CN108350432A - 来自灵长类物种的标准化神经元细胞测定试验 - Google Patents

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V·科斯塔
M·赫纳
C·帕奇
E·C·托马
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Abstract

本申请涉及一种从灵长类物种产生标准化且稳健的神经元细胞培养物测定试验的方法，例如适用于药物候选物的高通量筛选的试验。该方法包括将人和/或非人灵长类神经元前体细胞(NPC)分化成神经元细胞(NC)，基于在分化的NC上进行的解离和再接种步骤产生均一的NC培养物，导致适用于高通量药物筛选测定试验，特别是筛选反义寡核苷酸的稳健培养物。

Description

来自灵长类物种的标准化神经元细胞测定试验
技术领域
本申请涉及一种从灵长类物种产生标准化且稳健的神经元细胞培养物测定试验的方法，例如适用于高通量筛选药物候选物的测定试验。该方法包括，将人和/或非人灵长类动物神经元前体细胞(NPC)分化成神经元细胞(NC)，和基于在分化的NC上进行的解离(dissociate)和再接种(reseed)步骤，产生均一的NC培养物，从而获得适用于高通量药物筛选测定，特别是筛选反义寡核苷酸的稳健培养物。
背景技术
基于显示各种疾病(包括中枢神经***(CNS)疾病)的病理生理学的各种细胞类型或细胞培养物模型的高通量筛选试验，广泛用于早期评估药物候选物的功效和毒性特征。在过去的十年中，通过建立从体细胞产生多能细胞的方案，克服了由有限的细胞类型或细胞的胚胎干细胞来源所造成的局限性。自从Yamanaka及其同事(Takahashi，K。&Yamanaka，S.Cell.2006；126：663-676)证明了体细胞可重编程为诱导的多能干细胞(IPSCs)，已经可以从多种细胞来源产生多能细胞。已经将不同类型的体细胞，包括成纤维细胞，角质形成细胞，脂肪细胞和血细胞，重编程为IPSC多能状态。最近，特定的体细胞类型可以被转分化成完全不同的体细胞类型，例如神经元。Vierbuchen及其同事证明，通过转导三种关键基因Mash1，Brn2和Myt11，小鼠成纤维细胞可以直接转化为功能性神经元(Vierbuchen等，Nature。2010；463：1035-41)。值得注意的是，US2010/0021437公开了从成纤维细胞产生诱导的多能干细胞并诱导这些细胞分化成NPC的方法。最近已经描述了分化的体细胞向NPC的直接转化(WO2012/022725)。这些神经元细胞被认为是模建各种CNS疾病的病理生理学的有价值的工具。
NPC是多能干细胞并在特定条件下繁殖。它们可以生长为单层贴壁培养物，也可以在非贴壁细胞培养板中生长为漂浮神经球(neurosphere)。两种类型的NPC培养物(神经球，贴壁培养物)似乎是完全可以相互转化的。NPC可以无限生长，并仍然保持真正的多能性。在特定条件下，它们可以分化成组成成年大脑的神经元细胞类型，包括分化的NC。分化的NC培养物是筛选有效和安全药物的有价值的疾病模型。事实上，NC培养物在药物开发中对评估药物候选物的毒性和功效非常重要。
在首次给予人类患者之前，需要在体外细胞培养***中、然后在啮齿动物和非人灵长类(NHP)物种的体内测试中彻底地评估药物候选物。目前，新药药物候选物的毒性和功效评估可以针对不同的物种采用不同的方案以不同试验形式进行。虽然药物候选物的体外测试可以减少为药物测试而处死的实验动物的数量，但这也对结果从体外到体内和人体生理学的转化提出了挑战。事实上，由于物种之间的非密切遗传关系，药物候选物的功效和毒性特征从啮齿动物物种到人类的转化可能是具有挑战性的。值得注意的是，小鼠和人类基因组的蛋白质编码区约85％相同。遗传组成的差异可能造成对药物的不同生理反应、以及对毒素或诱变剂的不同耐受性。目前，对于靶向特定DNA或RNA序列(例如，反义寡核苷酸)或基因或基因产物的遗传变体的新药类型，物种间的可转化性变得甚至更加重要。因此，鉴于遗传关系密切(>90％)，NHP物种代表了最有意义的模型***，用于产生功效和毒性数据以预测人类的反应率和不良事件发生率。不受理论束缚，认为在NHP物种(例如，食蟹猴)中的体内测试，在所有药物类别的首次人体试验之前均是优选的，而且对于靶向确定的人类遗传组成的药物类别尤其如此。另一方面，在药物开发中使用NHP物种仍然是一个有争议的问题。NHP物种在遗传上与人类接近的这一事实引发伦理问题。因此，NHP实验动物例如食蟹猴的数量，应尽可能减少。
因此，对新药候选物进行功效和毒性筛选的全面布局应该包括体外和体内NHP物种测试、以及使用IPSC来源的人类细胞的平行体外测试。测试顺序应包括，在NHP物种(例如食蟹猴)的体内试验之前，在NHP物种和人的细胞上的体外平行测试。具有较差功效和/或毒性性质的药物候选物应当，在对NHP物种开始体内测试之前，在NHP和/或人类细胞上进行体外评估时在早期阶段就予以排除。事实上，这个顺序可以确保NHP实验室动物的数量可以尽可能低。
然而，从干细胞来源的分化NC获得在灵长类物种之间可转化的功效和毒性体外数据，存在许多大的障碍：首先是物种特异性的细胞培养方案和细胞培养条件的不可转化性；其次是分化中的NPCs的不均一分布，导致非最佳的存活条件或受阻的分化效应(由于局部细胞浓度和自分泌和旁分泌信号所致)，由此在药物效应的表型评估上造成困难。当培养物必须长期分化以获得所需的细胞分化状态时，这变得最为明显。最值得注意的是，分化的灵长类NC对细胞培养条件天生敏感，不能耐受苛刻的处理，这是用这些细胞产生标准化测定试验的固有障碍。
因此，仍然需要一种易于获得且可重现的技术用于从不同灵长类物种(包括人类)产生一致的NC测定试验。
发明内容
本文提供了用于自不同灵长类物种产生均匀分布的分化神经元细胞(NC)的标准化细胞培养物的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供神经元前体细胞(NPC)；
b)将NPC区分为NC，包括以下步骤：
(i)在分化的约20天至约45天后，将分化的NC从其支持物上解离；和
(ii)以合适的细胞培养形式再接种细胞并继续分化NC约4天至约15天。
在一个实施方案中，灵长类物种选自人(Homo sapiens)，食蟹猴(Macacafascicularis)和恒河猴(Macaca mulatta)。
在一个实施方案中，灵长类物种选自人(Homo sapiens)和食蟹猴(Macacafascicularis)。
在一个实施方案中，针对2种灵长类物种分开单独产生分化NC的标准化细胞培养物，其中第一灵长类物种是人(Homo sapiens)，第二灵长类物种是食蟹猴(Macacafascicularis)。
在一个实施方案中，NPC来源于诱导的多能干细胞(IPSCs)。
在一个实施方案中，步骤b)包括用选自Shh，FGF8，BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸磷酸盐的一种或多种分化剂培养NPCs。
在一个实施方案中，步骤b)(i)包括在含有Shh，FGF8和抗坏血酸磷酸盐的基础培养基中培养细胞约5至约10天的时间，接着在含有BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸磷酸盐的基础培养基中再培养细胞约15天至约35天，然后将分化的NC从其支持物上解离。
在一个实施方案中，一种或多种分化剂在基础培养基中的浓度，对于Shh是50-500ng/ml，对于FGF8是25-250ng/ml，对于BDNF是1-50ng/ml，对于BDNF是1-50ng/ml，对于cAMP是0.1-10mM，对于抗坏血酸磷酸盐是20-200μM。
在一个实施方案中，一种或多种分化剂在基础培养基中的浓度，对于Shh是200ng/ml，对于FGF8是100ng/ml，对于BDNF是20ng/ml，对于GDNF是10ng/ml，对于cAMP是0.5mM，对于抗坏血酸磷酸盐是100μM。
在一个实施方案中，用Shh，FGF8和抗坏血酸磷酸盐的培养期约为7天，用BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸磷酸盐的培养期为约20至约40天。
在一个实施方式中，NPC在Laminin521支持物上提供。
在一个实施方案中，步骤b)(i)包括用细胞分离溶液(cell detachmentsolution)解离细胞。
在一个实施方案中，细胞分离溶液是Accutase。
在一个实施方案中，步骤b)(ii)包括在Laminin521支持物上以200000个细胞/cm2重接种细胞。
在一个实施方案中，将细胞重接种在96孔或384孔板中。
在一个实施方案中，步骤b)(ii)包括在ROCK抑制剂存在下再接种细胞。
在一个实施方案中，ROCK抑制剂是Y-27632。
在一个实施方案中，步骤b)(ii)包括在再接种细胞后通过在补充了BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸的基础培养基中培养细胞来继续分化。
在一个实施方案中，分化的NC表达MAP2。
在一个实施方案中，分化的NC包含MAP2阳性神经突。
在一个实施方案中，NPC来自患有神经元病症的个体。
在一个实施例中，NPC来自健康的个体。
在一个实施方案中，细胞培养物针对不同物种依次产生。
在一个实施方案中，如通过细胞核染色所评估的，细胞基本均匀地分布在细胞培养区域上。
在一个实施方案中，通过DNA染色，特别是Hoechst染色来评估细胞的分布。
在一个实施方案中，提供了通过如本文所述的方法获得的细胞培养***。
在一个实施方案中，提供了根据本文所述的方法获得的细胞培养物用于体外测试药物候选物的毒性的用途。
在一个实施方案中，提供了根据本文所述的方法获得的细胞培养物用于体外测试药物候选物的功效的用途。
在一个实施方案中，提供了根据本文所述的方法获得的细胞培养物用于体外测试药物候选物的功效的用途，其中在源自患有神经元病症的个体的细胞培养物中以及在源自健康个体的细胞培养物中测试功效。
在一个实施方案中，提供了根据本文所述方法获得的细胞培养物用于选择药物候选物，特别是选择用于进一步开发的药物候选物的用途。
在一个实施方案中，提供了细胞培养物用于如本文所述的用途，其中药物候选物包含多核苷酸或靶向多核苷酸的特定序列。
在一个实施方案中，提供了如本文所述使用的细胞培养物，其中药物候选物包含至少一个核酸分子，例如RNAi剂或反义寡核苷酸。
在一个实施方案中，提供细胞培养物用于如本文所述的用途，其中所述核酸分子包含一个或多个2'糖修饰的核苷，其独立地选自2'-O-烷基-RNA，2'-O-甲基-RNA，2'-O-烷氧基-RNA，2'-O-甲氧基乙基-RNA，2'-氨基-DNA，2'-氟-DNA，***糖核酸(arabinonucleic acid，ANA)，2'-氟-ANA和LNA核苷。
在一个实施方案中，提供了细胞培养物用于如本文所述的用途，其中所述一个或多个2'糖修饰的核苷是LNA核苷。
在一个实施方案中，提供了细胞培养物用于如本文所述的用途，其中LNA核苷选自β-D-氧基-LNA，α-L-氧基-LNA，β-D-氨基-LNA，α-氨基-LNA，β-D-硫代-LNA，α-L-硫代-LNA，(S)cET，(R)cET，β-D-ENA或α-L-ENA。
在一个实施方案中，提供了细胞培养物用于如本文所述的用途，其中所述核酸分子包含至少一个修饰的核苷间连接。
在一个实施方案中，提供了细胞培养物用于如本文所述的用途，其中连续核苷酸序列内的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
在一个实施方案中，提供了细胞培养物用于如本文所述的用途，其中反义寡核苷酸能够募集RNase H.
在一个实施方案中，提供了细胞培养物用于如本文所述的用途，其中反义寡核苷酸是gapmer。
在一个实施方案中，提供细胞培养物用于如本文所述的用途，其中所述寡核苷酸是式5'-FG-F'-3'的gapmer，其中区F和F'独立地包含1至7个修饰的核苷且G为能够募集RNA酶H的6至16个核苷的区域。
在一个实施方案中，提供了基本上如本文所述的方法和用途。
附图简述
图1：上链举例说明SNORD109B下游的SNHG14转录物的区域(UBE3A-ATS)，其中黑框表示测试的小鼠寡核苷酸的位置。下链举例说明UBE3A编码区，其中黑框表示外显子。外显子1位于160kb左右。寡核苷酸被置于外显子9(位于)，外显子10(位于)，外显子13(位于)和外显子16的5'端(位于)的反义区中。
图2：表示实施例2中测试的寡核苷酸在人神经元细胞培养物中诱导UBE3A重新表达的能力。与SNORT109B和UBE3A编码区上游区域之间(SEQ ID NO：1的位置1至55318)的人SNHG14长非编码RNA区域互补的寡核苷酸用·非重叠表示。与反义于UBE3A pre-mRNA(SEQID NO：1的位置55319至141053)的人SNHG14长非编码RNA区域互补的寡核苷酸用▲重叠表示。来自表3的具有对人和恒河猴的保守性的寡核苷酸以显示在每个小图的底部。人:恒河猴:鼠之间的保守性标示为寡核苷酸浓度为0.2,1和5μM，在每个小图的右手侧标出。
图3：筛选策略的示意图，在人体上评估药物功效之前，在灵长类动物体外细胞培养物模型上、然后在灵长类物种体内研究中评估药物候选物的功效。将食蟹猴和人IPSC来源的神经元用作体外模型以评估靶向UBE3A反义物的寡核苷酸的靶结合和功效。在体内研究之前，按优先次序排序具有良好功效特征的候选物。
图4：以食蟹猴IPSCs来源的神经祖细胞执行的不同步骤的概览。双重SMAD抑制方案的修改形式用于灵长类动物IPSC系的神经化。MT是指MT培养基；N2B27+SB+LDN是指补充有SB-431542和LDN-193189的N2B27培养基；N2B27+FEB是指补充有FGF，EGF和BDNF的N2B27培养基。
图5：Cyno和人神经前体显示相似的Sox2和Nestin染色阳性，并且各自的分化的神经元染色呈Map2阳性。
图6：应用的定向分化方法诱导可比的跨物种神经元分化。图6A)Cyno IPSC在补充有BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸磷酸盐(BGAA)的基础培养基中分化14天。自cyno IPSC和第14天的NC分离RNA，并且通过qPCR分析所示的标志物的表达。将数据相对于持家基因GAPDH进行标化，并且相对于cyno IPSC中的表达水平呈现。图6B)从人PSC和在补充有BGAA的基础培养基中分化14天的人NC中分离RNA，并且通过RNA测序分析所示的标志物的表达。数据以RPKM值表示。图6C)从人PSC和在补充有BGAA的基础培养基中分化14天的人NC中分离RNA，并且通过qPCR分析所示的标志物的表达。将数据相对于持家基因GAPDH标化，并且相对于人PSC中的表达水平呈现。图6D)从在补充有BGAA的基础培养基中分化14天的cyno(左图)和人(右图)NC中分离RNA，通过qPCR分析了UBE3A和UBE3A-ATS转录物的表达。左图：数据相对于持家基因TBP标化并且相对于cyno IPSC呈现。右图：数据相对于持家基因GAPDH标化，并且相对于人PSC呈现。
图7：实验设置的示意图，用于比较从cyno神经前体获得适用于化合物筛选的稳健神经元培养物的4种分化方法(A-D)。MI指有丝***抑制剂。
图8：如图7所述的4种神经元分化方法的基于图像的比较。将NC在分化的第35天固定，并进行品红显示的Sox2染色(Sox2为Glia和NSCs的标志物)和绿色显示的Map2染色(Map2为NC的标志物)。
图9：为了测试解离和再接种人iPSC来源的分化NCs的可行性，平行分化两个细胞系。对于每个细胞系，细胞直接分化(即没有重新铺板)6周，或在第21天解离并再接种然后再培养3周。神经元(MAP2)和神经胶质(GFAP)标志物的免疫荧光染色显示，解离和再接种(重新铺板)不妨碍细胞分化的能力。
图10：定量分析在有和无分化和再接种(重新铺板)时在两种不同的iPSC来源的细胞系中的分化程度。HuC/D是由神经元表达的标志物，并在总共6周分化的培养物中通过免疫荧光染色来检测，并通过高内涵成像来量化。数据显示重新铺板不会显著改变神经元分化的程度。
图11：分析了微管相关蛋白Tau和其两种磷酸化形式的表达。在有和无再接种的两个细胞系中的持续表达和磷酸化程度证明，重新铺板(解离和再接种)不破坏人iPSC来源的NC的细胞骨架特征，表明生理学特征不会被解离和再接种NC而改变。
图12：工作流程示意图，该工作流程能够持续提供稳健的灵长类动物神经元培养物用于高通量形式的筛选。SFA是指补充有Shh，FGF8和抗坏血酸磷酸盐的基础培养基；BGAA是指补充有BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸磷酸盐的基础培养基；箭头表示解离和再接种(重新铺板)。
图13：测试化合物在来自人和食蟹猴的均匀分布的神经细胞(NC)的标准化细胞培养物上的靶结合。测试了两种浓度(低：0.02μM；高：2μM)针对UBE3A-反义转录物(antisense)的反义寡核苷酸，在人中具有已知的靶结合。A和B中来自食蟹猴的NC培养物与C和D中来自人的NC培养物相比，显示出相当的靶结合。在所示浓度下处理cyno和人NCs导致UBE3A反义转录物减少和伴随的UBE3A转录物(有义)上调。根据图12中包括的工作流程产生这些细胞培养物。
发明详述
如本文所使用的术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸，特别是靶核酸上的连续序列，杂交来调节靶基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是siRNA。优选地，本发明的反义寡核苷酸是单链的。
如本文所用，术语“基础培养基”是指由等体积的DMEM：F12 Glutamax培养基和Neurobasal培养基(Gibco，Invitrogen)组成的成分确定培养基，其中补充有1xB27(Gibco，Invitrogen)，1xN2(Gibco，Invitrogen)、0.1mMβ-巯基乙醇(Gibco，Invitrogen)。术语“BGAA”是指补充有20ng/ml BDNF(Peprotech)，10ng/ml GDNF(Peprotech)，0.5mM cAMP(BIOLOG Life Science)和100μM抗坏血酸磷酸盐(Sigma)的基础培养基。术语“SFA”是指补充有200ng/ml Shh，100ng/ml FGF8和100μM抗坏血酸磷酸盐的基础培养基。
如本文所用的术语“连续核苷酸序列”是指与靶核酸互补的寡核苷酸的区域。该术语在本文中与术语“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”可互换使用。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸都存在于该连续核苷酸序列中。在一些实施方案中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列并且可以任选地包含其它核苷酸(一个或多个)，例如可以用于将官能团连接至连续核苷酸序列的核苷酸接头区。核苷酸接头区可以或可以不与靶核酸互补。
如本文所用，术语“成分确定培养基”或“化学成分确定培养基”是指细胞培养基中所有单个组分和它们各自的浓度是已知的。成分确定培养基可以含有重组的和化学确定的成分。
如本文所使用的，术语“分化”是指将较低分化细胞转化为较高分化的细胞，特别是有丝***后组织特异性细胞类型，的一个或多个步骤，例如将NPC转化为NC。可以例如通过向细胞培养基中加入一种或几种分化剂，诱导NPC向NC的分化。
如本文所用，术语“功效谱”或“功效”按本领域技术人员通常理解的定义，包括基于使测试***(例如细胞培养物或生物体)暴露于(特别是以不同浓度和/或不同施用途径)药物候选物，并随后确定与药物候选物的期望效应相关的所得细胞和/或生理效应，来评估药物候选物的功效。用于确定细胞和/或生理效应的参数在各药物候选物的上下文中定义，包括与药物候选物在测试***或生物体上的期望表型效应相关的参数。优选地，记录一个以上参数，包括但不限于存活率，细胞活力，形态，特定基因的表达和/或表达水平，和蛋白质合成，以建立药物候选物的功效谱。在本发明的一个方面中，建立效能谱包括评估靶结合。
“表达标志物”或“标志物”可用于确定细胞类型的身份。细胞特异性基因的某些有信息的DNA序列可以被转录成mRNA，并且通常随后被翻译成在细胞中发挥特定功能的蛋白质(其基因产物)。标志物的表达可以通过本领域已知的方法在RNA水平或蛋白质水平上检测和定量。IPSC细胞标志物是本领域已知的，并且包括但不限于TRA-1-60，TRA-1-81，Ecat1，Nanog，Oct4/POU5F1，Sox2，Rex1/Zfp-42和UTF1、或其任何组合。NPC细胞标志物在本领域中是已知的，并且包括但不限于Sox2，Nestin，Sox1，Pax6，Dach1。NC细胞标志物是本领域已知的，并且包括但不限于MAP2，β-III-微管蛋白，DCX/Doublecortin，SYN1/Synapsin 1和GPHN/Gephyrin。
如本文所用，术语“遗传距离”应理解为两个物种，两个基因组或两个群体之间的遗传分歧的量度。遗传距离，例如不同物种之间的遗传距离，可以通过本领域已知的方法确定，包括但不限于确定Nei标准距离，Goldstein距离或Rynolds/Weir/Cockerham遗传距离。可以使用本领域已知的软件来计算遗传距离，包括但不限于POPTREE2或DISPAN。当遗传距离小时，“遗传相似性”高。
如本文所用，使用以下缩写词；成纤维细胞生长因子(FGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)，音猬因子(sonic hedgehog，shh)，成纤维细胞生长因子8(FGF8)，脑源性神经营养因子(BDNF)，神经胶质细胞来源的神经营养因子(GDNF)，环腺苷单磷酸(cAMP)，Rho相关的卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶(ROCK)。
如本文所用，术语“生长因子”意指引起细胞增殖的生物活性多肽或小分子化合物，并且包括生长因子及其类似物。
如本文所用，“高通量筛选”应理解为表示，使用本文所述的新试验，可以分析和比较相对大量的不同疾病模型条件和/或化学化合物。典型的这种高通量筛选在多孔微量滴定板中进行，例如在96孔板或384孔板或具有1536或3456孔的板中进行。
“LNA核苷”是修饰的核苷，其在核苷酸的核糖糖环的C2'和C4'之间包含连接基团(称为二价基(biradicle)或桥)。这些核苷在文献中也称为桥联核酸或双环核酸(BNA)。
如本文所用，术语“均匀分布的”，“均匀分布”或“均一分布”是指，本领域技术人员通常理解的，实体在1维，2维或多维空间中的分布，特别是细胞在细胞培养支持物的二维表面上的分布。如果每个区域的平均细胞计数在整个细胞培养表面上基本恒定，则在二维细胞培养表面上建立均匀分布。细胞的分布可以通过例如核染色和使用荧光显微镜确定每个区域的细胞核的数量来评估。细胞非均匀分布的指标包括例如细胞团块，显著数量的重叠细胞核、或显著部分的缺乏细胞的细胞培养区域。一种或多种细胞类型的具有均匀分布的细胞的细胞培养物在本文中被称为“标准化的”。“标准化细胞培养物”或“标准化NC培养物”是指根据本发明产生的细胞培养物，其中细胞的分布基本上是均匀的，即细胞均匀分布，且细胞培养物的特征在于细胞的均匀分布，其中细胞培养物可以包括一种或多种细胞类型。因此，如果细胞显示均匀分布(例如通过核染色和确定每个区域的细胞核数量进行评估)，则认为细胞培养物是标准化的。
本文使用的术语“修饰的核苷间连接”按本领域技术人员通常理解定义为，将两个核苷共价连接在一起的、除磷酸二酯(PO)连接以外的连接。具有修饰的核苷间连接的核苷酸也称为“修饰的核苷酸”。与磷酸二酯连接相比，修饰的核苷间连接可以增加寡核苷酸的核酸酶抗性。对于天然存在的寡核苷酸，核苷间连接包括在相邻核苷间产生磷酸二酯键的磷酸基团。修饰的核苷间连接对于稳定用于体内使用的寡核苷酸是特别有用的，并且可用于防止在本发明寡核苷酸中DNA或RNA核苷的区域处(例如在gapmer寡核苷酸的gap区域内以及在修饰的核苷的区域中)的核酸酶切割。
如本文所用，术语“MT培养基”是指这样的成分确定培养基，该培养基含有Dulbecco改良Eagle培养基和Ham氏F12营养混合物(DMEM/F12)并具有2.5mM GlutaMAXTM，7μg/ml胰岛素，450μM单硫代甘油，1x脂质浓缩物，5mg/ml BSA，14ng/ml***钠，1x非必需氨基酸，2mg/ml肝素，15μg/ml转铁蛋白和220μM抗坏血酸-2-磷酸盐。
如本文所用，“神经元前体细胞”或“NPC”是指多能细胞的一个子集，其源自IPSC并表达一些神经祖细胞标志物，包括例如Nestin。特别是可以根据Costa等人Cell Rep 2016；15：86-95和Dunkley等人,Proteomics Clin Appl 2015；7-8：684-94(其通过引用整体并入本文)所述的方法或根据本文所述的方法，产生NPC。NPC可以无限扩增并可分化成神经元或神经胶质细胞(例如星形胶质细胞和少突胶质细胞)。术语“患者特异性NPC”是指由已经从患者的体细胞重编程的患者IPSC获得的NPC。如本文所用，“从健康个体获得的NPC”是指从明显健康且未怀疑患有任何病症或疾病的个体的体细胞获得的IPSC分化的NPC。
如本文所用，“神经元细胞”或“NCs”是指来自神经元谱系的组织特异性细胞。如本文所述，使用特定的细胞培养条件，例如通过撤除生长因子或通过添加一种或多种分化剂，NC可以在体外从NPCs分化。
如本文所用，术语“非人灵长类动物”或“NHP”是指，除智人(Homo sapiens)之外属于灵长类动物的物种。具体而言，根据本发明公开的方法,NHP物种包括但不限于，黑猩猩(Pan troglodytes),倭黑猩猩(Pan paniscus),白掌长臂猿(Hylobates lar),西非大猩猩(Gorilla gorilla)，苏门达腊猩猩(Pongo abelii)，婆罗洲猩猩(Pongo pygmaeus),青长尾猴(Cercopithecus mitis),白臀长尾猴(Cercopiticus neglectus),黑脸绿猴(Chlorocebus aethiops),绿猴(Chlorocebus sabaeus),东非黑白疣猴(Colocusguereza),黑冠白睑猴(Lophocebus aterrimus),短尾猴(Macaca arctoides),熊猴(Macaca assamensis),食蟹猴(Cynomolgus monkey),日本猴(Macaca fuscata),猕猴(Macaca mulatta(恒河猴)),豚尾猴(Macaca nemestrina),狮尾猴(Macaca silenus),鬼狒(Mandrillus leucophaeus),山魈(Mandrillus sphinx),藏酋猴(Macaca thibetana),东非狒狒(Papio anubis),草原狒狒(Papio cynocephalus),***狒狒(Papiohamadryas),几内亚狒狒(Papio papio),豚尾狒狒(Papio ursinus),长尾叶猴(Presbytisentellus),狮尾狒(Theropithecus gelada),阿氏夜猴(Aotus azarae),秘鲁夜猴(Aotusnancymaae),黑夜猴(Aotus nigriceps),夜猴(Aotus trivirgatus),巴西夜猴(Aotusvociferans),白腹蜘蛛猴(Ateles belzebuth),棕头蜘蛛猴(Ateles fusciceps),普通狨(Callithrix jacchus),暗色伶猴(Callicebus moloch),倭狨(Cebuella pygmaea),卷尾猴(Cebus apella),金狮面狨(Leontopithecus rosalia),白脸僧面猴(Pitheciapithecia),棕须柽柳猴(Saguinus fuscicollis),斑柽柳猴(Saguinus geoffroyi),白唇柽柳猴(Saguinus labiatus),长须柽柳猴(Saguinus mystax),绒顶柽柳猴(SaguinusOedipus)和松鼠猴(Saimiri sciureus)。
本文使用的术语“cyno”是食蟹猴的缩写，和/或是指来源于食蟹猴的物质，包括但不限于细胞，组织，器官，血液或由其来源的细胞。
“核苷酸”是寡核苷酸和多核苷酸的结构单元，为了本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。在自然界中，核苷酸(例如DNA和RNA核苷酸)包含核糖部分，核碱基部分和一个或多个磷酸基团(其在核苷中不存在)。核苷和核苷酸也可以互换地称为“单元”或“单体”。
如本文所用，术语“源自人类基因组的核苷酸序列”是指相应的核苷酸序列来源于人类基因组参考序列，即至少全球人类的一个亚群在基因组中包含该相应核苷酸序列。此外，如本文所用，术语“来源自人类基因组的核苷酸序列”用于这样的序列，所述序列使用NCBI/Blast数据库和算法具有最高的最大得分值而归属于人类基因组(Zheng Zhang,Scott Schwartz,Lukas Wagner,and Webb Miller(2000),"A greedy algorithm foraligning DNA sequences",J Comput Biol 2000；7(1-2):203-14.)。不受理论束缚，认为如果查询序列源自人类基因组的话，则查询序列与人类参考序列的比对得分将高于查询序列与非人类参考序列的比对得分。
如本文所用的术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指，与相应的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一个或多个修饰而修饰的核苷。在优选的实施方案中，修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语“修饰的核苷”也可以与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。
术语“修饰的核苷间连接”按本领域技术人员通常理解被定义为，除了磷酸二酯(PO)连接之外的、将两个核苷共价连接在一起的连接。具有修饰的核苷间连接的核苷酸也称为“修饰的核苷酸”。在一些实施方案中，与磷酸二酯连接相比，修饰的核苷间连接增加寡核苷酸的核酸酶抗性。对于天然存在的寡核苷酸，核苷间连接包括在相邻核苷间产生磷酸二酯键的磷酸基团。修饰的核苷间连接对于稳定用于体内使用的寡核苷酸是特别有用的，并且可用于防止本发明寡核苷酸中的DNA或RNA核苷的区域处的核酸酶切割，例如在gapmer寡核苷酸的gap区域内以及在修饰的核苷的区域中的切割。
如本文所用，术语“N2B27”是指补充有N2和B27(均来自Gibco，Invitrogen)的、由等体积的DMEM：F12(Gibco，Invitrogen)组成的成分确定培养基。
如本文所用，术语“寡核苷酸”如本领域技术人员通常理解地定义，是指包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。这种共价结合的核苷也可以被称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常通过固相化学合成在实验室中制备并之后进行纯化。当提及寡核苷酸的序列时，指共价连接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。寡核苷酸可以包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸。如本文所使用的术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸，特别是靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是siRNA。优选地，反义寡核苷酸是单链的。
如本文所用，术语“重编程”是指将体细胞转化为较低分化的细胞所需的一个或多个步骤，例如用于将成纤维细胞，脂肪细胞，角质形成细胞或白细胞转化为NPC的步骤。“重编程的”细胞指通过如本文所述重编程体细胞而产生的细胞。
本文使用的术语“小分子”、或“小化合物”、或“小分子化合物”是指，合成的或天然存在的有机或无机分子，其分子量通常小于10,000克/摩尔，任选小于5,000克/摩尔，并且任选小于2,000克/摩尔。
如本文所用，术语“体细胞”是指，非生殖细胞(例如，***和卵子，产生***和卵子的细胞(配子体细胞))和未分化干细胞的任何形成生物体的细胞。
如本文所用，术语“干细胞”是指具有自我更新和分化能力的细胞。如本文所用的“未分化的干细胞”是指未经历分化的干细胞。如本文所用，“多能干细胞”或“PSC”是指可产生三个胚层(内胚层，外胚层，中胚层)的细胞类型以及生殖系的干细胞。多能干细胞(PSCs)包括但不限于“胚胎干细胞”(“ESCs”)和“诱导的多能干细胞”(“IPSCs”)。术语“hIPSC”和“cIPSC”分别指源自人类细胞的IPSC和源自食蟹猴细胞的IPSCs。
如本文所用，术语“细胞活力的实质性丧失”是指，在应用不同的细胞培养条件、或在规定的方法中操作细胞时(特别是与从细胞培养支持物上解离细胞有关的操作)，细胞活力的降低。在一个实施方案中，细胞活力的实质性丧失意味着，5％以上的细胞变成无活性和/或经历细胞凋亡。在进一步的实施方案中，细胞活力的实质性丧失意味着，10％以上，15％以上，20％以上，或25％以上的细胞变成无活性和/或经历细胞凋亡。因此，在一个实施方案中，术语“基本上保持活力”是指95％以上的细胞保持活力。在进一步的实施方案中，基本上保持活力是指90％以上，85％以上，80％以上或75％以上的细胞保持活力。
如本文所用，“合适的分化培养基”也被描述为“分化培养基”，是指用于将NPC分化成NC的任何化学上确定的培养基。如本文所述的分化培养基含有至少一种“分化剂”。分化剂包括但不限于导致细胞分化的生物活性多肽或小分子化合物。
“靶”是指期望调节的蛋白质。“靶核酸”是本发明的寡核苷酸与之杂交的预期靶标，并且可以例如是基因，RNA，非编码RNA，长非编码RNA，mRNA和pre-mRNA，成熟的mRNA或cDNA序列。在一些实施方案中，靶核酸是非编码RNA或长非编码RNA或其子序列。对于特定的体内或体外应用，本发明的寡核苷酸能够降低SNORD109B下游SNHG14转录物的水平，从而在预期的靶细胞中缓解亲本UBE3A转录物的抑制。如在整个寡核苷酸的长度上测量的，本发明的寡核苷酸的连续核碱基序列与靶核酸互补，任选地除一个或两个错配以外，以及任选地排除基于核苷酸的接头区域(其可以将寡核苷酸连接至任选的官能团如缀合物上)。寡核苷酸包含与靶核酸分子的子序列互补或杂交的连续核苷酸序列。
如本文所用的术语“靶序列”是指存在于靶核酸中的核苷酸序列，其包含与本发明的寡核苷酸互补的核碱基序列。在一些实施方案中，靶序列由靶核酸上与本发明寡核苷酸的连续核苷酸序列互补的区域组成。在一些实施方案中，靶序列比单个寡核苷酸的互补序列长，并且可以例如是可以被本发明的几个寡核苷酸靶向的靶核酸的优选区域。本发明的寡核苷酸包含与靶核酸例如靶序列互补的连续核苷酸序列。寡核苷酸可以包含至少8个核苷酸的、与靶核酸分子中存在的靶序列互补或杂交的、连续核苷酸序列。连续的核苷酸序列(以及因此靶序列)包含至少8个连续的核苷酸，例如9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29或30个连续核苷酸，例如12-25个，例如14-18个连续核苷酸。
如本文所用的术语“靶细胞”是指表达靶核酸的细胞。在一些实施方案中，靶细胞可以在体内或体外。在一些实施方案中，靶细胞是哺乳动物细胞，诸如啮齿动物细胞，诸如小鼠细胞或大鼠细胞，或灵长类动物细胞诸如猴细胞或人类细胞。在一个实施方案中，靶细胞是神经元细胞(NC)。
如本文所用，术语“毒性谱”或“毒性”按本领域通常理解定义为包含潜在有害或无害物质的毒理学评估，所述评估基于将测试***(例如细胞培养物或细胞培养物)暴露于该物质，特别是以不同的浓度和/或不同的施用途径，随后确定所产生的细胞和/或生理效应，例如细胞存活或健康。确定细胞和/或生理效应的参数在本领域中是熟知的，包括但不限于存活，细胞活力，形态，某些基因的表达和/或表达水平、和蛋白质合成。优选地，记录一个以上参数以建立毒性未知的物质的毒性谱。本领域中使用药物候选物的毒性谱来选择药物候选物用于进一步开发，例如，在灵长类动物或人上进行体内测试。
本发明提供了用于从包括人在内的不同灵长类物种产生可重现和标准化的分化NC培养物的新方法，所述培养物可用于药物候选物的体外高通量测试。该方法包括提供灵长类NPC，将NPC分化为NC，并通过解离分化的灵长类NCs、以合适的细胞培养形式再接种细胞而不实质性丧失细胞活力、以及继续进行NC分化来使细胞培养物能够用于药物候选物的高通量筛选。灵长类NPC可以来源于IPSCs或转分化细胞，两者都可以从体细胞产生。优选地，所述体细胞是灵长类动物细胞，包括人体细胞。
在一个实施方案中，提供了用于自不同灵长类物种产生均匀分布的分化神经元细胞(NC)的细胞培养物的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供神经元前体细胞(NPC)；和
b)将NPC分化为NC，包括步骤：
(i)在分化的第20天和第45天之间将分化的NC从其支持物上解离；和
(ii)以合适的细胞培养形式再接种细胞并继续NC分化4天至15天。
为了实现这里描述的本发明方法，必须绕过NC培养的一些现有限制。人们普遍接受的观点是，与NPC可以以贴壁或漂浮培养物形式无限扩增不同，分化中的NCs严格依赖于与基质的相互作用，基质通常由细胞培养板的生物聚合物涂层组成。此外，分化的NC对细胞应激(cellular stress)变得敏感，因此，分化细胞的传代被认为对细胞有害。根据本发明的创新方法公开了细胞培养条件，由此可以从不同的灵长类物种产生均一的NC培养物，其中NC在分化的第10天和第40天之间从其支持物解离而没有实质性的活力丧失。NC可以以合适的细胞培养形式再接种并继续分化。解离和再接种导致分化的NC在细胞培养区域的均匀分布。此外，本发明的方法允许在NC分化的晚期改变细胞培养形式。在进一步的实施方案中，步骤b)(i)包括在分化的约第25天和约40天之间，约28天和约30天之间，约28天或约30天时，将分化的NC从其支持物上解离。
因此，本发明的一个方面是如本文所述的产生均一的分化NC培养物的方法。在一个实施方案中，步骤b)包括将NPC分化成神经细胞(NC)，包括以下步骤：(i)在分化的第20和45天之间将分化的NC从其支持物上解离；和(ii)以合适的细胞培养形式再接种细胞并继续NC分化4天至10天，其中NC基本上保持活力。所述解离和再接种步骤，对于获得在细胞培养表面区域(例如细胞培养孔)上均匀分布的分化灵长类动物NCs、和/或对于收获分化的灵长类动物NC而没有实质性的丧失活力，是关键的。因此，根据本发明产生的分化灵长类NC培养物测定试验，与没有解离和再接种时产生的细胞培养物相比，可以显示出更均匀分布的细胞，并且更适用于高通量测定。重要的是，细胞培养形式可以在NC分化的后期阶段改变。这与本领域的方法形成对比，在所述方法中最终的细胞培养形式必须在早期时间点予以使用。事实上，能够改变细胞培养形式可以提供相当大的供给灵活性(logisticflexibility)。
灵长类NC的高度可重现的细胞培养物是充分标准化的，并且可用于化合物筛选测定，包括但不限于药物候选物的体外功效评估。此外，如本文所述的细胞培养物可以用于选择药物候选物，特别是用于选择药物候选物用于如本文所述的进一步开发。在一个实施方案中，根据本发明的细胞培养物用于确定如本文所述的药物候选物的体外功效谱。在另一个实施方案中，药物候选物的体外功效谱在测定本文所述的体内功效谱之前确定。在另一个实施方案中，根据本发明的细胞培养物用于确定如本文所述的药物候选物的体外毒性谱。
因此，在一个实施方案中，分化的灵长类动物NC从细胞培养容器上解离，其中NC基本上保持活力。解离的NC可以以所需细胞培养物形式以优化的细胞密度再接种，其中所述细胞密度经优化符合给定细胞培养物测定的需要。在一个实施方案中，本发明中描述的解离和再接种条件可以应用于不同的灵长类物种。在一个实施方案中，根据本发明的方法可以用于药物候选物的功效谱的物种间比较，其中细胞培养物是从至少两个物种的细胞单独产生的，其中将基本上相同的条件应用于所有物种的培养物，并且其中对于所有物种，确定并比较效力谱。本发明的范围涵盖，使用基本上相同的细胞培养条件产生源自至少一种灵长类动物物种，至少两种灵长类动物物种或至少三种灵长类动物物种的标准化细胞培养物测定试验，并且比较和整合按照该测定试验读数所测定的结果，以确定至少一种药物候选物的综合效能谱。
在一个实施方案中，NPC由源自重编程的体细胞的IPSC产生。将体细胞重编程为IPSC可以通过引入参与维持IPSC性质的特定基因来实现。适合将体细胞重编程为IPSC的基因包括但不限于Oct4，Sox2，Klf4和C-Myc及其组合。在一个实施方案中，用于重编程的基因是Oct4，Sox2，Klf4和C-Myc。WO2012/022725中描述了用于将体细胞转分化成NPC的基因组合，其通过引用并入此处。
内脏，皮肤，骨骼，血液和***均由体细胞组成。用于产生IPSC的体细胞包括但不限于成纤维细胞，脂肪细胞和角质形成细胞，并且可以从皮肤活检物获得。其他合适的体细胞是从血液样品获得的白细胞、成红细胞、或上皮细胞、或从血液或尿样品获得的其他细胞，并通过本领域已知的方法和本文所述重编程为IPSC。体细胞可以从健康个体或患病个体获得。如本文所述的用于重编程的基因通过本领域已知的方法引入体细胞，通过重编程载体递送至细胞中或通过小分子激活所述基因。用于重编程的方法包括例如逆转录病毒，慢病毒，腺病毒，质粒和转座子，微RNA，小分子，修饰的RNA和重组蛋白。在一个实施方案中，使用慢病毒来递送如本文所述的基因。在另一个实施方案中，使用仙台病毒(Sendaivirus)颗粒将Oct4，Sox2，Klf4和C-Myc递送至体细胞。此外，体细胞可以在至少一种小分子存在下培养。在一个实施方案中，所述小分子包含Rho相关卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶(ROCK)家族的蛋白激酶的抑制剂。ROCK抑制剂的非限制性例子包括：fasudil(1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪)，Thiazovivin(N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺)和Y-27632((+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐)。由此产生的IPSCs可被诱导分化成NPC。在一个实施方案中，诱导IPSC分化成NPC。
在一个实施方案中，灵长类动物NPC通过双重SMAD抑制从IPSC产生。在一个实施方案中，通过使细胞与SB-431542(Calbiochem)和LDN-193189(Calbiochem)接触而由IPSC产生NPC。在一个具体实施方案中，通过使细胞接触5ng/ml FGF(Peprotech)，10μM SB-431542(Calbiochem)和100nM LDN-193189(Calbiochem)，由IPSC产生NPC。产生的灵长类NPC可以在补充有FGF，EGF和BDNF的基础培养基中扩增。在一个实施方案中，使NPC在补充有10ng/mlFGF(Peprotech)，10ng/ml EGF(RnD)和20ng/ml BDNF(Peprotech)的基础培养基中扩增。在补充有FGF，EGF和BDNF的基础培养基中继续传代产生稳定的神经祖细胞系(NPC系)。稳定的NPC系由其自我更新能力和发育阶段特异性标志物Sox2和Nestin的表达来定义。因此，在一个实施方案中，灵长类NPC表达Sox2和Nestin。
为了扩大增殖NPCs，细胞在包含补充有生长因子的无血清培养基的扩增培养基中生长。在一个实施方案中，所述生长因子包含FGF，BDNF和EGF。因此，在一个实施方案中，该方法还包括在适于NPC增殖的条件下孵育步骤a)的细胞，例如，直至达到规定数量的细胞/区域。本文描述了扩增培养基的非限制性示例。在一个实施方案中，扩增培养基补充有10-50ng/ml FGF，10-50ng/ml EGF和1-20ng/ml BDNF。在一个具体的实施方案中，NPC扩增培养基是补充有10ng/ml FGF2,10ng/ml EGF和20ng/ml BDNF的基础培养基。NPC可以以不受限制的量生产，因此最适用于需要大量测定板的高通量细胞培养测定试验。培养在本领域技术人员的能力范围内。
在一个实施方案中，在启动分化之前，用合适的缓冲液或培养基洗涤灵长类NPC以去除任何死亡细胞。优选地，在细胞培养方案的每个步骤之间改变培养基，例如通过抽吸或离心细胞并且弃去上清液来去除培养基，然后将用于随后步骤的培养基添加到细胞中。在一个实施方案中，细胞在加入后续步骤的培养基之前用合适的缓冲液或培养基洗涤，以除去任何死细胞和任何残留培养基或在前一步骤中应用的生长因子或细胞因子。本领域已知可用于洗涤细胞的缓冲液或培养基。用于洗涤细胞的合适缓冲液的一个实例是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一个实施方案中，灵长类NPC培养物以约5000个细胞/cm2至约100000个细胞/cm2的密度提供。在进一步的实施方案中，灵长类NPC培养物以约10000个细胞/cm2至约50000个细胞/cm2的密度提供。在一个实施方案中，贴壁灵长类NPC培养物以约20000个细胞/cm2至约40000个细胞/cm2的密度提供。在一个实施方案中，贴壁灵长类NPC培养物以约30000个细胞/cm2的密度提供。在一个实施方案中，贴壁灵长类NPC培养物在Laminin521支持物上提供。
在一个实施方案中，通过本领域已知和本文所述的方法获得的灵长类动物NPC，在下一步中通过细胞与Shh(音猬因子)，FGF8(成纤维细胞生长因子8)和抗坏血酸磷酸盐接触而诱导分化成NC。在一个实施方案中，将NPC与本文所述的包含Shh，FGF8和抗坏血酸磷酸盐的化学成分确定培养基一起孵育。在一个实施方案中，培养基补充有50-1000ng/ml Shh，25-500ng/ml FGF8和20-200μM抗坏血酸磷酸盐。在进一步的实施方案中，使细胞与Shh，FGF8和抗坏血酸磷酸盐接触约1天，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约8天，约9天或约10天。在另一个实施方案中，使细胞与Shh，FGF8和抗坏血酸磷酸盐接触约5天至约10天。在一个具体的实施方案中，灵长类NPC在补充有200ng/ml Shh，100ng/ml FGF8和100μM抗坏血酸磷酸盐的基础培养基中培养约7天。
在一个实施方案中，在诱导神经元分化后，细胞以约10000个细胞/cm2至约80000个细胞/cm2，约20000个细胞/cm2至约70000个细胞/cm2，约30000个细胞/cm2至约60000个细胞/cm2，或约40000个细胞/cm2至约50000个细胞/cm2重新铺板。在一个具体的实施方案中，在诱导神经元分化后细胞以约45000个细胞/cm2的密度重新铺板。
在一个实施方案中，诱导神经元分化后的细胞在下一步在补充有BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸磷酸盐的基础培养基中再分化约15天，再分化约16天，再分化约17天，再分化约18天，再分化约19天，再分化约20天，再分化约21天，再分化约22天，再分化约23天，再分化约24天，再分化约25天，再分化约26天，再分化约27天，再分化约28天，再分化约29天，再分化约30天，再分化约31天，再分化约32天，再分化约33天，再分化约34天或再分化约35天。在一个具体的实施方案中，细胞在补充有20ng/ml BDNF(Peprotech)，10ng/ml GDNF(Peprotech)，0.5mM cAMP(BIOLOG Life Science)和100μM抗坏血酸磷酸盐(Sigma)的基础培养基中再培养约19天至约35天。
在一个实施方案中，根据本发明，按本文所述的，将分化的NC从其支持物上解离，并以合适的细胞培养物形式再接种。在进一步的实施方案中，NC在补充有BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸的基础培养基中分化至少约10天，至少约11天，至少约12天，至少约13天，至少约14天，至少约15天，至少约16天，至少约17天，至少约18天，至少约19天，至少约20天，至少约21天，至少约22天，至少约23天，至少约24天，至少约25天，至少约26天，至少约27天或至少约28天，之后解离并以合适的细胞培养测定试验形式再接种。在进一步的实施方案中，灵长类动物NC在补充有BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸的基础培养基中分化约15至约30天，约20至约25天，约21至约23天，然后解离并以合适的细胞培养测定试验形式再接种。
在本发明的一个方面，通过本文所述的方法获得的分化的NC从细胞培养基质解离而没有实质性的细胞活力丧失。因此，在一个实施方案中，收获分化的NC而没有实质性的细胞活力丧失。细胞数量可根据本领域中使用的常规方法确定，包括但不限于在血细胞计数器中计数细胞数量或使用流式细胞术。细胞活力可以根据常规方法测定，包括但不限于台盼蓝和赤藓红B染色。解离后，根据基于NC的所需测定试验的具体需要或实验参数，细胞可以以合适的细胞密度再接种在合适的细胞培养孔中。
因此，在一个实施方案中，通过使用细胞分离溶液，将分化的NC与细胞培养表面分离。在一个实施方案中，将分化的NC从其支持物上解离并以合适的细胞培养形式再接种。在另一个实施方案中，分化的NC在分化的大约第20天和第45天之间从其支持物解离。从分化开始日起计数分化天数，例如与Shh，FGF8和抗坏血酸磷酸一起孵育，其中Shh，FGF8和抗坏血酸的添加日计为第0天。在另外的实施方案中，分化的NC在分化的约第15天和约第50天之间，约第28天和约30天之间，在分化的约第25天，在分化的约第26天，在分化的约第27天，在分化的约第28天，在分化的约第29天，在分化的约第30天，在分化的约第31天，在分化的约第32天，在分化的约第33天，或在约分化的第34天，从其支持物解离。在一个实施方案中，通过用细胞分离溶液孵育细胞，使分化的NC从其支持物解离。在一个实施方案中，细胞分离溶液是Accutase。Accutase是一种具有蛋白水解和胶原蛋白溶解活性的海洋来源酶。在一个实施方案中，将细胞分离溶液加入到分化的NC培养物中并孵育1至5分钟，2至4分钟，优选3分钟。孵育时间结束后，Accutase溶液用培养基，特别是基础培养基稀释。在再接种之前，除去含有Accutase的培养基并补加补充有如本文所述的生长因子的新鲜基础培养基。
分离之后，灵长类NC可以在新的细胞培养容器中再接种，例如合适的平板形式的细胞培养孔。NC可以以任何期望的密度再接种，包括低密度，中等密度和高密度。因此，均匀分布的分化NC的培养物可以以确定的和期望的密度产生，包括低密度，中密度和高密度。这与常规的细胞培养方法相反，其中细胞密度在培养开始时固定，并且其中细胞密度由于细胞增殖或细胞死亡可以随时间显著改变。在一个实施方案中，NC以高密度再接种。在进一步的实施方案中，将NC以约50000个细胞/cm2至约500000个细胞/cm2的密度，以约75000个细胞/cm2至约400000个细胞/cm2的密度，或以约100000个细胞/cm2至约300000个细胞/cm2的密度再接种。在一个具体的实施方案中，将分化的NC以约200000个细胞/cm2的密度在步骤b)(ii)中再接种。在一个实施方案中，在用BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸磷酸盐分化后，细胞解离并以约50000个细胞/cm2至约500000个细胞/cm2，约75000个细胞/cm2至约400000个细胞/cm2，或约100000个细胞/cm2至约300000个细胞/cm2的密度再接种。在一个具体的实施方案中，细胞在用BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸磷酸盐分化后解离并以约200000个细胞/cm2的密度再接种。在解离和再接种(重新铺板)后，将细胞在补充有BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸的基础培养基中进一步分化另外约1天，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约8天，约9天，约10天，约11天，约12天，约13天，约14天或约15天。
根据本发明可以使用解离并再接种的分化NC培养物来测试药物候选物的功效。在一个具体的实施方案中，在将药物候选物应用于细胞之前，细胞在补充有20ng/ml BDNF(Peprotech)，10ng/ml GDNF(Peprotech)，0.5mM cAMP(BIOLOG Life Science)和100μM抗坏血酸磷酸盐(Sigma)的基础培养基中进一步分化约7天。因此，在约10天至约50天，约15天至约45天，约30天至约40天，约35天或约37天的总分化期之后，NC细胞即可用于筛选药物候选物。在一个具体的实施方案中，在约30至约40天的总分化期后，NC即可用于筛选寡核苷酸候选物。
在进一步的实施方案中，分化的NC培养物在约28天，约29天，约30天，约31天，约32天，约33天，约34天，约35天，约36天，约37天，约38天，约39天，约40天，约41天，约42天，约43天，约44天，约45天，约46天，约47天，约48天，约49天，约50天，约51天，约52天，约53天，约54天或约55天的总分化期之后，即可用药物候选物处理。在另一个实施方案中，用药物候选物处理可以在本文所述的细胞培养方案的任何步骤进行。
在一个具体的实施方案中，灵长类动物NPC在解离和再接种前在包含20ng/mlBDNF，10ng/ml GDNF，0.5mM cAMP和100μM抗坏血酸磷酸盐的无血清分化培养基中分化为NC约21至约23天。在另一个实施方案中，如本文所述再接种后，将分化的NC与如本文所述的分化培养基一起孵育另外约1天，另外约2天，另外约3天，另外约4天，另外约5天，另外约6天，另外约7天，另外约8天，另外约9天，另外约10天，另外约11天，另外约12天，另外约13天，另外约14天，或另外约15天。在一个具体的实施方案中，在再接种后，将分化的NC在含有20ng/ml BDNF，10ng/ml GDNF，0.5mM cAMP和100μM抗坏血酸磷酸盐的无血清分化培养基中孵育约7天。此后，分化的NC即可用于药物候选物处理。
在本发明的一个方面中，在将药物候选物添加至细胞培养基之前，继续进行分离和再接种的NC的分化。因此，在进一步的实施方案中，将再接种的NC在如本文所述的分化培养基中孵育约1天，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，大约8天，大约9天，大约10天，大约11天，大约12天，大约13天，大约14天或大约15天，然后加入药物候选物。在进一步的实施方案中，步骤b)(ii)包括在再接种后用如下基础培养基分化NCs另外约1至约20天，另外约5至约10天，另外约7天，其中所述基础培养基包含1至50ng/ml BDNF，1至50ng/ml GDNF和0.1-10mM cAMP和20至200μM抗坏血酸磷酸盐，然后加入药物候选物。在一个具体的实施方案中，步骤b)(ii)包括，在再接种后用包含20ng/ml BDNF，10ng/ml GDNF和0.5mM cAMP和100μM抗坏血酸磷酸盐的基础培养基再分化NC约7天，之后加入药物候选物。
在一个实施方案中，在解离并再接种分化的NC后，将药物候选物添加到细胞培养基中。在进一步的实施方案中，在再接种分化的NC后约1天至约15天，约5天至约10天或约7天，将药物候选物添加至细胞培养基中。在一个具体的实施方案中，在再接种分化的NC后约7天，将药物候选物添加到细胞培养基中。
在一个实施方案中，灵长类动物NPC根据本文所述的方法分化为NC。在一个实施方案中，用与神经元的细胞和/或代谢功能相关的表达标志物评估神经元身份。典型的神经元标志物包括但不限于MAP2，HuC/D，Nestin，β-III-微管蛋白，DCX/Doublecortin，SYN1/Synapsin 1和GPHN/Gephyrin。与原代神经元或神经组织中的表达水平相比，与神经元身份相关的表达标志物可以在源自NPC的NCs中以较低水平表达。与原代神经元或神经组织中相应标志物的表达水平相比，NSC来源的NC中神经元表达标志物的标化表达水平可以低10000倍，或低1000倍，或低100倍，或低10倍，或低2倍。NPC来源的NC和原代神经元之间的神经元表达标志物的表达水平倍数变化，对于不同的表达标志物可以是不同的。标化可以通过将给定标志物的绝对表达水平与合适的持家基因(例如GAPDH或TBP)相关联来进行。
在一个实施方案中，本发明的创新方法用于针对包括但不限于人(Homosapiens)，食蟹猴(Macaca fascicularis)和恒河猴(Macaca mulatta)的不同灵长类物种产生具有均匀NC分布的稳健的分化NC培养物。基本上相同的细胞培养条件可应用于所有灵长类物种。
不受理论约束，本发明沿着从多能干细胞至完全分化NC的轴线区分了细胞的两个不同阶段，即NPC和分化的NC。多能NPC可如本文所公开的获得，并可扩增至任何合适的细胞数目，例如用于期望形式的细胞培养测定试验。可以冻融健康个体和患者特定的NPC等分试样。因此，根据本发明，所述NPC可以扩大到合适的细胞数目，冷冻保存或直接分化以产生稳健的分化NC培养测定试验。出乎意料地，本发明人发现，使用本申请中公开的特定条件，可收获分化的灵长类NCs并用作具有固定神经元身份的细胞的来源。这些分化的灵长类NC可以在分化的晚期从细胞培养基质分离而不实质性丧失活力。收获的分化灵长类NC可以以规定的测定试验形式再接种，其中细胞贴附于细胞培养支持物，并且可以在应用待测试的药物候选物之前或平行于该药物候选物应用，继续进行分化。本发明的方法解决了来自不同灵长类物种的NC培养物不均一的问题。因此，用本文描述的方法获得的灵长类NC培养物是筛选有效且安全的药物和阐明各种神经***疾病的新疗法的有价值模型。
因此，在本发明的另一方面，根据本发明产生的NC培养物用于测试至少一种药物候选物的功效。可以在本发明方法的任何阶段将药物候选物添加到细胞培养基中。在一个实施方案中，将药物候选物添加到分化的NC中。在一个实施方案中，将药物候选物添加到解离并再接种的分化NC中以确定药物候选物的功效谱。在进一步的实施方案中，药物候选物在分化的约第1天，约第2天，约第3天，约第4天，约第5天，约第6天，约第7天，大约第8天，大约第9天，大约第10天，大约第11天，大约第12天，大约第13天，大约第14天，大约第15天，大约第16天，大约第17天，大约第18天，大约第19天，大约第20天，大约第21天，大约第22天，大约第23天，大约第24天，大约第25天，大约第26天，大约第27天，大约第28天，大约第29天，大约第30天，大约第31天，大约第32天，大约第33天，大约第34天，大约第35天，大约第36天，大约第37天，大约第38天，大约第39天或大约第40天，加入细胞培养基中。
在一个具体的实施方案中，步骤b)(i)包括以该顺序在约28天至约30天后将分化的NC从其支持物解离，并且步骤b)(ii)包括以合适的细胞培养形式再接种细胞，继续分化NC约7天，向细胞培养基添加药物候选物，继续再分化NC约5天，并评估药物候选物的功效谱。
根据本发明的灵长类NC培养物的特征在于均匀的细胞分布，因此测试新药物候选物的功效是直接且充分标准化的。药物候选物的功效可以通过本领域已知的方法确定，包括但不限于测量与药物候选物的功效相关的表型标志物，例如标志物的表达。在一个实施方案中，药物候选物的功效通过确定疾病相关标志物的表达来测试。在一个实施方案中，药物候选物的功效通过测定疾病相关蛋白的表达来测试。在一个实施方案中，药物候选物的功效通过定量实时PCR测定相关标志物的表达来测试。在添加药物候选物后的确定时间点进行功效的确定。在进一步的实施方案中，功效的确定在加入药物候选物后在大约第1天，大约第2天，大约第3天，大约第4天，大约第5天，大约第6天，大约第7天，大约第8天，大约第9天，大约第10天，大约第11天，大约第12天，大约第13天或大约第14天进行。在一个具体的实施方案中，步骤b)(ii)包括在解离和再接种后在大约第7天将药物候选物添加到细胞培养基中，并且在将药物候选物添加到细胞培养基后在约第5天确定药物候选物的功效。可以针对不同的灵长类物种产生根据本发明的稳健且均一的分化NC培养物，并用于测试药物候选物的功效谱。在一个实施方案中，该方法适用于在灵长类物种之间，特别是NHP物种与人之间的功效的物种间比较。
本发明的另一方面是通过本文所述方法获得的均匀分布的分化灵长类NCs的用途。在一个优选的实施方案中，通过本发明的方法获得的分化的灵长类NCs用作体外模型以研究CNS疾病的病理生理学。例如，通过本发明的方法获得的分化的灵长类NC可以用于筛选逆转、抑制或预防神经学疾病的化合物。在一个实施方案中，均匀分布的分化灵长类NCs用于筛选逆转、抑制或预防药物例如糖尿病药物的神经副作用的化合物。
在一个实施方案中，根据步骤a)至b)的均匀分布的分化灵长类NCs用于高通量筛选选自小分子，蛋白质，肽和核酸的化合物和/或药物候选物。在另一个实施方案中，根据本发明的分化的NC用于核酸分子例如RNAi剂或反义寡核苷酸的高通量筛选。
在一个具体的实施方案中，提供了用于选择至少一种药物候选物用于进一步开发的体外方法，其包括分别从人(Homo sapiens)和食蟹猴(Macaca fascicularis)产生均匀分布的分化神经元的细胞培养物，所述方法包括以下步骤：
a)以约30000个细胞/cm2的密度单独针对人和食蟹猴提供神经元前体细胞(NPC)，其中所述NPC源自IPSC；
b)将NPC分化为神经细胞(NC)，包括以下步骤
(i)将NPC与补充有Shh，FGF8和抗坏血酸磷酸盐的基础培养基一起孵育约7天，以约45000个细胞/cm2的密度重新铺板细胞，将重新铺板的细胞与补充有BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸磷酸盐的基础培养基一起孵育约21天至约23天，随后将分化的NC从其支持物上解离；和
(ii)以约200000个细胞/cm2的密度单独地以合适的细胞培养形式再接种细胞，并通过将细胞与补充有BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸的基础培养基一起孵育以继续分化NC约7天，之后将细胞与药物候选物一起孵育约5天，其中将药物候选物添加到补充有BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸的基础培养基中；和
建立药物候选物对人和食蟹猴两者的功效谱，并且如果功效谱是有利的，则选择药物候选物以供进一步开发。在一个实施方案中，建立功效谱包括评估靶结合。在一个实施方案中，进一步的开发包括在NHP物种中体内测试药物候选物和/或人体内测试。
在一个实施方案中，提供了通过任何上述方法产生的分化的灵长类NC群体。在一个实施方案中，解离并再接种分化的灵长类NCs，并进一步分化，以获得分化的NC的均一且标准化的培养物。在一个实施方案中，灵长类NC源自健康个体。在另一个实施方案中，患者来源的灵长类NCs用于产生疾病相关的体外模型以研究CNS疾病的病理生理学。将患者特异性体细胞转化为分化的NC是一种易于获得且可重现的技术，可以产生患者特异性NC来源用于疾病模建或化合物筛选的高通量细胞试验。
在一个实施方案中，来自Angelman综合征患者的体细胞用于产生NPC。源自一个或几个患Angelman综合征患者的NPC可用于产生Angelman综合征的疾病模型。通过本领域已知的方法，将病因基因突变引入相应的NHP基因组中，例如通过将相应的突变引入NHP NPC中，可以在相应NHP物种中重现人类单基因疾病模型。
在另一个实施方案中，使用本发明细胞测定试验产生的数据旨在用于研究目的以解决神经疾病如神经变性疾病如阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，亨廷顿病，肌萎缩性侧索硬化症(ALS/Lou Gehrig's病)中风和脊髓损伤，或用于治疗所述神经学疾病。重要的是，本发明导致一致且可再现的细胞培养试验。事实上，源自灵长类干细胞的先前细胞培养测定试验的主要缺点是分化细胞在细胞培养区域表面的非均匀分布。本发明通过引入解离和再接种步骤解决了这个问题，该步骤出人意料地被分化中的灵长类NCs所耐受，所述细胞保持活力并且适于以确定和均一的细胞密度接种细胞培养测定试验。给定细胞培养容器表面上的均匀细胞分布可以导致改进的和更加可重现的细胞培养试验。因此，提供了产生标准化灵长类NC培养试验的方法，其中根据步骤a)至b)得到的分化NC培养物的特征在于均匀细胞分布，在高通量板孔中均匀分布的细胞，减少的簇和/或团块形成和更相等的细胞分布。因此，所得测定试验显示增加的稳健性，增加的同质性以及试验重复之间减小的变异性。在一个实施方案中，细胞均匀分布在细胞培养区域上，特别是如通过细胞核染色所评估的。
一个实施方案是，根据本发明的方法获得的标准化NC培养物用于确定药物候选物功效的用途。在本发明的另一方面，标准化灵长类NC培养物用于体外测试药物候选物的毒性。在本发明的另一方面，标准化灵长类NC培养物用于体外测试药物候选物的功效。培养物可以来源于健康个体和/或来自患病个体，并来自功效和/或毒性的结果整合以预测药物候选物的疾病和/或治疗相关生理学效应。在一个实施方案中，评估药物候选物的体外功效谱，并选择具有有利功效谱的药物候选物用于进一步开发。进一步的开发可以包括在NHP物种中药物候选物的体内测试和/或人体内测试。
在一个具体实施方案中，提供了使用来自至少两种灵长类物种的均匀分布的分化神经细胞(NC)的标准化细胞培养物来确定药物候选物的体外功效谱的方法，其中所述分化的NC培养物适用于高通量筛选，该方法包括以下步骤：
a)在分化约20天至约45天后，将分化的NC从其支持物解离并以高通量细胞培养形式再接种分化的NC；
b)将再接种的NCs在分化培养基中孵育；
c)将再接种的NC与药物候选物接触；和
d)确定药物候选物的体外功效谱。
由于NHP物种与人之间的遗传距离很小，因此在人体内进行体内测试之前，在NHP物种上的体外和/或体内评估功效数据是令人信服的。这与例如与NHP物种相比在遗传学上更远离人类的啮齿动物物种形成对比。当评估靶向人多核苷酸序列的药物候选物时，或当药物候选物本身包含具有或接近源自人基因组的序列的多核苷酸时，NHP物种与人之间的小遗传距离尤其重要。在一个实施方案中，提供如本文所述的方法，其中确定的药物候选物的体外功效谱用于药物候选物的功效谱的种间比较，其中从至少两种灵长类物种的细胞分别产生细胞培养物，其中对所有灵长类物种的培养物应用基本相同的条件，并且其中针对所有灵长类物种，确定并比较功效谱。在一个实施方案中，提供了用于选择用于进一步开发的药物候选物的方法，其包括以下步骤：(i)根据本文所述的方法，确定药物候选物对于第一物种和第二物种的体外功效谱；和(ii)如果药物候选物的功效谱是有利的，则选择药物候选物用于进一步开发。在一个实施方案中，蛋白质编码区在第一和第二物种之间的遗传相似性高。在一个实施方案中，第一和第二物种之间的蛋白质编码区的遗传相似性高于人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)之间的遗传相似性。在进一步的实施方案中，第一物种和第二物种之间蛋白质编码区的遗传相似性高于85％，高于90％或高于95％。在一个实施方案中，第一和第二物种之间的蛋白质编码区的遗传相似性高于90％。在一个特定实施方案中，第一物种是食蟹猴(Macaca fascicularis)，第二物种是人(Homo sapiens)。根据本发明的分化的NC培养物可以针对不同物种依次产生。
因此，在一个实施方案中，根据本发明来自一种或多种灵长类物种的分化NC的标准化细胞培养物用于药物候选物的体外功效测试，其中药物候选物包含多核苷酸或靶向多核苷酸的特定序列，其中多核苷酸序列来源于人类基因组。在另一个实施方案中，药物候选物包含核酸分子，例如RNAi剂或反义寡核苷酸。
在本发明的另一个实施方案中，在体外功效和/或毒性测试中评估的药物候选物包含一个或多个反义寡核苷酸。在其他实施方案中，反义寡核苷酸包含10至30个核苷酸长度或由其组成，与来自人类基因组的序列具有至少90％的同一性，优选100％的同一性。应该理解，可以修饰反义寡核苷酸序列(基序序列)，以例如增加对靶核酸的核酸酶抗性和/或结合亲和力。在一个方面，反义寡核苷酸包含糖修饰的核苷并且还可以包含DNA或RNA核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸包含糖修饰的核苷和DNA核苷。另一方面，将修饰的核苷引入寡核苷酸增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力。在此情况下，修饰的核苷可以被称为亲和力增强的修饰核苷酸。
在一个实施方案中，反义寡核苷酸包含至少1个修饰的核苷，例如至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个或至少16个修饰的核苷。在一个实施方案中，寡核苷酸包含1至10个修饰的核苷，例如2至9个修饰的核苷，例如3至8个修饰的核苷，例如4至7个修饰的核苷，例如6或7个修饰的核苷。在一些实施方案中，修饰的核苷中的至少一个是锁核酸(LNA)，例如至少2个，例如至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，或至少8个修饰的核苷是LNA。在又一个实施方案中，所有修饰的核苷都是LNA。
在一个实施方案中，反义寡核苷酸包含独立地选自这三种类型的修饰(修饰的糖，修饰的核碱基和修饰的核苷间连接)或其组合的修饰。优选地，反义寡核苷酸包含一个或多个糖修饰的核苷，例如2'糖修饰的核苷。优选地，反义寡核苷酸包含一个或多个2'糖修饰的核苷，其独立地选自2'-O-烷基-RNA，2'-O-甲基-RNA，2'-烷氧基-RNA，2'-O-甲氧基乙基-RNA，2'-氨基-DNA，2'-氟-DNA，***糖核酸(ANA)，2'-氟-ANA和LNA核苷。甚至更优选地，一个或多个修饰的核苷是LNA。
在另一个实施方案中，反义寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间连接。在一个优选的实施方案中，连续核苷酸序列内的核苷间连接是硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯核苷间连接。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷，其为2'-MOE-RNA，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个2'-MOE-RNA核苷单位。在一些实施方案中，所述修饰的核苷中的至少一个是2'-氟DNA，如2、3、4、5、6、7、8、9或10个2'-氟-DNA核苷单元。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含至少一个LNA单元，诸如1、2、3、4、5、6、7或8个LNA单元，诸如2至6个LNA单元，诸如3到7个LNA单元，4到8个LNA单元，或3、4、5、6或7个LNA单元。在一些实施方案中，所有修饰的核苷都是LNA核苷。在另一个实施方案中，寡核苷酸可以包含β-D-氧基-LNA和一个或多个以下LNA单元：硫代-LNA，氨基-LNA，氧基-LNA和/或ENA，在β-D或α-L构型中或其组合。在另一个实施方案中，所有的LNA胞嘧啶单元是5-甲基-胞嘧啶。在一个优选实施方案中，寡核苷酸或连续核苷酸序列在核苷酸序列的5'末端具有至少1个LNA单元并且在3'末端具有至少2个LNA单元。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含至少一个LNA单元和至少一个2'取代的修饰的核苷。
在本发明的一些实施方案中，反义寡核苷酸包含2'糖修饰的核苷和DNA单元。优选地，反义寡核苷酸包含LNA和DNA单元两者。优选地，LNA和DNA单元的组合总数为8-30，例如10-25，优选12-22，例如12-18，甚至更优选11-16个。在本发明的一些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷酸序列，例如连续核苷酸序列，由至少一个或两个LNA单元组成，其余核苷酸单元是DNA单元。在一些实施方案中，反义寡核苷酸仅包含LNA核苷和天然存在的核苷(例如RNA或DNA，最优选DNA核苷)，任选地具有修饰的核苷间连接如硫代磷酸酯。
在本发明的一个实施方案中，反义寡核苷酸能够募集RNA酶H。
在一个优选的实施方案中，反义寡核苷酸具有gapmer设计或结构，在本文中也称为“Gapmer”。在gapmer结构中，反义寡核苷酸以'5→3'方向包含至少三个不同的结构区，即5'-侧翼，gap和3'-侧翼，F-G-F'。在该设计中，侧翼区F和F'(也称为翼区)包含修饰核苷的连续区段，其与靶核酸互补；而gap区G包含连续的核苷酸区段，当反义寡核苷酸与靶核酸形成双链体时，该区段能够招募核酸酶，优选核酸内切酶，例如RNase，例如RNase H。能够募集核酸酶，尤其是RNase H的核苷可选自:DNA，α-L-氧基-LNA，2'-氟-ANA和UNA。位于区域G的5'和3'端侧翼的区域F和F'优选包含非核酸酶募集核苷(具有3'endo结构的核苷)，更优选一个或多个亲和力增强的修饰核苷。在一些实施方案中，3'侧翼包含至少一个LNA核苷，优选至少2个LNA核苷。在一些实施方案中，5'侧翼包含至少一个LNA核苷。在一些实施方案中，5'和3'侧翼区域均包含LNA核苷。在一些实施方案中，侧翼区中的所有核苷都是LNA核苷。在其他实施方案中，侧翼区域可包含LNA核苷和其他核苷(混合侧翼)，如DNA核苷和/或非LNA的修饰核苷，如2'取代的核苷。在这种情况下，gap被定义为至少5个RNase H募集核苷(具有2'endo结构的核苷，优选DNA)的连续序列，其在5'和3'末端侧接增强亲和力的修饰核苷，优选LNA，如β-D-氧基-LNA。因此，与gap区相邻的5'侧翼区和3'侧翼区的核苷是修饰的核苷，优选非核酸酶募集核苷。
在一些实施方案中，本发明寡聚物的修饰核苷或LNA核苷具有式I或II的通式结构：
其中W选自-O-,-S-,-N(Ra)-,-C(RaRb)-，例如在一些实施方案中为-O-；
B表示核碱基或修饰的核碱基部分；
Z表示与相邻核苷的核苷间连接或5'-末端基团；
Z*表示与相邻核苷的核苷间连接或3'-末端基团；
X表示选自-C(RaRb)-,-C(Ra)＝C(Rb)-,-(Ra)＝N-,-O-,-Si(Ra)2-,-S-,-SO2-,-N(Ra)-,和>C＝Z的基团。
在一些实施方案中，X选自：–O-,-S-,NH-,NRaRb,-CH2-,CRaRb,-C(＝CH2)-,和-C(＝CRaRb)-。
在一些实施方案中，X是-O-且Y表示选自-C(RaRb)-,-C(Ra)＝C(Rb)-,-C(Ra)＝N-,-O-,-Si(Ra)2-,-S-,-SO2-,-N(Ra)-,和>C＝Z的基团。
在一些实施方案中，Y是选自–CH2-,-C(RaRb)-,–CH2CH2-,-C(RaRb)-C(RaRb)-,–CH2CH2CH2-,-C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-,-C(Ra)＝C(Rb)-,和-C(Ra)＝N-的基团。
在一些实施方案中，Y是选自以下的基团：-CH2-,-CHRa-,-CHCH3-,CRaRb-，或-X-Y-一起表示二价连接基团(也称为基(radicle))，一起表示由选自以下的1,2,3或4个基团/原子组成的二价连接基：-C(RaRb)-,-C(Ra)＝C(Rb)-,-C(Ra)＝N-,-O-,-Si(Ra)2-,-S-,-SO2-,-N(Ra)-,和>C＝Z。
在一些实施方案中，-X-Y-表示选自由以下组成的组的二价基(biradicle)：-X-CH2-,-X-CRaRb-,-X-CHRa-,-X-C(HCH3)-,-O-Y-,-O-CH2-,-S-CH2-,-NH-CH2-,-O-CHCH3-,-CH2-O-CH2,-O-CH(CH3CH3)-,-O-CH2-CH2-,OCH2-CH2-CH2-,-O-CH2OCH2-,-O-NCH2-,-C(＝CH2)-CH2-,-NRa-CH2-,N-O-CH2,-S-CRaRb-和-S-CHRa-。
在一些实施方案中，-X-Y-表示–O-CH2-或–O-CH(CH3)-，其中Z选自-O-,-S-和-N(Ra)-，并且Ra以及，当存在Rb时，各自独立地选自氢、任选取代的C1-6-烷基,任选取代的C2-6-链烯基,任选取代的C2-6-炔基,羟基,任选取代的C1-6-烷氧基,C2-6-烷氧基烷基,C2-6-链烯基氧基,羧基,C1-6-烷氧羰基,C1-6-烷基羰基,甲酰基，芳基，芳氧基-羰基，芳氧基，芳基羰基，杂芳基，杂芳氧基-羰基，杂芳氧基，杂芳基羰基，氨基，单和二(C1-6-烷基)氨基，氨甲酰基，单和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，单和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，C1-6-烷基-羰基氨基，脲基，C1-6-烷酰基氧基，磺酰基(sulphono)，C1-6-烷基磺酰氧基，硝基，叠氮基，硫烷基(sulphanyl)，C1-6-烷硫基，卤素，其中芳基和杂芳基可以被任选取代，并且其中两个成对取代基Ra和Rb一起可以指任选取代的亚甲基(＝CH2)，其中对于所有手性中心，不对称基团可以以R或S取向存在，其中R1,R2,R3,R5和R5*独立地选自：氢，任选取代的C1-6-烷基，任选取代的C2-6-链烯基，任选取代的C2-6-炔基，羟基，C1-6-烷氧基，C2-6-烷氧基烷基，C2-6-链烯基氧基，羧基，C1-6-烷氧基羰基，C1-6-烷基羰基,甲酰基，芳基，芳氧基-羰基，芳氧基，芳基羰基，杂芳基，杂芳氧基-羰基，杂芳氧基，杂芳基羰基，氨基，单和二(C1-6-烷基)氨基，氨甲酰基，单和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，单和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，C1-6-烷基-羰基氨基，脲基，C1-6-烷酰基氧基，磺酰基(sulphono)，C1-6-烷基磺酰氧基，硝基，叠氮基，硫烷基(sulphanyl)，C1-6-烷硫基，卤素，其中芳基和杂芳基可以被任选取代，并且其中两个成对取代基一起可以指氧代，硫代(thioxo)，亚氨基，或任选取代的亚甲基。
在一些实施方案中，R1,R2,R3,R5和R5*独立地选自C1-6烷基如甲基和氢。
在一些实施方案中，R1,R2,R3,R5和R5*都是氢。
在一些实施方案中，R1,R2,R3都是氢，且R5和R5*之一也是氢，并且R5和R5*中的另一个不是氢，例如是C1-6烷基如甲基。
在一些实施方案中，Ra是氢或甲基。在一些实施方案中，当存在时，Rb是氢或甲基。
在一些实施方案中，Ra和Rb中的一个或两个是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb中的一个是氢而另一个不是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb之一是甲基，另一个是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb都是甲基。
在一些实施方案中，二价基-X-Y-是-O-CH2-，W是O，且R1,R2,R3,R5和R5*都是氢。这样的LNA核苷在WO99/014226，WO00/66604，WO98/039352和WO2004/046160中公开(这些公开都通过引用并入本文)，并且包括通常称为β-D-氧基LNA和α-L-氧基LNA核苷的核苷。
在一些实施方案中，二价基-X-Y-是-S-CH2-，W是O，且R1,R2,R3,R5和R5*都是氢。这种硫代LNA核苷在WO99/014226和WO2004/046160中公开(这些公开通过引用并入本文中)。
在一些实施方案中，二价基-X-Y-是-NH-CH2-，W是O，且R1,R2,R3,R5和R5*都是氢。这种氨基LNA核苷在WO99/014226和WO2004/046160中公开(这些公开通过引用并入本文中)。
在一些实施方案中，二价基-X-Y-是-O-CH2-CH2-或-O-CH2-CH2-CH2-，W是O，并且所有R1,R2,R3,R5和R5*都是氢。这种LNA核苷公开于WO00/047599和Morita等，Bioorganic&Med.Chem.Lett.12 73-76(其通过引用并入本文)，并且包括通常称为2'-O-4'C-亚乙基桥接的核酸(ENA)的核苷。
在一些实施方案中，二价基-XY-是-O-CH2-，W是O，并且R1,R2,R3全部以及R5和R5*中的一个是氢，并且R5和R5*中的另一个不是氢，如C1-6烷基，如甲基。这种5'取代的LNA核苷在WO2007/134181中公开，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，二价基-X-Y-是-O-CRaRb-，其中Ra和Rb中的一个或两个不是氢，例如甲基，W是O，并且R1,R2,R3全部和R5和R5*中的一个是氢，并且R5和R5*中的另一个不是氢，例如C1-6烷基，如甲基。这种双修饰的LNA核苷在WO2010/077578中公开，其通过引入并入本文。
在一些实施方案中，二价基-X-Y-表示二价连接基团-O-CH(CH2OCH3)-(2'O-甲氧基乙基双环核酸-Seth等人，2010，J.Org.Chem.Vol 75(5)第1569-81页)。在一些实施方案中，二价基-X-Y-表示二价连接基团-O-CH(CH2CH3)-(2'O-乙基双环核酸-Seth等人，2010，J.Org.Chem.Vol 75(5)第1569-81页)。在一些实施方案中，二价基-X-Y-是-O-CHRa-，W是O，并且R1,R2,R3,R5和R5*都是氢。这种6'取代的LNA核苷在WO10036698和WO07090071中公开，其在此引入作为参考。
在一些实施方案中，二价基-X-Y-是-O-CH(CH2OCH3)-，W是O，并且所有R1,R2,R3,R5和R5*都是氢。这种LNA核苷在本领域中也称为环状MOE(cMOE)，并公开在WO07090071中。
在一些实施方案中，二价基-X-Y-表示二价连接基团-O-CH(CH3)-，呈R或S构型。在一些实施方案中，二价基-X-Y-一起表示二价连接基团-O-CH2-O-CH2-(Seth等人，2010，J.Org.Chem)。在一些实施方案中，二价基-X-Y-是-O-CH(CH3)-，W是O，并且所有R1,R2,R3,R5和R5*都是氢。这种6'甲基LNA核苷在本领域中也称为cET核苷，并且可以是(S)cET或(R)cET立体异构体，参见如WO07090071(β-D)和WO2010/036698(α-L)中的公开(其都通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，二价基-X-Y-是-O-CRaRb-，其中Ra和Rb都不是氢，W是O，且R1,R2,R3,R5和R5*都是氢。在一些实施方案中，Ra和Rb都是甲基。这种6'二取代的LNA核苷在WO2009006478中公开，该文献在此引入作为参考。
在一些实施方案中，二价基-X-Y-是-S-CHRa-，W是O，且R1,R2,R3,R5和R5*都是氢。这种6'取代的硫代LNA核苷在WO11156202中公开，其在此引入作为参考。在一些6'取代的硫代LNA实施方案中，Ra是甲基。
在一些实施方案中，二价基-X-Y-是-C(＝CH2)-C(RaRb)-，例如-C(＝CH2)-CH2-或-C(＝CH2)-CH(CH3)-W是O，并且R1,R2,R3,R5和R5*都是氢。这样的乙烯基碳LNA核苷在WO08154401和WO09067647中公开，这两篇文献均通过引用并入本文。
在一些实施方案中，二价基-X-Y-是-N(-ORa)-，W是O，且R1,R2,R3,R5和R5*全部都是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基如甲基。这种LNA核苷也被称为N取代的LNA并公开在WO2008/150729中，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，二价基-X-Y-一起表示二价连接基团-O-NRa-CH3-(Seth等人，2010，J.Org.Chem)。在一些实施方案中，二价基-X-Y-是-N(Ra)-，W是O，且R1,R2,R3,R5和R5*全部都是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基如甲基。
在一些实施方案中，R5和R5*中的一个或两个是氢，并且当被取代时，R5和R5*中的另一个是C1-6烷基如甲基。在这样的实施方式中，R1,R2,R3全部可以是氢，并且二价基-X-Y-可以选自-O-CH2-或-O-C(HCRa)-，例如-O-C(HCH3)-。
在一些实施方案中，所述二价基是-CRaRb-O-CRaRb-，例如CH2-O-CH2-，W是O，且所有R1,R2,R3,R5和R5*都是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基如甲基。这种LNA核苷也被称为构象限制性核苷酸(CRN)，并公开在WO2013036868中，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，所述二价基是-O-CRaRb-O-CRaRb-，例如O-CH2-O-CH2-，W是O，并且所有R1,R2,R3,R5和R5*都是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基如甲基。此类LNA核苷也称为COC核苷酸，并公开于Mitsuoka等人，Nucleic Acids Research 2009 37(4)，1225-1238中，其通过引用并入本文。
除非另有说明，否则将认识到，LNA核苷可以为β-D或α-L立体异构形。
其它gapmer设计在WO2004/046160，WO2007/146511中公开并且通过引用并入。
本发明的一个方面是调节猪、灵长类动物或人UBE3A蛋白质表达的水平，特别是增加神经元细胞中，特别是人神经元细胞中的亲本UBE3A表达。人UBE3A蛋白存在几种同种型，在Uniprot nr.Q05086下列出。母本UBE3A基因中的几个突变可导致Angelman综合征。
本发明该方面的寡核苷酸的靶核酸是RNA，特别是长非编码RNA。本发明寡核苷酸靶向的长非编码RNA是人SNHG14(也称为UBE3A-ATS，其Ensembl条目号ENSG00000224078，版本GRCh38.p2)。特别地，靶核酸是SNORD109B下游的区域，对应于染色体15上的位置25278410至25419462(SEQ ID NO：1)。在恒河猴(Macaca mulatta)中，UBE3A阻遏物被定义为SNORD109A下游的区域，使用Ensembl assembly MMUL1.0(SEQ ID NO：2)，对应于染色体7上的第4222848位至第4373084位(正向链)。
在一些实施方案中，靶核酸是SEQ ID NO：1，或其天然存在的变体。在某些实施方案中，靶核酸对应于人(SEQ ID NO：1)和恒河猴(SEQ ID NO：2)之间保守的区域。在某些实施方案中，靶核酸对应于人(SEQ ID NO：1)，恒河猴(SEQ ID NO：2)和小鼠(SEQ ID NO：3)之间保守的区域。
在某些实施方案中，靶核酸是与UBE3A前mRNA反义的区域，该区域对应于SEQ IDNO：1的55319至141053位。
在一些实施方案中，靶核酸存在于体外或体内细胞中，例如哺乳动物细胞，特别是人细胞(靶细胞)中。在某些实施方案中，靶细胞是神经元，优选人神经元细胞。
靶序列可以是靶核酸的子序列。在一些实施方案中，寡核苷酸靶向选自UBE3A的外显子9，外显子10，外显子13，外显子14，内含子14，外显子15，内含子15和外显子16的反义区的子序列。在一些实施方案中，寡核苷酸或连续核苷酸序列与选自以下的单链核酸分子杂交或互补：SEQ ID NO：1的位置：55319-76274,77483-77573,92157-93403和97056-97354。在一些实施方案中，寡核苷酸或连续核苷酸序列与选自SEQ ID NO：1的位置：60821-60849,77567-77583,923232-92339和97156-97172的单链核酸分子杂交或互补。
具体实施方案
1.用于自不同灵长类物种产生均匀分布的分化神经细胞(NC)的标准化细胞培养物的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供神经元前体细胞(NPC)；
b)将NPC分化为神经细胞(NC)，包括以下步骤
(i)在分化的约20天至约45天后，将分化的NC从其支持物解离；和
(ii)以合适的细胞培养形式再接种细胞并继续分化NC约4天至约15天。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述灵长类物种选自人(Homo sapiens)，食蟹猴(Macaca fascicularis)和恒河猴(Macaca mulatta)。
3.根据实施方案1所述的方法，其中所述灵长类物种选自人(Homo sapiens)和食蟹猴(Macaca fascicularis)。
4.根据实施方案1的方法，其中分化NC的标准化细胞培养物针对2种灵长类物种分别单独地产生，其中第一灵长类物种是人(Homo sapiens)，第二灵长类物种是食蟹猴(Macaca fascicularis)。
5.根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述NPC源自诱导的多能干细胞(IPSCs)。
6.根据实施方案1至5中任一项所述的方法，其中步骤b)包括用选自Shh，FGF8，BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸磷酸盐的一种或多种分化剂培养NPCs。
7.根据实施方案1至6中任一项所述的方法，其中步骤b)(i)包括在含有Shh，FGF8和抗坏血酸磷酸盐的基础培养基中培养细胞约5至约10天的时间，然后在包含BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸磷酸盐的基础培养基中再培养细胞约15天至约35天的时间，然后将分化的NC从其支持物解离。
8.根据实施方案6或7所述的方法，其中所述一种或多种分化剂在基础培养基中的浓度，对于Shh为50-500ng/ml，对于FGF8为25-250ng/ml，对于BDNF为1-50ng/ml，对于GDNF为1-50ng/ml，对于cAMP为0.1-10mM，对于抗坏血酸磷酸盐为20-200μM。
9.根据实施方案6至8中任一项所述的方法，其中所述一种或多种分化剂在基础培养基中的浓度，对于Shh为200ng/ml，对于FGF8为100ng/ml，对于BDNF为20ng/ml，对于GDNF为10ng/ml，对于cAMP为0.5mM，对于抗坏血酸磷酸盐为100μM。
10.根据实施方式6至9中任一项所述的方法，其中用Shh，FGF8和抗坏血酸磷酸盐的培养期约为7天，且用BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸磷酸盐的培养期为约20至约40天。
11.根据实施例1至10中任一项所述的方法，其中所述NPC在Laminin521支持物上提供。
12.根据实施方案1至11中任一项的方法，其中步骤b)(i)包括用细胞分离溶液解离细胞。
13.根据实施方案12所述的方法，其中所述细胞分离溶液是Accutase。
14.根据实施方案1至13中任一项的方法，其中步骤b)(ii)包括在Laminin521支持物上以200000个细胞/cm2再接种细胞。
15.根据实施方案1至14中任一项所述的方法，其中所述细胞在96孔或384孔板中再接种。
16.根据实施方案1至15中任一项所述的方法，其中步骤b)(ii)包括在ROCK抑制剂存在下再接种所述细胞。
17.根据实施方案16所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y-27632。
18.根据实施方案1至17中任一个所述的方法，其中步骤b)(ii)包括在再接种细胞后通过在补充了BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸的基础培养基中培养细胞来继续分化。
19.根据实施例1至18中任一项所述的方法，其中所述分化的NC表达MAP2。
20.根据实施方案1至19中任一项的方法，其中所述分化的NC包含MAP2阳性神经突。
21.根据实施方案1至20中任一项所述的方法，其中所述NPC源自患有神经元病症的个体。
22.根据实施例1至21中任一项所述的方法，其中所述NPC来自健康个体。
23.根据实施方案1至22中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物针对不同物种依次产生。
24.根据实施方案1至23中任一项所述的方法，其中通过细胞核染色评估，细胞在细胞培养区域上基本均匀地分布。
25.根据实施方案1至24中任一项所述的方法，其中所述细胞的分布通过DNA染色，特别是Hoechst染色进行评估。
26.通过实施方案1至25中任一项的方法获得的细胞培养***。
27.根据实施方案1至26中任一项获得的细胞培养物用于体外测试药物候选物毒性的用途。
28.根据实施方案1至27中任一项获得的细胞培养物用于体外测试药物候选物功效的用途。
29.根据实施方案28的用途，其中在源自实施方案21的方法的细胞培养物和源自实施方案22的方法的细胞培养物中测试功效。
30.根据实施方案1至25中任一项获得的细胞培养物用于选择药物候选物，特别是选择用于进一步开发的药物候选物的用途。
31.根据实施方案27至30中任一项的细胞培养物的用途，其中所述药物候选物包含多核苷酸或靶向多核苷酸的特定序列。
32.根据实施方案27至31中任一项所述的细胞培养物的用途，其中所述药物候选物包含至少一个核酸分子，例如RNAi剂或反义寡核苷酸。
33.根据实施方案32所述的细胞培养物的用途，其中所述核酸分子包含一个或多个2'糖修饰的核苷，所述核苷独立地选自2'-O-烷基-RNA，2'-O-甲基-RNA，2'-烷氧基-RNA，2'-O-甲氧基乙基-RNA，2'-氨基-DNA，2'-氟-DNA，***糖核酸(ANA)，2'-氟-ANA和LNA核苷。
34.根据实施方案33所述的细胞培养物的用途，其中所述一个或多个2'糖修饰的核苷是LNA核苷。
35.根据实施方案34所述的细胞培养物的用途，其中所述LNA核苷选自β-D-氧基-LNA，α-L-氧基-LNA，β-D-氨基-LNA，α-L-氨基-LNA，β-D-硫代-LNA，α-L-硫代-LNA，(S)cET，(c)cET，β-D-ENA或α-L-ENA。
36.根据实施方案32至35中任一项所述的细胞培养物的用途，其中所述核酸分子包含至少一个修饰的核苷间连接。
37.根据实施方案36的细胞培养物的用途，其中所述连续核苷酸序列中的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
38.根据实施例32至37中任一项所述的细胞培养物的用途，其中所述反义寡核苷酸能够募集RNase H.
39.根据实施方案32至38中任一项所述的细胞培养物的用途，其中所述反义寡核苷酸是gapmer。
40.根据实施方案38或39所述的细胞培养物的用途，其中所述寡核苷酸是式5'-F-G-F'-3'的gapmer，其中区域F和F'独立地包含1至7个修饰的核苷并且G是能够募集RNase H的6至16个核苷的区域。
41.基本上如本文所述的方法和用途。
这里描述的任何实施方案可以单独使用或组合使用。下面的实施例更详细地解释了本发明。给出以下制备和实施例旨在使本领域技术人员能够更清楚地理解和实践本发明。然而，本发明的范围不受限于示例性实施方案，这些实施方案仅用于举例说明本发明的各单个方面，并且功能上等同的方法在本发明的范围内。事实上，除了本文公开的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言从前面的描述和附图将变得显而易见。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。
实施例
材料和方法
表3：列出与SEQ ID NO：1互补的寡核苷酸或连续核苷碱基序列(由SEQ ID NO指出的基序序列)、由这些实施的寡核苷酸设计、以及基于该基序序列设计的具体寡核苷酸化合物(由CMP ID NO指出)。
设计是指gapmer设计，F-G-F'，其中每个数字分别代表连续的修饰核苷(例如2’修饰的核苷)的数目(第一个数字＝5'侧翼)，接着是DNA核苷的数目(第二个数字＝gap区域)，接着是修饰核苷(例如2'修饰的核苷)的数目(第三个数字＝3'侧翼)，任选地之前或之后为DNA和LNA的其它重复区域，所述其它重复区域不一定是与靶核酸互补的连续序列的一部分。
对于寡核苷酸化合物，大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，小写字母代表DNA核苷，所有LNA C均为5-甲基胞嘧啶，且5-甲基DNA胞嘧啶以“e”呈现，所有核苷间连接均为硫代磷酸酯核苷间连接。
寡核苷酸合成
寡核苷酸合成在本领域中通常是已知的。以下是可应用的方案。本发明的寡核苷酸可以通过在所使用的装置，支持物和浓度方面略作改变的方法而产生。
寡核苷酸在尿嘧啶通用支持物上使用亚磷酰胺方法在MerMade12或OligomakerDNA/RNA合成仪上以1-4μmol规模合成。在合成结束时，使用氨水在60℃进行5-16小时，将寡核苷酸从固相支持物上切下。通过反相HPLC(RP-HPLC)或通过固相萃取纯化寡核苷酸并通过UPLC表征，并且通过ESI-MS进一步确认分子量。
寡核苷酸的延伸：
通过使用0.1M 5'-O-DMT-保护的亚酰胺的乙腈溶液和DCI(4,5-二氰基咪唑)的乙腈溶液(0.25M)作为活化剂，偶联β-氰基乙基-亚磷酰胺(DNA-A(Bz)，DNA-G(ibu)，DNA-C(Bz)，DNA-T，LNA-5-甲基-C(Bz)，LNA-A(Bz)，LNA-G(dmf)，LNA-T或氨基-C6接头)。对于最后的循环，可以使用具有所需修饰的亚磷酰胺，例如，用于连接缀合物基团的C6接头或缀合物基团。通过使用氢化黄原素(xanthane hydride)(0.01M在乙腈/吡啶9:1中)进行硫醇化用于引入硫代磷酸酯键。磷酸二酯键可以使用THF/吡啶/水7:2:1中的0.02M碘引入。其余的试剂是通常用于寡核苷酸合成的试剂。
通过RP-HPLC纯化：
通过制备型RP-HPLC在Phenomenex Jupiter C18 10μ150×10mm柱上纯化粗化合物。使用0.1M乙酸铵pH8和乙腈作为缓冲液，流速为5mL/min。将收集的级分冷冻干燥，得到纯化合物，典型地为白色固体。
缩写：
DCI：4,5-二氰基咪唑
DCM：二氯甲烷
DMF：二甲基甲酰胺
DMT：4,4'-二甲氧基三苯甲基
THF：四氢呋喃
Bz：苯甲酰基
Ibu：异丁酰基
RP-HPLC：反相高效液相色谱
Tm分析
将寡核苷酸和RNA靶双链体在500ml无RNA酶的水中稀释至3mM，并与500ml 2×Tm缓冲液(200mM NaCl，0.2mM EDTA，20mM磷酸钠，pH7.0)混合。将溶液加热至95℃3分钟，然后在室温退火30分钟。使用PE Templab软件(Perkin Elmer)在配备Peltier温度编程器PTP6的Lambda 40UV/VIS分光光度计上测量双链体解链温度(Tm)。温度从20℃变温上升到95℃，然后下降到25℃，记录260nm的吸收。使用熔解和退火的一阶导数和局部最大值来评估双链体Tm。
小鼠原代皮层神经元细胞培养物的制备
根据标准程序从15日龄的小鼠胚胎大脑制备原代皮层神经元培养物。简言之，在室温下用聚-L-赖氨酸(50μg/ml聚-L-赖氨酸，10mM四硼酸钠，pH8缓冲液)包被培养板2-3小时。使用前用1×PBS洗涤平板。解剖收获的小鼠胚胎脑并用剃刀刀片均化并浸入38ml解剖介质(HBSS，0.01M Hepes，青霉素/链霉素)中。然后，加入2ml胰蛋白酶，细胞在37℃温育30分钟并离心。将细胞溶解在20ml DMEM(+10％FBS)中并通过注射器进一步匀浆。随后以500rpm离心15分钟。将细胞溶解于DMEM(+10％FBS)中并接种于96孔板(100μl中0.1×106个细胞/孔)中。在接种后神经元细胞培养物即可使用。
在小鼠原代皮质神经元细胞培养物中筛选寡核苷酸
将细胞在96孔板中在生长培养基(Gibco Neurobasal培养基，B27补充物，Glutamax，青霉素-链霉素)中培养，并与寡核苷酸一起以所需浓度孵育3天。从细胞中分离总RNA，并使用来自Quanta Bioscience(95134-500)的qScriptTM XLT One-Step RT-qPCRLow ROXTM试剂盒，通过qPCR分析测量敲低(know-down)效力。使用来自ThermoFisher Scientific的商业taqman测定法来测量Ube3a_ATS，包括GAPDH在内用于标准化。
产生人原代神经元细胞培养物
在任何所需时间点的任何细胞系在37℃，5％CO 2浓度和95％相对湿度下温育。
人诱导的多能干细胞(hIPSC)培养物
从诊断有Angelman综合征的患者获得人全血样品。原代外周血单核细胞(PBMC)的后续培养物富集成红细胞。用CytoTune-iPS Sendai重编程试剂盒(Thermo FisherScientific)重编程成红细胞，产生患者特异性IPSC系。使用hESC合格的Matrigel(Corning)，在mTESR1(STEMCELL Technologies)中，进行每日培养基替换，将来源的IPSC细胞系保持在无饲养细胞条件下。达到汇合时，使用温和细胞解离试剂(STEMCELLTechnologies)将集落解离成50-200μm大小的细胞簇，并在10μM Y-27632(Calbiochem)的存在下以1:10-1:20的比例进行传代培养。
分化成神经祖细胞(NPC)
在诱导神经分化后，将IPSC来源的细胞维持在基础培养基中，所述基础培养基由等体积DMEM:F12Glutamax培养基和Neurobasal培养基(Gibco，Invitrogen)组成，补充有1xB27(Gibco，Invitrogen)，1xN2(Gibco，Invitrogen)，0.1mMβ-巯基乙醇(Gibco，Invitrogen)和所示补充物。
神经祖细胞(NPC)由hIPSC通过双重SMAD抑制并根据稍修改的公开程序而得到(Chambers等，2009Nat Biotechnol.Vol.3pp.275-80，Boissart等，2013TranslPsychiatry.3:e294)。将HIPSC用Accutase(Innovative Cell Technologies Inc.)解离成单细胞悬浮液，并重悬于进一步补充有10μM Y-27632(Calbiochem)，5ng/ml FGF(Peprotech)，10μM SB-431542(Calbiochem)和100nM LDN(Calbiochem)的MT培养基中。将单细胞悬浮液转移至AggreWell800板(STEMCELL Technologies)，使得能够形成由8000个细胞组成的聚集体。5天后，将神经聚集体转移到用聚-L-鸟氨酸(Sigma)和层粘连蛋白(Roche)包被的平板上，并允许在补充有FGF的基础培养基中在持续的双重SMAD抑制(SB-431542和LDN)下形成神经玫瑰花结。使用STEMdiffTM神经玫瑰花结选择试剂(STEMCELLTechnologies)选择性分离神经玫瑰花结，将其重铺于包被有聚-L-鸟氨酸和Laminin521(BioLamina)的培养皿上，并在补充有10ng/ml FGF(Peprotech)，10ng/ml EGF(RnD)和20ng/ml BDNF(Peprotech)的基础培养基中扩增。当达到汇合时，用0.05％胰蛋白酶/EDTA(Gibco，Invitrogen)将细胞酶促解离并继代培养。在补充有FGF，EGF和BDNF的基础培养基中持续传代，在10至20代传代中产生稳定的神经祖细胞系(NPC系)。稳定的神经祖细胞系由其自我更新能力和发育阶段特异性标志物Sox2和Nestin的表达来定义。在特定刺激下，NPC分化成神经元(MAP2+，Tau+，HuC/D+)和星形胶质细胞(GFAP+)后代(Dunkley等，2015Proteomics Clin Appl.Vol.7-8pp.684-94)。
NPC培养
先前已经描述了NPC培养的条件并且在稍作修改下使用(Boissart等，2013Transl Psychiatry.3:e294)。简言之，将细胞维持在用Laminin521(BioLamina)包被的培养皿中，并在基础培养基[由等体积的DMEM：F12Glutamax培养基和Neurobasal培养基(Gibco，Invitrogen)组成，补充有1x B27(Gibco，Invitrogen)，1x N2(Gibco，Invitrogen)，0.1mMβ-巯基乙醇(Gibco，Invitrogen)]并补充有10ng/ml FGF(Peprotech)，10ng/ml EGF(RnD)和20ng/ml BDNF(Peprotech)。
分化成神经元细胞培养物
为了诱导NPC的神经元分化，将细胞用0.05％胰蛋白酶/EDTA(Gibco，Invitrogen)解离成单细胞悬浮液并以12.000个细胞/cm2的密度接种到Laminin521(BioLamina)包被的培养皿上，并维持在补充有200ng/ml Shh(Peprotech)，100ng/ml FGF8(Peprotech)和100μM抗坏血酸磷酸盐(Sigma)的基础培养基中7天。随后，将细胞在补充有20ng/ml BDNF(Peprotech)，10ng/ml GDNF(Peprotech)，0.5mM cAMP(BIOLOG Life Science)和100μM抗坏血酸磷酸盐(Sigma)的基础培养基中重铺，密度为45000个细胞/cm2并分化21天。在分化的第21天，将分化的神经元培养物重新铺在筛选兼容的平板形式上。通过将培养物用Accutase(Innovative Cell Technologies Inc.)解离成单细胞悬液来进行重新铺板。在存在10μM Y-27632(来自Calbiochem的细胞可透过的、可逆的Rho激酶抑制剂)的情况下，将细胞以200,000个细胞/cm 2的密度接种到384孔微量滴定板中，用于最终的寡核苷酸筛选测定试验。在补充有20ng/ml BDNF(Peprotech)，10ng/ml GDNF(Peprotech)，0.5mM cAMP(BIOLOG Life Science)和100μM抗坏血酸磷酸盐(Sigma)的基础培养基中再分化神经元培养物7天。分化培养基每周更换两次。在35天的总分化期后，神经元细胞培养物即可用于寡核苷酸处理。
在人神经元细胞培养物中筛选寡核苷酸
为了筛选，在384孔微量滴定板(化合物板)中将寡核苷酸原液用水预先稀释至指定浓度。平板布局用作处理模板。将2微升来自每个孔的寡核苷酸稀释液从化合物平板转移到相应的培养板中。所有液体处理均在无菌条件下使用半自动实验室机器人***(Beckmancoulter)在层流中完成。将神经元细胞培养物与寡核苷酸一起温育5天而不改变培养基。随后，将神经元培养物裂解并用RealTime ready Cell lysis and RNA VirusMaster试剂盒(Roche)进行qPCR分析。使用半自动实验室机器人***(Beckmancoulter)进行液体处理。样品通过Lightcycler480实时PCR***(Roche)进行分析。
使用以下引物和探针通过qPCR监测UBE3A的转录物丰度来评估寡核苷酸的活性：
UBE3a-有义:正向引物:ATATGTGGAAGCCGGAATCT,
反向引物:TCCCAGAACTCCCTAATCAGAA,
用染料FAM标记的内部探针:ATGACGGTGGCTATACCAGG
将RT-qPCR与持家基因PPIA(肽基脯氨酰异构酶A)复合用于标化。PPIA引物和染料VIC标记的探针购自Thermo Fisher Scientific(试验ID Hs99999904_m1)。每个平板包括作为阴性对照的非靶向寡核苷酸(模拟物)(TTGaataagtggaTGT)和参考寡核苷酸CMP IDNO：41_1，导致UBE3A mRNA的上调。
寡核苷酸的选择性通过反筛选位于染色体15上SNORD109B上游的SNORD 115转录物来验证。使用以下引物和探针通过qPCR监测SNORD115的表达
正向引物:GGGTCAATGATGAGAACCTTAT,
反向引物:GGGCCTCAGCGTAATCCTATT,
染料FAM标记的内部探针:TTCTGAAGAGAGGTGATGACTTAAAA
寡核苷酸处理后，RT-qPCR与PPIA(Thermo Fisher Scientific)复合。
使用以下引物和探针通过RT-qPCR测量SNORD109B(也称为UBE3A阻遏物)下游的SNHG14转录物的减少：
正向引物:ATCCGAGGCATGAATCTCAC,
反向引物:CAGGCCAAAACCCTTGATAA,
染料FAM标记的内部探针:TTGCTGAGCATTTTTGCATC
RT-qPCR与PPIA(Thermo Fisher Scientific)复合。
数据表示为在所有平板上相对于模拟物的平均％表达，并且针对参考寡核苷酸进行标化以解释板与板的变异性。
在人类神经元细胞培养物中筛选寡核苷酸--96孔***
为了筛选，在96孔微量滴定板(化合物板)中将寡核苷酸原液用水预稀释至指定浓度。平板布局用作处理模板。将2微升来自每个孔的寡核苷酸稀释液从化合物平板转移到相应的培养板中。所有液体处理均在无菌条件下使用半自动实验室机器人***(BeckmanCoulter)在层流中完成。将神经元细胞培养物与寡核苷酸一起温育5天而不改变培养基。随后，裂解神经元培养物并使用RNA纯化试剂盒Pure Link Pro96(12173011A)LifeTechnologies进行RNA纯化。使用半自动实验室机器人***(Beckmancoulter)进行液体处理。使用来自Quanta的qScriptTM XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix Low ROX(95134-50)，在ViiA TM 7实时PCR***Thermo Fisher Scientific上进行Ube3a和Ube3a-ATS的qPCR分析。
使用以下引物和探针：
qPCR UBE3a-有义:
正向引物:ATATGTGGAAGCCGGAATCT,
反向引物:TCCCAGAACTCCCTAATCAGAA,
染料FAM标记的内部探针:ATGACGGTGGCTATACCAGG
SNORD109B下游的qPCR SNHG14转录物(也称为UBE3A阻遏物)：
商业上可获得的来自Thermo Fisher的引物和探针组：Hs01372957_m1。这些引物扩增Genbank转录物AF400500.1中87bp外显子-外显子跨越序列
QPCR GAPDH转录物：
商业上可获得的来自Thermo Fisher的引物和探针组：Gene Symbol：具有以下试验细节：RefSeq：NM_002046.3，探针外显子位置：3，扩增子大小：122bp。相应的TaqManAssay ID：Hs99999905_m1。
用于Ube3a和Ube3a-ATS两者的RT-qPCR与作为持家基因的GAPDH复合以进行标化。每个平板包括作为阴性对照的非靶向寡核苷酸(模拟物)(TTGaataagtggaTGT)和参考寡核苷酸CMP ID NO：21_1，导致UBE3A mRNA的上调。此外，还包括了不靶向Ub3a或SNORD109B下游的SNHG14转录物(也称为UBE3A阻遏物)的对照寡核苷酸的组，以监测试验噪音和检测假阳性的风险。这些随机分布在板上。
对照寡核苷酸：
序列
CGAaccactgaaCAA
CGAaccactgaacAAA
CGAagtgcacaCG
GCGtaaagagaGGT
GAGAaggcacagaCGG
GCGaagtgcacaCGG
GAGaaggcacagaCGG
CGAaccactgAACA
GAAccactgaacAAA
caGCGtaaagagaGG
GCgtaaagagAGG
CGAaccactgaAC
CGAAccactgaaCAAA
AGCgaagtgcacaCGG
AGGtgaagcgaAGTG
TAGTaaactgagCCA
AGAaggcacagaCGG
CCGcagtatggaTCG
产生食蟹猴原代神经元细胞培养物
任何所述时间点的任何细胞系在37℃，5％CO2浓度和95％相对湿度下温育。
食蟹猴诱导的多能干细胞(cIPSC)培养物
所有的动物操作均按照美国国立卫生研究院的指南进行，并由与美国新泽西州Roche 340 Kingsland Street Nutley NJ 07110(2014年关闭)有关的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。食蟹猴IPSC使用携带Yamanaka因子(Oct4，Sox2，Klf4和C-Myc)的仙台病毒颗粒(CytoTune-iPS仙台重编程试剂盒，Thermo Fisher Scientific)从14岁雌性毛里求斯食蟹猴的肾成纤维细胞建立(Takahashi，K.&Yamanaka，S.，2006)。转染后五天，将细胞以不同密度传代到丝裂霉素C灭活的饲养细胞上，并在hESC培养基(敲除DMEM:F12，补充有20％敲除血清替代物，0.1mM非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺，0.1mM 2-巯基乙醇和8ng/ml bFGF，全部来自Life Technologies)中培养。转染后20天选择具有ES样形态的克隆用于进一步传代。通过人工解离集落，每3-4天常规传代细胞。在至少10次传代后，基于Ono等，2014的修改方法，使cIPSC适应无饲养细胞的培养条件(补充有15ng/ml FGF2(Peprotech)和10ng/ml ActivinA(Peprotech)的MT培养基)，其中所述修改为在Matrigel(BDBioscience)包被的平板上培养细胞以及当细胞处于单细胞悬浮液中时使用Y-27632(Calbiochem)代替Thiazovivin。MT培养基是成分确定培养基，含有Dulbecco改良Eagle培养基和Ham's F12营养混合物(DMEM/F12)，具有2.5mM GlutaMAXTM，7μg/ml胰岛素，450μM单硫代甘油，1x脂质浓缩物，5mg/ml BSA，14ng/ml***钠，1x非必需氨基酸，2mg/ml肝素，15μg/ml转铁蛋白和220μM抗坏血酸-2-磷酸盐。使用温和细胞解离试剂(Stem CellTechnologies)将细胞每2-4天传代一次。选择一个克隆用于进一步实验并用于以下所有测定试验。
分化成神经祖细胞(NPC)
在诱导神经分化后，将cIPSC来源的细胞(参见图4：第1天)维持在由等体积的DMEM:F12Glutamax培养基和Neurobasal培养基(Gibco，Invitrogen)组成的基础培养基中，其中补充有1x B27(Gibco，Invitrogen)，1×N2(Gibco，Invitrogen)，0.1mMβ-巯基乙醇(Gibco，Invitrogen)和所示补充物。
神经祖细胞(NPC)由cIPSC通过双重SMAD抑制作用并根据轻微修饰的已公布的程序而得到(Chambers等，2009 Nat Biotechnol.Vol.3pp.275-80，Boissart等，2013 TranslPsychiatry.3：e294)。将CynoIPSC用Accutase(Innovative Cell Technologies Inc.)解离成单细胞悬浮液并重悬于补充有10μM Y-27632(Calbiochem)的MT培养基中。将单细胞悬浮液转移至AggreWell800平板(STEMCELL Technologies)，以使得可以形成由12000个细胞组成的聚集体(参见图4：EB形成)。对于接下来的连续五天，每个AggreWell中的1.5ml培养基用补充有5ng/ml FGF(Peprotech)，10μM SB-431542(Calbiochem)和100nM LDN-193189(Calbiochem)的基础培养基替代。5天后，将神经聚集物转移到用聚-L-鸟氨酸(Sigma)和层粘连蛋白(Roche)包被的平板上并且允许在补充有FGF的基础培养基中在持续的双重SMAD抑制(SB-431542和LDN-193189)下形成神经玫瑰花结(见图4：收获)。通过手动解剖选择性分离神经玫瑰花结，然后重新铺板在包被有聚-L-鸟氨酸和来自BioLamina的Laminin521的培养皿上(参见图4：神经玫瑰花结分离)，并在补充有10ng/ml FGF(Peprotech)，10ng/mlEGF(RnD)和20ng/ml BDNF(Peprotech)的基础培养基中扩增。当达到汇合时，用0.05％胰蛋白酶/EDTA(Gibco，Invitrogen)将细胞酶促解离并继代培养。在补充有FGF，EGF和BDNF的基础培养基中继续传代，在5至10代中产生稳定的神经祖细胞系(NPC系)(参见图4，第24-45天)。稳定的神经祖细胞系由其自我更新能力和发育阶段特异性标志物Sox2和Nestin的表达来定义。在特定的刺激下，cyno NPCs分化成神经元MAP2+细胞。
NPC培养
先前已经描述了NPC培养的条件并且稍作修改予以使用(Boissart等，2013Transl Psychiatry.3:e294)。简言之，将细胞维持在用Laminin521(BioLamina)包被的培养皿中，并在补充有10ng/ml FGF(Peprotech)，10ng/ml EGF(RnD)和20ng/ml BDNF(Peprotech)的基础培养基[由等体积的DMEM：F12 Glutamax培养基和Neurobasal培养基(Gibco，Invitrogen)组成，补充有1x B27(Gibco，Invitrogen)，1xN 2(Gibco，Invitrogen)，0.1mMβ-巯基乙醇(Gibco，Invitrogen)]培养。
分化成神经元细胞培养物
为了诱导NPC的神经元分化，将细胞用0.05％胰蛋白酶/EDTA(Gibco，Invitrogen)解离成单细胞悬浮液并以30,000个细胞/cm2的密度接种到Laminin521(BioLamina)包被的培养皿上，并保持在补充有200ng/ml Shh(Peprotech)，100ng/ml FGF8(Peprotech)和100μM抗坏血酸磷酸盐(Sigma)的基础培养基中7天。随后，将细胞在补充有20ng/ml BDNF(Peprotech)，10ng/ml GDNF(Peprotech)，0.5mM cAMP(BIOLOG Life Science)和100μM抗坏血酸磷酸盐(Sigma)的基础培养基中重铺，密度为45000个细胞/cm2并分化21天。在分化的第21天，将分化的NC解离并再接种到筛选兼容的平板形式上。通过将培养物用Accutase(Innovative Cell Technologies Inc.)分离成单细胞悬液来进行重铺板。在10μM Y-27632(来自Calbiochem的细胞可透过的、可逆的Rho激酶抑制剂)存在下，将细胞以200000个细胞/cm2的密度接种到384孔微量滴定板中用于最终的寡核苷酸筛选测定试验。在补充有20ng/ml BDNF(Peprotech)，10ng/ml GDNF(Peprotech)，0.5mM cAMP(BIOLOG LifeScience)和100μM抗坏血酸磷酸盐(Sigma)的基础培养基中再分化神经元培养物7天。分化培养基每周更换两次。在35天的总分化期后，神经元细胞培养物即可用于寡核苷酸处理。
在cyno神经元细胞培养物中筛选寡核苷酸--96孔***
为了筛选，在96孔微量滴定板(化合物板)中将寡核苷酸原液用水预稀释至指定浓度。平板布局用作处理模板。将2微升来自每个孔的寡核苷酸稀释液从化合物平板转移到相应的培养板中。所有液体操作均在无菌条件下使用半自动实验室机器人***(Beckmancoulter)在层流中完成。将神经元细胞培养物与寡核苷酸一起温育5天而不改变培养基。随后，使用Pro 96总RNA纯化试剂盒(Thermo Fisher)将神经元培养物裂解和纯化，并随后使用qScript XLT One-Step RT-qPCR Tough Mix，Low ROX(QuantaBiosiences)进行qPCR测定。液体操作使用半自动实验室机器人***(Integra Assist andIntegra Viaflo)进行。样品通过Lightcycler480实时PCR***(Roche)进行分析。
使用以下引物和探针，通过qPCR监测UBE3A-有义和UBE3A-反义的转录物丰度来评估寡核苷酸的活性：
UBE3a-有义:HS00166580_VIC Taqman试验(Thermo Fisher)
UBE3A-反义:HS01372957_VIC Taqman试验(Thermo Fisher)
RT-qPCR与持家基因TBP(TATA盒结合蛋白)复合以进行标准化。TBP引物和FAM标记的探针购自Roche(REF.:05532957001，Assay Id.101145)。每个平板包括非靶向寡核苷酸(模拟物)作为阴性对照(TTGaataagtggaTGT)。
数据表示为相对于模拟物处理条件的平均百分比表达。
免疫细胞荧光染色
细胞用4％PFA固定并用0.1％TritonX(Sigma)在PBS中(含有Ca2+和Mg2+)透化。使用补充有0.1％TritonX的SuperBlock溶液(Thermo Fisher Scientific)进行封闭。细胞用以下一级抗体染色：抗SOX2(Milipore AB5603)，抗GFAP(Dako Z033401)，抗HuC/D(Invitrogen A21271)，抗Nestin(Millipore mab5326)和抗Map2(Neuromics CH22103)。随后，洗涤细胞并用缀合于Alexa488，Alexa555或Alexa647(全部Molecular Probes)的第二抗体染色。细胞核用Hoechst 1:1000(Molecular Probes)染色。使用Axiovert显微镜(Zeiss)或Operetta高内涵成像***(Perkin Elmer)使细胞成像。使用ImageJ软件分析图像。
qPCR分析
自cIPSC，食蟹猴分化的NC，hESC和人分化的NC，使用miRNeasy Mini试剂盒(QIAGEN)分离RNA，并进行qPCR分析(对于人类细胞，使用Ag-Path-ID One-Step RT-PCR试剂盒，Ambion；对于食蟹猴细胞，使用Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒Roche进行逆转录，使用LightCycler480 Probes Master，Roche进行qPCR)。使用以下引物和探针：对于人类细胞：NES Hs04187831_g1；MAP2 Hs00258900_m1；ASCL1 Hs00269932_m1；SOX2Hs01053049_s1；ELAVL3 Hs00154959_m1；GAPDH 4352665，全部来自Thermo Fisher/Applied Biosystems；UBE3A-ATS Fw引物：CAA ATG CCT CAC CCA CTC TT，RV引物：CCA GCTGTC AAC ATG TGC TT，内部寡聚物：AAG TGC GCT CCT GTG AAA AG；UBE3A Fw引物：TCT GGGAAA TCG TT CATT CA，RV引物：TGT AGG TAA CCT TTC TGT GTC TGG，内部寡聚物TAC AACGGG CAC AGA CAG AG。对于食蟹猴细胞：NANOG测定ID 700103，POU5F1测定ID 113034，SOX2测定ID 111867，Nestin测定ID 138150，PAX6测定ID 136139，SOX1测定ID 136988，ZIC1测定ID 112077，ASCL1测定ID 700027，TUBB3测定ID 700047，GAPDH Cat N.04694333001，探针#147；TBP测定ID 101145，全部从罗氏公司购买。UBE3A-ATS Fw引物：AATGCAAAGGCAGCAGTACA，Rv引物：TTGGGGAGTTGGTTATTGGA，内部寡聚物TGACACCACCAGAAGAACACA；
UBE3A有义：Fw引物：ATATGTGGAAGCCGGAATCT，
Rv引物：TCCCAGAACTCCCTAATCAGAA，
内部寡聚物：ATGACGGTGGCTATACCAGG。
RNA测序分析
使用miRNeasy Mini试剂盒(QIAGEN)进行RNA分离。使用Ribo-Zero Golddepletion和TruSeq Stranded Total RNA LT试剂盒(Illumina)进行文库制备。使用cBOT仪器和HiSeq PE Cluster kit v4进行簇生成。使用以下试剂在HiSeq 2500仪器上进行测序，以匹配末端Single-indexed测序运行进行(2×125个循环)：HiSeq SBS试剂盒v4 250个循环(Illumina)。
Western Blot分析
对于蛋白质表达研究，通过刮取收集细胞并快速冷冻。使用完成了磷酸酶和蛋白酶抑制剂和DNAse(均来自Roche)的Cytobuster(Millipore)裂解沉淀。通过BCA测定(Thermo Scientific)测量提取物中的蛋白质浓度，并将该溶液加载到聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上。电泳后，使用iBlot***(Invitrogen)将蛋白质印迹在硝酸纤维素膜上。用于检测感兴趣蛋白质的抗体是抗hTau HT7(Pierce MN1000)，抗pTauS422(Roche)抗pTauS404(Abcam ab92676)；这些通过合适的HRP缀合的二抗检测。使用成像仪(Biorad)，使用SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate(Thermo Fisher)通过发光检测复合物。
参考文献
Ono,T.et al.A single-cell and feeder-free culture system for monkeyembryonic stem cells.PLoS One 9,e88346,doi:10.1371/journal.pone.0088346(2014).
Takahashi,K.&Yamanaka,S.Induction of pluripotent stem cells frommouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell 126,663–676,doi:10.1016/j.cell.2006.07.024(2006).
实施例1-在小鼠原代神经元细胞培养物中的寡核苷酸活性
靶向与UBE3A前mRNA反义的SNHG14长非编码RNA的一部分(SEQ ID NO：1的位置55319至141053)的寡核苷酸，测试其降低SNHG14长非编码RNA转录物(在数据表中也称为UBE3A阻遏物或UBE3A-SUP)阻止UBE3A表达的能力、以及它们在小鼠原代皮质神经元细胞培养物中诱导UBE3A mRNA重新表达的能力，如上文“材料和方法”部分所述获得细胞培养物。寡核苷酸浓度为5μM。
根据在“材料和方法”部分中描述的用于在小鼠皮层神经元细胞培养物中筛选的方案，筛选寡核苷酸。结果如表4所示。
表4：原代小鼠神经元细胞培养物中的寡核苷酸活性。
实施例2-在人神经元细胞培养物中的寡核苷酸活性
在患者来源的人神经元细胞培养物中(参见“材料和方法”部分中的方案)，测试了靶向人染色体15上SNORD109B下游区域中对应于位置25278410至25419462(SEQ ID NO：1)的人SNHG14的寡核苷酸。分析了寡核苷酸降低SNORD109B下游区域中SNHG14转录物(在数据表中也称为UBE3A阻遏物或UBE3A-SUP)而不影响SNORD115表达的能力。此外，分析了诱导UBE3A mRNA重新表达的能力。
在根据上文“材料和方法”部分中描述的人神经元细胞培养物中，根据筛选寡核苷酸的方案，筛选寡核苷酸。
结果显示在表5中。已经针对所有化合物测量了UBE3A mRNA的表达，但是对于所有化合物，尚没有分析UBE3A阻遏物的敲低和SNORD1115水平的维持。
表5：在患者来源的人神经元细胞培养物中的寡核苷酸活性。
在测试的187种化合物中，以5微摩尔浓度，与模拟寡核苷酸相比，约90％显示出UBE3A的重新表达。能够诱导UBE3A重新表达的寡核苷酸的数目在SEQ ID NO：1的位置1至55318之间的区域(非重叠区域)中，比在与UBE3A编码区域互补的区域(重叠区域)中更高。图2描述了根据寡核苷酸在15号染色体上的位置以及相对于模拟寡核苷酸的UBE3A mRNA表达而绘制的寡核苷酸分布图。
对于已经测试SNORD115的寡核苷酸，在1和5μM，与模拟物相比，没有显著的下调。
实施例3-体外***中cyno神经元分化的产生和验证
按照材料和方法部分中以及在图4中描述的方案，诱导Cyno IPSC分化成NPC。该方案允许获得可在补充有FGF，EGF和BDNF的基础培养基中维持和扩增的NPC。为了验证cynoNPC的有效诱导，通过免疫染色评估了神经干细胞标志物SOX2和NESTIN的表达(参见图5)。Cyno NPC表达SOX2和NESTIN，其表达模式与人类NPC高度相似。
为了获得分化的NC，将扩增的NPC解离并在SFA培养基中接种一周。之后将细胞暴露于分化培养基(BGAA)。为了评估cyno NPC的神经元分化潜能，进行转录分析并将结果与分化的人类NPC的转录谱进行比较(参见图6)。在BGAA培养基中分化14天后，与cIPSC相比，食蟹猴培养物显示多能性标志物如NANOG和POU5F1的表达降低以及外胚层和神经元标志物如PAX6，SOX1，ZIC1，ASCL1，TUBB3的表达增加(参见图6A)。类似地，在BGAA中分化14天的人多能干细胞来源的NC的转录分析(图6B中的RNA测序和图6C中的qPCR)揭示了，与hESC相比，在第14天BGAA分化的NC中多能性标志物的表达降低和外胚层和神经元标志物的表达增加。重要的是，UBE3A(涉及Angelman综合征的疾病基因)和UBE3A-ATS(被描述为在神经元中表达的非编码转录物)的表达变化在分化的食蟹猴和人NCs之间是相当的(参见图6D)。这些数据表明，食蟹猴IPCS分化为NCs，特定标志物的表达谱与分化的人NCs相似。
实施例4-分化的食蟹猴NCs的解离和再接种
干细胞来源的细胞作为药物筛选的体外***具有很大的潜力，特别是如果相应的原代细胞类型不可得或仅限于有限的量，如神经元的情况。然而，药物筛选需要可用于合适平板形式的稳健的细胞筛选***。为此，我们测试了不同的策略，将来源于NHP-IPSCs的NPC分化为神经元细胞(NCs)。为了鉴定具有均匀分布的NC的稳健的细胞***，以两种方式之一将扩增的NPC解离并暴露于分化培养基：将它们直接以最终测定试验形式接种，或者将细胞接种于细胞培养瓶然后在进一步分化后解离并再接种到最终测定试验形式(参见图7)。在方法A和B中，NPC在瓶中分化23天，然后解离并以测定试验形式再接种。在7天的另外的分化期后，用寡核苷酸处理细胞。或者，在方法C和D中，解离NPC并直接铺板到96孔板上。方法A和C中的分化培养基补充有丝***抑制剂混合物(尿苷35μg/ml和15μg/ml 5-氟-2'-脱氧尿苷)以抑制细胞增殖。在第35天，将培养物固定并对神经祖细胞和神经胶质细胞标志物SOX2和神经元标志物MAP2进行染色(参见图8)。方法B(有重铺板并且没有有丝***抑制剂)导致与其他方法相比更均匀分布的细胞培养物，具有MAP2阳性细胞并具有较少的SOX2阳性细胞。出于这个原因，神经元分化方法B被选择用于随后描述的寡核苷酸处理。
实施例5-分化的人NCs的解离和再接种
如实施例4所述，我们确立了，重铺板分化中的cyno神经元是使这些细胞适合于筛选目的的必要步骤。因此，我们着手验证是否可以对人IPSC来源的神经元采用类似的程序。为此，来自两个IPSC系(ED4和SFC808)的先前建立的神经祖细胞(NPC)按照材料和方法部分中描述的程序进行分化。简而言之，将扩增的NPC解离并在SFA培养基中接种一周。之后，将细胞以两种方式之一暴露于分化培养基(BGAA)：将它们直接铺板在测定试验形式中或细胞培养瓶中。在后一种情况下，细胞分化21天，然后解离并以测定试验形式再接种。在处理之前，两个实验组(即直接分化的或解离并再接种的)分化总共6周(分别为在测定试验形式中6周，或在瓶中3周和在测定试验形式中3周)。
对于第一组实验，通过免疫荧光和高内涵成像分析神经元。所使用的标志物对神经祖细胞(SOX2)，神经胶质细胞(GFAP)或神经元(MAP2和HuC/D)是特异的。如图9所示例的，重铺板过程似乎不影响人类IPSC来源的神经元的分化或形态。这通过定量染色进一步验证，其显示在直接分化和重铺板组中HuC/D阳性细胞的存在没有显著差异(图10；对于ED80，p＝0.542，对于SFC808，p＝0.579)。
为了进一步证实可以解离和再接种分化的人IPSC来源的神经元而不改变其特征，我们想确认细胞骨架相关蛋白不被解离过程破坏。我们分析了微管相关蛋白Tau的表达，因为它对于神经元功能是至关重要的，并且直接参与神经变性疾病，例如额颞痴呆和阿尔茨海默氏病。如上所述培养细胞(有和没有解离和再接种)，并通过蛋白质印迹分析蛋白质提取物。如图11所示，Tau及其两种磷酸化形式的恒定表达证明再接种令人惊讶地不破坏人类IPSC来源的神经元的细胞骨架特征，表明生理学特征不会因该过程而改变。
这些结果表明，人类IPSC来源的神经元可以在分化过程中经历解离和再接种并保持它们的关键特征，这表明重铺板步骤(解离和再接种)对于灵长类干细胞来源的神经元的分化是可行的。
实施例6-使用灵长类IPSC来源的经解离和再接种的分化NC进行高通量筛选
上述灵长类IPSC来源的神经元培养物是高度灵活和可重现的***，适合用于筛选目的。我们开发了一个工作流程，其中用寡核苷酸处理细胞，并通过定量聚合酶链式反应(qPCR)验证靶标和相关基因的表达(见图12)。为此，如上所述处理人或食蟹猴神经祖细胞。为了筛选，细胞在分化3周后解离并以200,000个细胞/cm2的密度接种在96孔板中。再分化一周后，将细胞用寡核苷酸处理5天，然后如材料和方法部分中所述处理用于表达分析。该方法允许持续获得待以高通量方式测试的待测样品。
对于本实施例，我们利用了5种不同的寡核苷酸，它们以8个浓度靶向Ube3A反义(Ube3A_ATS)转录物，从20μM开始并在每一步降低3倍，导致剂量20.000,6.325,2.000,0.632,0.2200,0.063，0.020和0.006μM。我们在从Angelman综合征患者IPSCs(人)或食蟹猴IPSCs(cyno)分化的神经元上测试了这些化合物。
处理后，裂解细胞，提取RNA并通过使用市售的TaqMan测定试验进行Ube3A和Ube3A_ATS的qPCR反应；在人类细胞中使用GAPDH，在食蟹猴细胞中使用TBP作为持家基因以对表达数据进行标化。在所有情况下，处理导致了Ube3A_ATS显著降低，这与有义转录物的表达增加相匹配。这种效应以剂量反应方式是明显的；为了方便可视化，我们在图13中报告了高剂量(2μM)和低剂量(0.02μM)时的表达水平。
在2μM的剂量下，反义转录物表达为赋形剂(PBS)处理的细胞的水平的这对于人类和食蟹猴细胞都是如此。Ube3A_ATS的敲低导致了Ube3A的表达增加，对于人和食蟹猴分别为和的赋形剂水平。这种差异并不令人惊讶，因为患者来源的神经元由于Ube3A基因的一个等位基因的缺失故表达非常低水平的有义转录物。
这些实验证明在人和cyno神经元中针对Ube3A_ATS的寡核苷酸的靶结合。因此，所描述的方法适用于在灵长类IPSC来源神经元中的治疗性寡核苷酸的高通量筛选。

Claims (16)

1.用于自不同灵长类物种产生均匀分布的分化神经细胞(NC)的标准化细胞培养物的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供神经元前体细胞(NPC)；
b)将NPC分化为神经细胞(NC)，包括以下步骤
(i)在分化的约20天至约45天后，将分化的NC从其支持物解离；和
(ii)以合适的细胞培养形式再接种细胞并继续分化NC约4天至约15天。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述灵长类物种选自由人(Homo sapiens)，食蟹猴(Macaca fascicularis)和恒河猴(Macaca mulatta)组成的组。
3.根据权利要求1所述的方法，其中分化NC的标准化细胞培养物针对2种灵长类物种分别单独产生，其中所述第一灵长类物种是人(Homo sapiens)，并且所述第二灵长类物种是食蟹猴(Macaca fascicularis)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述NPC源自诱导的多能干细胞(IPSCs)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤b)(i)包括在含有Shh，FGF8和抗坏血酸磷酸盐的基础培养基中培养细胞约5至约10天的时间，随后在包含BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸磷酸盐的基础培养基中再培养细胞约15天至约35天的时间，然后将分化的NC从其支持物解离。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤b)(i)包括用细胞分离溶液解离所述细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述细胞分离溶液是Accutase。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述细胞在96孔或384孔板中再接种。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中步骤b)(ii)包括在再接种细胞后通过在补充了BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸的基础培养基中培养细胞来继续分化。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中通过细胞核染色评估，所述分化的NC基本上均匀分布在细胞培养区域上。
11.根据权利要求1至10中任一项获得的细胞培养物用于体外测试药物候选物的毒性的用途。
12.根据权利要求1至10中任一项获得的细胞培养物用于体外测试药物候选物功效的用途。
13.根据权利要求1至10中任一项获得的细胞培养物用于选择药物候选物，特别是选择用于进一步开发的药物候选物的用途。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的细胞培养物的用途，其中所述药物候选物包含多核苷酸或靶向多核苷酸的特定序列。
15.根据权利要求11至13中任一项所述的细胞培养物的用途，其中所述药物候选物包含至少一个核酸分子，例如RNAi剂或反义寡核苷酸。
16.基本上如本文所述的方法和用途。
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