CN108350427A

CN108350427A - Ror1阳性的间充质干细胞及其制备方法、包含ror1阳性的间充质干细胞的药物组合物及其制备方法、以及使用ror1阳性的间充质干细胞的疾病的预防或治疗方法

Info

Publication number: CN108350427A
Application number: CN201680062889.3A
Authority: CN
Inventors: 池山芳史; 西田浩之; 津田智博; 宇野荣子; 汤本真代; 须田真; 须田一真; 吉野美穗子; 吴春忠
Original assignee: Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-08-28
Filing date: 2016-08-29
Publication date: 2018-07-31
Anticipated expiration: 2036-08-29
Also published as: US20180333436A1; JPWO2017038784A1; WO2017038784A1; US11707488B2; EP3342858B1; CN108350427B; EP3342858A4; JP6998768B2; EP3342858A1

Abstract

本发明的目的在于，提供一种对各种疾病发挥优异的治疗效果的新的间充质干细胞及含有该间充质干细胞的新的药物组合物、以及它们的制备方法。本发明为一种ROR1阳性的间充质干细胞。上述ROR1阳性的间充质干细胞优选为CD29、CD73、CD90、CD105及CD166阳性，优选源自脐带或脂肪。

Description

ROR1阳性的间充质干细胞及其制备方法、包含ROR1阳性的间充质干细胞的药物组合物及其制备方法、以及使用ROR1阳性的间充质干细胞的疾病的预防或治疗方法

技术领域

本发明涉及ROR1阳性的间充质干细胞及其制备方法、包含ROR1阳性的间充质干细胞的药物组合物及其制备方法、以及使用ROR1阳性的间充质干细胞的疾病的预防或治疗方法。

背景技术

近年来，利用了生物体的细胞或组织的药品开发、再生医疗研究正在推进并受到关注。其中，ES细胞、iPS细胞作为脏器再生技术或药物发现筛选工具正在加速进行研究。另一方面，从骨髓、脂肪组织、脐带等分离出体干细胞(间充质干细胞)而加以利用的细胞疗法在再生医疗中利用的是用于修复由于疾病等而受到损伤的组织的成体干细胞的本来功能，因此作为更高实用性的方法而受到关注并进行了研究。已知体干细胞(间充质干细胞)通常并不能分化成所有的脏器、组织而是分化成特定的组织、脏器。

另外还已知，体干细胞(间充质干细胞)不仅具有上述那样的修复受到损伤组织的效果，而且对各种疾病具有治疗效果。已知例如，源自脐带组织的体干细胞(间充质干细胞)具有抑制与移植供体在组织相容性方面不相容的移植受体的移植物抗宿主疾病反应(GVHD)的效果(参照专利文献1)；源自特定的脐带组织的间充质干细胞可以用于帕金森病的治疗(参照专利文献2)；还有源自特定的脐带组织的间充质干细胞对循环***的疾病具有治疗效果(参照专利文献3)。但是，这些间充质干细胞的治疗效果不能说充分。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2009-519978号公报

专利文献2：日本特表2008-525489号公报

专利文献3：日本特表2007-528705号公报

发明内容

发明要解决的问题

本发明是鉴于上述状况而作出的，目的在于提供一种对各种疾病发挥优异的治疗效果的新的间充质干细胞及包含该间充质干细胞的新的药物组合物、它们的制备方法、以及使用ROR1阳性的间充质干细胞的疾病的预防或治疗方法。

用于解决问题的方案

本发明人们为了解决上述课题反复进行了深入研究，结果发现，包含某种特定的间充质干细胞的药物组合物对各种疾病显示优异的治疗效果，至此完成了本发明。即，本发明的主旨如下。

(1)一种ROR1阳性的间充质干细胞。

(2)根据(1)所述的间充质干细胞，其为CD29、CD73、CD90、CD105及CD166阳性。

(3)根据(1)或(2)所述的间充质干细胞，其源自脐带或脂肪。

(4)一种药物组合物，其包含(1)至(3)中任一项所述的间充质干细胞和/或其培养上清。

(5)根据(4)所述的药物组合物，其中，药物组合物包含ROR1阳性的间充质干细胞时，ROR1阳性的间充质干细胞的比率为药物组合物所含的全部间充质干细胞的70％以上。

(6)根据(4)或(5)所述的药物组合物，其中，药物组合物包含ROR1阳性的间充质干细胞时，ROR1阳性的间充质干细胞的比率为药物组合物所含的全部间充质干细胞的90％以上。

(7)根据(4)～(6)中任一项所述的药物组合物，其用于预防或治疗选自由癌症、癌前病变(precancerous lesion)、炎症性疾病、免疫疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、心血管疾病、脑血管损伤、骨疾病、胃肠疾病、肺疾病、肝疾病及肾疾病组成的组中的疾病。

(8)根据(4)～(7)中任一项所述的药物组合物，其用于预防或治疗起因于上皮或内皮的屏障功能降低的疾病、或与IL-1相关的疾病。

(9)根据(8)所述的药物组合物，其中，屏障功能降低起因于上皮或内皮细胞层中的紧密连接(tight junction)功能的降低。

(10)根据(4)～(6)中任一项所述的药物组合物，其用于抑制癌细胞的浸润和/或转移。

(11)根据(4)～(10)中任一项所述的药物组合物，其为线粒体转移剂。

(12)一种ROR1阳性的间充质干细胞的制备方法，其包含诱导ROR1阳性的间充质干细胞并对其进行浓缩或分离筛选的工序。

(13)一种用于疾病的预防或治疗的药物组合物的制备方法，其包含诱导ROR1阳性的间充质干细胞并对其进行浓缩或分离筛选的工序。

(14)根据(13)所述的药物组合物的制备方法，其中，疾病选自由癌症、癌前病变、炎症性疾病、免疫疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、心血管疾病、脑血管损伤、骨疾病、胃肠疾病、肺疾病、肝疾病及肾疾病组成的组。

(15)一种预防或治疗选自由癌症、癌前病变、炎症性疾病、免疫疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、心血管疾病、脑血管损伤、骨疾病、胃肠疾病、肺疾病、肝疾病及肾疾病组成的组中的疾病的方法，其使用ROR1阳性的间充质干细胞。

发明的效果

ROR1阳性的间充质干细胞具有如下特性：抑制由巨噬细胞等免疫细胞的产生炎症性细胞因子的作用、屏障功能亢进作用、迁移能力、线粒体转移能力优异，并且是对氧化应激也具有耐性、不易受到损伤的细胞。另外，ROR1阳性的间充质干细胞的培养上清也具有同样的功能。因此，包含ROR1阳性的间充质干细胞和/或其培养上清的本发明的药物组合物对癌症、癌前病变、炎症性疾病、免疫疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、心血管疾病、脑血管损伤、骨疾病、胃肠疾病、肺疾病、肝疾病、肾疾病等各种疾病显示优异的治疗效果。

附图说明

图1是示出ROR1阳性间充质干细胞的迁移能力的图。

图2是示出ROR1阳性间充质干细胞的氧化应激耐性的图。

图3是示出ROR1阳性间充质干细胞的线粒体转移能力的图。

图4是示出ROR1阳性间充质干细胞对慢性阻塞性肺病的人支气管平滑肌细胞的线粒体转移能力的图。

图5是示出ROR1阳性间充质干细胞对人心肌细胞的线粒体转移能力的图。

图6是示出ROR1阳性间充质干细胞的培养上清的抗炎症效果的图。

图7是用推荐培养基或配方培养基培养第7天的源自脐带的间充质干细胞及培养第8天的源自脂肪的间充质干细胞的照片。

图8是示出用推荐培养基或配方培养基培养第8天的源自脐带的间充质干细胞的细胞表面标志物的图。

图9是示出用推荐培养基或配方培养基培养第8天的源自脂肪的间充质干细胞的ROR1表达的图。

图10是示出用推荐培养基或配方培养基培养第8天的源自脂肪的间充质干细胞的细胞表面标志物表达的图。

图11是示出用推荐培养基或配方培养基培养第8天的源自脐带的间充质干细胞的细胞表面标志物表达的图。

图12是示出用推荐培养基或配方培养基培养第11天的源自脐带的间充质干细胞的细胞表面标志物表达的图。

图13是示出用推荐培养基或配方培养基培养第11天的源自脐带的间充质干细胞的细胞表面标志物表达的图。

图14是示出用配方培养基培养的源自脐带的间充质干细胞与用推荐培养基培养的源自脐带的间充质干细胞的基因表达进行比较的图。

图15是示出用配方培养基或推荐培养基培养得到的源自脐带的间充质干细胞的培养上清中的核心蛋白聚糖、护骨蛋白、MMP1的浓度的图。

图16是示出用配方培养基或推荐培养基培养得到的源自脐带的间充质干细胞的氧化应激耐性的比较的图。

图17是示出用配方培养基或推荐培养基培养得到的源自脐带的间充质干细胞的培养上清的屏障功能亢进活性的图。

图18是示出用配方培养基或推荐培养基培养得到的源自脐带的间充质干细胞的炎症性细胞因子产生抑制效果的图。

图19是示出用配方培养基培养的间充质干细胞(源自脂肪及源自脐带)与用推荐培养基培养的间充质干细胞(源自脂肪及源自脐带)向着骨细胞分化的样子的照片的图。

图20是示出用配方培养基培养的间充质干细胞(源自脂肪及源自脐带)和用推荐培养基培养的间充质干细胞(源自脂肪及源自脐带)向着脂肪细胞分化的样子的照片。

图21是示出ROR1阳性间充质干细胞培养上清的癌细胞迁移抑制作用的图。

图22是示出ROR1阳性间充质干细胞培养上清的氧化应激耐性的图。

图23是示出ROR1阳性间充质干细胞对慢性阻塞性肺病的人支气管平滑肌细胞的线粒体转移能力的图。

图24是示出ROR1阳性间充质干细胞对人心肌细胞的线粒体转移能力的图。

具体实施方式

本发明的ROR1阳性的间充质干细胞具有如下特性：IL-6等炎症性细胞因子的产生抑制作用、屏障功能亢进作用、迁移能力、线粒体转移能力优异，并且为对氧化应激也具有耐性、不易受到损伤的细胞。另外，在维持未分化性的同时，若处于分化条件下则能够高效地分化成具有目标功能的细胞。另外，ROR1阳性的间充质干细胞的培养上清也具有同样的功能。因此，包含这样的ROR1阳性的间充质干细胞和/或其培养上清的本发明的药物组合物对各种疾病发挥优异的治疗效果。以下对本发明的ROR1阳性的间充质干细胞、包含其的药物组合物等进行说明。

[ROR1阳性的间充质干细胞]

在本发明中，间充质干细胞是指：具有向着骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、腱细胞、脂肪细胞等属于间充质的细胞分化的能力且能够在维持该分化能力的状态下增殖的细胞。可列举例如：源自骨髓、脂肪、血液、骨膜、真皮、脐带、胎盘、羊膜、绒毛膜、蜕膜、肌肉、子宫内膜、真皮、牙囊、牙周组织、牙髓、牙胚等的间充质干细胞，优选为源自脐带的、源自脂肪、源自骨髓的间充质干细胞，更优选为源自脐带的、源自脂肪的间充质干细胞，进一步优选为源自脐带的的间充质干细胞。在此，“源自”表示上述细胞是由作为供给源的组织获得、生长或进行离体操作而得到的细胞。需要说明的是，本发明的ROR1阳性的间充质干细胞既可以作为上述间充质干细胞的集合体而包含彼此间具有不同特性的多种间充质干细胞，也可以是实质上均一的间充质干细胞的集合体。

本发明中的间充质干细胞既可以是源自被检体的自体细胞，也可以是源自同种的其它对象的异体细胞。优选为异体细胞。

“ROR1阳性”是指：间充质干细胞表达ROR1基因或表达ROR1蛋白、或者表达这两者。间充质干细胞中是否表达ROR1基因、是否表达ROR1蛋白这一点可以通过本领域技术人员已知的常规方法来确认。例如，表达ROR1基因这一点可以如下确认：通过常规方法从细胞分离总RNA后合成cDNA，使用ROR1用的引物利用实时PCR进行ROR1mRNA的表达分析。另外，ROR1蛋白在细胞表面上的表达可以使用与ROR1蛋白特异性结合的抗体通过FACS分析来确认。此时，使用与上述抗体相同的同种型抗体作为阴性对照。ROR1是具有酪氨酸激酶活性的跨膜型受体，是在中枢神经***中控制轴突伸长的分子。为I型的膜蛋白，属于细胞表面受体ROR亚家族。ROR1正在作为与癌细胞转移相关的分子进行研究。另外，最近查明，ROR1在卵巢癌干细胞中表达，这提示了参与癌的组织浸润的可能性。进而已经查明，ROR1/2作为驱动非经典(Non-canonical)信号的Wnt5的受体起作用，还提示了可能是通过夺取Fzd而抑制经典通路。作为本发明的间充质干细胞团中ROR1的表达上调或ROR1阳性细胞的比率增加的效果，可列举非经典通路的活化、即经典通路的抑制介导的骨分化能力提高等。

本发明的ROR1阳性的间充质干细胞除了为ROR1阳性这一特征以外，例如还可以通过以下方法来表征：生长特征(例如，传代至老化为止的集团倍增能力、倍增时间)、核型分析(例如，正常核型、母体***或新生儿***)、利用流式细胞术(例如，FACS分析)的表面标志物表达、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如，表位检测)、基因表达谱(例如，基因芯片阵列；反转录PCR、实时PCR、以往类型PCR等聚合酶链反应)、miRNA表达谱、蛋白质阵列、细胞因子等蛋白质分泌(例如，血浆凝固分析、ELISA、细胞因子阵列)、代谢产物(代谢物组学分析)、本领域中已知的其它方法等。本发明中的ROR1阳性的间充质干细胞例如具有以下这些特征。

(表面标志物的表达)

本发明中的ROR1阳性的间充质干细胞表达成为未分化性指标的CD29、CD73、CD90、CD105及CD166。

(基因表达)

本发明中的ROR1阳性的间充质干细胞除了ROR1基因以外还可以通过其它基因表达的有无来表征。作为本发明的ROR1阳性的间充质干细胞所表达的基因，可列举例如：MT1X、NID2、CPA4、DKK1、ANKRD1、TIMP3、MMP1、护骨蛋白(Osteoprotegerin；TNFRSF11B)、IGFBP5、SLC14A1等。进而还可列举：线粒体超氧化物歧化酶2(SOD2)、谷氧还蛋白(GLRX)、血红素加氧酶(脱环)-1(HMOX-1)、IV型胶原蛋白alpha(COLA4A)、纤连蛋白1、及微纤丝相关蛋白5(MFAP5)、趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、趋化因子(C-C基序)配体7(CCL7)、抑制素βA(INHBA)、三十四肽重复序列的干扰素诱导蛋白1(Interferon-induced protein withtetratricopeptide repeats，IFIT1)、白细胞介素1alpha(IL-1α)、白细胞介素1beta(IL-1β)、内皮素1(EDN1)、***素I2(前列环素)合酶(PTGIS)、分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)等。本发明中的ROR1阳性的间充质干细胞优选表达选自由MT1X、NID2、CPA4、DKK1、ANKRD1、TIMP3、MMP1、护骨蛋白(Osteoprotegerin；TNFRSF11B)、IGFBP5及SLC14A1组成的组中的至少1种基因。更优选为两种以上、3种以上、4种以上、5种以上，进一步优选为6种以上、7种以上、8种以上、9种以上，特别优选表达上述所有基因。

另外，本发明中的ROR1阳性的间充质干细胞中可以高表达选自由MT1X、NID2、CPA4、DKK1、及ANKRD1组成的组中的至少1种基因。优选两种以上、3种以上，更优选为4种以上，进一步优选高表达上述所有基因。另外，本发明中的ROR1阳性的间充质干细胞可以高表达线粒体超氧化物歧化酶2(SOD2)、谷氧还蛋白(GLRX)、血红素加氧酶(脱环)-1(HMOX-1)、IV型胶原蛋白alpha(COLA4A)、纤连蛋白1、或微纤丝相关蛋白5(MFAP5)的基因。进而，可以低表达选自由TIMP3、MMP1、护骨蛋白(Osteoprotegerin；TNFRSF11B)、IGFBP5、及SLC14A1组成的组中的至少1种基因。优选为两种以上、3种以上，更优选为4种以上，进一步优选低表达上述所有基因。另外，本发明中的ROR1阳性的间充质干细胞可以低表达趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、趋化因子(C-C基序)配体7(CCL7)、抑制素βA(INHBA)、三十四肽重复序列的干扰素诱导蛋白1(IFIT1)、白细胞介素1alpha(IL-1α)、白细胞介素1beta(IL-1β)、内皮素1(EDN1)、***素I2(前列环素)合酶(PTGIS)、或分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)的基因。在此，高表达基因或低表达基因是指：与ROR1阴性的以往的间充质干细胞相比，各基因表达增加的情况或降低的情况。具体而言，例如，作为源自脐带的间充质干细胞而使用LifeLine公司的UC-MSC(脐带来源间充质干细胞华顿氏胶，Umbilical Cord derived MesenchymalStem Cells Wharton’s Jelly，HMSC-WJ)、FC-0020)时，可以与用LifeLine公司的推荐培养基进行培养时的各基因表达强度进行比较。

需要说明的是，此时的各基因的表达可以通过本领域技术人员公知的方法来测定。例如，可以由细胞通过常规方法制备mRNA，对于想要确认有无表达、表达左右的基因进行qRT-PCR，分析各个基因的表达。

MT1X是富含半胱氨酸的低分子量蛋白(分子量500～14000Da)，定位在高尔基体膜上。MT1X的具体功能不明，提示有可能作为抗氧化蛋白而与防御氧化应激的机制相关。另外，还指出MT1X是成为细胞的未分化性指标的蛋白。作为本发明的ROR1阳性的间充质干细胞表达MT1X的效果，可列举细胞获得氧化应激耐性这一点，从在用于疾病治疗时为更耐损伤的细胞方面是优选的。

NID2是与层粘连蛋白γ1链结合从而将层粘连蛋白和IV型胶原蛋白连结、由此参与基底膜的形成和维持的蛋白。在中枢神经组织内的几乎所有基底膜中都表达。作为本发明的ROR1阳性的间充质干细胞表达NID2的效果，认为可能是提高向着肌肉细胞(特别是骨骼肌、心肌)分化的能力。

CPA4是切断蛋白质的C末端氨基酸的蛋白水解酶之一。另外，CPA4还是作为***癌标志物而为人所知的蛋白，已知其表达与癌的恶性程度成比例地上调。有在活跃地增殖的未分化性高的细胞中表达上调的倾向，因此可以说，本发明的ROR1阳性的间充质干细胞表达CPA4这一点提示了本发明的ROR1阳性的间充质干细胞的未分化性及增殖性高。

ANKRD1是除了在间充质干细胞中以外还在心肌、平滑肌、成纤维细胞、肝星型细胞等中表达的蛋白，是参与和作用于分化过程、应激的转录因子。现已查明其参与多种心脏疾病。另外已知，在处于创伤愈合过程中的成纤维细胞和肝损伤时的肝星型细胞中表达上调、ANKRD1缺损小鼠的伤口愈合延迟等(Susan E.Samaras et al.The American Journal ofPathology，Vol.185，No.1，January 2015，Inge Mannaerts et al，Journal ofHepatology 2015)。另外为控制MMP10、13等胞外基质分解酶的表达的核内因子(KarinnaAlmodovar-Garcia et al.MCB 2014)。因此，作为本发明的ROR1阳性的间充质干细胞表达ANKRD1的效果，认为可能是提高向着心肌细胞分化的能力、创伤愈合效果亢进、参与纤维化组织的胞外基质的重建。

DKK1是作为Wnt信号抑制剂起作用的蛋白，被认为有助于抑制经典通路。因此，在骨分化中作用于促进骨分化的方向，提高骨分化能力。已知在骨质疏松中表达减少。另一方面，被认为对细胞的未分化性维持及增殖带来良好影响，还已知也有助于胎儿发育。

TIMP3(Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 3，金属蛋白酶组织抑制剂3)抑制MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、MMP13的活化。进而，MMP3参与此外的多种MMP的活化，因此TIMP3作为广谱的MMP的抑制因子起作用。另外已知通过抑制VEGF向VEGFR2的结合来抑制血管新生、作为凋亡促进信号起作用。

MMP1(Matrix metalloproteinase 1，基质金属蛋白酶1)是以I型、II型、III型、V型胶原蛋白为对象并将其分解的蛋白质。已知由于以主要的ECM为对象而在细胞***、细胞迁移时起作用。已知会由于炎症反应而增加表达，参与炎症时的组织破坏、重建。

护骨蛋白(Osteoprotegerin；TNFRSF11B)为破骨细胞分化因子(RANKL)的诱骗受体，抑制RANK介导的NF-κB信号活化。由成骨细胞、成纤维细胞、肝细胞等产生，抑制破骨前体细胞向破骨细胞的分化。有报道指出，通过护骨蛋白的局部给药可促进骨形成，或者相反地通过敲除而引发骨质疏松。

IGFBP-5为***(IGF)结合蛋白，几乎所有的IGF都以与IGFBP结合的状态存在。作为IGFBP的功能，可列举增强IGF信号。另外已知，除了促进TNFR1的基因表达以外，还对TNFR1蛋白发挥拮抗剂样作用而抑制TNFα信号。另外，报道了在乳癌细胞中IGFBP-5会促进细胞粘附、增加生存率，抑制细胞迁移。

SLC14A1为尿素转运蛋白，在肾脏中高表达，进行细胞内的尿素浓度控制。有报道显示，在间充质干细胞中也表达，特别是在软骨分化时表达降低。

SOD2为ROS(活性氧)消除酶，GLRX为氧化还原酶，HMOX-1为抗氧化酶，COLA4A为构成基底膜的蛋白，纤连蛋白1及MFAP5为参与基质形成的蛋白。另外，CCL2、CCL7、INHBA、IFIT1、IL-1α、IL-1β、EDN1、PTGIS为炎症相关蛋白，SFRP1为参与wnt信号抑制的蛋白。

(微小RNA表达)

本发明的ROR1阳性的间充质干细胞可以通过有无表达miRNA来进一步表征。作为本发明的ROR1阳性的间充质干细胞所表达的miRNA，可列举例如：hsa-miR-145-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-503-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-let-7d-5p等。本发明的ROR1阳性的间充质干细胞优选表达选自由hsa-miR-145-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-503-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-382-5p、及hsa-let-7d-5p组成的组中的至少1种微小RNA。更优选两种以上、3种以上、4种以上、5种以上、6种以上的，进一步优选7种以上、8种以上、9种以上、10种以上、11种以上、12种以上，特别优选表达上述所有的微小RNA。

另外，优选为低表达选自由hsa-miR-145-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199b-5p、及hsa-miR-503-5p组成的组中的至少1种微小RNA的倾向且为高表达选自由hsa-let-7e-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-382-5p、及hsa-let-7d-5p组成的组中的至少1种微小RNA的倾向。在此，低表达微小RNA是指与ROR1阴性的间充质干细胞相比为低表达。另外，相反地，高表达微小RNA是指与ROR1阴性的间充质干细胞相比为高表达。具体而言，例如，作为源自脐带的间充质干细胞而使用LifeLine公司的UC-MSC(脐带来源间充质干细胞华顿氏胶(HMSC-WJ)、FC-0020)时，可以将用LifeLine公司的推荐培养基进行培养时的各微小RNA表达强度作为基准。

需要说明的是，此时的微小RNA的表达可以通过本领域技术人员公知的方法来测定。例如，可以由细胞通过常规方法制备mRNA，通过qRT-PCR或市售的微小RNA阵列等分析细胞中的微小RNA表达。微小RNA的表达量的判定可以算出将用配方培养基进行培养得到的细胞中的各种微小RNA表达量除以用以往的培养基、推荐培养基等培养得到的细胞中的各微小RNA表达量而得的值(倍性变化(Fold change)值)来进行。

(细胞因子分泌)

本发明的ROR1阳性的间充质干细胞可以通过有无细胞因子分泌来进一步表征。作为本发明的ROR1阳性的间充质干细胞所分泌的细胞因子，可列举例如：核心蛋白聚糖、护骨蛋白、MMP1等。本发明的ROR1阳性的间充质干细胞优选分泌选自由核心蛋白聚糖、护骨蛋白及MMP1组成的组中的至少1种细胞因子，更优选分泌至少两种细胞因子，进一步优选分泌全部3种细胞因子。

另外，本发明的ROR1阳性的间充质干细胞优选核心蛋白聚糖的分泌量多、且护骨蛋白及MMP1的分泌量少。在此，各因子的分泌量多或少的判断可以通过与ROR1阴性的间充质干细胞中的各因子的产生量(培养上清中的浓度)进行比较来进行。

需要说明的是，细胞因子的分泌量(培养上清中的浓度)可以通过本领域技术人员公知的方法来测定。可列举例如ELISA法等。

核心蛋白聚糖是富含亮氨酸的小分子蛋白多糖家族中最广为人知的因子之一。已知在生物体内广泛表达，参与胶原蛋白纤维的缔合、细胞的增殖等。在本发明的ROR1阳性的间充质干细胞中，作为核心蛋白聚糖的分泌上调的效果，可以期待炎症部位、损伤部位中的组织修复效果、组织中的细胞增殖促进效果等。

护骨蛋白(Osteoprotegerin；TNFRSF11B)如基因表达部分的记载所述为破骨细胞分化因子(RANKL)的诱骗受体，已知RANK介导的NF-κB信号活化。由成骨细胞、成纤维细胞、肝细胞等产生，已知破骨前体细胞向破骨细胞的分化。有报道指出，通过护骨蛋白的局部给药可促进骨形成，相反地通过敲除会引发骨质疏松。

MMP1(Matrix metalloproteinase 1，基质金属蛋白酶)如基因表达部分的记载所述为间质胶原酶，是特异性切断I型、II型、III型、V型胶原蛋白的螺旋部位、参与组织破坏和组织再构建的酶。在本发明的ROR1阳性的间充质干细胞中，作为MMP1的分泌比ROR1阴性细胞低的效果，可以期待炎症部位、损伤部位的组织修复效果等。

(分化的方向性)

本发明中的ROR1阳性的间充质干细胞具有向着骨、脂肪、软骨分化的优异分化能力。关于分化能力，可以通过本领域技术人员公知的分化诱导条件培养上述间充质干细胞团来进行判断。

作为向着骨细胞分化的分化诱导法，可以使用以往使用的诱导方法，没有特别限定，经典情况下，可以通过以下那样的方法进行诱导。即，将本发明中的ROR1阳性的间充质干细胞培养数天后，悬浮、接种于在培养基中含有FBS等血清、***、β-甘油磷酸酯(β-glycerol phosphate)、抗坏血酸-2-磷酸酯(ascorbic acid-2-phosphate)的分化培养液中。需要说明的是，作为上述分化培养液，可以使用市售的骨细胞分化用培养基。作为这样的市售的骨分化用培养基，可列举例如：OsteoLife Complete Osteogenesis Medium(Lifeline，LM-0023)、Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium(宝生物公司，D12109)等。在用于骨分化的培养中，在从分化培养用接种起24小时～72小时左右之后进行培养基更换，以后每3～4天进行培养基更换，培养2周～1个月左右。

作为向着脂肪细胞分化的分化诱导方法，可以使用以往使用的诱导方法，没有特别限定，经典情况下，在用添加有视黄酸的培养液悬浮培养数天之后，用添加有胰岛素及三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyronine)(T3)的培养液进行培养。另外，可以利用以往用于培养这种细胞的培养条件，例如，对培养基的种类、组合物的内容、组合物的浓度及培养温度等没有特别限制。另外，就培养期而言，经典情况下优选在不超过21天的期间内进行培养，也可以持续培养30天～40天左右。具体而言，可以通过以下那样的方法诱导脂肪细胞。即，在将本发明中的ROR1阳性的间充质干细胞培养数天后，悬浮于脂肪细胞分化用培养基，按照KURABO分化规程建议的细胞密度进行接种。作为上述分化用培养基，可列举例如人间充质干细胞用脂肪细胞分化用培养基：AdipoLife DfKt-1(Lifeline，LL-0050)、AdipoLifeDfKt-2(Lifeline，LL-0059)、Mesenchymal Stem Cell Adipogenic DifferentiationMedium(宝生物公司，D12107)等。在用于脂肪分化的培养中，在从分化培养用接种起24～72小时左右之后进行培养基更换，以后每3～4天进行培养基更换，培养2周～1个月左右。

作为向着软骨细胞分化的分化诱导法，可以使用以往使用的诱导方法，没有特别限定，经典情况下，可以将本发明中的ROR1阳性的间充质干细胞与胶原蛋白凝胶等混合而进行凝胶化，添加在DMEM等培养基中包含***、抗坏血酸-2-磷酸酯、丙酮酸钠(sodiumpyruvate)、TGF-β3(Transforming Growth Factor-β3，转化生长因子β3)、ITS pluspremix(胰岛素、转铁蛋白、***的混合物)的分化培养液进行培养。1周进行2～3次左右培养液更换并培养3周左右。具体而言，可以通过以下那样的方法诱导软骨细胞。即，将本发明中的ROR1阳性的间充质干细胞培养数天后，悬浮于软骨分化用培养基，按照KURABO分化规程建议的细胞密度用微团培养(micromass culture)法进行接种。作为上述软骨分化用培养基，可列举例如：ChondroLife Complete Chondrogenesis Medium(Lifeline，LM-0023)、Mesenchymal Stem Cell Chondrogenic Differentiation Medium w/o Inducers(宝生物公司，D12110)等。然后，每3～4天进行培养基更换，培养2周～1个月左右。

通过上述分化诱导方法得到的细胞可以通过生物化学途径或形态观察来确认已分化的细胞的种类。例如，可以通过利用显微镜的细胞观察、各种细胞染色法、使用杂交的RNA印迹法、RT-PCR法等各种确认方法来确定已分化的细胞的种类。

脂肪细胞、骨细胞及软骨细胞难以由其细胞形状来判定，但可以通过对细胞内脂质进行染色(例如可以通过油红O染色法染成红色。)来确认脂肪细胞的存在。另外，通过将细胞用茜素红(Alizarin red)进行染色，可以确认骨细胞的存在。另外，通过进行阿辛蓝(Alcian blue)染色、番红O染色、或甲苯胺蓝染色，可以确认软骨细胞的存在。

本发明的ROR1阳性的间充质干细胞具有向着脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞分化的分化能力，特别是，向着脂肪细胞分化的分化能力与用推荐培养基培养的间充质干细胞团相比显著提高。

(氧化应激耐性)

本发明的ROR1阳性的间充质干细胞与ROR1阴性的间充质干细胞相比不易由于鱼藤酮、H₂O₂等所带来的氧化应激而受到损伤。即，对ROR1阳性的间充质干细胞和ROR1阴性的间充质干细胞用相同浓度的鱼藤酮、H₂O₂处理并比较细胞的存活率(％)时，ROR1阴性的间充质干细胞的存活率依赖于浓度而显著降低，与此相对地，本发明的ROR1阳性的间充质干细胞的存活率的降低受到抑制，某些细胞有时达到几乎100％的存活率。

(细胞迁移能力及癌细胞迁移抑制能力)

本发明的ROR1阳性的间充质干细胞与ROR1阴性的间充质干细胞相比迁移能力优异。另外，本发明的ROR1阳性的间充质干细胞的培养上清与ROR1阴性的间充质干细胞的培养上清相比，抑制癌细胞的迁移的活性高。即可认为，本发明的ROR1阳性的间充质干细胞由于迁移能力优异而能够适宜地移动到作用部位，进而ROR1阳性的间充质干细胞或它们所产生的因子在作用部位抑制例如癌细胞等的迁移，由此能够抑制癌细胞的浸润、转移。

(线粒体转移能力)

在本发明中，“线粒体转移能力”是指：细胞能够使线粒体迁移到其它细胞中的能力或线粒体自身迁移到其它细胞中的能力，以在对多种细胞进行共培养时接受方的全部细胞中接受了线粒体转移的细胞的比例(％)来表示其程度。需要说明的是，在此，作为被转移的线粒体，除了线粒体本身以外，还可列举线粒体所包含的线粒体基因(DNA、RNA)和各种蛋白、以及这些与其它蛋白或内质网等其它细胞器的复合体。当特定细胞的线粒体转移能力优异时，可以期待对各种疾病的治疗效果、与老化等相伴随的症状的恢复效果等。

本发明的ROR1阳性的间充质干细胞的线粒体转移能力优异，通过对发生了线粒体功能障碍、线粒体活性降低等的细胞转移线粒体而对各疾病、老化/应激等所伴随的症状发挥优异的效果。对从本发明的ROR1阳性的间充质干细胞获得线粒体转移的细胞(接受方的细胞)没有特别限定，可列举例如：心肌细胞、肺泡上皮细胞、肾小管细胞、星形细胞、支气管平滑肌细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、免疫细胞(巨噬细胞等)、表皮干细胞、真皮成纤维细胞、角膜结膜上皮干细胞等，其中，可列举心肌细胞、真皮成纤维细胞、支气管平滑肌细胞之类尤其会由于疾病、老化/应激等而功能降低的这些细胞作为优选细胞。

[ROR1阳性的间充质干细胞的制备]

对ROR1阳性的间充质干细胞的制备方法没有特别限定，例如可以如下制备。即，从脐带、脂肪组织、骨髓等组织中按照本领域技术人员公知的方法分离间充质干细胞并进行培养，使用与ROR1特异性结合的抗ROR1抗体通过细胞分选仪、磁珠等分离ROR1阳性细胞，从而可以取得。另外，通过使用后述培养基的培养诱导间充质干细胞中的ROR1表达，由此也可以取得ROR1阳性的间充质干细胞。在通过该诱导而得到的细胞团中，优选细胞团的70％以上为ROR1阳性，更优选80％以上为ROR1阳性，进一步优选90％以上为ROR1阳性，特别优选实质上为ROR1阳性的均一细胞团。以下具体说明ROR1阳性的间充质干细胞的制备方法。

作为本发明中的ROR1阳性的间充质干细胞的制备方法，例如可以使用以下那样的方法。即，通过包含如下工序的方法可以取得间充质干细胞并进行培养，所述工序为：(A)将包含间充质干细胞的组织用酶等进行处理工序；(B)将通过上述酶处理得到的细胞悬浮液悬浮于适当培养基进行贴壁培养的工序；(C)除去悬浮细胞的工序；(D)对间充质干细胞进行培养的工序等。以下对各工序进行详细说明。

在(A)将包含间充质干细胞的组织用酶等进行处理的工序中，脐带等包含间充质干细胞的组织通过在生理盐水(例如磷酸缓冲盐水(PBS))等中搅拌、沉降等进行清洗。通过该操作，可以从组织中除去上述组织中所含的夹杂物。残存的细胞以各种尺寸的块形式存在，因此为了在将细胞本身的损伤抑制到最低限度的同时使其解散，优选将清洗后的细胞块用减弱细胞间的结合或破坏细胞间的结合的酶(例如胶原酶、分散酶、胰蛋白酶等)处理。使用的酶量及处理期根据所使用的条件而改变，可以在本技术领域的技术常识的范围内进行。作为这样的酶处理的替代或与这样的酶处理组合使用，可以将细胞块用机械搅拌、超声波能量、热能等其它处理法分解，但为了将细胞的损伤抑制到最低限度，优选仅通过酶处理来进行。在使用酶时，为了将对细胞的有害作用抑制到最低限度，在酶处理后用培养基等使酶失活是理想的。

通过上述工序得到的细胞悬浮物包含聚集状的细胞浆或悬浮物、以及各种夹杂细胞，例如红细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、及成纤维细胞。因此，接下来可以对凝集状态的细胞和这些夹杂细胞进行分离、除去，由于通过后述的悬浮细胞等除去工序也可除去，因此也可以省略该分离、除去。在对夹杂细胞进行分离、除去的情况下，可以通过将细胞强制分为上清和沉淀的离心分离来达成。将得到的包含夹杂细胞的沉淀悬浮于适当溶剂。悬浮状的细胞有可能包含红细胞，但通过后述的利用向固体表面的粘附而进行的选择可排除红细胞，因此溶解工序并不是必需的。作为选择性溶解红细胞的方法，例如可以使用基于用氯化铵进行溶解的、在高渗培养基或低渗培养基中孵育等本技术领域中熟知的方法。溶解后，可以通过例如过滤、离心沉降或密度分级从期望细胞中分离溶解物。

然后，在(B)将通过上述酶处理得到的细胞悬浮液悬浮于适当培养基进行贴壁培养的工序中，为了提高悬浮状态的细胞中间充质干细胞的纯度，可以清洗1次或连续清洗多次，离心分离并再次悬浮于培养基中。此外，也可以将细胞基于细胞表面标志物谱或基于细胞的尺寸及颗粒性分离。在该工序中，可以通过使用细胞分选仪、磁珠等的免疫学方法仅选择性分离表达ROR1蛋白的细胞。

用于再次悬浮的培养基只要是能够培养间充质干细胞的培养基则没有特别限定，例如，可以向动物细胞用的基础培养基中添加血清和/或血清代替物等而制作。另外，也可以使用作为适合于培养间充质干细胞的培养基销售的培养基。需要说明的是，在本发明中，由于将间充质干细胞、其培养上清用于动物(包括人)的疾病的治疗，因此优选尽量不含源自生物的原料的培养基(例如，无血清培养基)。特别优选不含源自不同种属的成分的(xeno-free，无异源)培养基。

上述基础培养基的组成可以根据要培养的细胞的种类适宜选择。可列举例如：伊戈尔培养基之类的最小必需培养基(MEM)、杜尔贝科改良伊戈尔培养基(DMEM)、最小必需培养基α(MEM-α)、间充质细胞基础培养基(MSCBM)、Ham’s F-12及F-10培养基、DMEM/F12培养基、Williams培养基E、RPMI-1640培养基、MCDB培养基、199培养基、Fisher培养基、Iscove改良杜尔贝科培养基(IMDM)、McCoy改良培养基等。

血清例如有人血清、胎牛血清(FBS)、牛血清、小牛血清、山羊血清、马血清、猪血清、绵羊血清、兔血清、大鼠血清等，但不限于这些。在使用血清的情况下，可以相对于基础培养基添加0.5％～15％、优选5％～10％。

作为加入基础培养基中的上述血清代替物，可列举例如：白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、***钠、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油等。

上述基础培养基中可以根据需要进一步添加氨基酸、无机盐类、维生素类、生长因子、抗生素、微量金属类、干细胞分化诱导剂、抗氧化剂、碳源、盐、糖、糖前体、源自植物的水解物、表面活性剂、氨、脂质、激素、缓冲剂、指示剂、核苷、核苷酸、丁酸、有机物、DMSO、源自动物的产物、基因诱导剂、细胞内pH的调节剂、甜菜碱、渗透压保护剂、矿物等物质，但不限于这些物质。这些物质的使用浓度没有特别限定，可以以通常用于哺乳动物细胞用培养基的浓度来使用。

作为上述氨基酸，可列举例如：甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸等。

作为上述无机盐类，可列举例如：氯化钙、硫酸铜、硝酸铁(III)、硫酸铁、氯化镁、硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二氢钠、磷酸二氢钠等。

作为上述维生素类，可列举例如：胆碱、维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B4、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B12、维生素B13、维生素B15、维生素B17、维生素Bh、维生素Bt、维生素Bx、维生素C、维生素D、维生素E、维生素F、维生素K、维生素M、维生素P等。

作为此外的可以添加于基础培养基的具体物质，可列举：

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、内皮细胞生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、***(IGF)、转化生长因子(TGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、***(EPO)、血小板生成素(TPO)、肝细胞生长因子(HGF)等生长因子；青霉素、链霉素、硫酸新霉素、两性霉素B、杀稻瘟素、氯霉素、阿莫西林、杆菌肽、博来霉素、头孢菌素、金霉素、盐酸博来霉素(Zeocin)和嘌呤霉素等抗生素；葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖等碳源；镁、铁、锌、钙、钾、钠、铜、硒、钴、锡、钼、镍、硅等微量金属；β-甘油磷酸盐、***、罗格列酮、异丁基甲基黄嘌呤、5-氮杂胞苷等干细胞分化诱导剂；2-巯基乙醇、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、N-乙酰半胱氨酸等抗氧化剂；腺苷5'-一磷酸、皮质酮、乙醇胺、胰岛素、还原型谷胱甘肽、硫辛酸、褪黑激素、次黄嘌呤、酚红、孕酮、腐胺、丙酮酸、胸苷、三碘甲状腺原氨酸、转铁蛋白、乳铁蛋白等。

作为适合于本发明中的间充质干细胞的无血清培养基，可列举市售的无血清培养基。可列举例如：由PromoCell公司、Lonza公司、Biological Industries公司、Veritas公司、R&D Systems公司、Corning公司及Rohto公司等提供的作为间充质干细胞用途预先制备的培养基等。

然后，在不使间充质干细胞分化的条件下在培养容器等固体表面上使用上述适当培养基以适当细胞密度及培养条件进行培养。对具有固体表面的培养容器的形状没有特别限定，可适当使用培养皿、烧瓶等。本发明中的间充质干细胞的培养条件只要是适合于各间充质干细胞的方法则没有特别限定，可使用与以往相同的方法。通常在30℃～37℃的温度、2％～7％CO₂环境下、5％～21％O₂环境下进行。另外，间充质干细胞的传代时期及方法只要适合于各细胞则也没有特别限定，可以一边观察细胞的样子一边与以往同样地进行。

在(C)除去悬浮细胞的工序中，除去培养容器的固体表面非附着状态的悬浮细胞及细胞的碎片等，用生理盐水(例如磷酸缓冲盐水；PBS)等清洗附着细胞。在本发明中，可以选择最终以附着于培养容器的固体表面的状态残留的细胞作为间充质干细胞的细胞团。

然后，进行(D)对间充质干细胞进行培养的工序。培养方法只要是适合于各细胞的方法则没有特别限定，可使用与以往相同的方法。通常在30℃～37℃的温度、2％～7％CO₂环境下、5％～21％O₂环境下进行。另外，间充质干细胞的传代时期及方法只要适合于各间充质干细胞则没有特别限定，可以一边观察间充质干细胞的形态一边与以往同样地进行。作为培养中使用的培养基，可以使用与工序(B)同样的培养基。需要说明的是，也可以在细胞的整个培养期内使用无血清培养基等进行。

从通过上述(D)工序的培养而得到的间充质干细胞中，通过使用细胞分选仪、磁珠等的免疫学方法仅选择性分离表达ROR1蛋白的细胞，由此可以取得ROR1阳性的间充质干细胞。

需要说明的是，在上述(B)工序之后的工序中，例如，通过采用以下的培养基诱导间充质干细胞中的ROR1表达，也可以高效地取得ROR1阳性的间充质干细胞。

[ROR1表达诱导(间充质干细胞用的特定培养基)]

作为用于诱导ROR1表达、高效地取得ROR1阳性的间充质干细胞的特定培养基(以下也称为“配方培养基”)，可列举含有选自由PTEN抑制剂、p53抑制剂、p38抑制剂、Wnt信号活化剂及ROCK抑制剂组成的组中的至少两种成分以及动物细胞培养用基础培养基的培养基。配方培养基通过含有这些成分而诱导或促进间充质干细胞中ROR1的表达，并且能够在长期维持间充质干细胞的未分化性的条件下进行培养。另外，配方培养基能够在使间充质干细胞长期维持良好的细胞状态的条件下高效地增殖。进而，配方培养基优选进一步含有选自由生长因子及甾类化合物组成的组中的至少1种成分。以下对配方培养基所含的成分进行详细说明。

(PTEN抑制剂)

在本发明中，PTEN抑制剂是指具有抑制PTEN(Phosphatase and Tensin HomologDeleted from Chromosome 10，第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失基因)基因或PTEN蛋白的作用的功能的所有物质。PTEN基因位于染色体上的10q23.3，已被确定为肿瘤抑制因子。PTEN蛋白在全身细胞中广泛表达，已知为催化作为肌醇磷脂的磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸酯(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate；PIP3)的脱磷酸化反应的酶。PIP3在细胞内被PI3激酶(PI3K)合成，引起蛋白激酶B(PKB)/AKT的活化。PTEN负责该PIP3的脱磷酸化反应，具有将其转变为磷脂酰肌醇4,5-双磷酸酯(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate；PIP2)的作用。因此，PTEN对PI3K/AKT信息转导***进行负调控。若PTEN的活性被抑制则细胞内会积累PIP3，PI3K/AKT信息转导***活化。

作为本发明中的PTEN抑制剂，可列举例如：pV(phenbig)(双过氧(苯基双胍)氧代钒酸二钾)、bpV(HOpic)(双过氧(5-羟基吡啶-2-羧基)氧代钒酸二钾)、VO-OHPic三水合物((OC-6-45)Aqua(3-羟基-2-哌啶羧酸根合-kapaN1，kapaO2)[3-(羟基-kapaO)-2-哌啶羧酸根合(2-)-kapaO2]氧代钒酸(1-)，氢三水合物)等。这些可以单独使用，也可以将两种以上组合使用。

作为配方培养基中的PTEN抑制剂在培养基中的浓度，从本发明的效果的观点出发，优选为10nM～10μM，更优选为50nM～1μM，进一步优选为100nM～750nM，特别优选为250nM～750nM。

(p53抑制剂)

在本发明中，p53抑制剂是指具有抑制p53基因或p53蛋白质的作用的功能的所有物质。p53基因位于染色体上的17p13.1，已知为肿瘤抑制基因。p53蛋白质作为转录因子起作用，具有多样的生理活性。

作为本发明中的p53抑制剂，可列举例如：原钒酸钠、抑制素-α、MDM2蛋白等。这些可以单独使用，也可以将两种以上组合使用。

就配方培养基中的p53抑制剂的浓度而言，从本发明的效果的观点出发，优选为100nM～1mM，更优选为500nM～500μM，进一步优选为1μM～100μM。

(p38抑制剂)

在本发明中，p38抑制剂是指具有抑制p38基因或p38蛋白质的作用的功能的所有物质。p38是作为丝氨酸/苏氨酸激酶的MAP激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，促***原活化蛋白激酶)中的一种。已明确了MAP激酶与转导外界刺激的信号分子、细胞增殖、分化、基因表达、凋亡等有关。

作为本发明中的p38抑制剂，可列举例如：SB203580(甲基[4-[4-(4-氟苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯基]亚砜)、SB202190(4-[4-(4-氟苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯酚)、BIRB796(Doramapimod；1-[5-叔丁基-2-(4-甲基苯基)-2H-吡唑-3-基]-3-[4-(2-吗啉代乙氧基)-1-萘基]脲)、LY2228820(5-[2-(1,1-二甲基乙基)-5-(4-氟苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2,2-二甲基丙基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-胺双甲磺酸盐)、VX-702(2-(2,4-二氟苯基)-6-[(2,6-二氟苯基)(氨基羰基)氨基]吡啶-3-羧酰胺)、PH-797804(N，4-Di甲基-3-[3-溴-4-[(2,4-二氟苯甲基)氧基]-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-1-基]苯甲酰胺)、TAK-715(N-[4-[2-乙基-4-(3-甲基苯基)噻唑-5-基]-2-吡啶基]苯甲酰胺)、VX-745(5-(2,6-二氯苯基)-2-[2,4-二氟苯基)硫]-6H-嘧啶并[1,6-b]哒嗪-6-酮)、及Skepinone-L((2R)-3-[8-[(2,4-二氟苯基)氨基]-5-氧代-5H-二苯并[a，d]环庚烯-3-基氧基]-1,2-丙二醇)等。这些可以单独使用，也可以将两种以上组合使用。

作为配方培养基中的p38抑制剂的浓度，从本发明的效果的观点出发，优选为1nM～1μM，更优选为10nM～500nM，进一步优选为50nM～250nM。

(Wnt信号活化剂)

在本发明中，Wnt信号活化剂是指活化Wnt信号的所有物质。Wnt是分泌性的细胞间信号转导蛋白，参与细胞内信号转导。该信号转导通路控制着细胞的增殖和分化、运动、早期胚胎发生时的体轴形成和器官形成等功能。在Wnt信号通路中，通过Wnt作用于细胞而包括若干种独立地被活化的细胞内信号转导机制。已知Wnt信号通路中有介由β-联蛋白来控制基因表达的β-联蛋白通路、对细胞的平面内极性进行控制的PCP(planar cellpolarity，平面内细胞极性)通路、促进Ca²⁺的细胞内动员的Ca²⁺通路等。在本说明书中，Wnt信号活化剂可以是活化其中的任一通路的活化剂。

本发明中的Wnt信号活化剂中包含Wnt-3a那样的联蛋白依赖性的活化剂、Wnt-5a那样的联蛋白非依赖性的活化剂中的任一种。此外还可以使用氯化锂(LiCl)、补体分子C1q等。这些可以单独使用，也可以将两种以上组合使用。

就配方培养基中的Wnt信号活化剂的浓度而言，从本发明的效果的观点出发，优选为1μM～10mM，更优选为10μM～10mM，进一步优选为100μM～1mM，特别优选为100μM～500μM。

(ROCK抑制剂)

在本发明中，ROCK抑制剂是指抑制Rho激酶(ROCK)的作用的所有物质。Rho激酶(ROCK)是以作为低分子量GTP结合蛋白的Rho的靶蛋白的形式被确定的丝氨酸/苏氨酸蛋白质磷酸化酶。Rho激酶参与肌肉等的收缩、细胞增殖、细胞迁移及其它基因表达诱导等生理功能。

作为本发明中的ROCK抑制剂，可列举例如：Y-27632〔(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-氨基乙基)-环己烷甲酰胺·2HCl·H₂O〕、K-155(利舒地尔盐酸盐水合物)、法舒地尔盐酸盐〔HA1077/1-(5-异喹啉磺酰)高哌嗪盐酸盐〕

作为配方培养基中的ROCK抑制剂的浓度，从本发明的效果的观点出发，优选为1nM～10μM，更优选为10nM～1μM，进一步优选为50nM～500nM。

配方培养基含有选自由上述PTEN抑制剂、p53抑制剂、p38抑制剂、Wnt信号活化剂及ROCK抑制剂组成的组中的至少两种成分，从本发明的效果的观点出发，优选含有3种成分，更优选含有4种成分，进一步优选含有全部5种。

(生长因子)

作为配方培养基中的生长因子，本领域技术人员公知的任意生长因子都可以使用。代表性的生长因子可列举转化生长因子(TGF)、上皮生长因子(EGF)等，但不限定于这些，可列举***(IGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血小板源生长因子(PDGF)、***(EPO)、血小板生成素(TPO)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF2)、肝细胞生长因子(HGF)等。进而还可例示出白蛋白、转铁蛋白、乳铁蛋白、胎球蛋白等。这些可以单独使用，也可以将两种以上组合使用。

作为配方培养基中的生长因子的浓度，可根据生长因子的种类而适宜采用适当浓度。通常，从本发明的效果的观点出发，优选为1nM～100mM，更优选为10nM～10mM。

(甾类化合物)

作为配方培养基中的甾类化合物，本领域技术人员公知的任意甾类化合物都可以使用。代表性地可以使用***、孕酮、睾酮、可的松、皮质醇、氢化可的松等类固醇激素，但不限于这些。这些可以单独使用，也可以将两种以上组合使用。

作为配方培养基中的甾类化合物的浓度，可根据甾类化合物的种类适宜采用适当浓度。通常，从本发明的效果的观点出发，优选为0.1nM～1mM，更优选为1nM～100μM，进一步优选为10nM～1μM。

(动物细胞培养用基础培养基)

本发明中的动物细胞培养用基础培养基是指含有培养动物细胞所必需的碳源、氮源及无机盐等的培养基。在此，动物细胞是指哺乳类细胞，特别是人细胞。考虑到有可能将培养得到的细胞、其培养上清用于动物(包括人)的疾病的治疗，本发明中的动物细胞培养用基础培养基优选为尽量不含源自生物的原料的培养基(例如，无血清培养基)。动物细胞培养用基础培养基中可以根据需要配合微量营养促进物质、前体物质等微量有效物质。作为这样的动物细胞培养用基础培养基，可以使用本领域技术人员公知的动物细胞培养用培养基。具体而言，可列举伊戈尔培养基之类的最小必需培养基(MEM)、杜尔贝科改良伊戈尔培养基(DMEM)、最小必需培养基α(MEM-α)、间充质细胞基础培养基(MSCBM)、Ham’s F-12及F-10培养基、DMEM/F12培养基、Williams培养基E、RPMI-1640培养基、MCDB培养基、199培养基、Fisher培养基、Iscove改良杜尔贝科培养基(IMDM)、McCoy改良培养基等、这些的混合培养基等。在作为动物细胞培养基使用的情况下，特别优选使用DMEM/F12培养基，但不限于该方式。

动物细胞培养用基础培养基中可以添加氨基酸类、无机盐类、维生素类及碳源、抗生素等添加剂。对这些添加剂的使用浓度没有特别限定，可以以通常用于动物细胞用培养基的浓度来使用。

作为氨基酸类，可列举例如：甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸等。

作为无机盐类，可列举例如：氯化钙、硫酸铜、硝酸铁(III)、硫酸铁、氯化镁、硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二氢钠、磷酸二氢钠等。

作为维生素类，可列举例如：胆碱、维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B4、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B12、维生素B13、维生素B15、维生素B17、维生素Bh、维生素Bt、维生素Bx、维生素C(抗坏血酸)、维生素D、维生素E、维生素F、维生素K、维生素M、维生素P等。

此外可以添加：青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素等抗生素；、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖等碳源；镁、铁、锌、钙、钾、钠、铜、硒、钴、锡、钼、镍、硅等微量金属；β-甘油磷酸、***、罗格列酮、异丁基甲基黄嘌呤、5-氮杂胞苷等干细胞分化诱导剂；2-巯基乙醇、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、N-乙酰半胱氨酸等抗氧化剂；腺苷5'-一磷酸、皮质酮、乙醇胺、胰岛素、还原型谷胱甘肽、硫辛酸、褪黑激素、次黄嘌呤、酚红、孕酮、腐胺、丙酮酸、胸苷、三碘甲状腺原氨酸、转铁蛋白、乳铁蛋白、白蛋白、源自牛血清的胎球蛋白、碳酸氢钠、HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)等的缓冲液、脂质混合液体、ITSE(胰岛素、转铁蛋白、硒及乙醇胺)混合物等。

作为配方培养基，可列举例如：在DMEM/F-12培养基中加入了L-谷氨酰胺、抗坏血酸、人重组型白蛋白、源自牛血清的胎球蛋白、碳酸氢钠、HEPES、脂质混合液、ITSE混合液、转铁蛋白、bFGF、孕酮、氢化可的松、VO-OHPic、抑制素-α(Pifithrin-α)、SB203580、氯化锂及Y-27632的培养基；

在DMEM/F-12培养基中加入了L-谷氨酰胺、抗坏血酸、人重组型白蛋白、源自牛血清的胎球蛋白、碳酸氢钠、HEPES、脂质混合液、ITSE混合液、转铁蛋白、bFGF、孕酮、氢化可的松、VO-OHPic、抑制素-α(Pifithrin-α)、SB203580的培养基；

在DMEM/F-12培养基中加入了L-谷氨酰胺、抗坏血酸、人重组型白蛋白、源自牛血清的胎球蛋白、碳酸氢钠、HEPES、脂质混合液、ITSE混合液、转铁蛋白、bFGF、孕酮、氢化可的松、氯化锂及Y-27632的培养基；

在DMEM/F-12培养基中加入了L-谷氨酰胺、抗坏血酸、人重组型白蛋白、源自牛血清的胎球蛋白、碳酸氢钠、HEPES、脂质混合液、ITSE混合液、转铁蛋白、bFGF、孕酮、氢化可的松、VO-OHPic、抑制素-α(Pifithrin-α)、SB203580及Y-27632的培养基；

在DMEM/F-12培养基中加入了L-谷氨酰胺、抗坏血酸、人重组型白蛋白、源自牛血清的胎球蛋白、碳酸氢钠、HEPES、脂质混合液、ITSE混合液、转铁蛋白、bFGF、孕酮、氢化可的松、VO-OHPic、抑制素-α(Pifithrin-α)、SB203580及氯化锂的培养基；

在DMEM/F-12培养基中加入了L-谷氨酰胺、抗坏血酸、人重组型白蛋白、源自牛血清的胎球蛋白、碳酸氢钠、HEPES、脂质混合液、ITSE混合液、转铁蛋白、bFGF、孕酮、氢化可的松、VO-OHPic、SB203580、氯化锂及Y-27632的培养基；

在DMEM/F-12培养基中加入了L-谷氨酰胺、抗坏血酸、人重组型白蛋白、源自牛血清的胎球蛋白、碳酸氢钠、HEPES、脂质混合液、ITSE混合液、转铁蛋白、bFGF、孕酮、氢化可的松、抑制素-α(Pifithrin-α)、SB203580、氯化锂及Y-27632的培养基；

作为配方培养基的例示，可列举例如：在DMEM/F-12培养基中加入了L-谷氨酰胺、抗坏血酸、人重组型白蛋白、源自牛血清的胎球蛋白、碳酸氢钠、HEPES、脂质混合液、ITSE混合液、转铁蛋白、bFGF、孕酮、氢化可的松、VO-OHPic、抑制素-α(Pifithrin-α)、氯化锂及Y-27632的培养基等。

对配方培养基的制备方法没有特别限定，可以按照现有公知的常规方法来制备。例如，在室温下或根据需要在加温下在动物细胞培养用基础培养基中添加、混合上述各成分而得到。

配方培养基优选为液体，根据需要可以制成凝胶状、琼脂培养基等固态状的培养基。如果利用配方培养基，可以在培养表面经过了表面处理的、或未经过表面处理的培养容器或培养用载体中接种间充质干细胞并进行孵育。

[ROR1阳性的间充质干细胞的培养上清的制备]

作为本发明中的ROR1阳性的间充质干细胞培养上清，只要是培养上述ROR1阳性间充质干细胞而得到的上清则没有特别限定。例如，将上述ROR1阳性间充质干细胞在通常30℃～37℃的温度、2％～7％CO₂环境下、5％～21％O₂环境下以适当细胞密度在适当培养基中进一步进行培养。就培养而言，可以在细胞的整个培养期内使用无血清培养基来进行。在此，所使用的无血清培养基可以适用上述ROR1阳性间充质干细胞部分中的说明。

作为培养上清的回收时期，可以在考虑细胞状态而进行适当次数的传代之后、通常在传代1天后～5天后、优选1天后～4天后、更优选1天后～3天后、进一步优选2天后～3天后进行。可以仅回收1次培养上清，也可以在多天内进行多次回收。

需要说明的是，本说明书中的ROR1阳性间充质干细胞的培养上清是指：从在ROR1阳性间充质干细胞能增殖或生存的条件下用ROR1阳性间充质干细胞能增殖或生存的培养液培养而得到的培养液(培养后的培养液)中除去了细胞等而得的液体；为了方便，从这样的培养上清中进一步除去了例如残存培养基成分(培养前的培养液成分中的、在培养后的培养液中仍残存的成分)、培养液的水分等无益于本发明效果的成分中的至少一部分而得的液体也包含在本说明书的ROR1阳性间充质干细胞的培养上清中。需要说明的是，从简便性的观点出发，优选直接使用从培养后的培养液中除去了间充质干细胞而得的液体来作为培养上清。

本发明中的ROR1阳性间充质干细胞的培养上清例如可以用所含的细胞因子、miRNA等核酸、代谢产物等来表征。

[药物组合物]

本发明的药物组合物，其特征在于，含有ROR1阳性的间充质干细胞及或其培养上清。ROR1阳性的间充质干细胞具有如下特性：IL-6等炎症性细胞因子的产生抑制作用、屏障功能亢进作用、迁移能力、线粒体转移能力优异，并且为对氧化应激也具有耐性、不易受到损伤的细胞。另外，在维持未分化性的同时，若处于分化条件下则能够高效地分化成具有目标功能的细胞。这样的包含ROR1阳性的间充质干细胞的本发明的药物组合物对各种疾病发挥优异的预防或治疗效果。本发明的药物组合物可以在不损害本发明的效果的范围内、在ROR1阳性的间充质干细胞基础上含有其它成分。

本发明的药物组合物包含间充质干细胞团，该一部分或全部为ROR1阳性的间充质干细胞。ROR1阳性的间充质干细胞如上所述。本发明的药物组合物所含的间充质干细胞团中ROR1阳性的间充质干细胞所占的比例越高则越优选。上述比例优选为50％以上，更优选为70％以上，进一步优选为90％以上，特别优选为95％以上，最优选为99％以上。

[药物组合物的制备方法]

本发明还包含一种用于疾病的预防或治疗的药物组合物的制备方法，其包含诱导ROR1阳性的间充质干细胞并对其进行浓缩或分离筛选的工序。作为上述疾病，可列举选自由癌症、癌前病变、炎症性疾病、免疫疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、心血管疾病、脑血管损伤、骨疾病、胃肠疾病、肺疾病、肝疾病及肾疾病组成的组中的疾病。

本发明的药物组合物的制备方法包含诱导ROR1阳性的间充质干细胞并对其进行浓缩或分离筛选的工序。作为在上述诱导ROR1阳性的间充质干细胞的工序中采用的方法，只要是能够诱导、增强间充质干细胞中的ROR1表达的方法则没有特别限定。例如使用上述配方培养基诱导间充质干细胞中的ROR1蛋白的表达的方法也可作为优选的方法来示出。若利用使用上述配方培养基的培养，则能够将间充质干细胞团的60％以上诱导成ROR1阳性细胞，能够制成优选70％以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上、特别优选实质上为均一的ROR1阳性细胞。

另外，作为对ROR1阳性的间充质干细胞进行浓缩、分离筛选的工序中采用的方法，可列举例如上述那样的使用特异性识别ROR1的抗体并使用细胞分选仪、磁珠等的方法。若根据这些方法，则能够选择性地浓缩、分离筛选在细胞表面表达ROR1蛋白的间充质干细胞。

本发明的药物组合物除了含有通过上述“诱导ROR1阳性的间充质干细胞并对其进行浓缩或分离筛选的工序”取得的ROR1阳性的间充质干细胞和/或其培养上清以外，可以在不损害本发明的效果的范围内含有ROR1阴性的间充质干细胞、其它细胞，根据其用途、形态可以通过常规方法使其含有药学上可接受的载体、添加物。作为这样的载体、添加物，可列举例如：等渗剂、增粘剂、糖类、糖醇类、防腐剂(保存剂)、杀菌剂或抗菌剂、pH调节剂、稳定剂、螯合剂、油性基剂、凝胶基剂、表面活性剂、助悬剂、结合剂、赋形剂、润滑剂、崩解剂、泡腾剂、流动剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧化剂、甜味剂、酸味剂、着色剂、呈味剂、香料或清凉化剂等，但不限于这些。作为代表性成分，可列举例如以下的载体、添加物等。

[本发明的ROR1阳性的间充质干细胞及含有其的药物组合物的用途]

本发明的药物组合物可以用于各种疾病的预防和/或治疗，虽然不进行限定性解释，但可列举例如基于以下说明的作用、功能等的用途来作为优选例子。

(培养上清的屏障功能亢进作用)

本发明中的ROR1阳性的间充质干细胞的培养上清与ROR1阴性的以往的间充质干细胞的培养上清相比，显示更优异的细胞屏障功能亢进效果。即，本发明中的ROR1阳性的间充质干细胞的培养上清具有使由于炎症而受到损伤的细胞的屏障功能恢复的显著效果，因此本发明的ROR1阳性的间充质干细胞及含有其的药物组合物可以优选用于炎症相关疾病的治疗。另外，ROR1阳性的间充质干细胞或其培养上清还可以作为化妆品用组合物、食品用组合物等使用。

(抗炎症效果)

本发明中的ROR1阳性的间充质干细胞具有抑制巨噬细胞在炎症状态下产生炎症性细胞因子的效果。该效果与ROR1阴性的以往的间充质干细胞相比显著高。因此，本发明的ROR1阳性的间充质干细胞及含有其的药物组合物可以优选用于炎症相关疾病的治疗。另外，ROR1阳性的间充质干细胞或其培养上清还可以作为化妆品用组合物、食品用组合物等使用。

(抗肿瘤效果)

本发明的ROR1阳性的间充质干细胞与ROR1阴性的间充质干细胞相比迁移能力优异。另外，本发明的ROR1阳性的间充质干细胞的培养上清与ROR1阴性的间充质干细胞的培养上清相比，抑制癌细胞的迁移的活性高。即，可认为本发明的ROR1阳性的间充质干细胞由于迁移能力优异而能够适宜地移动到作用部位，进而能够在作用部位抑制例如癌细胞等的迁移，从而能够抑制癌细胞的浸润、转移。因此，本发明的包含ROR1阳性的间充质干细胞的药物组合物、及包含本发明的ROR1阳性的间充质干细胞的培养上清的药物组合物优选作为发挥抗肿瘤效果的药物使用。

(作为线粒体转移剂的作用)

本发明的ROR1阳性的间充质干细胞的线粒体转移能力优异，通过对发生了线粒体功能障碍、线粒体活性降低等的细胞转移线粒体而对各疾病、老化/应激等所伴随的症状发挥优异的效果。因此，含有本发明的ROR1阳性的间充质干细胞或其培养上清的药物组合物优选作为线粒体转移剂使用，所述线粒体转移剂用于通过对发生了线粒体功能障碍、线粒体活性降低等的细胞转移线粒体来改善、治疗和/或预防各疾病、老化/应激等所伴随的症状。作为这样的疾病及症状，没有特别限定，可列举例如：心肌细胞、肺泡上皮细胞、肾小管细胞、星形细胞、支气管平滑肌细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、免疫细胞(巨噬细胞等)、表皮干细胞、真皮成纤维细胞、角膜结膜上皮干细胞等相关的疾病及症状，其中优选用于心肌细胞、真皮成纤维细胞、支气管平滑肌细胞的相关疾病及症状。

就能够使用本发明的ROR1阳性的间充质干细胞及含有其的药物组合物作为细胞药品的疾病而言，可以列举例如：软骨退化、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、脊椎关节炎、骨关节炎、痛风、银屑病、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默氏症、帕金森氏病、充血性心脏衰竭、脑梗塞、中风、主动脉瓣狭窄、肾功能衰竭、红斑狼疮、胰腺炎、过敏症、纤维化、贫血、动脉粥样硬化、再狭窄、化疗/放疗相关并发症、I型糖尿病、II型糖尿病、自身免疫性肝炎、C型肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、暴发性肝炎、乳糜泻、非特异性结肠炎、变应性结膜炎、糖尿病性视网膜病、干燥综合症、葡萄膜炎过敏性鼻炎、哮喘、石棉沉着病、矽肺、慢性阻塞性肺病、慢性肉芽肿性炎症、囊肿性纤维化、结节病、肾小球肾炎、血管炎、皮炎、HIV相关恶病质、脑型疟疾、强直性脊柱炎、麻风病、肺纤维化、纤维肌痛、食道癌、胃食管反流病、Barrett食管、胃癌、十二指肠癌、小肠癌、阑尾癌、大肠癌、结肠癌、直肠癌、***癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、脾癌、肾癌、膀胱癌、***癌、睾丸癌、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌等。

作为将本发明的药物组合物作为药品使用时的给药方法，没有特别限制，优选血管内给药(优选静脉内给药)、腹腔内给药、肠管内给药、皮下给药等，其中更优选血管内给药。

本发明的药物组合物的用量(给药量)可根据患者的状态(体重、年龄、症状、身体状况等)及本发明的药物组合物的剂形等而不同，有如下倾向：从发挥充分的预防或治疗效果的观点出发，优选其量多的方式；另一方面，从抑制副作用的观点出发，优选其量少的方式。通常，在对成人给药的情况下，以细胞数计为5×10²～1×10¹²个/次，优选为1×10⁴～1×10¹¹个/次，更优选为1×10⁵～1×10¹⁰个/次。需要说明的是，可以将本用量作为1次的量并多次给药，也可以将本用量分成多次来给药。另外，通常在对成人给药的情况下，以每单位体重的细胞数计为1×10～5×10¹⁰个/kg，优选为1×10²～5×10⁹个/kg，更优选为1×10³～5×10⁸个/kg。需要说明的是，可以将本用量作为1次的量并多次给药，也可以将本用量分成多次来给药。

本发明包含一种疾病的预防或治疗方法，其特征在于，使用ROR1阳性的间充质干细胞、或包含ROR1阳性的间充质干细胞的药物组合物。作为上述疾病，可列举例如癌症、癌前病变、炎症性疾病、免疫疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、心血管疾病、脑血管损伤、骨疾病、胃肠疾病、肺疾病、肝疾病、肾疾病等。

实施例

然后，通过实施例更具体地说明本发明，但本发明不受以下实施例限定。

＜ROR1阳性间充质干细胞的制备＞

将源自脐带的间充质干细胞(UC-MSC；脐带来源间充质干细胞华顿氏胶(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine公司)在37℃、5％CO₂的条件下用LifeLine公司推荐培养基进行驯化，按照常规方法用相同培养基进行了传代培养而所得的UC-MSC用于以下的实验。

以6700个细胞/cm²接种上述UC-MSC并培养4天后，用-PBS(-)清洗2次，用0.025％胰蛋白酶回收细胞。在200G、5分钟、4℃下进行离心，用1％BSA/D-PBS溶液将细胞再悬浮。分别以5ul/100ul的浓度添加PE抗人ROR1(BD Biosciences#564474)或小鼠IgG2b PE，k型对照(k type control)(BioLegend#401208)并反应1小时。用1％BSA/D-PBS溶液清洗细胞3次，用1％BSA/D-PBS再悬浮，用SONY SH800Z进行细胞分选。将各细胞组用上述推荐培养基以1～3×10⁴个细胞/cm²接种在6孔板或96孔板中。

使用所得到的ROR1阳性MSC(R阳性，R posi)、ROR1阴性MSC(R阴性，R nega)、根据需要将ROR1阳性MSC与ROR1阴性MSC以1：1的比例混合而成的细胞(R混合，R mix)、未进行分选的MSC(R无分选)进行以下的试验。需要说明的是，在本试验中，作为ROR1阳性MSC而回收的细胞团中也可能包含部分ROR1阴性MSC。

(细胞迁移试验)

将通过上述分选得到的ROR1阳性MSC、ROR1阴性MSC用LifeLine公司推荐培养基进一步培养2天，通过常规方法进行胰蛋白酶处理并回收细胞。将回收的细胞悬浮于DMEM/F12(含有0.2％FBS(MP Biomedicals公司)、1％ANTIBIOTIC-ANTIMYCOTIC(gibco公司、15240-062))，用200μL的培养基以约各3.0×10⁴个细胞接种在24孔博伊登室(Boyden Chamber)(Corning公司、3422)的上部孔中。向下部孔中加入DMEM/F12(含有10％FBS、1％ANTIBIOTIC-ANTIMYCOTIC)550μL，在37℃、5％二氧化碳及95％空气的环境下培养5小时。培养后，从上部孔和下部孔两者中除去培养基，用PBS(-)清洗后，向下部孔加入冷却到-30℃的甲醇(Wako公司、134-01833)500μL，在-30℃静置10分钟。除去甲醇，用PBS(-)清洗后，向下部孔中加入1％结晶紫溶液(将革兰氏染色液I(武藤化学公司、41131)用20％乙醇/水稀释2倍而得的溶液)500μL，在室温下染色10分钟。取下上部孔，在流水中清洗后，将残留在膜的上侧的细胞用棉棒完全除去。将膜用手术刀切开并放入96孔板的孔中，加入1％SDS水溶液50μL溶解细胞。除去膜，用酶标仪(Molecular Probe公司)测定吸光度(590nm、对照波长650nm)。该测定值为与从上部孔迁移到下部孔的细胞数成比例的值。将结果示于图1。

如图1所示，可知ROR1阳性MSC(R阳性)与阴性MSC(R阴性)相比，迁移能力显著高。

(氧化应激耐性试验)

将通过上述方法得到的ROR1阳性MSC(R阳性)、ROR1阴性MSC(R阴性)、将ROR1阳性MSC与ROR1阴性MSC以1：1的比例混合而成的细胞(R混合)、未进行分选的MSC(R无分选)分别根据细胞密度而再次接种，在2天后用图3所示的各浓度的H₂O₂/HBSS溶液处理1小时，返回至原培养基，通过用Hoechst33342的核染色及其的荧光图像分析对24小时后的细胞数进行比较。

如图2所示，提示了：UC-MSC由于H₂O₂/HBSS溶液处理而受到损伤，细胞数减少，但ROR1阳性MSC(R阳性)与ROR1阴性MSC(R阴性)及未进行分选的MSC(R无分选)相比，对因H₂O₂/HBSS溶液处理而产生的损伤的耐性显著高，成为不易受到氧化应激的状态，细胞数的减少受到抑制。

(线粒体转移试验)

将通过上述方法得到的ROR1阳性MSC(R阳性)、ROR1阴性MSC(R阴性)、根据需要将ROR1阳性MSC与ROR1阴性MSC以1：1的比例混合而成的细胞(R混合)、未进行分选的MSC(R无分选)分别以1×10⁵个细胞/孔接种在6孔板(CORNING，Cell Bind 3335)中。2天后，用胰蛋白酶/EDTA(KURABO，HK-3120)处理细胞而将其剥离，重新接种。向成为线粒体的供给侧的UC-MSC细胞的烧瓶中添加线粒体染色试剂(将molecular probes MitoTracker(注册商标)Green FM(M7514life technologies)用HBSS(+)稀释为1/1000而成的试剂)在37℃下孵育30分钟，向成为线粒体的接受方的细胞的烧瓶中添加细胞质染色试剂(将invitrogenCellTraceTMFar Red Cell Proliferation Kit(C34564life technologies)用HBSS(+)稀释为1/7000而成的试剂)在37℃下孵育1小时。染色后，置换为各培养基并在37℃下培养一晚，第二天用HBSS(+)清洗3次，用胰蛋白酶/EDTA剥离细胞。将剥离的细胞用HBSS(+)进行清洗，将两种细胞分别以2000个细胞/孔的量接种到平板(96孔板)中开始共培养。第二天将核染色试剂用PBS(-)稀释为1/1000后对孔内培养基进行置换。在室温放置15分钟后，用ImageXpress拍摄图像(16个视野/孔)。用细胞计数程序*进行分析，计算线粒体转移率。将结果示于图3～5。

作为接受方的细胞，使用以下的细胞。

·通过上述方法制备的ROR1阳性MSC及ROR1阴性MSC

·BSMC-COPD细胞(慢性阻塞性肺病的人支气管平滑肌细胞；Bronchial SmoothMuscle cell Chronic Obstructive Pulmonary Disease(Lonza 00195274)；需要说明的是，在BSMC-COPD细胞的培养中使用了SmGMTM-2培养基+BulletKit(Lonza CC-3182)+1％ANTIBIOTIC-ANTIMYCOTIC(Gibco公司)。

·HCM(人心肌细胞)：Human Cardiac Myocytes(HCM(PromoCell))；需要说明的是，在HCM的培养中使用了肌细胞基础培养基(Myocyte Basal Medium)(PromoCell，C-22170)，肌细胞生长培养基补充包(Myocyte Growth Medium Supplement Pack)(PromoCell，C-39270)。

用细胞计数程序*的分析如下进行。

(1)用DAPI滤光片等识别核染色的滤光片观察，对核进行识别、测量(＝细胞数的测定)。

(2)用Cy5滤光片等识别接受方细胞染色的滤光片进行观察，对作为接受线粒体侧的细胞(接受方)的细胞质进行识别、测量(例如，被染成红色的细胞＝接受方)。

(3)用识别线粒体染色的滤光片观察，对具有线粒体的细胞(供给侧)进行识别、测量(例如，被染成绿色的细胞＝供给侧)。

(4)通过下述计算式可以算出线粒体转移率(％)。另外，通过对(1)的细胞数进行测量，可以评价药剂的细胞毒性。

计算式：((2)加上(3)的细胞数/(2)的细胞数)×100

如图3所示，可知：ROR1阳性(Posi)MSC与ROR1阴性(Nega)MSC、未进行分选的MSC相比，线粒体转移能力显著高。另外，如图4所示，可知：ROR1阳性MSC与ROR1阴性MSC相比，对BSMC-COPD细胞(慢性阻塞性肺病的人支气管平滑肌细胞)的线粒体转移率显著高。进而如图5所示，ROR1阳性MSC与ROR1阴性MSC相比，对HCM(人心肌细胞)的线粒体转移率显著高。

由以上的试验结果可知，ROR1阳性MSC与ROR1阴性MSC相比，迁移能力优异，并且对氧化应激的耐性强。另外，ROR1阳性MSC对作为慢性阻塞性肺病的人支气管平滑肌细胞株的BSMC-COPD细胞、作为人心肌细胞株的HCM细胞转移自身线粒体的比率高，因此可认为对慢性阻塞性肺病、心脏疾病的治疗或预防有效。另外可认为，除了上述疾病以外，能够广泛用于线粒体功能障碍、线粒体活性的降低等相关疾病、伴随老化等的症状。

(抗炎症效果)

将通过上述方法得到的ROR1阳性MSC、阴性MSC分别在0.2％FBS-DMEM/F12培养基中培养48小时，回收培养上清并用于以下的试验。

准备将染色试剂钙黄绿素-AM的0.5mM DMSO溶液用10％FCS DMEM稀释了1000倍的溶液。向小鼠巨噬细胞细胞株Raw264.7添加含有钙黄绿素-AM的培养基，在5％CO₂、37℃下进行3小时的前培养，然后以5×10⁵个细胞/孔接种于48孔板。

第二天、添加1/2量的培养上清，4小时后以100ng/mL的量添加LPS。在17-18小时后回收培养上清。通过ELISA(mIL-6ELISA，R&D Duoset DY406-05)测定培养上清中的IL-6量。需要说明的是，在回收培养上清后，测定预先摄入Raw264.7中的钙黄绿素-AM的荧光值并扣除，由此进行IL-6量的细胞数校正。将结果示于图6。

如图6所示，添加ROR1阳性MSC的培养上清时，与添加ROR1阴性MSC的培养上清时相比，巨噬细胞细胞株Raw264.7所产生的作为炎症性细胞因子的IL-6的产生进一步受到抑制。

＜ROR1表达细胞的诱导＞

(配方培养基的制备)

制备下述表1所示的基本培养基。具体而言，向DMEM/F12培养基中添加下述表1中记载的成分并使其达到记载的浓度。

[表1]

向上述制备的基本培养基中，按照LiCl(Wnt活化剂)250μM、Y-27632(ROCK抑制剂)100nM、Pifithrin-a(p53抑制剂)10μM、VO-OH Pic(PTEN抑制剂)500nM、SB203580(p38抑制剂)100nM的量添加各成分，制备配方培养基。将该培养基用于源自脐带的间充质干细胞、源自脂肪的间充质干细胞的培养，诱导ROR1阳性的间充质干细胞。需要说明的是，作为对照，使用了现有公知的作为间充质干细胞用的培养基的LifeLine公司的推荐培养基。

＜源自脐带的间充质干细胞及源自脂肪的间充质干细胞的培养和评价＞

(试验1)

将源自脐带的间充质干细胞(UC-MSC；脐带来源间充质干细胞华顿氏胶(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine公司；主脐带来源间充质干细胞(Primary Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells)；正常人类(Normal Human)、PCS-500-010、ATCC公司；人脐带间充质干细胞(Human Umbilical Mesenchymal Stem Cells,HUMSC)、7530、ScienCell公司)及源自脂肪的间充质干细胞(AD-MSC；脂肪间充质干细胞(Adiposederived Mesenchymal Stem Cells)、FC-0034、LifeLine公司)在37℃、5％CO₂的条件下用LifeLine公司推荐培养基进行驯化后，以5,000个细胞/cm²的密度接种于CellBind瓶。第二天更换为LifeLine公司推荐培养基或配方培养基(1×10⁵个细胞/孔；6孔板)。在3天后分别同样地重新接种并培养合计7天(UC-MSC)或8天(AD-MSC)，将细胞的形态示于图7。同样地，对于进一步培养2天(合计8天)的细胞，用FACS对包括ROR1在内的各种细胞表面标志物进行分析(图8；UC-MSC、图9；AD-MSC、图9仅表达ROR1)。图中，漏白表示用推荐培养基培养的细胞的各种细胞表面标志物表达，灰色表示用配方培养基培养的细胞的各种细胞表面标志物表达。另外，对于UC-MSC、AD-MSC的培养8天后的细胞，用FACS进行细胞表面标志物表达的分析，将结果示于图10(AD-MSC)及11(UC-MSC)。

关于AD-MSC，在使用配方培养基时，与推荐培养基相比会稍缩小且变圆、状态良好，与此相对，使用推荐培养基的情况下，成为细长的形态，判断其状态稍差。但是，关于表面标志物的表达，用推荐培养基培养时，AD-MSC的CD105、CD73的表达峰高且为1个，与此相对，用实施例1的培养基培养的CD105在部分细胞中的表达降低，表达峰变为2个。另外，CD73则整体性地表达强度降低(图10)。我们认为，推荐培养基对于维持AD-MSC的未分化性而言更适宜。

另一方面，关于UC-MSC的细胞形态，如图7所示，在配方培养基的情况下细胞会缩小且变圆，状态良好。另外，如图8及9所示，用配方培养基培养8天的UC-MSC及AD-MSC与用推荐培养基培养的各细胞相比，ROR1阳性的比例显著增加，进而ROR1的表达强度也提高。另外，如图8、图10及11所示，在用配方培养基培养的情况下，CD105、CD73的表达峰进一步变高，判断能够进一步维持未分化性。

(试验2)

将源自脐带的间充质干细胞(UC-MSC；脐带来源间充质干细胞华顿氏胶(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine公司)在37℃、5％CO₂的条件下用LifeLine公司推荐培养基进行驯化后，更换成LifeLine公司推荐培养基或配方培养基(1×10⁵个细胞/孔；6孔板)。每隔2～3天进行传代，用FACS对从培养基更换起第11天的细胞分析细胞表面标志物(CD29、CD73、CD90、105及CD166)的表达。将结果示于图12、13。

如图12、13所示，与用推荐培养基培养时相比，用配方培养基培养时UC-MSC的表面标志物的CD73及CD166的表达提高，CD29的峰变得更均匀。可判定：用配方培养基培养时能够维持UC-MSC的未分化性。

(试验3)细胞内的mRNA表达

将源自脐带的间充质干细胞(UC-MSC；脐带来源间充质干细胞华顿氏胶(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine公司；Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem CellsSciencell公司；或Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells ATCC公司)在37℃、5％CO₂的条件下用各公司推荐培养基进行驯化后，更换成各公司推荐培养基或配方培养基(1×10⁵个细胞/孔；6孔板)。每隔2～3天进行传代，将培养的细胞回收，通过常规方法分离mRNA。具体而言，用RNeasy Mini Kit(74109、QIAGEN公司)分离总RNA，用ReverTra AceqPCR RT kit Master Mix with gDNA Remover(FSQ-301、东洋纺公司)进行反转录而合成cDNA。以合成的cDNA为模板，用TaKaRa Ex Taq(RR039A、TaKaRa公司)并使用关于ROR1、MT1X、NID2、ANKRD1、CPA4、DKK1各基因的引物，通过实时PCR进行基因表达分析。另外，作为内源性对照基因，使用GAPDH及18s进行表达量校正。将结果示于图14。

与上述各个用推荐培养基培养的细胞相比，用配方培养基培养UC-MSC而得到的细胞中的ROR1、ANKRD1、CPA4、DKK1的基因表达上调(图14)。需要说明的是，在LifeLine公司及ATCC公司的UC-MSC中，MT1X、NID2的基因表达也与上述4个基因的表达同样地，用配方培养基培养时与各个用推荐培养基培养时相比可见基因表达的上调。

(试验4)细胞内的miRNA表达量

将源自脐带的间充质干细胞(UC-MSC；脐带来源间充质干细胞华顿氏胶(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine公司)在37℃、5％CO₂的条件下用LifeLine公司推荐培养基进行驯化后，更换成LifeLine公司推荐培养基或配方培养基(1×10⁵个细胞/孔；6孔板)，每隔2～3天进行传代，回收从培养基更换起第8天的细胞。由回收的细胞中通过与上述试验7同样的方法制备mRNA，通过miRNA阵列(miScript miRNA PCR array；MIHS-105Z及MIHS-117Z(inflammatory response&autoimmunity及Fibrosis、QIAGEN公司制)分析细胞中的miRNA表达。结果的分析通过将用配方培养基培养得到的细胞中的各种miRNA表达量除以用推荐培养基培养得到的细胞中的各种miRNA表达量而得的值(倍性变化值)来进行。将同样的实验进行2次。

对合计约150种miRNA进行分析的结果是，用配方培养基培养的UC-MSC表达hsa-let-7e-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-503-5p。另外，作为用配方培养基培养的UC-MSC与用推荐培养基培养的UC-MSC相比表达尤其有增加的倾向的miRNA，可列举hsa-let-7e-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-let-7d-5p，作为表达尤其有降低倾向的miRNA，可列举hsa-miR-145-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-503-5p。

(试验5)细胞因子向培养上清中的分泌

将(UC-MSC；脐带来源间充质干细胞华顿氏胶(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine公司)在37℃、5％CO₂的条件下用LifeLine公司推荐培养基进行驯化后，更换成LifeLine公司推荐培养基或配方培养基(1×10⁵个细胞/孔；6孔板)。在变更为各培养基并培养8天后重新接种，第二天更换成含有0.2％FBS的DMAM/F12，在2天后(48小时后)回收培养上清。通过ELISA测定所回收的培养上清中的核心蛋白聚糖、护骨蛋白、MMP1量。将结果示于图15。

如图15所示，在用配方培养基培养的UC-MSC的培养上清中含有核心蛋白聚糖、护骨蛋白、MMP1，与用推荐培养基培养的UC-MSC的培养上清相比，核心蛋白聚糖的含量多，相反，护骨蛋白及MMP1的含量少。

(试验6)氧化应激耐性的诱导

将(UC-MSC；脐带来源间充质干细胞华顿氏胶(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine公司；UC-MSC；脐带来源间充质干细胞(Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells)ScienCell公司；及脐带来源间充质干细胞(Umbilical Cord derived Mesenchymal StemCells)ATCC公司)在37℃、5％CO₂的条件下用各公司推荐培养基进行驯化后，更换成各公司推荐培养基或配方培养基(0.3～1×10⁵个细胞/孔；6孔板)。对于每隔2～3天进行传代的细胞，以各浓度的鱼藤酮进行处理(0nM、100nM、200nM、500nM、1μM)。48小时后用Hoechest33358染色，用ImageXpress测量核数。将结果示于图16。

如图16所示，提示了如下可能性：UC-MSC呈鱼藤酮处理浓度依赖性地受到损伤而细胞数减少；但通过用配方培养基进行培养，则能够耐受鱼藤酮处理所致的损伤，成为不易受到氧化应激的状态，细胞数的减少受到抑制。

(试验7)培养上清的屏障功能亢进作用

将源自脐带的间充质干细胞(UC-MSC；脐带来源间充质干细胞华顿氏胶(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine公司)在37℃、5％CO₂的条件下用LifeLine公司推荐培养基进行驯化后，更换成LifeLine公司推荐培养基或配方培养基(1×10⁵个细胞/孔；6孔板)。在变更为各培养基并培养8天后，将培养基更换成含有10％FCS的DMEM/F-12培养基2ml/孔。1天后回收培养上清(Sup-1)，以2ml/孔注入新的培养基，继续培养。进而在24小时后再次回收培养上清(Sup-2)。

将源自人结肠癌的细胞株Caco-2用含有10％FCS的DMEM培养基传代培养，将第3次传代的细胞用于本实验。将Caco-2以5×10⁴个细胞/孔接种于Transwell(Corning Costar#3460)，第二天确认细胞已附着于Transwell，除去培养基。将上述源自脐带的间充质干细胞的培养上清(Sup-1)用含有10％FCS的DMEM培养基稀释10倍后添加于Transwell。第二天除去培养基，添加将上述源自脐带的间充质干细胞的培养上清(Sup-2)用含有10％FCS的DMEM培养基稀释4倍而成的液体。进而，以1.5ng/ml的量添加IL-1β，进一步培养20小时后，测定TER(经上皮电阻值)。通过细胞增殖测试试剂盒(WST-8、#343-07623、同仁化公司)测定在相同条件下培养的Caco-2的细胞数(吸光度)，将得到的TER除以细胞数而得的值作为TER值(TER Value)并示于图17。

如图17所示，IL-1β处理引起了Caco-2细胞的细胞间屏障强度(TER值)的降低。与此相对地，若添加用配方培养基培养的UC-MSC的培养上清，则与添加用推荐培养基培养的UC-MSC的培养上清时相比TER值进一步恢复。由该结果可知，用配方培养基培养的ROR1阳性的UC-MSC的培养上清显示优异的屏障功能亢进效果。

(试验8)抗炎症效果

将源自脐带的间充质干细胞(UC-MSC；脐带来源间充质干细胞华顿氏胶(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine公司)在37℃、5％CO₂的条件下用LifeLine公司推荐培养基进行驯化后，更换成LifeLine公司推荐培养基或配方培养基(1×10⁵个细胞/孔；6孔板)。将变更为各培养基并培养8天后的细胞用于以下的试验。

准备将染色试剂钙黄绿素-AM的0.5mM DMSO溶液用10％FCS DMEM稀释了1000倍而成的液体。对小鼠巨噬细胞细胞株Raw264.7添加含有钙黄绿素-AM的培养基，在5％CO₂、37℃下进行3小时的前培养后以5×10⁵个细胞/孔接种于48孔板。

第二天,以5×10³个细胞/孔的量添加上述用推荐培养基或配方培养基培养8天的UC-MSC，开始进行UC-MSC和Raw264.7的共培养。在共培养开始起4小时后，以100ng/mL的量添加LPS。在17-18小时后回收培养上清。通过ELISA(mIL-6ELISA，R&D Duoset DY406-05)测定培养上清中的IL-6量。需要说明的是，在回收培养上清后，测定预先摄入至Raw264.7中的钙黄绿素-AM的荧光值并扣除，由此进行IL-6量的细胞数校正。将结果示于图18。

如图18所示，通过与UC-MSC的共培养，巨噬细胞细胞株Raw264.7所产生的作为炎症性细胞因子的IL-6的产生受到抑制。另外，与用推荐培养基培养的UC-MSC相比，用配方培养基培养的ROR1阳性的UC-MSC的该抑制效果显著高。

(试验9)关于骨分化能力

将源自脐带的间充质干细胞(UC-MSC；脐带来源间充质干细胞华顿氏胶(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine公司)及源自脂肪的间充质干细胞(AD-MSC；脂肪间充质干细胞、FC-0034、LifeLine公司)在37℃、5％CO₂的条件下用LifeLine公司推荐培养基进行驯化后，更换成LifeLine公司推荐培养基或配方培养基(1×10⁵个细胞/孔；6孔板)。每隔2～3天进行传代，准备传代次数为8的细胞。将传代次数为8的两MSC以7000个细胞/cm²接种于各2张Cell BIND T-75flask中，对于两MSC，将1张在第二天更换成配方培养基而另一张则在推荐培养基中继续培养至达到90-100％汇合。再次传代使传代数为9，重新接种到各4张T-75flask中，将分组后8天(传代数10)的细胞用于下述的分化试验。

在分组后第8天，对于各组回收细胞，按照KURABO分化规程建议的细胞密度用骨细胞分化用培养基(人间充质干细胞用骨细胞分化用培养基：OsteoLife CompleteOsteogenesis Medium(Lifeline，LM-0023))接种于24孔板(cellbind，3337，Corning)。在用于骨分化的培养中，在分化培养用接种起48小时后进行培养基更换，以后每隔3-4天进行培养基更换，直至28天为止。作为染色方法，在接种后第21天以后，将要染色的孔用PBS清洗1次后添加无水乙醇，在室温下放置30分钟，从而进行细胞的固定。将无水乙醇抽滤去除，在洁净室内静置约30分钟而使其干燥。添加2％茜素红溶液，在室温下静置15分钟后，用DW(蒸馏水)清洗2次，使其干燥。染色照片使用显微镜(Olympus IX70)来拍摄。将茜素红染色的结果示于图19。

如图19所示，可知用配方培养基培养的UC-MSC、AD-MSC与用推荐培养基培养时相比分化为骨的分化能力提高。

(试验10)关于脂肪分化能力

用于分化实验的间充质干细胞的制备通过与试验9同样的方法来进行。

在分组后第8天，对于各组回收细胞，按照KURABO分化规程建议的细胞密度用分化培养基{人间充质干细胞用脂肪细胞分化用培养基：AdipoLife DfKt-1(Lifeline，LL-0050)或者AdipoLife DfKt-2(Lifeline，LL-0059)接种于24孔板(cellbind，3337，Corning)。在用于脂肪分化的培养中，在分化培养用接种起48小时后进行培养基更换，以后每隔3-4天进行培养基更换，直至第28天为止。作为染色方法，在接种后第21天以后，将要染色的孔用PBS清洗1次后，用4％(v/v)多聚甲醛/磷酸缓冲液按照少量残留培养基的方式清洗2次。再次添加4％(v/v)多聚甲醛/磷酸缓冲液，在室温下静置20分钟。然后，用DW(蒸馏水)清洗2次、用100％异丙醇清洗1次以使培养基少量残留。添加用DW(蒸馏水)稀释为60％的油红O染色原液，在37℃静置30分钟后，完全抽滤去除。然后添加60％异丙醇，等待约10秒，加入DW(蒸馏水)。用DW(蒸馏水)清洗2次后，用显微镜(Olympus IX70)拍摄照片。需要说明的是，将AdipoLife DfKt-1的AdipoLife BM(100ml)分成15ml和85ml，向15ml中加入DifFactor 1(1ml)，将其作为AD-MSC用的分化开始培养基；向85ml中加入DifFactor 2(5ml)，将其作为AD-MSC用的分化维持培养基。另外，向AdipoLife DfKt-2的AdipoLife BM(100ml)中加入DifFactor 3(10ml)，将其作为UC-MSC用的分化培养基。将油红O染色的结果示于图20。

如图20所示，可知用配方培养基培养的UC-MSC与用推荐培养基培养的UC-MSC相比分化为脂肪细胞的分化能力提高。另一方面可知，在AD-MSC的情况下，用推荐培养基培养的AD-MSC分化为脂肪细胞的分化能力稍高。

(试验11)关于软骨分化能力

用于分化实验的间充质干细胞的制备通过与试验9同样的方法进行。

在分组后第8天，对各组回收细胞，按照KURABO分化规程建议的细胞密度用分化培养基(人间充质干细胞用软骨细胞分化用培养基：ChondroLife Complete ChondrogenesisMedium(Lifeline，LM-0023))接种于24孔板(3527，Corning)。在用于软骨分化的培养中，通过微团培养法进行接种。具体而言，将回收的细胞在各维持培养基中浓缩为1.6×10⁷个细胞/ml，向24孔板(3526，Corning)中以4滴/孔各滴加5ul，在37℃、5％CO₂中静置2小时后，以500ul/孔添加软骨分化培养基。然后，每3日进行培养基更换，直至第21天为止。作为染色方法，在接种后第21天以后，将要染色的孔用PBS清洗1次后，添加10％中性缓冲***液，在室温下放置30分钟，从而进行细胞的固定。然后，用DW(蒸馏水)清洗1次，添加3％乙酸并静置1分钟。添加阿辛蓝染色液后在室温下静置20分钟，然后将染色液抽滤去除，添加3％乙酸等待3分钟。最后用DW(蒸馏水)清洗2次，用数码相机拍摄。

上述试验的结果是用配方培养基培养的细胞与用推荐培养基培养的细胞在分化为软骨的分化能力方面差异不明显，但在用配方培养基培养的的情况下细胞会形成小块，与此相对，在用推荐培养基培养的情况下以扁平状态贴在平板上细胞较多。

＜ROR1阳性MSC的功能的研究＞

从上述用配方培养基培养而得到的细胞团中，通过分选将ROR1阳性MSC(F阳性，Fposi)及ROR1阴性MSC的细胞(F阴性，F nega)分离，根据需要使用将ROR1阳性MSC与ROR1阴性MSC以1：1的比例混合而成的细胞(F混合，F mix)、未进行分选的MSC(F无分选)并研究各自的功能。以下详细进行说明。

将源自脐带的间充质干细胞(UC-MSC；脐带来源间充质干细胞华顿氏胶(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine公司)用上述配方培养基进行培养，得到含有较多ROR1阳性MSC的细胞团。由得到的细胞团中，通过分选而得到ROR1阳性MSC、及ROR1阴性MSC。具体而言，向用配方培养基培养得到的MSC中分别以5ul/100ul的浓度添加PE抗人ROR1(BD Biosciences#564474)或小鼠IgG2b PE，k型对照(BioLegend#401208)并反应1小时。用1％BSA/D-PBS溶液将细胞清洗3次，用1％BSA/D-PBS进行再悬浮，用SONY SH800Z进行细胞分选。将各细胞组、以及根据需要将ROR1阳性MSC与ROR1阴性MSC以1：1的比例混合而成的细胞(F混合)、及未进行分选的MSC(F无分选)用上述配方培养基以1～3×10⁴个细胞/cm²接种于6孔板或96孔板，用于以下的试验。

(细胞迁移试验)

将通过上述而得到的ROR1阳性MSC(F阳性)、ROR1阴性MSC(F阴性)分别在0.2％FBS-DMEM/F12培养基中培养48小时，回收培养上清，对各培养上清的癌细胞迁移抑制能力进行比较。作为癌细胞，使用B16小鼠黑色素瘤细胞。具体而言，将培养至亚汇合的B16小鼠黑色素瘤细胞用0.25％胰蛋白酶/EDTA液(Gibco公司)回收。将回收的细胞悬浮于DMEM/F12(含有0.2％FBS、1％ANTIBIOTIC-ANTIMYCOTIC)，用200μL的培养基在24孔博依登槽(Corning公司、3422)的上部孔中各接种约4.0×10⁴个细胞。在下部孔中加入上述中制作的各MSC培养上清550μL，在37℃、5％二氧化碳及95％空气的环境下培养6小时。此后的处理与图1的实验同样进行。将结果示于图21。

如图21所示，可知：ROR1阳性MSC的培养上清与阴性MSC的培养上清相比，癌细胞(B16小鼠黑色素瘤细胞)的迁移抑制能力显著高。因此认为，ROR1阳性MSC和/或其培养上清发挥抑制癌细胞的浸润、转移的优异效果，提示含有它们的药物组合物对癌的治疗、预防有效。

(氧化应激耐性试验)

将通过上述方法得到的ROR1阳性MSC(F阳性)、ROR1阴性MSC(F阴性)、将ROR1阳性MSC与ROR1阴性MSC以1：1的比例混合而成的细胞(F混合)、未进行分选的MSC(F无分选)分别根据细胞密度进行再接种，2天后用各浓度的H₂O₂/HBSS溶液(0、100、200、400μM)处理1小时，用HBSS(+)清洗2次后，返回至原培养基，通过Hoechst33342(Dojindo#H342；1μg/ml下5～10分钟)染色后的荧光图像分析比较24小时后的细胞数。

如图22所示，UC-MSC由于H₂O₂/HBSS溶液处理而受到损伤而细胞数减少，ROR1阳性MSC(F阳性)与ROR1阴性MSC(F阴性)相比，对于H₂O₂/HBSS溶液处理所致的损伤的耐性显著高，另外，与将ROR1阳性MSC与ROR1阴性MSC以1：1的比例混合而成的细胞(F混合)、未进行分选的MSC(F无分选)相比，也有足够高的倾向，提示成为更不易受到氧化应激的状态、细胞数的减少受到抑制。

(线粒体转移试验)

将通过上述方法得到的ROR1阳性MSC(F阳性)、ROR1阴性MSC(F阴性)、将ROR1阳性MSC与ROR1阴性MSC以1：1的比例混合而成的细胞(F混合)分别接种于6孔板，使用与上述线粒体转移试验同样的方法比较各细胞的线粒体转移能力。作为接受方的细胞，使用以下的细胞。

·NHDF细胞(人皮肤成纤维细胞)：Human Dermal Fibroblast(KURABO KF-4009)；需要说明的是，在NHDF细胞的培养中使用了DMEM(Gibco 11995-065)培养基+10％FCS+1％AB*。

·HCM(人心肌细胞)：Human Cardiac Myocytes(HCM(PromoCell))；需要说明的是，在HCM的培养中使用了肌细胞基础培养基(PromoCell，C-22170)，肌细胞生长培养基补充包(PromoCell，C-39270)。

如图23及24所示，可知：与ROR1阴性MSC(F阴性)、将ROR1阳性MSC与ROR1阴性MSC以1：1的比例混合而成的细胞(F混合)相比，ROR1阳性MSC(F阳性)向BSMC-COPD细胞(慢性阻塞性肺病的人支气管平滑肌细胞)、HCM(人心肌细胞)的线粒体转移率显著高。另外，虽然数据未示出，但可见如下倾向：与ROR1阴性MSC(F阴性)、将ROR1阳性MSC与ROR1阴性MSC以1：1的比例混合而成的细胞(F混合)相比，ROR1阳性MSC(F阳性)对NHDF细胞(人皮肤成纤维细胞)的线粒体转移率足够高。

由以上的试验结果可知，ROR1阳性MSC的癌细胞的迁移抑制能力优异，并且对氧化应激的耐性强。另外，ROR1阳性MSC对作为人皮肤成纤维细胞的NHDF细胞、作为慢性阻塞性肺病的人支气管平滑肌细胞株的BSMC-COPD细胞、作为人心肌细胞株的HCM细胞转移自身线粒体的比率显著高，因此认为对于纤维症、慢性阻塞性肺病、心脏疾病的治疗或预防是有效的。另外认为，除了上述疾病以外，还能够广泛用于线粒体功能障碍、线粒体活性的降低等相关疾病、老化等相伴随的症状。

Claims

1.一种ROR1阳性的间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞，其为CD29、CD73、CD90、CD105及CD166阳性。

3.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞，其源自脐带或脂肪。

4.一种药物组合物，其包含权利要求1～3中任一项所述的间充质干细胞和/或其培养上清。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中，药物组合物包含ROR1阳性的间充质干细胞时，ROR1阳性的间充质干细胞的比率为药物组合物所含的全部间充质干细胞的70％以上。

6.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其中，药物组合物包含ROR1阳性的间充质干细胞时，ROR1阳性的间充质干细胞的比率为药物组合物所含的全部间充质干细胞的90％以上。

7.根据权利要求4～6中任一项所述的药物组合物，其用于预防或治疗选自由癌症、癌前病变、炎症性疾病、免疫疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、心血管疾病、脑血管损伤、骨疾病、胃肠疾病、肺疾病、肝疾病及肾疾病组成的组中的疾病。

8.根据权利要求4～7中任一项所述的药物组合物，其用于预防或治疗起因于上皮或内皮的屏障功能降低的疾病、或与IL-1相关的疾病。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中，屏障功能降低起因于上皮或内皮细胞层中的紧密连接功能的降低。

10.根据权利要求4～6中任一项所述的药物组合物，其用于抑制癌细胞的浸润和/或转移。

11.根据权利要求4～10中任一项所述的药物组合物，其为线粒体转移剂。

12.一种ROR1阳性的间充质干细胞的制备方法，其包含诱导ROR1阳性的间充质干细胞并对其进行浓缩或分离筛选的工序。

13.一种用于疾病的预防或治疗的药物组合物的制备方法，其包含诱导ROR1阳性的间充质干细胞并对其进行浓缩或分离筛选的工序。

14.根据权利要求13所述的制备方法，其中，所述疾病选自由癌症、癌前病变、炎症性疾病、免疫疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、心血管疾病、脑血管损伤、骨疾病、胃肠疾病、肺疾病、肝疾病及肾疾病组成的组。

15.一种预防或治疗选自由癌症、癌前病变、炎症性疾病、免疫疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、心血管疾病、脑血管损伤、骨疾病、胃肠疾病、肺疾病、肝疾病及肾疾病组成的组中的疾病的方法，其使用ROR1阳性的间充质干细胞。