CN108362803A - 一种测定材料中戊二醛含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制药工业以及生物医学材料中戊二醛的检测方法技术领域，具体涉及一种测定材料中戊二醛含量的方法。该方法包括：步骤一、往样品材料中加入乙醇，配制样品溶液；步骤二、对样品溶液预处理，然后加入2,4‑二硝基苯肼使其中的戊二醛与2,4‑二硝基苯肼进行化学反应生成2,4‑二硝基苯肼的衍生物后，加入乙腈溶解成澄清溶液；步骤三、澄清溶液注入高效液相色谱柱中，测定材料中戊二醛含量。该测定材料中戊二醛含量的方法直接通过乙醇萃取材料中的戊二醛，与传统的直接使用水萃取戊二醛相比，更加方便，不需要进行过滤，离心等操作，就可以直接萃取含有戊二醛的乙醇溶液进行检测，具有操作方便、快捷的优点。

Description

一种测定材料中戊二醛含量的方法

技术领域

本发明涉及制药工业以及生物医学材料中戊二醛的检测方法技术领域，具体涉及一种测定材料中戊二醛含量的方法。

背景技术

交联反应是可使两个或者更多的分子(一般为线性分子)相互键合交联成网络结构的较稳定分子(体型分子)反应。这种反应使线型或轻度支链型的大分子转变成三维网状结构，以此提高强度、耐热性、耐磨性、耐溶剂性等性能。制药工业以及生物医学领域，如硬、软胶囊，微球，人造血管密封胶，创伤敷料以及外科手术吸附垫等材料一般机械性能，韧性能和稳定性能较差，为了使材料具有长期生物医学性能，需要对其进行交联。戊二醛价廉易得，能改变脆性材料的机械性能，其分子式两端各有一个醛基，是一种优良的双官能团交联剂。尽管已经有报道碳化二亚胺、环氧化合物和京尼平等与胶原基材料进行交联。它们在降低细胞毒性上看似较好，但稳定胶原的作用不如戊二醛。戊二醛，可以加强大分子之间的作用,提高材料的强度，其水溶液可以在较短时间内有效地与蛋白进行交联，交联性能好，结合量多，结合牢固性较大，且能够保持蛋白质的原有构型。戊二醛作为生物组织工程材料中的交联剂，在保存生物组织工程材料的活性基础上，可以提高材料的机械性和热稳定性。生物组织工程材料大多数是高分子化合物，有些是天然高分子化合物，如胶原蛋白，明胶，聚谷氨酸、壳聚糖等在含有水溶液中，容易膨胀，甚至溶解，材料干燥后一般热稳定性能较差，机械性能差，加入少量的戊二醛进行交联，可以高效地提高其稳定性，材料在水中能减少其膨胀度，增加材料的断裂应力，拉伸强度，以及刚性等，使其更加适应组织工程上的应用。

尽管有许多关于戊二醛毒性的报道，但戊二醛的交联在临床上的应用具有许多优点且已经被接受。虽然戊二醛在制药工业以及生物医学领域被广泛使用，但是它的毒性、刺激性和对环境的污染是不容忽视的。据报道戊二醛具有明显的黏膜毒性和皮肤刺激性，接触戊二醛的人员可出现不同程度的喷嚏、头痛、流泪、皮疹和慢性咳嗽。它对小动物有突变异种现象，因此被视为致癌物。1978年9 月美国癌症协会(NCI)对戊二醛的致癌性进行了生物检查。目前戊二醛是英国危险物质安全管理处控管的化学物质之一，英国健康安全行政部对于必须暴露于戊二醛工作环境中的职业，制定了0.2×106的安全接触标准。在欧盟日用消费品中无有害物质的生态标签中，戊二醛被列为禁止使用的有毒或有害物质。在制药工业以及生物医学领域中，含有戊二醛的材料，尤其是直接接触人体的药物，支架材料等，其中戊二醛的含量需要明确，使用过程中，患者才能更加放心。

现有技术测定戊二醛含量的方法，是直接使用纯水萃取戊二醛，需要进行过滤，离心等操作，存在操作不方便，不够快捷的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种测定的方法，该测定材料中戊二醛含量的方法不需要进行过滤，离心等操作，具有操作方便、快捷的优点。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

提供一种测定材料中戊二醛含量的方法，它包括以下步骤：

步骤一、往样品材料中加入乙醇，配制样品溶液；

步骤二、对步骤一得到的样品溶液进行预处理，得到处理液，然后往处理液中加入2,4‐二硝基苯肼，室温避光反应一段时间，处理液中的戊二醛与2,4‐二硝基苯肼进行化学反应生成2,4‐二硝基苯肼的衍生物后，加入乙腈溶解成澄清溶液；

步骤三、步骤二得到的澄清溶液注入高效液相色谱柱中，采用流动相A和流动相B作为流动相梯度洗脱，并记录色谱图，进而测定材料中戊二醛含量。

上述技术方案中，所述步骤一中，所述样品材料为水溶性的壳聚糖、胶原蛋白、丝素蛋白或明胶中一种或任意两种以上的组合物。

上述技术方案中，所述步骤一中，所述样品材料的重量与所述乙醇的体积比为0.0001～10:1(g/ml)。

上述技术方案中，所述步骤一中，所述样品材料中所需含有戊二醛的重量与样品材料的重量比范围为＞0.1:10000000。

上述技术方案中，所述步骤二中，所述预处理为超声仪超声1min～72h。

上述技术方案中，所述步骤二中，所述预处理为在36℃～38℃下静置1min～72h。

上述技术方案中，所述步骤二中，所述预处理为连续振荡、涡旋或摇动 1min～72h。

上述技术方案中，所述步骤二中，所述室温避光反应的时间为3h～6h；所述处理液与所述2,4‐二硝基苯肼的体积比为1～900:1～50。

上述技术方案中，所述步骤三中，所述高效液相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。

上述技术方案中，所述步骤三中，所述流动相A是水，所述流动相B是乙腈，所述流动相A与所述流动相B的质量比为60～80:20～40。

本发明与现有技术相比较，有益效果在于：

(1)本发明提供的一种测定材料中戊二醛含量的方法，由于使用乙醇作为萃取剂萃取样品材料中的戊二醛时，戊二醛能溶解到乙醇中，而水溶性的生物材料不溶解于乙醇中，该过程能有效避免材料的溶胀作用，又能高效提取出戊二醛进行检测，该方法可以有效减少检测时大量的杂峰的出现。本申请就是提供了一种含有戊二醛的水溶性材料测定其戊二醛含量的快捷方法，直接通过乙醇萃取材料中的戊二醛，与传统的直接使用水萃取戊二醛相比，更加方便，不需要进行过滤，离心等操作，就可以直接萃取含有戊二醛的乙醇溶液进行检测，具有操作方便、快捷的优点。

(2)本发明提供的一种测定材料中戊二醛含量的方法，具有方法简单、检测成本低的特点。

附图说明

图1是冷冻干燥后的胶原蛋白海绵图，其中，A和B是没有加入戊二醛交联的胶原蛋白海绵；C和D是加入戊二醛交联的胶原蛋白海绵。

图2是乙腈定容2,4‐二硝基苯肼衍生物后，抽取一部分去按色谱条件检测戊二醛含量剩下来的澄清溶液。

图3是戊二醛的标准曲线。

图4是2,4‐二硝基苯肼，按色谱条件进样色谱图。

图5是2,4‐二硝基苯肼与标准戊二醛溶液反应后，按色谱条件进样色谱图。

图6是加入戊二醛的胶原蛋白进行交联所制备的胶原海绵在乙醇溶液中，戊二醛被萃取到溶液中，取1ml的溶液加入2,4‐二硝基苯肼溶液反应后，按色谱条件进样色谱图。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1。

一种测定材料中戊二醛含量的方法，它包括以下步骤：

步骤一、往样品材料中加入乙醇，配制样品溶液；本实施例中，样品材料为水溶性的壳聚糖；本实施例中，样品材料的重量与乙醇的体积比为1:1(g/ml)；其中，样品材料中所需含有戊二醛的重量与样品材料的重量比范围为＞ 0.1:10000000，才能测量出戊二醛的含量；

步骤二、对步骤一得到的样品溶液进行超声仪超声1min～72h，得到处理液，然后往处理液中加入2,4‐二硝基苯肼，室温避光反应4h，处理液中的戊二醛与 2,4‐二硝基苯肼进行化学反应生成2,4‐二硝基苯肼的衍生物后，加入乙腈溶解成澄清溶液；本实施例中，处理液与2,4‐二硝基苯肼的体积比为400:25；

步骤三、步骤二得到的澄清溶液注入高效液相色谱柱中，采用流动相A和流动相B作为流动相梯度洗脱，并记录色谱图，进而测定材料中戊二醛含量。其中，高效液相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。本实施例中，流动相A 是水，流动相B是乙腈，流动相A与流动相B的质量比为70:30。

实施例2。

一种测定材料中戊二醛含量的方法，它包括以下步骤：

步骤一、往样品材料中加入乙醇，配制样品溶液；本实施例中，样品材料为胶原蛋白；本实施例中，样品材料的重量与乙醇的体积比为0.01:1(g/ml)；其中，样品材料中所需含有戊二醛的重量与样品材料的重量比范围为＞ 0.1:10000000，才能测量出戊二醛的含量；

步骤二、对步骤一得到的样品溶液在36℃～38℃下静置1min～72h，得到处理液，然后往处理液中加入2,4‐二硝基苯肼，室温避光反应5h，处理液中的戊二醛与2,4‐二硝基苯肼进行化学反应生成2,4‐二硝基苯肼的衍生物后，加入乙腈溶解成澄清溶液；本实施例中，处理液与2,4‐二硝基苯肼的体积比为1:1；

步骤三、步骤二得到的澄清溶液注入高效液相色谱柱中，采用流动相A和流动相B作为流动相梯度洗脱，并记录色谱图，进而测定材料中戊二醛含量。其中，高效液相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。本实施例中，流动相A 是水，流动相B是乙腈，流动相A与流动相B的质量比为60:40。

实施例3。

一种测定材料中戊二醛含量的方法，它包括以下步骤：

步骤一、往样品材料中加入乙醇，配制样品溶液；本实施例中，样品材料为丝素蛋白；本实施例中，样品材料的重量与乙醇的体积比为0.001:1(g/ml)；其中，样品材料中所需含有戊二醛的重量与样品材料的重量比范围为＞ 0.1:10000000，才能测量出戊二醛的含量；

步骤二、对步骤一得到的样品溶液进行连续振荡、涡旋或摇动1min～72h，得到处理液，然后往处理液中加入2,4‐二硝基苯肼，室温避光反应6h，处理液中的戊二醛与2,4‐二硝基苯肼进行化学反应生成2,4‐二硝基苯肼的衍生物后，加入乙腈溶解成澄清溶液；本实施例中，处理液与2,4‐二硝基苯肼的体积比为900:50；

步骤三、步骤二得到的澄清溶液注入高效液相色谱柱中，采用流动相A和流动相B作为流动相梯度洗脱，并记录色谱图，进而测定材料中戊二醛含量。其中，高效液相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。本实施例中，流动相A 是水，流动相B是乙腈，流动相A与流动相B的质量比为80:20。

实施例4。

一种测定材料中戊二醛含量的方法，它包括以下步骤：

步骤一、往样品材料中加入乙醇，配制样品溶液；本实施例中，样品材料为明胶；本实施例中，样品材料的重量与乙醇的体积比为0.0001:1(g/ml)；其中，样品材料中所需含有戊二醛的重量与样品材料的重量比范围为＞0.1:10000000，才能测量出戊二醛的含量；

步骤二、对步骤一得到的样品溶液进行超声仪超声24h，得到处理液，然后往处理液中加入2,4‐二硝基苯肼，室温避光反应3h，处理液中的戊二醛与2,4‐二硝基苯肼进行化学反应生成2,4‐二硝基苯肼的衍生物后，加入乙腈溶解成澄清溶液；本实施例中，处理液与2,4‐二硝基苯肼的体积比为100:15；

步骤三、步骤二得到的澄清溶液注入高效液相色谱柱中，采用流动相A和流动相B作为流动相梯度洗脱，并记录色谱图，进而测定材料中戊二醛含量。其中，高效液相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。本实施例中，流动相A 是水，流动相B是乙腈，流动相A与流动相B的质量比为65:35。

实施例5。

一种测定材料中戊二醛含量的方法，它包括以下步骤：

步骤一、往样品材料中加入乙醇，配制样品溶液；本实施例中，样品材料为水溶性的壳聚糖和胶原蛋白的组合物；本实施例中，样品材料的重量与乙醇的体积比为10:1(g/ml)；其中，样品材料中所需含有戊二醛的重量与样品材料的重量比范围为＞0.1:10000000，才能测量出戊二醛的含量；

步骤二、对步骤一得到的样品溶液在37℃下静置36h，得到处理液，然后往处理液中加入2,4‐二硝基苯肼，室温避光反应4h，处理液中的戊二醛与2,4‐二硝基苯肼进行化学反应生成2,4‐二硝基苯肼的衍生物后，加入乙腈溶解成澄清溶液；本实施例中，处理液与2,4‐二硝基苯肼的体积比为700:40；

步骤三、步骤二得到的澄清溶液注入高效液相色谱柱中，采用流动相A和流动相B作为流动相梯度洗脱，并记录色谱图，进而测定材料中戊二醛含量。其中，高效液相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。本实施例中，流动相A 是水，流动相B是乙腈，流动相A与流动相B的质量比为75:25。

实施例6。

一种测定材料中戊二醛含量的方法，它包括以下步骤：

步骤一、往样品材料中加入乙醇，配制样品溶液；本实施例中，样品材料为胶原蛋白、丝素蛋白和明胶的组合物；本实施例中，样品材料的重量与乙醇的体积比为5:1(g/ml)；其中，样品材料中所需含有戊二醛的重量与样品材料的重量比范围为＞0.1:10000000，才能测量出戊二醛的含量；

步骤二、对步骤一得到的样品溶液进行连续振荡、涡旋或摇动30h，得到处理液，然后往处理液中加入2,4‐二硝基苯肼，室温避光反应4.5h，处理液中的戊二醛与2,4‐二硝基苯肼进行化学反应生成2,4‐二硝基苯肼的衍生物后，加入乙腈溶解成澄清溶液；本实施例中，处理液与2,4‐二硝基苯肼的体积比为600:35；

步骤三、步骤二得到的澄清溶液注入高效液相色谱柱中，采用流动相A和流动相B作为流动相梯度洗脱，并记录色谱图，进而测定材料中戊二醛含量。其中，高效液相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。本实施例中，流动相A 是水，流动相B是乙腈，流动相A与流动相B的质量比为63:37。

实验：

1实验材料。

1.1主要试剂及仪器。

乙醇(AR,天津市大茂化学试剂厂)，2,4‐二硝基苯肼(HPLC，上海麦克林生化科技有限公司)，50％戊二醛(AR，阿拉丁试剂(上海)有限公司)，浓盐酸(AR，天津市大茂化学试剂厂)，乙腈(AR，天津市大茂化学试剂厂)，高效液相色谱仪 (HPLC，日本岛津公司)，十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(InertSustain C18，5μm， 4.6mm×250mm)，标准试剂型超纯水机(青岛富勒姆科技有限公司)。

1.2相关试剂的配制。

2,4‐二硝基苯肼(DNPH)溶液：精密称取0.1g 2,4‐二硝基苯肼，用无水乙醇定容至100ml，再用移液管缓慢加入1.00ml浓盐酸，混合均匀，室温保存。

10ug/ml戊二醛标准溶液：精密移取阿拉丁50％戊二醛2ul，无水乙醇定容至100ml，10ug/ml戊二醛溶液，避光保存，备用。

1‰戊二醛醋酸溶液：取50％戊二醛400uL，加入0.5M醋酸至200ml。

2实验方法。

2.1戊二醛交联的胶原蛋白海绵制备。

实验室自制的I型胶原蛋白溶胀物600g，浓度(5.8mg/g),按戊二醛含量与胶原蛋白含量比为1:50(g/g)进行交联。往I型胶原蛋白溶胀物加入1‰戊二醛醋酸溶液139.2g，搅拌均匀，胶原液分别倒入一次性培养皿中，常温交联24小时，‐20℃冰箱预冻12小时后，真空冷冻干燥72小时，即得戊二醛交联的量与原材料的量比是29:250000(g/g)即得2％戊二醛交联的胶原蛋白海绵，即胶原蛋白海绵，见图1。

2.2戊二醛标准曲线的建立。

精密量取10ug/ml戊二醛标准溶液：0.1ml、0.2ml、0.6ml、0.8ml、1ml、1.5ml、1.8ml、2ml分别置8个10ml容量瓶中编号，分别加入2,4‐二硝基苯肼溶液500ul，立即于混合器上混匀,室温静置反应4h，乙腈定容至10ml,各用注射器抽取1.5ml，用0.45um膜滤过，于高效液相中进行检测。记录时间在14min～16min 之间出现的色谱峰的面积，以横坐标为戊二醛含量(ug)，纵坐标为峰面积绘制标准曲线。

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶境充剂(SG120,S‐5μm，直径4.6mm，长250mm)；以70％乙腈溶液为流动相；流速为0.8mL/min；检测波长为360nm；记录时间为30分钟，进样量50ul。流动相：超纯水经0.45um的水系滤膜滤过，乙腈经0.45um的有机系滤膜滤过，均超声脱气20min。

2.3供试品溶液的准备与检测。

供试品溶液：称取自制戊二醛交联的海绵，各加入10ml乙醇，编号，为避免胶原海绵变性，超声40min，为避免胶原海绵变性，超声的温度均控制在37℃以下，取出避光放置室温。各自取出2ml的戊二醛乙醇溶液，分别加入2,4‐二硝基苯肼溶液500ul,立即于混合器上混匀,室温避光静置反应4h后，乙腈定容至 10ml，各用注射器抽取1.5ml，用0.45um膜滤过，于高效液相中按色谱条件进行检测。

2.4实验方法的准确度验证。

2.4.1方法精密度。

为考察方法精密度，取戊二醛标准溶液1ml，直接按2.2项编号后步骤一样，按HPLC色谱条件方法每天分别进样3次，考察日内精密度；连续进样三天，考察日间精密度，见表1、2。

表1

表2

2.4.2方法的稳定性。

为考察方法稳定性，取戊二醛标准液1ml，直接按2.2项编号后步骤一样，分别在0小时，12小时，24小时，48小时按HPLC方法进样检测，见表3。

表3

2.4.3方法的准确度以及精确度。

通过回收率来表示本方法的准确度，在供试品溶液中，添加已知含量的戊二醛标准溶液，按照上述规定的色谱操作条件测定其含量，计算其回收率及相对标准偏差，见表4。

表4

3.实验结果。

3.1戊二醛交联前后的外表观察。

由图1可以看出，没有加入戊二醛交联的胶原海绵表面疏松，不光滑平整，较薄，胶原蛋白的柔韧能力比交联过的胶原蛋白海绵较差，皿上残留着较多的胶原蛋白纤维或粉末；加入了戊二醛交联的胶原海绵表面密集，光滑平整，较厚，胶原蛋白的柔韧能力比没有交联过的胶原蛋白海绵较好，皿上残留着较少的胶原蛋白纤维。

3.2戊二醛的标准曲线。

以质量含量(x，ug)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标作图可得一标准曲线(见图3)。经最小二乘法计算，得戊二醛的标准曲线的回归方程 Y＝20810427.6800X+59890.6158，r²＝0.997；进样50ul时，胶原海绵中戊二醛残留含量0.005ug～0.1ug可被检测到，该标准曲线的线性范围在0.1ug/ml～2ug/ml线性较好。

3.3供试品溶液的准备与检测。

同一批次戊二醛交联后的胶原蛋白海绵，经过预处理后的戊二醛乙醇溶液与 2,4‐二硝基苯肼反应后，按色谱条件进样检测，见图6，保留时间为14.7～16.5之间的峰为戊二醛腙。进行6次平行实验，测得结果之间相对标准偏差RSD达到 4.0754％，见表5，表明戊二醛与胶原蛋白混合较均匀，该方法具有较高的重复性。

表5

3.4实验方法精密度、稳定性、回收率对实验正确度的验证。

由表1～3中可知，取1ml的戊二醛的标准溶液，加入2,4‐二硝基苯肼反应后，乙腈定溶至10ml，按色谱条件进样检测，其标准品日内精密度、日间精密度RSD 均为0.19％左右，稳定性的RSD约为0.83％；胶原蛋白海绵的戊二醛平均回收率为88.89％～94.34％，相对标准偏差为2.08％～3.48％(见表4)，该方法不管是精密度，稳定性，还是回收率，其相对标准偏差均较小，因此，利用本方法进行戊二醛残留样品的分离和含量测定，灵敏度高，重现性好，能为实验检测提供可靠的数据。采用本方法对戊二醛的最低检出浓度为0.1mg/l。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种测定材料中戊二醛含量的方法，其特征在于：它包括以下步骤：

步骤一、往样品材料中加入乙醇，配制样品溶液；

步骤二、对步骤一得到的样品溶液进行预处理，得到处理液，然后往处理液中加入2,4-二硝基苯肼，室温避光反应一段时间，处理液中的戊二醛与2,4-二硝基苯肼进行化学反应生成2,4-二硝基苯肼的衍生物后，加入乙腈溶解成澄清溶液；

步骤三、步骤二得到的澄清溶液注入高效液相色谱柱中，采用流动相A和流动相B作为流动相梯度洗脱，并记录色谱图，进而测定材料中戊二醛含量。

2.根据权利要求1所述的一种测定材料中戊二醛含量的方法，其特征在于：所述步骤一中，所述样品材料为水溶性的壳聚糖、胶原蛋白、丝素蛋白或明胶中一种或任意两种以上的组合物。

3.根据权利要求1所述的一种测定材料中戊二醛含量的方法，其特征在于：所述步骤一中，所述样品材料的重量与所述乙醇的体积比为0.0001～10:1(g/ml)。

4.根据权利要求1所述的一种测定材料中戊二醛含量的方法，其特征在于：所述步骤一中，所述样品材料中所需含有戊二醛的重量与样品材料的重量比范围为＞0.1:10000000。

5.根据权利要求1所述的一种测定材料中戊二醛含量的方法，其特征在于：所述步骤二中，所述预处理为超声仪超声1min～72h。

6.根据权利要求1所述的一种测定材料中戊二醛含量的方法，其特征在于：所述步骤二中，所述预处理为在36℃～38℃下静置1min～72h。

7.根据权利要求1所述的一种测定材料中戊二醛含量的方法，其特征在于：所述步骤二中，所述预处理为连续振荡、涡旋或摇动1min～72h。

8.根据权利要求1所述的一种测定材料中戊二醛含量的方法，其特征在于：所述步骤二中，所述室温避光反应的时间为3h～6h；所述处理液与所述2,4-二硝基苯肼的体积比为1～900:1～50。

9.根据权利要求1所述的一种测定材料中戊二醛含量的方法，其特征在于：所述步骤三中，所述高效液相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。

10.根据权利要求1所述的一种测定材料中戊二醛含量的方法，其特征在于：所述步骤三中，所述流动相A是水，所述流动相B是乙腈，所述流动相A与所述流动相B的质量比为60～80:20～40。