CN108362811A - 青蒿中有效成分的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于将超高效液相色谱和质谱结合起来测试或分析材料技术领域，具体涉及一种青蒿中有效成分的检测方法。所述检测方法包括以下步骤：将样品破碎、过筛，然后进行超声萃取，接着用超高效液相色谱进行梯度洗脱，再用质谱法检出，用峰面积外标法定量检测。该方法能够同时检测青蒿药材中青蒿素、青蒿酸、青蒿乙素、双氢青蒿素、山奈酚、木犀草素和槲皮素的含量，其检测时间短，灵敏度高，专属性强，准确度高，线性关系良好，精密度高，稳定性强，重复性好。

Description

青蒿中有效成分的检测方法

技术领域

本发明属于将超高效液相色谱和质谱结合起来测试或分析材料技术领域，具 体涉及一种青蒿中有效成分的检测方法。

背景技术

青蒿为菊科一年生草本植物黄花蒿(Artemisia annua L.)的干燥地上部分，其性苦、辛寒，具有清透虚热、凉血除蒸、解暑、截疟等功效(中华人民共和国药 典(一部))，国家药典委员会编，北京：中国医药科技出版社，2015年第198 页，公开日2015年12月31日)。青蒿分布广泛，重庆、四川、贵州、广西、广 东、江西、湖北、湖南、江苏、河北、河南、山东和陕西等地区均有分布(“青 蒿适生地分析评价方法探讨”，刘峻明等，中国农业资源与区划，2006年第27 卷第4期，第14-17页，公开日2006年08月31日)。其中，重庆拥有优质的青 蒿种质资源(“不同产地的青蒿药用成分含量研究”，张雪等，中国药房，2009年 第20卷第15期，第1188-1191页，公开日2009年12月31日)，为全国最大的 青蒿种植基地。

除青蒿素外，青蒿药材中还含有青蒿酸、青蒿乙素和以山奈酚、木犀草素、 槲皮素为代表的黄酮类化合物，这些成分协同青蒿素对疟疾具有治疗作用(“青 蒿化学成份及其与青蒿素伍用对鼠疟的药效学研究”，纪晓光等，寄生虫与医学 昆虫学报，2008年第15卷第4期，第198-201页，公开日2008年12月31日)。 研究还表明，双氢青蒿素对人肺腺癌A549细胞在体内外均有生长抑制作用(“双 氢青蒿素抗人肺腺癌A549细胞生长的实验研究”，陈卫强等，中国肺病杂志， 2005年第8卷第2期，第85-88页，公开日2005年04月30日)。目前，青蒿药 材的质量研究主要以青蒿素、青蒿酸、青蒿乙素为含测指标，双氢青蒿素、山奈 酚、木犀草素、槲皮素等化合物的研究较少，分析方法包括柱前衍生-高效液相 色谱法(英文简称柱前衍生-HPLC)、高效液相色谱-紫外联用法(英文简称 HPLC-UV)、高效液相色谱-蒸发光散射检测器联用法(英文简称HPLC-ELSD) 和高效液相色谱-紫外-蒸发光散射检测器法(英文简称HPLC-UV-ELSD)(“柱前 衍生-RP-HPLC法测定青蒿中青蒿素的含量”，刘丽芳等，中国野生植物资源，2004年第23卷第6期，第60-62页，公开日2004年12月31日；“UV法与HPLC 法测定青蒿中青蒿素含量的方法比较”，丁小莉等，中国药房，2011年第22卷 第3期，第246-248页，公开日2011年12月31日；“HPLC-ELSD测定不同产 地青蒿中青蒿素的含量”，胡向荣等，现代食品与药品杂志，2006年第16卷第3 期，第34-36页，公开日2006年12月31日；“HPLC-UV-ELSD法同时测定青 蒿中青蒿素、青蒿乙素和青蒿酸的含量”，张东等，药学学报，2007年第42卷 第9期，第978-981页，公开日2007年12月31日)。其中，柱前衍生-HPLC和 HPLC-UV不能同时测定青蒿素、青蒿酸、青蒿乙素、双氢青蒿素、山奈酚、木 犀草素和槲皮素的含量；HPLC-ELSD和HPLC-UV-ELSD的检测时间长，需要 30-60min，灵敏度低，含量在十万分之一以下的成分检测不出。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种青蒿中有效成分的检测方法，该方 法能够同时检测青蒿药材中青蒿素、青蒿酸、青蒿乙素、双氢青蒿素、山奈酚、 木犀草素和槲皮素的含量，检测时间短，15min内即可检测出含量，灵敏度高， 能够检测出含量在十万分之一以下的成分。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

青蒿中有效成分的检测方法，包括以下步骤：将样品破碎、过筛，然后进行 超声萃取，接着用超高效液相色谱进行梯度洗脱，再用质谱法检出，用峰面积外 标法定量检测。

进一步，所述过筛是指过《中华人民共和国药典》2015年版5号筛。

进一步，所述超声萃取的溶剂为石油醚与丙酮的组合物。

所述石油醚为沸点为60-90℃的石油醚。

进一步，所述超声萃取的溶剂为石油醚与丙酮按照体积比为0.8-1.1∶0.8-1.1 的组合物。

进一步，所述超声萃取的溶剂的用量为样品质量的33-37倍。

进一步，所述超声萃取的参数设置为：萃取功率为280-330W，时间为 40-50min。

进一步，所述超高效液相色谱的色谱条件为，

色谱柱：超高效液相色谱；流动相：流动相A与流动相B按照体积比为 90∶10-10∶90的混合溶液，所述流动相A为乙腈，所述流动相B为体积分数为0.1％ 的乙酸溶液；

梯度洗脱；

流速：0.1-0.4mL/min；柱温：20-35℃；

进样量：2μL。

进一步，所述梯度洗脱的具体过程为，洗脱时间及流动相A体积比顺序为 0-1min10％运行，1-6min从10％→85％，6-13min再以85％运行，13-14min， 再从85％→10％，14-15min，以10％运行。

进一步，所述质谱条件为：电喷雾离子源，采用正离子和负离子模式检测； 多重反应监测模式，离子源温度：550℃。

该方法能够同时检测青蒿药材中青蒿素、青蒿酸、青蒿乙素、双氢青蒿素、 山奈酚、木犀草素和槲皮素的含量，检测时间短，15min内即可检测出含量，灵 敏度高，能够检测出含量在十万分之一以下的成分。

说明书附图

图1为实施例2中青蒿素对照溶液色谱图和青蒿素样品溶液色谱图，其中， A为青蒿素对照溶液色谱图，B为青蒿素样品溶液色谱图；

图2为实施例2中青蒿酸对照溶液色谱图和青蒿酸样品溶液色谱图，其中， A为青蒿酸对照溶液色谱图，B为青蒿酸样品溶液色谱图；

图3为实施例2中青蒿乙素对照溶液色谱图和青蒿乙素样品溶液色谱图，其 中，A为青蒿乙素对照溶液色谱图，B为青蒿乙素样品溶液色谱图；

图4为实施例2中双氢青蒿素对照溶液色谱图和双氢青蒿素样品溶液色谱图， 其中，A为双氢青蒿素对照溶液色谱图，B为双氢青蒿素样品溶液色谱图；

图5为实施例2中山奈酚对照溶液色谱图和山奈酚样品溶液色谱图，其中， A为山奈酚对照溶液色谱图，B为山奈酚样品溶液色谱图；

图6为实施例2中木犀草素对照溶液色谱图和木犀草素样品溶液色谱图，其 中，A为木犀草素对照溶液色谱图，B为木犀草素样品溶液色谱图；

图7为实施例2中槲皮素对照溶液色谱图和槲皮素样品溶液色谱图，其中， A为槲皮素对照溶液色谱图，B为槲皮素样品溶液色谱图。

本发明的有益效果在于：

该方法能够同时检测青蒿药材中青蒿素、青蒿酸、青蒿乙素、双氢青蒿素、 山奈酚、木犀草素和槲皮素的含量。

该方法的检测时间短，15min内即可检测出含量。

该方法的灵敏度高，能够检测出含量在十万分之一以下的成分。

该方法的专属性强。

该方法的准确度高，加速回收试验的相对标准偏差为1.84％-3.03％。

该方法的线性关系良好，线性系数高达99.78％-99.99％。

该方法的精密度高，相对标准偏差为0.99％-2.37％。

该方法的稳定性强，稳定性测试的相对标准偏差为1.39％-2.47％。

该方法的重复性好，重复性测试的相对标准偏差为1.47％-2.50％。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内 容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案 进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

以下青蒿样品采集于重庆市青蒿规范化种植基地；青蒿素对照品、青蒿酸对 照品、双氢青蒿素对照品、山奈酚对照品、木犀草素对照品和槲皮素对照品购自 成都曼斯特生物科技有限公司，生产批号分别为MUST-13060203、13011614、 13101302、13121112、13121011和13072505)，青蒿乙素对照品购自四川省维克 奇生物科技有限公司，生产批号为120915；水为去离子水，丙酮和石油醚均为 分析纯，甲醇和乙腈均为色谱纯；

以下所述“称取”所用仪器为日本岛津公司的AW-220型电子天平，“精密 称取”所用仪器为日本岛津公司的AEG-45SM型电子天平；超声提取所用仪器 为昆山市超声仪器有限公司的KQ-250B型超声波清洗机；超高效液相色谱仪为 日本岛津公司的LC-30AT型高效液相仪；质谱法所用质谱仪器为美国应用生物 ***公司的Triple T of 4600高分辨率质谱***。

实施例1青蒿中有效成分的检测方法，具体步骤为：

A.取重庆各区县不同产地的青蒿药材样品(如表1所示)粉碎后，过《中华 人民共和国药典》(2015年版)5号筛，然后准确称取0.50g青蒿样品3份，滤 纸包裹，分别置于25mL量瓶中，加入50％石油醚(石油醚的沸点为60-90℃) -50％丙酮(均为体积比)的提取溶剂20mL，于功率为300W条件下超声提取 45min，连续超声提取2次，合并提取液，然后用50％石油醚(石油醚的沸点为 60-90℃)-50％丙酮(均为体积比)的提取溶剂定容至100mL，摇匀，取0.1mL， 置于100mL量瓶中，挥发至干，用甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，用0.22μm 的滤头，过滤，取滤液，作为样品溶液；

表1样品清单

B.将步骤A所得样品溶液超用高效液相色谱进行梯度洗脱，色谱条件为：

色谱柱：Nucleodur C18色谱柱(100mm×4.6mm，3μm ID)；

流动相：流动相A与流动相B的混合溶液，所述流动相A为乙腈，所述流 动相B为体积分数为0.1％的乙酸溶液；

梯度洗脱，洗脱时间及流动相A体积比顺序为0-1min 10％运行，1-6min从 10％→85％，6-13min再以85％运行，13-14min，再从85％→10％，14-15min， 以10％运行；

流速：0.4mL/min；

柱温：30℃；

进样量：2μL；

C.将进行梯度洗脱的样品溶液再用质谱法检出，用峰面积外标法定量检测； 电喷雾离子源，采用正离子和负离子模式检测；多重反应监测模式，离子源温度： 550℃，7种目标成分的其他质谱分析参数如表2所示。

表2质谱条件

D.标准曲线制作：精密称取青蒿素对照品、青蒿酸对照品、青蒿乙素对照品、 双氢青蒿素对照品、山奈酚对照品、木犀草素对照品和槲皮素对照品各5mg，分 别置于10mL量瓶中，加甲醇分别配制成浓度为0.964mg/mL、1.023mg/mL、0.990 mg/mL、1.017mg/mL、0.990mg/mL、1.000mg/mL和1.040mg/mL的溶液，分别 作为青蒿素对照品母液、青蒿酸对照品母液、青蒿乙素对照品母液、双氢青蒿素 对照品母液、山奈酚对照品母液、木犀草素对照品母液和槲皮素对照品母液，用 甲醇稀释母液得到系列浓度为144.60μg/mL、96.40μg/mL、48.20μg/mL、 24.10μg/mL、19.28μg/mL、14.46μg/mL和9.64μg/mL的青蒿素溶液；系列浓度为 8.18μg/mL、6.14μg/mL、5.12μg/mL、4.09μg/mL、2.05μg/mL、1.02μg/mL和 0.10μg/mL的青蒿酸溶液；系列浓度为0.99μg/mL、0.74μg/mL、0.50μg/mL、 0.25μg/mL、0.050μg/mL、0.025μg/mL和0.012μg/mL的青蒿乙素溶液；系列浓度 为1.02μg/mL、0.51μg/mL、0.10μg/mL、0.051μg/mL、0.010μg/mL、0.0051μg/mL 和0.0020μg/mL的双氢青蒿素溶液；系列浓度为0.99μg/mL、0.74μg/mL、 0.50μg/mL、0.25μg/mL、0.050μg/mL、0.025μg/mL和0.012μg/mL的山奈酚溶液； 系列浓度为1.0μg/mL、0.50μg/mL、0.10μg/mL、0.050μg/mL、0.010μg/mL、0.0050μg/mL和0.0010μg/mL的木犀草素溶液；1.04μg/mL、0.52μg/mL、0.10μg/mL、 0.052μg/mL、0.010μg/mL、0.0052μg/mL和0.0010μg/mL的槲皮素溶液；以上系 列浓度溶液分别吸取2μL，注入超高效液相色谱仪进行梯度洗脱，再用质谱法检 出，色谱条件与步骤B相同，质谱条件与步骤C相同；以进样量的浓度x为横 坐标，质谱测定信号强度峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程， 结果如表3所示。

表3回归方程

由表3可知，青蒿素、青蒿酸、青蒿乙素、双氢青蒿素、山奈酚、木犀草素 和槲皮素分别在其相应进样质量范围内线性关系良好。

E.将青蒿素样品溶液、青蒿酸样品溶液、青蒿乙素样品溶液、双氢青蒿素样 品溶液、山奈酚样品溶液、木犀草素样品溶液和槲皮素样品溶液的色谱峰面积代 入制得的标准曲线的回归方程中，即得青蒿样品中青蒿素、青蒿酸、青蒿乙素、 双氢青蒿素、山奈酚、木犀草素和槲皮素的含量，以三份样品的平均值作为最终 结果，结果如表4所示。

表4含量检测结果

由表4可知，本发明的方法能够同时检测青蒿药材中青蒿素、青蒿酸、青蒿 乙素、双氢青蒿素、山奈酚、木犀草素和槲皮素的含量；且该方法的灵敏度高， 能够检测出含量在十万分之一以下的成分。

实施例2专属性分析

A.取忠县新立的青蒿药材样品粉碎后，过《中华人民共和国药典》(2015 年版)5号筛，然后准确称取0.50g青蒿样品3份，滤纸包裹，分别置于25mL 量瓶中，加入50％石油醚(石油醚的沸点为60-90℃)-50％丙酮(均为体积比) 的提取溶剂20mL，于功率为300W条件下超声提取45min，连续超声提取2次， 合并提取液，然后用50％石油醚(石油醚的沸点为60-90℃)-50％丙酮(均为体 积比)的提取溶剂定容至100mL，摇匀，取0.1mL，置于100mL量瓶中，挥发 至干，用甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，用0.22μm的滤头，过滤，取滤液， 作为样品溶液；

B.将步骤A所得样品溶液超用高效液相色谱进行梯度洗脱，色谱条件与实 施例1相同；

C.将进行梯度洗脱的样品溶液再用质谱法检出，质谱条件参数设置与实施例 1相同；

D.称取青蒿素对照品、青蒿酸对照品、青蒿乙素对照品、双氢青蒿素对照品、 山奈酚对照品、木犀草素对照品和槲皮素对照品0.5g，甲醇溶解，配制成浓度为 1mg/mL的溶液，使用0.22μm的滤头，过滤，取滤液，作为对照品溶液，吸取 2μL对照品溶液，注入超高效液相色谱仪进行梯度洗脱，再用质谱法检出，色 谱条件和质谱条件与实施例1相同；图1为青蒿素对照溶液色谱图和青蒿素样品 溶液色谱图，其中，A为青蒿素对照溶液色谱图，B为青蒿素样品溶液色谱图； 图2为青蒿酸对照溶液色谱图和青蒿酸样品溶液色谱图，其中，A为青蒿酸对照 溶液色谱图，B为青蒿酸样品溶液色谱图；图3为青蒿乙素对照溶液色谱图和青蒿乙素样品溶液色谱图，其中，A为青蒿乙素对照溶液色谱图，B为青蒿乙素样 品溶液色谱图；图4为双氢青蒿素对照溶液色谱图和双氢青蒿素样品溶液色谱图， 其中，A为双氢青蒿素对照溶液色谱图，B为双氢青蒿素样品溶液色谱图；图5 为山奈酚对照溶液色谱图和山奈酚样品溶液色谱图，其中，A为山奈酚对照溶液 色谱图，B为山奈酚样品溶液色谱图；图6为木犀草素对照溶液色谱图和木犀草 素样品溶液色谱图，其中，A为木犀草素对照溶液色谱图，B为木犀草素样品溶 液色谱图；图7为槲皮素对照溶液色谱图和槲皮素样品溶液色谱图，其中，A为 槲皮素对照溶液色谱图，B为槲皮素样品溶液色谱图。

由图1-7可知，样品溶液和对照品溶液的色谱图的保留时间相近，且保留时 间＜10min。由此证明，本发明的方法的专属性强，检测时间短。

实施例3精密度试验

吸取实施例2所得青蒿素对照品溶液、青蒿酸对照品溶液、青蒿乙素对照品 溶液、双氢青蒿素对照品溶液、山奈酚对照品溶液、木犀草素对照品溶液和槲皮 素对照品溶液各2μL，注入超高效液相色谱仪进行梯度洗脱，再用质谱法检出， 色谱条件和质谱条件与实施例1相同，连续进样6次，测得各对照品的峰面积， 并计算相对标准偏差，结果如表5所示。

实施例4稳定性试验

吸取实施例2所得青蒿素对照品溶液、青蒿酸对照品溶液、青蒿乙素对照品 溶液、双氢青蒿素对照品溶液、山奈酚对照品溶液和槲皮素对照品溶液各2μL， 分别在0小时、4小时、8小时、12小时和24小时注入超高效液相色谱仪进行梯 度洗脱，再用质谱法检出，色谱条件和质谱条件与实施例1相同，测得各对照品 的峰面积，并相对标准偏差，结果如表5所示。

实施例5重复性试验

取忠县新立的青蒿药材样品粉碎后，过《中华人民共和国药典》(2015年 版)5号筛，然后准确称取0.50g青蒿样品6份，滤纸包裹，分别置于25mL量 瓶中，加入50％石油醚(石油醚的沸点为60-90℃)-50％丙酮(均为体积比)的 提取溶剂20mL，于功率为300W条件下超声提取45min，连续超声提取2次， 合并提取液，然后用50％石油醚(石油醚的沸点为60-90℃)-50％丙酮(均为体 积比)的提取溶剂定容至100mL，摇匀，取0.1mL，置于100mL量瓶中，挥发 至干，用甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，用0.22μm的滤头，过滤，取滤液， 作为样品溶液，测定青蒿素、青蒿酸、青蒿乙素、双氢青蒿素、山奈酚、木犀草 素和槲皮素的含量，方法与实施例1相同，并计算所得结果的相对标准偏差，结 果如表5所示。

表5精密度、稳定性和重复性测定结果

	青蒿素	青蒿酸	青蒿乙素	双氢青蒿素	山奈酚	木犀草	槲皮素
								精密度(相对标准偏差)/％	1.21	1.45	0.99	2.37	1.12	2.23	1.89
稳定性(相对标准偏差)/％	1.81	1.98	1.53	2.47	1.39	2.02	1.72
								重复性(相对标准偏差)/％	1.77	1.92	1.90	2.50	1.47	1.77	2.14

由表5可知，本发明的方法的精密度为0.99％-2.37％，稳定性为1.39％-2.47％，重复性为1.47％-2.50％。由此证明，本发明的方法的精密度高，稳定性和重复性 好。

实施例6加样回收率试验

精密量取9份已测得青蒿素、青蒿酸、青蒿乙素、双氢青蒿素、山奈酚、木 犀草素和槲皮素含量的忠县新立青蒿药材粉末0.25g，滤纸包裹，分3组，每组3份，每个组别分别加入高(120％)、中(100％)、低(80％)3个质量浓度的混合 标准品，过《中华人民共和国药典》(2015年版)5号筛，分别置于25mL量 瓶中，加入50％石油醚(石油醚的沸点为60-90℃)-50％丙酮(均为体积比)的 提取溶剂20mL，于功率为300W条件下超声提取45min，连续超声提取2次， 合并提取液，然后用50％石油醚(石油醚的沸点为60-90℃)-50％丙酮(均为体积比)的提取溶剂定容至100mL，摇匀，取0.1mL，置于100mL量瓶中，挥发 至干，用甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，用0.22μm的滤头，过滤，取滤液， 作为样品溶液，注入超高效液相色谱仪进行梯度洗脱，再用质谱法检出，色谱条 件和质谱条件与实施例1相同，得各对照品的峰面积，计算样品中青蒿素、青蒿 酸、青蒿乙素、双氢青蒿素、山奈酚、木犀草素和槲皮素的含量，并计算回收率、 平均含量和相对标准偏差，结果如表6所示。

表6加样回收实验结果

由表6可知，本发明所述方法的加样回收试验的相对标准偏差为1.84％-3.03％。由此证明，本发明的方法的准确度高。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方 式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领 域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组 合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (8)

1.青蒿中有效成分的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将样品破碎、过筛，然后进行超声萃取，接着用超高效液相色谱进行梯度洗脱，再用质谱法检出，用峰面积外标法定量检测。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述超声萃取的溶剂为石油醚与丙酮的组合物。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述超声萃取的溶剂为石油醚与丙酮按照体积比为0.8-1.1∶0.8-1.1的组合物。

4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，所述超声萃取的溶剂的用量为样品质量的33-37倍。

5.根据权利要求1、2、3或4所述的检测方法，其特征在于，所述超声萃取的参数设置为：萃取功率为280-330W，时间为40-50min。

6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的色谱条件为，

色谱柱：超高效液相色谱；

流动相：流动相A与流动相B按照体积比为90∶10-10∶90的混合溶液，所述流动相A为乙腈，所述流动相B为体积分数为0.1％的乙酸溶液；

梯度洗脱；

流速：0.1-0.4mL/min；

柱温：20-35℃；

进样量：2uL。

7.权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的具体过程为，洗脱时间及流动相A体积比顺序为0-1min 10％运行，1-6min从10％→85％，6-13min再以85％运行，13-14min，再从85％→10％，14-15min，以10％运行。

8.根据权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的检测方法，其特征在于，所述质谱条件为：电喷雾离子源，采用正离子和负离子模式检测；多重反应监测模式，离子源温度：550℃。