体(mAb)蛋白(mAb靶多肽)或感兴趣的Fc-融合蛋白(Fc-融合靶多肽)评价不同％报道蛋白截断值(通过FACS检测的)与靶多肽效价富集的水平的关系。尚不清楚是否靶向范围较广的具有较低报告基因表达的细胞(例如前5-20％)也会在所得群体中产生显著的富集。有可能的是，在分选富集后，较低生产细胞(其可具有比较高的生产细胞更快的生长速率)可超过汇集物中的群体动态并因此导致具有低于所希望生产力的汇集物。理论上是必须达到平衡：靶向足够大的百分比来快速收集许多细胞，但不能太大以捕获可能不利地影响富集程度的较低生产细胞。因此，这些实验的目标是理解针对不同分选百分比所达到的富集物水平之间的关系。结果显示，对报道蛋白表达细胞的前10％和前5％进行分选导致与高度严格的前1％分选的情况类似的生产力富集。具体而言，显示预分选汇集物的前10％、前5％和前1％中的每一个都能够产生汇集物，其具有为最初用低水平的MTX选择的预分选汇集物多至4倍高的靶多肽效价(图8和表1)。
表1：用于分选的不同％截断值对mAb靶多肽的效价
| 分选 | 分选的细胞的# | 扩大时间* | mAb的效价 |
| 预分选 | NA | NA | 104mg/L |
| 前10％ | 500,000个细胞 | 9天 | 397mg/L |
| 前5％ | 500,000个细胞 | 9天 | 415mg/L |
| 前1％ | 50,000个细胞 | 16天 | 335mg/L |
*从产生含有许多适于冷冻的细胞的细胞群体的时间开始，建立分批培养和/或重新分选(60-80x 106个细胞)
这些数据表明，大的前％靶标可以成功地分选，以在单一分选内收集大量细胞，用于快速扩大所得汇集物，这保持了非常高水平的富集。通过重复靶向收集的甚至更大量细胞(130万)的前10％的分选进一步证明了这种方法的速度，从中仅在7天成功扩大了更有生产力的汇集物(图8)。
这些快速批量分选实现了高水平的富集。快速批量分选仅产生100mg/L的mAb表达汇集物在小到7天内表现出汇集物生产力的4倍改善(图8，第二种前10％分选)。此外，以700mg/L表达Fc-融合蛋白的已经非常高生产力的汇集物在相同的时间范围内富集了20％(图8)。这些结果证明，用FLARE***的快速批量分选是1)可行的，2)快速的(仅限于可分选的细胞数量和分选后群体的恢复)，和3)高生产力。该快速批量分选也显示可与mAb和Fc融合蛋白一起工作，并且对于高和低生产力起子汇集物都是成功的。
从单轮批量分选中可见如此稳固的富集导致了是否根本上需要MTX，特别是如果MTX正在驱动(“扩增”)这些细胞中的表达或仅仅杀死低生产细胞的问题。据推测，如果MTX主要用于杀死较低产量的细胞，那么使用FLARE的快速批量分选富集可提供更有效(更快且至少与生产力相同)和更少侵入性的方法来增加细胞群体的生产力。换言之，生成一系列快速批量汇集物的顺序分选可为一种独立于MTX在汇集物中驱动表达的运载体。该顺序分选可使用以下方法，其在图9中示例：
1.通过用低水平(5nM)MTX转染和选择生成预分选的起子汇集物(也可使用单独的核苷酸缺陷培养基(0nM MTX)完成选择)
2.快速批量分选(前10％)以生成具有增强的表达的稳定汇集物
3.重复(按顺序)快速批量分选(前10％)，以生成具有进一步增强表达的另外的稳定汇集物
这有效地创造了一种顺序的分选方法，其集中于从不同的群体中分离出低频率、高产的细胞。这会基本代替MTX的作用，以使用FLARE***用细胞分选来消除低产细胞(通过细胞死亡)来选择性地忽略低产细胞并且仅分离高生产者以用于持续生长(即高生产者的细胞群体的富集)。
建立概念验证实验以使用三个5nM MTX汇集物(每个表达不同的分子(mAb#1，mAb#3和sFc融合#2))来测试该顺序快速批量分选方法。快速批量分选每个汇集物，靶向前10％，并在9-12天内扩大，然后再次快速批量分选(顺序的)，靶向前10％，并迅速扩大。将所得汇集物建立在分批培养物中以评估靶多肽的效价。图10显示了相对于起始5nM汇集物，每种分选富集的汇集物的报道基因表达(流式细胞术直方图叠加)和靶多肽效价。数据显示可能通过重复快速批量分选顺序富集表达。
为了能够与用于生成高产汇集物的“传统”MTX选择程序进行比较，每个起始5nM汇集物也经受另外两轮的MTX选择(50nM和250nM；图11和15)。如图11和15所示，不仅顺序快速批量分选比50nM和250nM MTX选择均实现靶多肽的显著更好效价，而且生成每个快速批量分选(除mAb#3RB#1之外)均比每个对应轮的MTX扩增快2-3倍。
相对于MTX选择的改善的显著程度是出乎意料的，并且再次表明MTX对于扩增表达不如先前认为的那样至关重要。据推测，由于其显著富集的基因表达，顺序分选的快速批量富集群体可受较高MTX浓度影响较小。为了测试这一点，将每个快速批量汇集物接种到具有50nM MTX的生长培养基中，并将培养物存活力与接种到相同50nM MTX培养基中的起始5nMMTX汇集物的存活力比较。结果如图12-14所示。
尽管据推测快速批量汇集物对50nM MTX会有一些抗性，但是sFc融合#2和mAb#3的快速批量汇集物显示几乎没有50nM MTX的影响(图12和14)。对于mAb#1，第一快速批量汇集物在存活力方面与5nM MTX初始汇集物类似地下降，但早于5nM汇集物开始恢复，并且第二快速批量汇集物在存活力方面下降，但与5nM MTX汇集物相比(图13)，受50nM MTX的影响明显较小。这些结果强有力的证明不需要MTX扩增以扩增汇集物表达，并且可能其作用仅仅是杀死较低生产的细胞。
从MTX扩增的汇集物(5nM和50从nM MTX)和表达mAb#1的快速批量汇集物(RB#1和RB#2)生成克隆以相对评价生产力。如前所述使用FLARE生成克隆(参见例如，Cairns,V.等(2011)Utilization of Non-AUG Initiation Codons in a Flow Cytometric Methodfor Efficient Selection of Recombinant Cell Lines.Biotechnol Bioeng 108(11):2611-2622)。简言之，使用FACS从每个汇集物使用FLARE分离并且单细胞铺板前1-3％的报道蛋白表达细胞。然后再次使用FLARE筛选扩大的克隆(取前25-30％的阳性表达者)，以仅鉴定最高级别克隆以扩大靶多肽效价评价。如图22所示，从表达mAb#1的RB#1和RB#2汇集物中快速批量分选生成克隆，其与从5nM和50nM MTX扩增的汇集物两者生成的克隆相当。RB#1和RB#2的最高快速批量克隆效价分别达到1.4g/L和1.6g/L。5nM和50nM的最大MTX扩增克隆效价分别达到1.2g/L和1.9g/L。尽管在50nM MTX生成的克隆中最高生产者的最高克隆表现和频率稍高，据信，快速批量生成的克隆可在稳定性研究中表现出更稳固的特征，因为在克隆过程中使用的MTX浓度低10倍并被除去。
总之，显示来自5nM MTX汇集物的顺序快速批量分选为使用MTX的直接选择过程的可行替代方案。顺序快速批量分选显示更快(时间线差异高达2-3周)，使用更少的MTX(潜在导致更稳固和更稳定的克隆)，更有生产力(实现了靶多肽的明显更好汇集物效价)，并对于3种不同的靶多肽(2种不同的mAb和Fc融合蛋白)起作用。
实施例3：完全MTX独立顺序快速批量分选
接下来，测试了完全MTX独立快速批量方法。测试起子汇集物表达Fc融合蛋白(sFcF#2)。通过用补充有谷氨酰胺(即0nM MTX)的核苷酸缺陷型培养基(CD CHO Medium，Gibco，Life Technologies，目录号10743)对转染细胞进行21天初始选择来建立两个起子汇集物。在该过程中，将稳定转染的细胞置于核苷酸缺陷型培养基中用于DHFR表达盒的较低严格选择。没有MTX的核苷酸缺陷型初始选择通常在略短的时间范围内得到较低的表达汇集物(通常这在标准MTX表达平台中不是优选的，因为它生成较高百分比的较低表达细胞，其最终需要在MTX扩增的以后几轮中被杀死)。
对于第一分选，将0nM MTX汇集物快速批量分选(前10％)，并将3-4x 106个细胞作为快速批量#1收集。允许快速批量#1的细胞群体扩大8天，然后将其如下所述重新分选，并设立为靶多肽效价评价和用于报道基因表达的FACS分析的分批培养物。对于第二分选，扩大的快速批量#1汇集物被快速批量分选(前10％)，并收集3-4x 106个细胞作为快速批量#2。允许快速批量#2的细胞群体扩大8天，然后将其设立为靶多肽效价评价和用于报道基因表达的FACS分析的分批培养物。对第二0nM MTX汇集物进行该过程，产生两个独立的快速批量1#和#2群体。
如图16和17所示，与预分选0nM MTX汇集物的0.17g/L生产力相比，在用核苷酸缺陷型培养基(0nM MTX)选择后进行的2轮快速批量分选在仅16天内生成了产生0.51g/L和0.64g/L(在未补料分批培养物中)的汇集物。为了将这些结果与MTX选择一起放入上下文，使用标准扩增范式(0nM MTX，接着是20nM MTX，然后是100nM MTX)，这些相同的两个0nMMTX汇集物也分别进行MTX扩增。这两个汇集物花费21天来完成20nM MTX选择，而仅在靶多肽效价中得到适度增加至刚超过0.2g/L(图17)。当进一步扩增至100nM MTX时，花费另外23天进行选择，一个汇集物的表达下降，另一个汇集物的生产力仅增加至0.31g/L(图17)。换言之，MTX选择的汇集物的生产力甚至没有超过从相应起始汇集物生成的第一快速批量汇集物。
在这点上，数据显示出，使用该新的方法可以生成高产量的汇集物，这也可以用于临床蛋白生物制品开发早期的材料产生。接下来的问题是这些汇集物可能生成的克隆是否会胜过MTX生成的克隆。为了测试这个，选择最好的MTX独立汇集物和两个最好的MTX选择汇集物来生成克隆(在图17中通过星号表示汇集物)。如前所述使用FLARE生成克隆(见例如，Cairns,V.等(2011)Utilization of Non-AUG Initiation Codons in a FlowCytometric Method for Efficient Selection of Recombinant CellLines.Biotechnol Bioeng108(11):2611-2622)。简言之，使用FACS从每个汇集物使用FLARE分离并且单细胞铺板前1％的报道基因表达细胞。然后再次使用FLARE筛选扩大克隆以仅鉴定最高级别克隆来扩大用于靶多肽效价评价。如图18和19所示，MTX独立克隆在未补料分批中得到多达2.3g/L。图18还显示在MTX独立分选中克隆效率和克隆存活率更高。
总之，这些结果显示出，完全MTX独立快速批量法是MTX直接选择的非常有吸引力的替代方案。完全MTX独立快速批量方法更快(时间节省高达4周，在分选前不需要MTX撤药)，无需使用MTX进行，并且更高生产力(与MTX汇集物相比，汇集物效价更高，以及与MTX选择的克隆相当或稍好的高效价克隆)。
药物独立细胞系生成***有许多影响。首先，考虑到MTX在一些CHO系中驱动DHFR表达所需的长期接受的教条，这些结果是令人惊奇的。其次，如果使用FLARE的分批分选富集可以避开罕见、低频率、高表达细胞，同时绕过药物选择***如MTX/DHFR，预期该方法也可用于其他药物可选***，如MSX/GS***。第三，假设从FLARE表达盒去除DHFR可允许真正独立于与细胞存活能力相关的可选标记。从药物选择***获得这种水平的独立性也可从CHO细胞中完全释放表达***，并开启动物宿主细胞的更广泛的工具箱。
实施例4：细胞的早期转染后分离(EPIC)
接下来，探索了一种分选方法的可行性，其目的是在选择之前靶向未经选择的转染的早期表达群体进行富集。分选的这种方法称为“短分选”或EPIC(细胞的早期转染后分离)，并设计成在转染后不久立即分选分离或批量富集早期报道基因表达。EPIC可显著减少选择时间线和/或改善所得异质群体的生产力。
已经进行了实验以研究在核苷酸缺陷选择过程的整个过程中转染群体的报道基因表达谱。图29描绘了EPIC的一般方案。图20显示了在核苷酸缺陷选择过程期间报道基因的明显早期表达。这些偏移量直方图证明早期表达(例如3-4天)是阳性的和可分选的；使得分离转染细胞的亚群用于EPIC过程可行。
如图29所示，EPIC可通过转染群体并允许早期表达发展来实施，其可使用流式细胞术分选靶向以分离。然后可将这些分选分离的早期表达群体置于选择培养基中以建立稳定的表达汇集物。在选择之前分离这些转染后早期表达群体产生相对于单独的标准转染/选择方法改善的生产力。
为了证明检测到CD52信号实际上是CD52报道蛋白表达的早期表达的概念的证据，构建并转染了表达RFP和CD52两者的载体(pGZ729-RFP)和仅表达RFP的载体(pGZ700-RFP)以进行早期表达评价。如图23所示，用pGZ729-RFP转染的CHO细胞产生CD52和RFP两者的早期表达，其在第2天和第3天左右达到峰值，信号劣化到转染后第7天。因此，在这些日子或附近靶向的EPIC适合分离转染的宿主细胞的早期表达亚群。为了证明这些低强度信号实际上是CD52表达，分析了用pGZ729-RFP或pGZ700-RFP转染的CHO细胞的RFP和CD52表达。如图24所示，用pGZ729-RFP转染的CHO细胞和用pGZ700-RFP转染的CHO细胞稳固表达RFP(分别为左上方和左下方)，而用pGZ729-RFP转染的CHO细胞具有中度表达的CD52(右上方)，用pGZ700-RFP转染的CHO细胞基本上不表达可检测的CD52(右下方)。这些数据支持以下观念：这些相对较低程度的荧光强度信号事实上是来自可替换的开始表达盒的CD52表达，并且是分选分离(EPIC)的合适靶标。作为原理的进一步证据，使用pGZ729-RFP靶向早期RFP表达用于来自转染群体的EPIC，然后生成稳定的汇集物。在转染后两天(峰值瞬变(peak transience))，靶向早期RFP表达用于分选分离和收集。然后经由在0nM MTX核苷酸缺陷型培养基中的选择使用EPIC生成的RFP阳性亚群建立稳定的汇集物。还生成了标准转染/选择汇集物用作比较对照。如图28所示，与单独传统的转染/选择方法(0nM汇集物)相比，EPIC生成的汇集物(其靶向早期RFP表达)得到了具有更高的RFP和CD52报道蛋白表达的稳定汇集物(EPIC汇集物)。结果证明了支持EPIC生成的汇集物比传统的转染/选择方法更有生产力的原理的FLARE独立证据。
EPIC最初尝试使用mAb#1，其中转染CHO细胞并给予2天恢复，之后开始0nM MTX选择以建立早期表达。转染四天后，靶向CD52细胞表面报道蛋白的早期表达用于分选分离(EPIC)。分选仅靶向阳性表达，其收集为约1百万个细胞的批量富集的群体，然后允许其在核苷酸缺陷型培养基(0nM MTX)中继续选择。作为对照，允许未分选的转染经由标准选择程序继续选择。如图25所示，与第8天的标准选择相比，EPIC分选得到了稍微富集的群体，如报道蛋白表达所示。然而，随着两个群体的选择继续，令人惊讶的是观察此小EPIC亚群随时间如何变得更加突出。事实上，在选择完成时，阴性亚群几乎都被消除了。相比之下，标准选择方法证明了历史上典型的报道蛋白表达的轻微改善。EPIC分选或分离早期表达，得到了阳性表达的亚群，其具有超过较少表达细胞的优选的存活力，继而得到更有生产力的稳定汇集物。
EPIC和标准选择汇集物均用于建立未补料分批培养物以确定mAb#1效价。如图25和26所示，生成汇集物的EPIC产生了502mg/L的效价，远远超过了由快速批量或MTX扩增产生的任何汇集物，再次在整个过程中没有使用MTX。相比之下，通过标准选择生成的汇集物产生了150mg/L的效价，其比EPIC生产的汇集物低3倍。
然而，这些初始EPIC分类花费35天，转染/分离/选择)以实现完成稳定汇集物，这与收集的少量分选细胞(100万)直接相关，然后该分选细胞不得不经受扩增和选择成稳定的群体。可通过简单地收集更多细胞和/或靶向更纯的分选而大大减少这样的时间线。许多分选的细胞具有高水平的杂质(极少至没有表达的细胞)，并且不得不被选出(杀死)，延长选择/扩增时间。
如前所述，接下来使用FLARE将该EPIC生成的汇集物用于再次生成克隆(参见例如，Cairns,V.等(2011)Utilization of Non-AUG Initiation Codons in a FlowCytometric Method for Efficient Selection of Recombinant CellLines.Biotechnol Bioeng 108(11):2611-2622)。简言之，使用FACS从每个汇集物将FLARE用于分离并且单细胞铺板前3-5％的报道蛋白表达细胞。然后再次使用FLARE筛选扩大的克隆(取前30％阳性表达者)，以仅鉴定最高级别克隆以扩大用于靶多肽效价评估。如图27所示，最高表达EPIC生成的克隆实现与来自传统方法(例如使用MTX扩增)的最高表达克隆的效价相似的效价(接近2.0g/L)。结果证明使用EPIC在选择之前分离早期表达群体是传统转染和选择方法的可行替代方案。EPIC提供MTX独立的方法以实现与来自传统MTX方法的那些克隆效价类似的克隆效价，产生潜在更稳固和稳定的克隆。在EPIC生成的群体的选择/扩大过程中，EPIC也可顺从MTX的引入，这保留了在这些富集的群体中驱动更高表达的可能。
实施例5：立即重复分选用于存活力获得
经常观察到，通过分选收集的CHO细胞作为批量分选后群体具有差的细胞存活力。通过立即重新分析等分的分选后群体来确定该存活力。使用两种不同的CHO宿主细胞系使用两种不同的细胞分选仪观察到低分选后存活力。试图在细胞分选程序中优化不同的参数和条件，以在一致的基础上实现更高的分选后细胞存活力。在该工作中，令人惊讶地观察到，立即重分选的分选的细胞具有显著改善的分选后存活力(与第一次分选后约47％存活力相比，重新分选后约83％存活力，图4和21)。使用具有活门(live gates)的FLARE以高报道蛋白表达细胞发现了该现象，但独立于报道蛋白***。通过显示仅基于活门的分选的细胞经由立即重复分选显示出改善的存活力而证实了这种独立性。这在生成无FLARE的mAb产生亚克隆的两个独立的实验中得到证实(细胞不表达报道蛋白)。
该过程(立即重复分选)起作用在显著程度上以改善分选后的细胞存活力。此外，如表2所示，这是使用较新型分选仪(BD InfluxTM)以及较旧型号分选仪(FACS Aria)观察到的高度可重复的结果。该结果以几种蛋白质表达(mAb和Fc融合蛋白)细胞显示，包括具有FLARE***的那些和不具有FLARE***的那些细胞。使用该立即重复分选方法在通过分选收集的细胞群体中得到改善的存活力，当将分选的细胞铺板在孔板中用于克隆生成时，预期将其转化为改善的克隆功效。
表2：不同蛋白质表达细胞的立即重复分选存活力
Claims (32)
1.一种荧光激活的细胞分选(FACS)以分批选择表达靶多肽的生产者细胞而不使用甲氨喋呤(MTX)作为扩增剂的方法，所述方法包括：
(a)提供生产者细胞的异质群体，其中所述群体中的所述生产者细胞表达不同水平的由相同多顺反子mRNA编码的FACS可选多肽和靶多肽，
(b)使用FACS从所述生产者细胞的异质群体选择生产者细胞的第一异质亚群，其中，所述第一异质亚群中的所述生产者细胞以高于(a)中所述异质群体中的所述生产者细胞的至少80％的水平的水平表达FACS可选多肽，和
(c)在无药物选择培养基中扩大所述生产者细胞的第一异质亚群，由此产生生产者细胞的扩大的第一异质亚群。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：
(d)使用FACS从步骤(c)中的所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群选择生产者细胞的第二异质亚群，其中所述第二异质亚群中的所述生产者细胞以高于(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群中的所述生产者细胞的至少80％的水平的水平表达FACS可选多肽，和
(e)在无药物选择培养基中扩大所述生产者细胞的第二异质亚群，由此产生生产者细胞的扩大的第二异质亚群。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括从生产者细胞的所述扩大的第一或第二异质亚群分离所述靶多肽。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括从生产者细胞的所述扩大的第一或第二异质亚群分离一个或多个单个生产者细胞，并且单独地培养所述一个或多个单个生产者细胞以产生所述一个或多个单个生产者细胞的克隆群体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，与(a)中所述生产者细胞的异质群体的情况相比，所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群在所述靶多肽产生中得到1.2至5倍改善。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，与(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群的情况相比，所述生产者细胞的扩大的第二异质亚群在所述靶多肽产生中得到1.2至2.5倍改善。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中，与(a)中所述生产者细胞的异质群体的情况相比，所述一个或多个单个生产者细胞的至少一个克隆群体在所述靶多肽产生中得到5至30倍改善。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，在(b)中经受FACS的所述生产者细胞的异质群体含有80-120x 106个细胞。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)或(e)中的扩大之前，所述生产者细胞的第一和/或第二异质亚群含有0.5-6.0x 106个细胞。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，步骤c)中的所述扩大进行7-14天。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，步骤e)中的所述扩大进行7-14天。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述无药物选择培养基为无甲氨喋呤培养基或无甲硫氨酸砜亚胺(methionine sulphoximine)培养基。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，通过用编码所述多顺反子mRNA的载体转染细胞和使转染的细胞经受一轮基于培养基的选择以选择表达不同水平的所述多顺反子mRNA的细胞来产生(a)中所述生产者细胞的异质群体。
14.根据权利要去13所述的方法，其中，所述载体进一步含有二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。
15.根据权利要去14所述的方法，其中，所述基于培养基的选择为含有甲氨喋呤的培养基或核苷酸缺乏培养基。
16.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，通过用编码所述多顺反子mRNA的载体转染细胞和使所述转染的细胞经受FACS以选择表达不同水平的所述多顺反子mRNA的细胞来产生(a)中所述生产者细胞的异质群体。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，所述多顺反子mRNA包含编码所述FACS可选多肽的第一开放读码框(ORF)，和编码所述靶多肽的第二ORF，其中，所述第一ORF位于所述第二ORF的5’。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述第一ORF具有非AUG起始密码子。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述第二ORF具有AUG起始密码子。
20.根据权利要求18所述的方法，其中，所述非AUG起始密码子为Kozak共有序列中的UUG、GUG或CUG。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中，编码所述FACS可选多肽的ORF没有任何AUG序列。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中，所述FACS可选多肽为CD52或CD59。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中，所述靶多肽为治疗剂。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中，所述靶多肽为分泌蛋白。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中，所述靶多肽为抗体或Fc融合蛋白。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中，所述生产者细胞为CHO细胞、HEK293细胞或HeLa细胞。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中，所述步骤(b)中的选择在用编码所述多顺反子mRNA的载体转染所述生产者细胞的异质群体后2-15天进行。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述步骤(b)中的选择在转染后2-10天、2-6天、2-4天进行。
29.根据权利要求27所述的方法，其中，所述步骤(b)中的选择在转染后2天进行。
30.根据权利要求27所述的方法，其中，所述步骤(b)中的选择在转染后3天进行。
31.一种荧光激活的细胞分选(FACS)以分批选择表达sFc融合多肽的生产者细胞的方法，所述方法包括：
(a)提供生产者细胞的异质群体，其中，所述群体中的所述生产者细胞表达不同水平的由相同多顺反子mRNA编码的FACS可选CD52多肽和所述sFc融合多肽，
(b)使用FACS从所述生产者细胞的异质群体选择生产者细胞的第一异质亚群，其中，所述第一异质亚群中的所述生产者细胞以高于(a)中所述异质群体中的所述生产者细胞的90％的水平的水平表达所述CD52多肽，
(c)在无药物选择培养基中扩大3-4x 106个生产者细胞的第一异质亚群8天，由此产生生产者细胞的扩大的第一异质亚群，
(d)使用FACS从(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群选择生产者细胞的第二异质亚群，其中，所述第二亚群中的所述生产者细胞以高于(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群中的所述生产者细胞的至少90％的水平的水平表达所述FACS可选多肽，和
(e)在无药物选择培养基中扩大3-4x 106个生产者细胞的第二异质亚群8天，由此产生生产者细胞的扩大的第二异质亚群，
其中，通过用编码所述多顺反子mRNA的载体转染细胞和使转染的细胞经受一轮基于培养基的选择以选择表达不同水平的所述多顺反子mRNA的细胞来产生(a)中所述生产者细胞的异质群体，
其中，所述基于培养基的选择为补充有谷氨酰胺和0nM甲氨喋呤的核苷酸缺乏培养基，
其中，所述多顺反子mRNA包含编码所述CD52多肽的第一开放读码框(ORF)和编码所述sFc融合多肽的第二ORF，其中，所述第一ORF位于所述第二ORF的5’，
其中，所述第一ORF具有UUG起始密码子，
其中，所述第二ORF具有AUG起始密码子，
其中，所述第一ORF没有任何AUG序列，
并且其中，所述多顺反子mRNA在表达载体中，所述表达载体进一步包含二氢叶酸还原酶(DHFR)盒。
32.一种荧光激活的细胞分选(FACS)以分批选择表达sFc融合多肽的生产者细胞的方法，所述方法包括：
(a)提供生产者细胞的异质群体，其中，所述群体中的所述生产者细胞表达不同水平的由相同多顺反子mRNA编码的FACS可选CD52多肽和所述sFc融合多肽，
(b)使用FACS从所述生产者细胞的异质群体选择生产者细胞的第一异质亚群，其中，所述第一异质亚群中的所述生产者细胞以高于(a)中所述异质群体中的所述生产者细胞的90％的水平的水平表达所述CD52多肽，
(c)在无药物选择培养基中扩大3-4x 106个生产者细胞的第一异质亚群8天，由此产生生产者细胞的扩大的第一异质亚群，
(d)使用FACS从(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群选择生产者细胞的第二异质亚群，其中，所述第二亚群中的所述生产者细胞以高于(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群中的所述生产者细胞的至少90％的水平的水平表达所述FACS可选多肽，
(e)在无药物选择培养基中扩大3-4x 106个生产者细胞的第二异质亚群8天，由此产生生产者细胞的扩大的第二异质亚群，和
(f)从所述扩大的第一或第二异质亚群分离单个生产者细胞，并单独地培养所述单个生产者细胞以产生所述单个生产者细胞的克隆群体，其中，所述分离的单个生产者细胞以高于单个生产者细胞的99％的水平的水平表达所述FACS可选多肽，
其中，通过用编码所述多顺反子mRNA的载体转染细胞和使转染的细胞经受一轮基于培养基的选择以选择表达不同水平的所述多顺反子mRNA的细胞来产生(a)中所述生产者细胞的异质群体，
其中，所述基于培养基的选择为补充有谷氨酰胺和0nM甲氨喋呤的核苷酸缺乏培养基，
其中，所述多顺反子mRNA包含编码所述CD52多肽的第一开放读码框(ORF)和编码所述sFc融合多肽的第二ORF，其中，所述第一ORF位于所述第二ORF的5’，
其中，所述第一ORF具有UUG起始密码子，
其中，所述第二ORF具有AUG起始密码子，
其中，所述第一ORF没有任何AUG序列，
并且其中，所述多顺反子mRNA在表达载体中，所述表达载体进一步包含二氢叶酸还原酶(DHFR)盒。
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