CN108348603B - 抗cd3叶酸结合物和其用途 - Google Patents

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Abstract

本文中描述了结合于叶酸的新颖抗CD3抗体并且提供了其在将得益于这类结合物的疾病或病状的治疗上的用途。

Description

抗CD3叶酸结合物和其用途
技术领域
本发明涉及结合于叶酸的抗CD3抗体和其片段。
背景技术
天然产生的抗体(Ab)是由两个相同免疫球蛋白(Ig)重链和两个相同轻链组成的四聚体结构。Ab的重链和轻链由不同结构域组成。每个轻链具有一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)，而每个重链具有一个可变结构域(VH)和三个或四个恒定结构域(CH)。由约110个氨基酸残基组成的每个结构域折叠成由两个抵靠彼此充填的β-片层形成的特征性β-夹层结构，即免疫球蛋白折叠。VL结构域各具有三个互补决定区(CDR1-3)并且VH结构域各具有至多四个互补决定区(CDR1-4)，所述互补决定区是在结构域的一端连接β链的环或转角。轻链和重链的可变区总体上促成抗原特异性，不过个别链对特异性的影响不一定相同。抗体分子已经发展到通过使用随机化CDR环结合于大量分子。
Ab的功能性亚结构可以通过蛋白分解和重组方法制备。其包含Fab片段，所述Fab片段包括由单个链间二硫键连接的重链的VH-CH1结构域与轻链的VL-CL1结构域；和Fv片段，所述Fv片段仅仅包括VH和VL结构域；和Fc部分，所述Fc部分包括分子的非抗原结合区。在一些情况下，单个VH结构域保留显著的对抗原的亲和力(Ward等人,1989,《自然(Nature)》341,554-546)。也已经显示某些单聚κ轻链将特异性地结合于其抗原。(L.Masat等人,1994,《美国国家科学院院刊(PNAS)》91:893-896)。有时已经发现分离的轻链或重链也保留一些抗原结合活性(Ward等人,1989,《自然》341,554-546)。
另一功能亚结构是单链Fv(scFv)，其由通过肽连接子共价连接的免疫球蛋白重链和轻链的可变区构成(S-z Hu等人,1996,《癌症研究(Cancer Research)》,56,3055-3061)。这些小(Mr 25,000)蛋白质通常保留单一多肽中对抗原的特异性和亲和力并且能够为较大的抗原特异性分子提供便利的构建基块。在许多情况下scFv在循环中的短半衰期限制了其治疗效用。
使用Ig VH结构域的一部分作为模板设计被称为“微抗体”的小蛋白质骨架(Pessi等人,1993,《自然》362,367-369)。通过随机化与VH的CDR1和CDR2相对应的环且接着使用噬菌体呈现法选择突变体，鉴别对白细胞介素-6具有高亲和力(解离常数(Kd)为约10-7M)的微抗体(Martin等人,1994,《欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)》13,5303-5309)。
当分析来自骆驼血清的IgG样物质时，骆驼常常缺乏可变轻链结构域，这表明可以只从VH结构域(三个或四个CDR环)得到足够抗体特异性和亲和力。已经制造具有高亲和力的“骆驼化”VH结构域，并且高特异性可以通过仅仅随机化CDR3来产生。
“微抗体”的一种替代物是“双功能抗体”。双功能抗体是具有两个抗原结合位点的小的二价和双特异性抗体片段。片段在同一多肽链(VH-VL)中包括连接到轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。双功能抗体大小类似于Fab片段。通过使用过短而使得同一链上的两个结构域之间不能配对的连接子，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对，并且产生两个抗原结合位点。这些二聚抗体片段或“双功能抗体”是二价和双特异性的。参见P.Holl iger等人,《美国国家科学院院刊》90:6444-6448(1993)。
已制得CDR肽和有机CDR模拟物(Dougall等人,1994,《生物技术趋势(TrendsBiotechnol.)》12,372-379)。CDR肽是短的、通常环状的肽，其与抗体的CDR环的氨基酸序列相对应。CDR环负责抗体-抗原相互作用。CDR肽和有机CDR模拟物已经显示保留一定的结合亲和力(Smyth和von Itzstein,1994,《美国化学学会杂志(J.Am.Chem,Soc.)》116,2725-2733)。在不损失亲和力下已经将小鼠CDR移植到人类Ig构架上(Jones等人,1986,《自然》321,522-525；Riechmann等人,1988)。
在体内，从大型文库选择特异性Ab并扩增(亲和力成熟)。所述过程可以使用组合文库技术在体外再现。成功地将Ab片段呈现在噬菌体的表面上已经使得产生和筛选大量的CDR突变成为可能(McCafferty等人,1990,《自然》348,552-554；Barbas等人,1991,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》88,7978-7982；Winter等人,1994,《免疫学年鉴(Annu.Rev.Immunol.)》12,433-455)。通过此技术产生增加数目的Fab和Fv(和其衍生物)。组合技术可以与Ab模拟物组合。
可能充当蛋白质骨架的许多蛋白质结构域已表达为与噬菌体衣壳蛋白的融合物。在Claclcson和Wells,《生物技术趋势》,12:173-184(1994)中评述。这些蛋白质结构域中的数个已用作呈现随机肽序列的骨架，包含牛胰腺胰蛋白酶抑制剂(Roberts等人,《美国国家科学院院刊》89:2429-2433(1992))、人类生长激素(Lowman等人,《生物化学(Biochemistry)》30:10832-10838(1991))、Venturini等人,《蛋白质肽通讯(ProteinPeptide Letters)》1:70-75(1994))以及链球菌的IgG结合域(O'Neil等人,《蛋白质化学中的技术V(Techniques in Protein Chemistry V)》(Crabb,L编)第517-524页,AcademicPress,圣地亚哥(San Diego)(1994))。这些骨架已经显示单个随机化环或区域。淀粉酶抑肽(Tendamistat)已用作丝状噬菌体M13上的呈递骨架(McConnell和Hoess,1995,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》250:460-470)。
亲水性聚合物聚(乙二醇)(简称为PEG)的共价连接是一种增加许多生物活性分子(包含蛋白质、肽且尤其是疏水性分子)的水溶性、生物利用率、增加血清半衰期、增加治疗半衰期、调节免疫原性、调节生物活性或延长循环时间的方法。PEG已经广泛地用于药品、人造植入物以及生物相容性、缺乏毒性和缺乏免疫原性具有重要意义的其它应用中。为了使PEG的所需特性达到最大，附接到生物活性分子的PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高，以赋予通常与PEG聚合物附接有关的有利特征，例如增加水溶解度和循环半衰期，同时不会不利地影响亲本分子的生物活性。
PEG衍生物时常通过反应性化学官能团(如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基)、N端和碳水化合物部分连接到生物活性分子。蛋白质和其它分子常常具有有限数目的可供聚合物附接的反应位点。最适合于经由聚合物附接进行修饰的位点常常在受体结合中起显著作用，且是保留分子的生物活性所需要的。因此，聚合物链与生物学活性分子上此类反应性位点之任意连接常常导致聚合物修饰的分子的生物活性明显降低或甚至全部丧失。R.Clark等人,(1996),《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,271:21969-21977。为了形成具有足够聚合物分子量从而赋予目标分子所需优势的结合物，现有技术方法通常涉及大量聚合物臂与所述分子的无规连接，由此增加了亲本分子的生物活性降低或甚至完全丧失的风险。
将非基因编码的氨基酸并入到蛋白质中的能力允许引入可提供天然存在的官能团的有价值的替代物的化学官能团，如赖氨酸的ε-NH2、半胱氨酸的硫氢基-SH、组氨酸的亚氨基等。已知某些化学官能团对在20种常见的基因编码的氨基酸中发现的官能团是惰性的，但简洁有效地反应形成稳定的键。例如，所属领域中已知叠氮基和乙炔基在催化量的铜存在下，在水性条件下进行胡伊斯根(Huisgen)[3+2]环加成反应。参见例如Tornoe等人,(2002)《有机化学(Org.Chem.)》67:3057-3064；和Rostovtsev等人,(2002)《应用化学国际 版(Angew.Chem.Int.Ed.)》41:2596-2599。举例来说，通过将叠氮部分引入到蛋白质结构中，能够并入对在蛋白质中发现的胺、硫氢基、羧酸、羟基呈化学惰性，但也与乙炔部分平稳并有效地反应形成环加成产物的官能团。重要的是，在不存在乙炔部分下，叠氮基在其它蛋白质侧链存在下和在生理条件下保持化学惰性和不反应。
本发明尤其解决了与抗原结合多肽和其片段且尤其多肽小分子结合物的活性和产生相关的问题，还解决了具有改善的生物或药理学特性、例如改善的治疗半衰期的抗原结合多肽和多肽小分子结合物的产生。
发明内容
本发明提供了抗CD3抗体和其与叶酸的结合物。在一些实施例中，本发明的新颖抗CD3抗体包括一或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施例中，抗CD3抗体包括完整抗体重链。在一些实施例中，抗CD3抗体包括完整抗体轻链。在一些实施例中，抗CD3抗体包括抗体轻链的可变区。在一些实施例中，抗CD3抗体包括抗体重链的可变区。在一些实施例中，抗CD3抗体包括抗体轻链的至少一个CDR。在一些实施例中，抗CD3抗体包括抗CD3抗体的抗体重链的至少一个CDR。在一些实施例中，抗CD3抗体包括轻链的至少一个CDR和重链的至少一个CDR。在一些实施例中，抗CD3抗体包括Fab。在一些实施例中，抗CD3抗体包括两个或更多个Fab。在一些实施例中，抗CD3抗体包括scFv。在一些实施例中，抗CD3抗体包括两个或更多个scFv。在一些实施例中，抗CD3抗体包括微抗体。在一些实施例中，抗CD3抗体包括两个或更多个微抗体。在一些实施例中，抗CD3抗体包括双功能抗体。在一些实施例中，抗CD3抗体包括两个或更多个双功能抗体。在一些实施例中，抗CD3抗体包括轻链可变区和重链可变区。在一些实施例中，抗CD3抗体包括完整轻链和完整重链。在一些实施例中，抗CD3抗体包括一或多个Fc结构域或其部分。在一些实施例中，抗CD3抗体包括以上实施例中的任何实施例的组合。在一些实施例中，抗CD3抗体包括以上实施例中的任何实施例的均二聚体、杂二聚体、均多聚体或杂多聚体。在一些实施例中，抗CD3抗体包括结合于结合搭配物的多肽，其中所述结合搭配物包括抗原、多肽、核酸分子、聚合物或其它分子或物质。在一些实施例中，抗CD3抗体与非抗体骨架分子或物质相关。
在一些实施例中，抗CD3抗体包括一或多个翻译后修饰。在一些实施例中，抗CD3抗体连接到连接子、聚合物或生物活性分子。在一些实施例中，抗CD3抗体连接到双官能聚合物、双官能连接子或至少一种其它抗CD3抗体。在一些实施例中，抗CD3抗体连接到非抗CD3抗体的多肽。在一些实施例中，包括非天然编码的氨基酸的抗原结合多肽连接到一或多个也可以包括非天然编码的氨基酸的额外抗原结合多肽。在一些实施例中，包括非天然编码的氨基酸的抗原结合多肽连接到也可以包括非天然编码的氨基酸的一或多个多肽小分子结合物。在一些实施例中，包括非天然编码的氨基酸的抗CD3抗体连接到一或多个也可以包括非天然编码的氨基酸的额外抗原结合多肽。
在一些实施例中，非天然编码的氨基酸连接到水溶性聚合物。在一些实施例中，水溶性聚合物包括聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子是双官能聚合物。在一些实施例中，双官能聚合物连接到第二多肽。在一些实施例中，第二多肽是抗原结合多肽。在一些实施例中，第二多肽是抗CD3抗体。
在一些实施例中，抗CD3抗体中的氨基酸取代可以用天然存在或非天然存在的氨基酸进行，其限制条件为至少一个取代是用非天然编码的氨基酸进行。
在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包括羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
在一些实施例中，聚(乙二醇)分子的分子量在约0.1kDa与约100kDa之间。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子的分子量在0.1kDa与50kDa之间。
在一些实施例中，聚(乙二醇)分子是分支聚合物。在一些实施例中，聚(乙二醇)分支聚合物的每一分支的分子量在1kDa与100kDa之间或在1kDa与50kDa之间。
本发明还提供了一种包括附接到一或多个非天然编码的氨基酸上的连接子、聚合物或生物活性分子的抗CD3抗体多肽，其中所述非天然编码的氨基酸在预先选择的位点处由核糖体并入所述多肽中。
附图说明
图1-展示在抗CD3Fab-叶酸下标靶细胞的T细胞衔接和剂量依赖性毒性。图1(A)是在活化人类PBMC(标靶:效应细胞的比率为1:10)存在下用抗CD3Fab-叶酸处理的KB(FR+)、OV-90(FR+)和CAKI-1(FR-)细胞的剂量依赖性T细胞介导的细胞毒性的图。将递增浓度的抗CD3Fab-叶酸或未结合的抗CD3Fab与标靶细胞一起在37℃和5％CO2下培育12-24小时。根据制造商的方案(Cytotox 96非放射性细胞毒性测定，Promega)，通过测量从溶解细胞释放的LDH水平来定量细胞毒性。图1(B)展示维持在补充有10％FBS的无叶酸的RPMI-1640培养基中的SKOV-3细胞，其进行至少三次传代，接着接种在48孔细胞培养板中并使其附接到板，然后加入活化人类PBMC(标靶:效应细胞的比率为1:10)。将抗CD3Fab或抗CD3Fab-叶酸在无叶酸的培养基中稀释并以指示浓度加入，并且将共培养物培育16小时。用25x物镜显微镜获得影像。
图2-使用雌性NOD-SCID小鼠，在异种移植模型中，评估抗CD3Fab-叶酸双特异性药剂的体内功效。动物维持低叶酸饮食，以减少可能与双特异性药剂竞争的叶酸的循环血清水平。当与未活化的人类PBMC(标靶:效应细胞的比率为1:100)或活化人类PBMC(标靶:效应细胞的比率为1:10)混合并皮下注射到小鼠中时KB(FR+)或A549(FR-)细胞能够形成肿瘤。将与活化人类PBMC(标靶:效应细胞的比率为1:10)混合的KB细胞植入小鼠中并接着每天用1.5mg/kg抗CD3Fab-叶酸或PBS静脉内注射小鼠，在肿瘤细胞植入的同一天开始，历时10天。图2(A)展示来自此实验的肿瘤体积。肿瘤体积展示PBS处理的小鼠中快速增加，加倍时间为约5天。相比之下，在整个研究持续时间期间，在用抗CD3Fab-叶酸处理的小鼠中几乎无法检测到肿瘤。在平行研究中，小鼠植入与未活化的人类PBMC(标靶:效应细胞的比率为1:100)混合的KB细胞并且每天用1.5mg/kg抗CD3Fab-叶酸或PBS静脉内处理，在肿瘤细胞植入的同一天开始，历时10天。图2(B)展示来自1:100标靶:效应细胞实验的肿瘤体积。抗CD3Fab-叶酸处理的小鼠中肿瘤的减小速率更高。研究第35天后，PBS处理的小鼠中的肿瘤体积不断地增加，而抗CD3Fab-叶酸处理的小鼠中的肿瘤减小到几乎不可检测的水平，这表明即使在不存在活化T细胞下，抗CD3Fab-叶酸结合物也能够衔接细胞毒性T细胞，从而消除肿瘤。图2(C)展示来自两个处理组的小鼠的体重变化的图示。图2(D)展示三个测试组中大鼠随时间推移的血清浓度∶注射1mg/kg抗CD3Fab-叶酸的大鼠；注射5mg/kg抗CD3Fab-叶酸的大鼠；以及注射1mg/kg抗CD3Fab的大鼠。以规律时间间隔收集血清并通过ELISA来分析。对于抗CD3Fab-叶酸和对应的未结合的突变抗CD3Fab，血清浓度都以相同速率减少，血清半衰期为60分钟。
图3-展示叶酸结合物与FR和CD3的结合。图3(A)是叶酸-CF488与KB细胞(FR+)但未与A549细胞(FR-)结合的图示，通过与游离叶酸竞争进行分析。将细胞与含有递增浓度的结合物的培养基和100nM叶酸一起在4℃下培育30分钟，并通过流式细胞术分析细胞结合的荧光。图3(B)是抗CD3Fab-CF488与Jurkat细胞(CD3+)但未与ICB细胞(CD3-)结合的图示。将细胞与递增浓度的结合物一起在4℃下培育30分钟，并通过流式细胞术分析结合。
图4-展示通过两个独立的细胞毒性测定的抗CD3Fab-叶酸结合物的T细胞介导的毒性。在未活化的人类PBMC(标靶:效应细胞的比率为1:10)存在下用抗CD3Fab-叶酸处理的KB细胞(FR+)但非A549细胞(FR-)的剂量依赖性T细胞介导的细胞毒性。将递增浓度的抗CD3Fab-叶酸与标靶细胞一起在37℃和5％CO2下培育12-24小时。在图4(A)中，细胞用DIO(绿色质膜染剂)标记并加入碘化丙锭到1μg/mL的最终浓度。通过流式细胞术来测量细胞毒性。图4(B)展示24小时后洗掉的PBMC的图示，并使用Cell Titer Glo(Promega)测量KB细胞的ATP含量。
图5-展示在利用无叶酸的培养基的测定中人源化SP34Fab的新颖序列SEQ ID NO：1-15和结合物与SKOV-3的结合。
图6-展示在利用50nM SFA培养基的测定中人源化SP34Fab的新颖序列SEQ ID NO：1-15和结合物与SKOV-3的结合。
图7(a)-展示通过给与嵌合SP34叶酸所诱发的CD69表达。
图7(b)-展示用来自图7(a)的相同血清样品处理的HPB-ALL细胞的细胞活力。
图8-是展示人类PBMC中的细胞毒性百分比的杀死测定，重复来自图6的50nM SFA条件。
定义
应了解，本发明不限于本文中所述的特定方法、方案、细胞株、构筑体和试剂，因此可以变化。还应了解，本文中所用的术语仅仅是为了描述具体实施例，并且不打算限制本发明的范围，本发明的范围将仅受所附权利要求书限制。
除非上下文另作明确指示，否则如本文和所附权利要求书中所使用，单数形式“一(a/an)”和“所述”包含多个参考物。因此，举例来说，提及“多肽小分子结合物”或“抗CD3抗体”是提及一或多种这类蛋白质，并包含本领域的技术人员已知的其同等物等等。
除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所了解相同的含义。现描述优选的方法、装置和材料，但任何与本文中所描述类似或等效的方法、装置和材料都可以用于实践或测试本发明。
本文所提及的所有公开案和专利都是以引用的方式并入本文中以达成描述和公开例如所述公开案中所描述的构筑体和方法的目的，所述构筑体和方法可以结合目前所描述的本发明一起使用。提供本文中讨论的公开案仅仅是为了其在本申请的申请日之前的公开内容。本文中的任何内容都不应被理解为承认由于先前的发明或出于任何其它原因，本发明人无权先于此公开内容。
术语“基本上纯化”是指抗CD3抗体可以基本上或基本不含如在其天然存在环境中发现的蛋白质通常所伴随的或与其相互作用的组分，所述环境即天然细胞，或在重组产生的抗CD3抗体的情况下，为宿主细胞。可以基本上不含细胞物质的抗CD3抗体包含具有低于约30％、低于约25％、低于约20％、低于约15％、低于约10％、低于约5％、低于约4％、低于约3％、低于约2％或低于约1％(以干重计)污染性蛋白质的蛋白质制剂。当抗CD3抗体或其变异体由宿主细胞重组产生时，蛋白质可以呈细胞干重的约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更少存在。当抗CD3抗体或其变异体由宿主细胞重组产生时，蛋白质可以呈细胞干重的约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约l g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更少存在于培养基中。因此，如通过例如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细电泳法等适当的方法所测定，如由本发明的方法产生的“基本上纯化的”抗CD3抗体可以具有至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％的纯度水平，确切地说至少约75％、80％、85％的纯度水平，且更确切地说，至少约90％的纯度水平、至少约95％的纯度水平、至少约99％的纯度水平或更大。
“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指包含外源性多核苷酸的细胞，无论用于***的方法，例如直接吸收、转导、f-配合或所属领域中已知的产生重组宿主细胞的其它方法任何。外源性多核苷酸可以维持为未整合的载剂，例如质粒，或者可以整合到宿主基因组中。
抗体是对特异性抗原展现结合特异性的蛋白质。天然抗体通常为约150,000道尔顿之杂四聚体醣蛋白，由两个相同轻(L)链及两个相同重(H)链构成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而在不同免疫球蛋白同型的重链之间二硫键的数目不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在一个末端具有可变结构域(VH)，其后为多个恒定域。每条轻链在一个末端处具有可变域(VL)并在其另一末端处具有恒定域；轻链恒定域与重链的第一恒定域对准，并且轻链可变域与重链可变域对准。相信特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域之间形成界面。
术语“可变”是指如下事实：在抗体之间，可变域的某些部分在序列上广泛不同，且负责每种特定抗体对其特定抗原的结合特异性。然而，可变性并非均匀分布于抗体可变域中。它集中在轻链和重链可变域两者中的三个称为互补决定区(CDR)的区段中。可变域的更高保守性部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各包括四个FR区，FR区主要采用β片层构型，由三个或四个CDR连接，形成连接且在一些情况下形成β片层结构的一部分的环。每条链中的CDR通过FR区紧邻在一起且与来自另一链的CDR促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,《免疫学关注的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)》第5版，美国国立卫生研究院公共卫生服务部(Public HealthService,National Institute of Health),Bethesda,Md.(1991))。
恒定域并不直接与抗体与抗原的结合有关，但是表现出各种效应功能。取决于重链恒定区的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白可以分类为不同类别。存在五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且这些类别中的若干类别可以进一步分成亚类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类别的免疫球蛋白对应的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。在多种人类免疫球蛋白类别中，已知仅仅人类IgG1、IgG2、IgG3和IgM活化补体。
在体内，抗体的亲和力成熟受较高亲和力抗体变异体的抗原选择所驱动，所述较高亲和力抗体变异体主要是通过体细胞超突变而制得。还常常进行“库漂移”，其中看到二级或三级反应的主要生殖系基因不同于初级或二级反应的生殖系基因。
可以通过体外向抗体基因中引入突变且使用亲和选择法分离具有改进亲和力的突变体来复制免疫***的亲和力成熟过程。这类突变抗体可以呈现在丝状噬菌体或例如酵母等微生物的表面上，并且可以通过对抗原的亲和力或通过从抗原解离的动力学(解离速率)来选择抗体。Hawkins等人,《分子生物学(J,Mol.Biol.)》226:889-896(1992)。已经采用CDR步移诱变(walking mutagenesis)来使结合1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的人包膜糖蛋白gp120的人类抗体(Barbas III等人《美国国家科学院院刊》91:3809-3813(1994)；和Yang等人《分子生物学杂志》254:392-403(1995))和抗c-erbB-2单链Fv片段(Schier等人《分子生物学杂志》263:551567(1996))亲和力成熟。抗体链改组和CDR诱变用于使针对HIV的第三高变环的高亲和力人类抗体亲和力成熟(Thompson等人《分子生物学杂志》256:77-88(1996))。Balint和Larrick《基因(Gene)》137:109-118(1993)描述了计算机辅助的寡脱氧核苷酸引导的扫描诱变，进而同时且彻底地搜索可变区基因的所有CDR以得到改进变异体。使用起始有限诱变策略使αvβ3特异性人源化抗体亲和力成熟，其中所有六个CDR的每个位置都突变，接着表达并筛选包含最高亲和力突变体的组合文库(Wu等人《美国国家科学院院刊》95:6037-6-42(1998))。噬菌体呈现抗体在Chiswell和McCafferty TIBTECH 10:80-84(1992)；以及Rader和Barbas III《生物技术当前述评(Current Opinion in Biotech.)》8:503-508(1997)中评述。在以上参考文献中报道亲和力与亲本抗体相比得到改善的突变抗体的每种情况下，突变抗体在CDR中具有氨基酸取代。
本文中“亲和力成熟”是指增强抗体对其抗原的亲和力的过程。用于亲和力成熟的方法包含(但不限于)计算筛选法和实验法。
本文中“抗体”意指由个或多个基本上由所有或部分抗体基因编码的多肽组成的蛋白质。免疫球蛋白基因包含(但不限于)κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因以及多个免疫球蛋白可变区基因。本文中的抗体意图包含全长抗体和抗体片段，并且包含任何有机体中天然存在的或工程化(例如变异体)的抗体。
“抗体片段”是指除全长形式之外的任何形式的抗体。本文中的抗体片段包含作为在全长抗体内存在的较小组分的抗体和已经工程化的抗体。抗体片段包含(但不限于)Fv、Fc、Fab和(Fab')2、单链Fv(scFv)、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、双官能杂交抗体、CDR1、CDR2、CDR3、CDR组合、可变区、构架区、恒定区等等(Maynard和Georgiou,2000,《生物医学工程年评(Annu.Rev.Biomed.Eng.)》2:339-76；Hudson,1998,《生物技术当前述评》9:395-402)。
本文中“计算筛选法”是指在蛋白质中设计一或多个突变的任何方法，其中所述方法采用计算机来评估潜在氨基酸侧链取代彼此的相互作用和/或与蛋白质其余部分相互作用的能量。
本文中“Fc”意指由免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)构成的抗体部分。Fc还可以包含存在于Cγ2与Cγ1(Cγ1)之间的N端铰链内的任何残基。Fc可以指分离的此区域，或在抗体或抗体片段的情况下的此区域。Fc还包含Fc的任何修饰形式，包含(但不限于)天然单体、天然二聚体(二硫键连接)、修饰二聚体(二硫化物和/或非共价连接)和修饰单体(即，衍生物)。
本文中“全长抗体”意指构成抗体H和/或L链的天然生物形式的结构。在包含人和小鼠的大部分哺乳动物中，这种形式为四聚体，且由两对相同的两个免疫球蛋白链组成，各对具有一条轻链和一条重链，每条轻链包括免疫球蛋白域VL和CL，且每条重链包括免疫球蛋白域VH、Cγ1、Cγ2和Cy3。每对中，轻链和重链可变区(VL和VH)一起负责抗原结合，并且恒定区(CL、Cγ1、Cγ2和Cγ3，特别是Cγ2和Cγ3)负责抗体效应功能。在一些哺乳动物中，例如在骆驼和美洲驼中，全长抗体可以仅仅由两条重链组成，每条重链包括免疫球蛋白结构域VH、Cγ2和Cγ3。
本文中“免疫球蛋白(Ig)”意指由一或多种基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。免疫球蛋白包含(但不限于)抗体。免疫球蛋白可以具有大量结构形式，包含(但不限于)全长抗体、抗体片段和个别免疫球蛋白结构域，包含(但不限于)VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL和CL。
本文中“免疫球蛋白(Ig)结构域”是指由基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质结构域。如图1所示，Ig结构域包含(但不限于)VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL和CL。
如本文所用的“变异蛋白质序列”是指具有一或多个与另一相似蛋白质序列在氨基酸同一性上有所不同的蛋白质序列。所述相似蛋白质序列可以是天然野生型蛋白质序列，或所述野生型序列的另一变异体。一般来说，起始序列称为“亲本”序列，并且可以是野生型或变异序列。举例来说，本发明的优选实施例可以利用人源化亲本序列，对所述人源化亲本序列进行计算分析以制造变异体。
本文中抗体的“可变区”意指由VH免疫球蛋白域、VL免疫球蛋白域或VL和VH免疫球蛋白域构成的多肽(包含变异体)，如图1中所示。可变区可以指分离的此多肽或这些多肽、Fv片段、scFv片段、在较大抗体片段的情况下的此区域或在全长抗体或替代的非抗体骨架分子的情况下的此区域。
本发明可以应用于从广泛范围的来源获得的抗体。抗体可以基本上由来自任何生物体的抗体基因编码，所述生物体包含(但不限于)人类、小鼠、大鼠、兔、骆驼、美洲驼、单峰驼、猴，特别是哺乳动物且尤其是人类且尤其是小鼠和大鼠。在一个实施例中，抗体可以是全人抗体，例如通过使用转基因小鼠或其它动物(Bruggemann和Taussig,1997,《生物技术当前述评》8:455-458)或人抗体文库结合选择法(Griffiths和Duncan,1998,《生物技术当前述评》9:102-108)从患者或受试者中所获得的。抗体可以来自任何来源，包含人工或天然存在。举例来说，本发明可以利用包含(但不限于)嵌合抗体和人源化抗体(Clark,2000,《今日免疫学(Immunol.Today)》21:397-402)的工程化抗体，或来源于组合文库。另外，优化的抗体可以是基本上由一或多种天然抗体基因编码的抗体的工程化变异体。例如，在一个实施例中，优化的抗体是已经通过亲和力成熟鉴别的抗体。
关于本发明的抗CD3抗体，术语“抗原特异性”或“特异性地结合”是指抗CD3抗体结合于所关注的抗原或结合搭配物的一或多个表位，但其基本上不识别和结合含有混合抗原群体的样品中的其它分子。
如本文所用，术语“双特异性抗CD3抗体”或“多特异性抗CD3抗体”是指包括两个或更多个抗原结合位点或结合搭配物结合位点的抗CD3抗体，第一结合位点对第一抗原或表位具有亲和力并且第二结合位点对与第一抗原或表位不同的第二抗原或表位具有结合亲和力。
如本文所用，术语“表位”是指由抗CD3抗体识别的抗原或结合搭配物上的位点。如果抗原包括多肽，那么表位可以是线性或构象上形成的序列或形状的氨基酸。表位也可以是抗CD3抗体可以结合于抗原的任何类型抗原上的任何位置。
如本文所用，“抗原结合多肽”或“抗CD3抗体”应包含至少具有特异性结合于例如抗原等特定结合搭配物的生物活性的那些多肽和蛋白质，以及其抗CD3抗体类似物、抗CD3抗体同工型、抗CD3抗体模拟物、抗CD3抗体片段、杂交抗CD3抗体蛋白质、融合蛋白、低聚物和多聚物、同源物、糖基化模式变异体和突变蛋白，无论其生物活性，并且进一步无论其合成或制造的方法，方法包含(但不限于)重组(由cDNA、基因组DNA、合成DNA还是其它形式的核酸产生)、体外、体内、通过核酸分子的微注射、合成、转基因和基因活化方法。抗CD3的具体实例包含(但不限于)抗体分子、重链、轻链、可变区、CDR、Fab、scFv、替代性骨架非抗体分子、配体、受体、肽或结合抗原的任何氨基酸序列。
术语“抗CD3抗体”或“抗原结合多肽”是指如上所述的抗CD3抗体，以及保留天然存在的抗体的至少一种生物活性，包含(但不限于)除抗原结合外的活性的多肽。除抗原结合外的活性包含(但不限于)任一或多种与Fc相关的活性。
抗原结合多肽包含天然存在的人抗CD3抗体的药学上可接受的盐和前药，以及盐的前药、多晶型物、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变异体和立体异构体，以及天然存在的人抗CD3抗体的激动剂、模拟物和拮抗剂变异体以及其多肽融合物。术语“抗原结合多肽”涵盖在氨基端、羧基端或两端包括其它氨基酸的融合物。示例性融合物包含(但不限于)例如由重组表达产生的甲硫氨酰基抗CD3抗体，其中甲硫氨酸连接到抗CD3抗体的N端；为了纯化(包含(但不限于)聚组氨酸或亲和力表位)的融合物；为了将抗CD3抗体连接到其它生物活性分子的融合物；与血清白蛋白结合肽的融合物；与例如血清白蛋白等血清蛋白的融合物。
术语“抗原”或“结合搭配物”是指作为抗CD3抗体所表现出的结合活性的标靶的物质。实际上任何物质都可能是抗CD3抗体的抗原或结合搭配物。
本发明的双特异性抗体包含具有人源化SP34抗体或抗体片段的抗CD3双特异性抗体。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在重链的位置160处具有非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在轻链的位置172处具有非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在轻链的位置157处具有非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在重链的位置129处具有非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在重链的位置129和轻链的位置172处具有非天然编码的氨基酸。
在一些实施例中，本发明涵盖在重链的位置204处包括非天然编码的氨基酸的人源化SP34抗体。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在重链的位置210处具有非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在重链的位置191处具有非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在重链的位置187处具有非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在重链的位置133处具有非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在重链的位置114处具有非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在重链的位置115处具有非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在轻链的位置111处具有非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在轻链的位置115处具有非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在轻链的位置204处具有非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在轻链的位置191处具有非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在轻链的位置193处具有非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在轻链的位置186处具有非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有两个以上提及的氨基酸改变。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有两个或更多个以上提及的氨基酸变化。
本发明的双特异性抗体包含具有人源化SP34抗体或抗体片段的抗CD3双特异性抗体。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有取代重链的位置160Thr的非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有取代轻链的位置172Lys的非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有取代轻链的位置157Leu的非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有取代重链的位置129Lys的非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有取代重链的位置129Lys和轻链的位置172Lys的非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有取代重链的位置129Lys和轻链的位置157Leu的非天然编码的氨基酸。
在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有取代重链的位置204Asn的非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有取代重链的位置210Lys的非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有取代重链的位置191Thr的非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有取代重链的位置187Ser的非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有取代重链的位置133Gly的非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有取代重链的位置114Ala的非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有取代重链的位置115Ser的非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有取代轻链的位置111Arg的非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有取代轻链的位置115Ala的非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有取代轻链的位置204Leu的非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有取代轻链的位置191Lys的非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有取代重链的位置193Lys的非天然编码的氨基酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体具有取代轻链的位置186Lys的非天然编码的氨基酸。
本发明的双特异性抗体包含具有结合于叶酸的人源化SP34抗体或抗体片段的抗CD3Fab-叶酸双特异性抗体。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在重链的位置160Thr处结合于叶酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在轻链的位置172Lys处结合于叶酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在轻链的位置157Leu处结合于叶酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在重链的位置129Lys处结合于叶酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在重链的位置129Lys和轻链的位置172Lys处结合于叶酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在重链的位置129Lys和轻链的位置157Leu处结合于叶酸。
在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在重链的位置204Asn处结合于叶酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在重链的位置210Lys处结合于叶酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在重链的位置191Thr处结合于叶酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在重链的位置187Ser处结合于叶酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在重链的位置133Gly处结合于叶酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在重链的位置114Ala处结合于叶酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在重链的位置115Ser处结合于叶酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在轻链的位置111Arg处结合于叶酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在轻链的位置115Ala处结合于叶酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在轻链的位置204Leu处结合于叶酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在轻链的位置191Lys处结合于叶酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在轻链的位置193Lys处结合于叶酸。在本发明的一些实施例中，人源化SP34抗体在轻链的位置186Lys处结合于叶酸。
各种参考文献公开通过聚合物结合或糖基化进行的多肽修饰。术语“抗CD3抗体”或“抗原结合多肽”包含(但不限于)结合于例如PEG等聚合物的多肽，并且可以由半胱氨酸、赖氨酸、N端或C端氨基酸或其它残基的一或多个额外衍生构成。另外，抗CD3抗体可以包括连接子、聚合物或生物活性分子，其中连接子、聚合物或生物活性分子结合的氨基酸可以是根据本发明的非天然氨基酸，或可以利用所属领域中已知的技术，例如连接到赖氨酸或半胱氨酸而结合于天然编码的氨基酸。美国专利第4,904,584号公开聚乙二醇化的赖氨酸耗尽的多肽，其中至少一个赖氨酸残基已缺失或被任何其它氨基酸残基置换。WO 99/67291公开一种使蛋白质与PEG结合的方法，其中使蛋白质上的至少一个氨基酸残基缺失并且使蛋白质与PEG在足以实现与蛋白质结合的条件下接触。WO 99/03887公开了属于生长激素超家族的多肽的聚乙二醇化变异体，其中位于多肽的规定区域的半胱氨酸残基已经被非必需氨基酸残基取代。WO 00/26354公开了一种制造与包括至少一个其它糖基化位点的对应亲本多肽相比过敏原性降低的糖基化多肽变异体的方法。
术语“抗原结合多肽”还包含糖基化抗CD3抗体，如(但不限于)在任何氨基酸位置处糖基化的多肽、所述多肽的N-连接或O-连接糖基化形式。含有单一核苷酸变化的变异体也被视为抗CD3抗体的生物活性变异体。另外，还包含剪接变异体。术语“抗原结合多肽”还包含由化学手段连接或表达为融合蛋白的任一或多种抗CD3抗体或任何其它多肽、蛋白质、碳水化合物、聚合物、小分子、连接基团、配体或任何类型的其它生物活性分子的抗CD3抗体杂二聚体、均二聚体、杂多聚体或均多聚体，以及含有例如特异性缺失或其它修饰但维持生物活性的多肽类似物。
在一些实施例中，抗原结合多肽进一步包括调节抗CD3抗体的生物活性的添加、取代或缺失。举例来说，添加、取代或缺失可以调节抗CD3抗体的一或多种性质或活性(包含(但不限于)调节对抗原的亲和力)；调节(包含(但不限于)增加或降低)抗原构象或其它二级、三级或四级结构改变；稳定抗原构象或其它二级、三级或四级结构改变；诱导或引起抗原构象或其它二级、三级或四级结构改变；调节循环半衰期；调节治疗半衰期；调节多肽稳定性；调节剂量；调节释放或生物可用性；促进纯化；或改进或改变特定施用途径。类似地，抗原结合多肽可以包括蛋白酶裂解序列、反应基团、抗体结合域(包含(但不限于)FLAG或poly-His)或其它基于亲和力的序列(包含(但不限于)FLAG、poly-His、GST等)或改进多肽的检测(包含(但不限于)GFP)、纯化或其它特性的连接分子(包含(但不限于)生物素)。
术语“抗原结合多肽”还涵盖连接的抗CD3抗体均二聚体、杂二聚体、均多聚体和杂多聚体，包含(但不限于)直接经非天然编码的氨基酸侧链连接于相同或不同非天然编码的氨基酸侧链、连接于天然编码的氨基酸侧链形成融合物或间接经连接子连接的那些。示例性连接子包含(但不限于)小有机化合物、多种长度的水溶性聚合物(例如聚(乙二醇)或聚葡聚糖)或多种长度的多肽。
所属领域的技术人员应了解与特定抗原结合多肽序列中的位置相对应的氨基酸位置容易在抗原结合多肽的片段或相关抗原结合多肽等中鉴别出。举例来说，例如BLAST等序列比对程序可以用于比对和鉴别蛋白质中与相关序列中的位置相对应的特定位置。
术语“抗原结合多肽”涵盖包括一或多个氨基酸取代、添加或缺失的抗原结合多肽。本发明的抗原结合多肽可以包括用一或多种天然氨基酸修饰以及一或多种非天然氨基酸修饰。已经描述天然存在的抗CD3抗体多肽中的多个氨基酸位置的示例性取代，包含(但不限于)调节抗原结合多肽的一或多种生物活性的取代，例如(但不限于)增加促效剂活性、增加多肽溶解性、将多肽转化成拮抗剂等，并且涵盖于术语“抗CD3抗体”内。
“非天然编码的氨基酸”是指不是20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸中的一种的氨基酸。可与术语“非天然编码的氨基酸(non-naturally encoded aminoacid)”同义使用的其它术语为“非天然氨基酸(non-natural amino acid)”、“非天然氨基酸(unnatural amino acid)”、“非天然存在的氨基酸(non-naturally-occurring aminoacid)”和其各种加连字符和不加连字符形式。术语“非天然编码的氨基酸”还包含(但不限于)通过天然编码的氨基酸(包含(但不限于)20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)的修饰(例如翻译后修饰)产生但本身并未通过翻译复合物天然并入到生长的多肽链中的氨基酸。这类非天然存在的氨基酸的实例包含(但不限于)N-乙酰基葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基葡糖胺基-L-苏氨酸和O-磷酸化酪氨酸。
“氨基端修饰基团”是指可与多肽的氨基端连接的任何分子。类似地，“羧基端修饰基团”是指可与多肽的羧基端连接的任何分子。末端修饰基团包含(但不限于)多种水溶性聚合物、肽或蛋白质，例如血清白蛋白，或增加肽的血清半衰期的其它部分。
术语“官能团”、“活性部分”、“活化基团”、“离去基”、“反应性位点”、“化学反应性基团”以及“化学反应性部分”在所属领域中和本文中用于指分子不同的可定义的部分或单元。所述术语在某种程度上与在化学领域中的含义同义，并且在本文中用于指示分子中执行某种功能或活性并与其它分子反应的部分。
术语“键”或“连接子”在本文中用于指通常由化学反应形成且通常为共价键的基团或键。水解稳定键意指，所述键在水中基本上稳定，并且在适用的pH值下，包含但不限于在生理条件下，能够在一段较长时间内(可能甚至无限期地)不与水反应。水解不稳定或可降解键意指，所述键能够在水或水溶液(包含例如血液)中降解。酶促不稳定或可降解键意指，所述键能够被一种或多种酶降解。如所属领域中所了解，PEG和相关聚合物可以在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一或多个末端官能团之间的连接基团中包含可降解键。举例来说，由PEG羧酸或活化PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应所形成的酯键一般在生理条件下水解，释放所述生物活性剂。其它水解可降解的键包含但不限于：碳酸酯键；由胺与醛反应产生的亚胺键；通过醇与磷酸酯基反应形成的磷酸酯键；作为酰肼与醛的反应产物的腙键；作为醛与醇的反应产物的缩醛键；作为甲酸酯与醇的反应产物的原酸酯键；由(包含但不限于)聚合物(例如PEG)末端的氨基与肽的羧基形成的肽键；以及由(包含但不限于)聚合物末端的亚磷酰胺基与寡核苷酸的5'羟基形成的寡核苷酸键。分支连接子可以用于本发明的抗原结合多肽中。
术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”在用于本文中时意谓会影响与包含(但不限于)病毒、细菌、噬菌体、转座子、朊病毒、昆虫、真菌、植物、动物和人类的生物体有关的生物***、通路、分子或相互作用的任何物理或生物化学特性的任何物质。具体来说，如本文所用，生物活性分子包含(但不限于)意图用于诊断、治愈、减轻、治疗或预防人类或其它动物的疾病，或以其它方式增强人类或动物的身体或精神健康的任何物质。生物活性分子的实例包含(但不限于)肽、蛋白质、酶、小分子药物、硬药、软药、染料、脂质、核苷、寡核苷酸、毒素、细胞、病毒、脂质体、微米粒子和胶束。适合与本发明一起使用的生物活性剂的类别包含(但不限于)药物、前药、放射性核素、显影剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子、类固醇剂、微生物来源毒素等。
本发明的抗CD3抗体可以结合于例如PEG等分子以改善体内递送和药物动力学概况。Leong等人描述了相比于未聚乙二醇化形式，清除率降低并几乎未丧失抗原结合活性的抗IL-8抗体的Fab'片段的位点特异性聚乙二醇化(Leong，S.R.等人(2001)《细胞因子(Cytokine)》16:106-119)。
许多不同的可裂解连接子为所属领域的技术人员已知的。参见美国专利第4,618,492号、第4,542,225号和第4,625,014号。从这些连接基团释放试剂的机制包含例如照射光不稳定性键和酸催化水解。举例来说，美国专利第4,671,958号包含包括连接子的免疫结合物的描述，所述连接子在标靶位点处通过患者补体***的蛋白水解酶体内裂解。连接子的长度可以预先确定，或视抗CD3抗体与连接到其的分子之间的所需空间关系来选择。鉴于所报导的用于将多种放射诊断化合物、放射性治疗化合物、药物、毒素和其它试剂与抗体相连接的许多方法，所属领域的技术人员将能够确定将所给试剂与抗CD3抗体或其它多肽连接的适合方法。
“双官能聚合物”是指包括两个能够特异性地与其它部分(包含(但不限于)氨基酸侧基)反应以形成共价键或非共价键的不连续的官能团的聚合物。具有与特定生物活性组分上的基团反应的一个官能团和与第二生物组分上的基团反应的另一基团的双官能连接子可以用于形成包含第一生物活性组分、双官能连接子和第二生物活性组分的结合物。已知许多用于连接各种化合物与肽的程序和连接分子。参见例如欧洲专利申请第188,256号；美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号、第4,680,338号、第4,569,789号和第4,589,071号，这些以引用的方式并入本文中。“多官能聚合物”是指包括两个或更多个能够特异性地与其它部分(包含(但不限于)氨基酸侧基)反应以形成共价键或非共价键的不连续的官能团的聚合物。双官能聚合物或多官能聚合物可以是任何所需分子长度或分子量，并且可以选择成在与抗CD3抗体连接的一个分子之间提供特定所需间距或构象。
如本文所用，术语“水溶性聚合物”是指任何在水性溶剂中可溶的聚合物。水溶性聚合物连接到抗CD3抗体可以引起包含(但不限于)以下的改变：相对于未修饰的形式，增加或调节血清半衰期或增加或调节治疗半衰期；调节免疫原性、调节物理缔合特征(例如聚集体和多聚体形成)、改变受体结合和改变受体二聚或多聚。水溶性聚合物可以具有或不具有其自身的生物活性，并且可以用作将抗CD3抗体连接到包含(但不限于)一或多种抗CD3抗体或一或多种生物活性分子的其它物质的连接子。合适的聚合物包含(但不限于)：聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美国专利第5,252,714号中，其以引用的方式并入本文中)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯醚顺丁烯二酸酐、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包含硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包含但不限于甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚烷二醇和其衍生物、聚烷二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚以及α-β-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺等，或其混合物。这类水溶性聚合物的实例包含(但不限于)聚乙二醇和血清白蛋白。
如本文所用的术语“聚烷二醇”或“聚(烯二醇)”是指聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。术语“聚烷二醇”涵盖线性与分支聚合物且平均分子量在0.1kDa与100kDa之间。其它示范性实施例列于例如商业供应商产品目录中，例如Shearwater公司的产品目录《生物医学用聚乙二醇和衍生物(Polyethylene Glycol andDerivatives for Biomedical Applications)》(2001)。
如本文所用的术语“调节血清半衰期”意指修饰的抗CD3抗体相对于其未修饰形式的循环半衰期的正的或负的变化。血清半衰期通过在施用抗CD3抗体之后的各个时间点处取得血液样品并且测定所述分子在各样品中的浓度来测量。血清浓度与时间的相关性允许计算血清半衰期。血清半衰期宜增加至少约两倍，但更小的增加是适用的，例如当其能够实现令人满意的给药方案或避免毒性作用时。在一些实施例中，增加至少约三倍、至少约五倍或至少约十倍。
如本文所用，术语“调节治疗半衰期”意指治疗有效量的包括修饰的生物活性分子的抗CD3抗体或抗CD3抗体相对于未修饰形式半衰期正的或负的变化。通过在施用之后的各个时间点测量分子的药物动力学和/或药效学特性来测量治疗半衰期。增加的治疗半衰期有利地实现尤其有益的给药方案、尤其有益的总剂量，或避免不良作用。在一些实施例中，增加的治疗半衰期由以下引起：效能增加、修饰分子与其标靶的结合增加或减少或未修饰分子的另一参数或作用机理的增加或减少。
术语“分离”在应用于核酸或蛋白质时表示所述核酸或蛋白质基本上不含在天然状态下与其缔合的其它细胞组分。其可以处于均质状态。分离的物质可以是干燥或半干燥状态；或呈溶液形式，包含但不限于水溶液。纯度和均质性通常使用例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱等分析化学技术测定。作为制剂中存在的主要物种的蛋白质基本上是纯化的。具体地说，分离的基因与侧接所述基因且编码除所关注的基因之外的蛋白质的开放阅读框分离。术语“纯化”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一个亮带。具体来说，其意思是指核酸或蛋白质是至少85％纯、至少90％纯、至少95％纯、至少99％或更大程度纯度。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸和其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸类似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非特定限制，否则所述术语还指寡核苷酸类似物，包含PNA(肽核酸)、用于反义技术的DNA的类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸等)。除非另作指示，否则特定核酸序列还暗含其保守修饰的变异体(包含(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体来说，简并密码子取代可以通过产生一或多个所选择的(或所有)密码子的第三个位置经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人,《核酸研究(Nucleic Acid Res.)》19:5081(1991)；Ohtsuka等人,《生物化学杂志(J.Biol Chem.)》260:2605-2608(1985)；以及Cassol等人.(1992)；Rossolini等人,《分子细胞探针(Mol.Cell.Probes)》8:91-98(1994))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于肽的描述和蛋白质的描述，且反之亦然。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及一或多个氨基酸残基为非天然编码的氨基酸的氨基酸聚合物。如本文所用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，包含全长蛋白质(即，抗原)，其中氨基酸残基通过共价肽键来连接。
术语“氨基酸”是指天然存在的和非天然存在的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)和吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基以及R基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保持与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。
氨基酸在本文中可以由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)所推荐的单字母符号来提及。同样地，核苷酸可以由其通常接受的单字母密码来提及。
“保守修饰变异体”适用于氨基酸和核酸序列两者。关于特定核酸序列，“保守修饰变异体”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列或其中核酸不编码氨基酸序列的那些核酸，是指基本上相同的序列。因为遗传密码的简并，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。举例来说，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子指定丙氨酸的每一位置，所述密码子可以变为任一所描述的对应密码子而不更改所编码的多肽。这类核酸变异体为“沉默变体”，其为保守修饰变体的一个物种。本文中的编码多肽的每种核酸序列还描述核酸的每种可能沉默变体。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除通常是甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常是色氨酸的唯一密码子TGG外)可以进行修饰以得到功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变体隐含在每个所述序列中。
关于氨基酸序列，技术人员将认识到改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或较小百分比的氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变异体”，其中所述变化引起氨基酸经化学上类似的氨基酸取代。提供功能上类似的氨基酸的保守取代表在本领域中众所周知。这类保守修饰的变异体另外为且不排除本发明的多态变异体、种间同系物和对偶基因。
以下八个组各自含有彼此保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)
(参见例如Creighton,《蛋白质：结构和分子特性(Proteins：Structures andMolecular Properties)》(W H Freeman&Co.；第2版(1993年12月))。
如本文所用，术语“受试者”是指作为治疗、观测或实验对象的动物，优选哺乳动物，最优选人类。
如本文所用的术语“有效量”是指所施用的(修饰)的非天然氨基酸多肽的量，其将在一定程度上缓解所治疗的疾病、病状或病症的一或多种症状。可以施用含有本文中描述的(修饰)非天然氨基酸多肽的组合物以进行预防性、增强和/或治疗性治疗。
术语“增强(enhance或enhancing)”意指增加或延长所期望作用的效力或持续时间。因此，关于增强治疗剂的作用，术语“增强”是指能够在效力或持续时间上增加或延长其它治疗剂对***的作用。如本文所用，“增强有效量”是指足以增强另一治疗剂在所期望***中的作用的量。当用于患者时，有效用于这种用途的量将取决于疾病、病症或病状的严重度和过程、此前疗法、患者健康状况和药物反应，以及治疗医师的判断。
如本文所用的术语“修饰”是指在多肽上存在翻译后修饰。形式“(修饰)”术语意指所论述的多肽任选地进行修饰，也就是说，论述的多肽可以修饰或未修饰。
术语“翻译后修饰”和“修饰”是指在已经将天然或非天然氨基酸并入到多肽链中之后，这类氨基酸所发生的任何氨基酸修饰。仅举例来说，所述术语涵盖共翻译体内修饰、翻译后体内修饰和翻译后体外修饰。
在治疗应用中，含有(修饰)非天然氨基酸多肽的组合物以足以治愈或至少部分抑制疾病、病症或病状的症状的量施用于已经罹患疾病、病状或病症的患者。这类量被定义为“治疗有效量”，并将取决于疾病、病症或病状的严重度和过程、此前疗法、患者健康状况和药物反应，以及治疗医师的判断。认为所属领域的技术人员完全能够通过常规实验确定这类治疗有效量(例如剂量递增临床试验)。
术语“治疗”用于指预防性和/或治疗性治疗。
除非另外说明，否则采用所属领域的技术范围内的常规质谱法、NMR、HPLC、蛋白化学法、生物化学法、重组DNA技术和药理学法。
具体实施方式
引言
在本发明中提供包括至少一种非天然氨基酸的抗CD3抗体分子。在本发明的某些实施例中，具有至少一种非天然氨基酸的抗CD3抗体包含至少一种翻译后修饰。在一个实施例中，至少一种翻译后修饰包括利用所属领域的一般技术人员已知的适合于特定反应性基团的化学方法，将包含(但不限于)水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、药物、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、生物活性剂、小分子或以上或任何其它合乎需要的化合物或物质的任何组合的包括第二反应性基团的分子连接到包括第一反应性基团的至少一种非天然氨基酸。举例来说，第一反应性基团是炔基部分(包含(但不限于)在非天然氨基酸对炔丙基氧基苯丙氨酸中，其中炔丙基有时也称为乙炔部分)并且第二反应性基团是叠氮基部分，并且利用[3+2]环加成化学方法。在另一实例中，第一反应性基团是叠氮基部分(包含(但不限于)在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)并且第二反应性基团是炔基部分。在本发明的修饰的抗CD3抗体多肽的某些实施例中，使用包括至少一种翻译后修饰的至少一种非天然氨基酸(包含(但不限于)含有酮官能团的非天然氨基酸)，其中至少一种翻译后修饰包括糖部分。在某些实施例中，在真核细胞中或在非真核细胞中进行翻译后修饰。
表1包含本发明的抗CD3抗体的新颖的人源化可变重链、可变轻链和可变重链与轻链序列的清单。
表1：
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抗原结合多肽和小分子可以通过连接子、聚合物或共价键来接合。连接子、聚合物或小分子本身可以包括对20种常见氨基酸不起反应的官能团。连接子或聚合物可以是双官能的。与经由连接子、聚合物或共价键将抗原结合多肽与生物活性分子接合有关的一或多种键在所需条件下可以是不可逆、可逆或不稳定的。与经由连接子、聚合物或共价键将抗原结合多肽与分子接合有关的一或多种键可以允许调节抗原结合多肽或其它分子的释放。多种小分子可以由所属领域的技术人员通过化学手段、作为天然产物分离或其它手段产生。
Rader等人在以引用的方式并入本文中的《美国国家科学院院刊》2003年4月29日；100(9):5396-400描述了一种经由与通用抗体分子反应为小合成分子提供效应功能并延长血清半衰期的方法。所述复合物通过经由抗体上的反应性赖氨酸残基，在mAb38C2、模拟天然醛缩酶的催化抗体和靶向Arg-Gly-Asp肽模拟物的整合素的二酮衍生物之间的可逆共价键来建立。除增加肽模拟物的半衰期之外，复合物还展示抗体选择性再靶向表达整合素αvβ3和αvβ5的细胞的表面。
本发明提供了基于包括至少一种非天然编码的氨基酸的抗原结合多肽或抗CD3抗体的方法和组合物。至少一种非天然编码的氨基酸引入抗CD3抗体中可以允许应用结合化学反应，其包含特定化学反应，包含(但不限于)与一或多个非天然编码的氨基酸反应，而不与通常存在的20种氨基酸反应。在一些实施例中，包括非天然编码的氨基酸的抗CD3抗体经由非天然编码的氨基酸的侧链连接到水溶性聚合物，例如聚乙二醇(PEG)。本发明提供了一种用PEG衍生物选择性修饰蛋白质的高效方法，其包含响应于选择密码子，将包含(但不限于)含有在20种天然并入的氨基酸中未发现的官能团或取代基，包含(但不限于)酮、叠氮化物或乙炔部分的那些氨基酸的非基因编码的氨基酸选择性并入蛋白质中并且随后用适当反应性PEG衍生物修饰那些氨基酸。一旦并入，那么氨基酸侧链可以接着通过利用所属领域的技术人员已知的适合于天然编码的氨基酸中存在的特定官能团或取代基的化学方法来修饰。多种已知的化学方法适合用于本发明中以将水溶性聚合物并入蛋白质中。这类方法包含(但不限于)分别与包含(但不限于)乙炔或叠氮化物衍生物进行胡伊斯根[3+2]环加成反应(参见例如Padwa,A.《综合有机合成(Comprehensive Organic Synthesis.)》第4卷,(1991)编辑Trost,B.M.,Pergamon,Oxford,第1069-1109页；以及Huisgen,R.《1,3-偶极环 加成化学(1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry.)》(1984)编辑Padwa,A.,Wiley,NewYork,第1-176页)。
因为胡伊斯根[3+2]环加成方法涉及环加成而非亲核取代反应，所以蛋白质可在极其高的选择性下进行修饰。所述反应可以在室温下在水性条件中在优良区位选择性(1,4>1,5)下通过加入催化量的Cu(I)盐到反应混合物来进行。参见例如Tornoe等人,(2002)《有 机化学》67:3057-3064；和Rostovtsev等人,(2002)《应用化学国际版》41:2596-2599；和WO03/101972。可以通过[3+2]环加成而加成到本发明蛋白质上的分子包含几乎任何具有合适的官能团或取代基的分子，包含(但不限于)叠氮基或乙炔衍生物。这些分子可以分别用乙炔基(包含(但不限于)对炔丙基氧基苯丙氨酸)或叠氮基(包含(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)。
胡伊斯根[3+2]环加成产生的5元环通常在还原性环境中不可逆并且在水性环境中长期对水解保持稳定。因此，各种物质的物理和化学特征可以在苛刻水性条件下用本发明的活性PEG衍生物进行修饰。更重要地，因为叠氮化物和乙炔部分对彼此具有特异性(并且举例来说，不与20种常见的基因编码的氨基酸中的任一种反应)，所以可以在一或多个特定位点在极其高的选择性下对蛋白质进行修饰。
本发明还提供了PEG衍生物的水溶性和水解稳定衍生物以及具有一或多个乙炔或叠氮基部分的相关亲水性聚合物。含有乙炔部分的PEG聚合物衍生物对与响应于选择密码子而选择性地引入蛋白质中的叠氮基部分偶合具有高度选择性。类似地，含有叠氮基部分的PEG聚合物衍生物对与响应于选择密码子而选择性地引入蛋白质中的乙炔部分偶合具有高度选择性。
更具体地说，叠氮基部分包括(但不限于)烷基叠氮化物、芳香基叠氮化物和这些叠氮化物的衍生物。烷基和芳基叠氮化物的衍生物可以包含其它取代基，只要维持乙炔特异性反应性即可。乙炔部分包括烷基和芳基乙炔和各自的衍生物。烷基和芳基乙炔的衍生物可以包含其它取代基，只要维持叠氮化物特异性反应性即可。
因此，抗CD3抗体旨在包含展示特异性结合标靶分子或抗原的能力的任何多肽。任何已知的抗体或抗体片段都是抗CD3抗体。
本发明的抗CD3抗体可以包括Fc区或Fc样区。Fc域提供与如补体或吞噬细胞的效应功能的连接。免疫球蛋白的Fc部分具有长血浆半衰期，而Fab具有短寿命(Capon等人(1989),《自然》,337:525-531)。当连同治疗蛋白构筑时，Fc域可以提供更长半衰期或者并入如Fc受体结合、蛋白A结合、补体固定和可能甚至是胎盘转移的功能。举例来说，IgG1抗体的Fc区已经与CD30-L的N端融合，CD30-L是结合表达于霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)肿瘤细胞、间变性淋巴瘤细胞、T细胞白血病细胞和其它恶性细胞型上的CD30受体的分子(美国专利第5,480,981号)。消炎性和抗排斥剂IL-10已经与鼠类Fcγ2a融合以增加细胞因子的短循环半衰期。Zheng,X.等人(1995),《免疫学杂志(The Journal of Immunology)》,154：5590-5600。研究也已评估使用与人类IgG1的Fc蛋白相连接的肿瘤坏死因子受体来治疗患有败血性休克的患者。Fisher,C.等人,《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》,334：1697-1702(1996)；Van Zee,K.等人,《免疫学杂志》,156：2221-2230(1996))和类风湿性关节炎(Moreland等人(1997),《新英格兰医学杂志》,337(3):141-147)。Fc也已经与CD4受体融合以产生用于治疗AIDS的治疗蛋白(Capon等人(1989),《自然》,337:525-531)。此外，白细胞介素2的N端也已经与IgG1或IgG3的Fc部分融合以克服白细胞介素2的短半衰期和其全身性毒性(Harvill等人(1995),《免疫技术(Immunotechnology)》,1:95-105)。
众所周知，抗体的Fc区由可以通过二硫键或通过非共价缔合而连接成二聚或多聚形式的单聚多肽区段组成。天然Fc分子的单体子单元之间的分子间二硫键数目在1到4范围内，取决于所涉及的抗体的类别(例如IgG、IgA、IgE)或子类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2)。如本文所用的术语“Fc”是单聚、二聚和多聚形式的Fc分子的总称。应注意，当存在适当Cys残基时，除非存在防止经二硫键形成而二聚的特殊条件，否则Fc单体将自发二聚化。即使通常在Fc二聚物中形成二硫键的Cys残基被移除或由其它残基置换，单聚链通常仍将经由非共价相互作用而二聚化。本文的术语“Fc”用于意指以下这些形式任一种：天然单体、天然二聚体(经二硫键连接)、修饰二聚体(经二硫键和/或非共价键连接)和修饰单体(即衍生物)。
举例来说，可以通过在包含非天然编码的氨基酸的残基或序列上进行各种取代来构筑Fc部分的变异体、类似物或衍生物。变异体(或类似物)多肽包含***变异体，其中一或多个氨基酸残基补充Fc氨基酸序列。***可以位于蛋白质的任一端或两端，或可以置于Fc氨基酸序列的内部区域内。在任一端或两端具有其它残基的***变异体可以包含例如融合蛋白和包含氨基酸标签或标记的蛋白。举例来说，Fc分子可以任选地含有N端Met，尤其是当所述分子在细菌细胞(如大肠杆菌)中重组表达时。在Fc缺失变异体中，移除Fc多肽中的一或多个氨基酸残基。可以在Fc多肽的一端或两端实现缺失，或者可以用移除Fc氨基酸序列中的一或多个残基来实现缺失。因此，缺失变异体包含Fc多肽序列的所有片段。在Fc取代变异体中，移除Fc多肽的一或多个氨基酸残基被用替代残基置换。在一个方面中，取代为保守的，然而本发明还涵盖非保守的取代。举例来说，半胱氨酸残基可以缺失，或者可以用其它氨基酸置换以防止Fc序列的一些或全部二硫化物交联形成。蛋白质可以具有一或多个半胱氨酸残基，并且可以去除这些半胱氨酸残基中之每一个，或用例如Ala或Ser的其它氨基酸或非天然编码的氨基酸取代一或多个这类半胱氨酸残基。作为另一实例，也可以进行修饰以引入氨基酸取代以(1)切除Fc受体结合位点；(2)切除补体(C1q)结合位点；和/或(3)切除抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点。这类位点为所属领域中已知的，并且任何已知的取代都在如本文所用的Fc的范围内。举例来说，就IgG1中的ADCC位点来说，参见《分子免疫学(Molecular Immunology)》,第29卷,第5期,633-639(1992)。同样，一或多个酪氨酸残基也可以由苯丙氨酸残基置换。另外，还涵盖其它变异体氨基酸***、缺失(例如1-25个氨基酸)和/或取代并且在本发明的范围内。保守氨基酸取代一般是优选的。此外，改变可以呈改变的氨基酸形式，如肽模拟物或D-氨基酸。
Fc序列也可以衍生化，即，载有除氨基酸残基***、缺失或取代外的修饰。修饰优选是共价的，并且包含例如与聚合物、脂质、其它有机部分和无机部分的化学键结。可以制备本发明的衍生物以增加循环半衰期，或者可以设计本发明的衍生物以改进多肽靶向所需细胞、组织或器官的能力。也可能将完整Fc分子的救助受体结合域(salvage receptorbinding domain)用作本发明化合物的Fc部分，如标题为“半衰期延长的改变的多肽(Altered Polypeptides with Increased Half-Life)”的WO 96/32478中所述。本文指定为Fc的一类分子的其它成员是标题为“半衰期延长的免疫球蛋白样域(Immunoglobul in-Like Domains with Increased Half-Lives)”的WO 97/34631中所述的那些。本段中所引用的两个公开PCT申请以引用的方式并入本文中。
在一个实施例中，提供包含非天然氨基酸(例如对(炔丙氧基)-苯丙氨酸)的抗CD3抗体的组合物。还提供包括对(炔丙氧基)-苯丙氨酸和(包含(但不限于))蛋白质和/或细胞的各种组合物。在一个方面中，包含对(炔丙氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸的组合物进一步包含正交tRNA。非天然氨基酸可以键结(包含(但不限于)共价)于正交tRNA，包含(但不限于)通过氨基-酰基键共价键结于正交tRNA、共价键结于正交tRNA的末端核糖的3'OH或2'OH等、三氟乙磺酸盐、烯烃和酮。
抗CD3抗体对抗CD3抗体抗原或结合搭配物的抗CD3抗体活性和亲和力的测量
抗CD3抗体活性可以使用标准体外或体内测定来测定。举例来说，结合抗CD3抗体的细胞或细胞系(包含(但不限于)含有天然抗CD3抗体抗原或结合搭配物的细胞或产生抗CD3抗体抗原或结合搭配物的重组细胞)可以用于监测抗CD3抗体结合。对于包括非天然氨基酸的非聚乙二醇化或聚乙二醇化抗原结合多肽，抗CD3抗体对其抗原或结合搭配物的亲和力可以通过使用所属领域中已知的技术，例如BIAcoreTM生物传感器(Pharmacia)测量。
不论使用何种方法来产生抗CD3抗体，都使抗CD3抗体进行生物活性测定。适当时，可以进行氚化胸苷测定以确定细胞***程度。然而，其它生物测定可以用于确定所需活性。例如测量抑制抗原生物活性，例如酶、增生或代谢活性的能力的生物测定还指示抗CD3抗体活性。其它体外测定可以用于确定生物活性。一般来说，生物活性的测试应提供对所需结果的分析，例如生物活性增加或减少(与未改变的抗CD3抗体相比)、不同生物活性(与未改变的抗CD3抗体相比)、受体亲和力分析、构形或结构改变或血清半衰期分析，适当时分析抗原的生物活性。
关于测定方法的参考文献的以上汇编并不详尽，并且所属领域的技术人员将认识到适用于测试所希望的最终结果的其它测定。
效力、功能体内半衰期和药物动力学参数的测量
本发明的一个重要方面是延长生物半衰期，这是通过构筑抗CD3抗体获得的，抗CD3抗体结合或未结合于水溶性聚合物部分。抗CD3抗体血清浓度的快速减少已经使其对评估对使用结合和未结合的抗CD3抗体和其变异体治疗的生物反应来说至关重要。优选地，本发明的结合和未结合的抗CD3抗体和其变异体在静脉内施用之后也具有延长的血清半衰期，使得通过例如ELISA法或通过初级筛选测定来测量成为可能。如本文中所述进行体内生物半衰期的测量。
包括非天然编码的氨基酸的抗原结合多肽的药物动力学参数可以在正常史泊格-多利雄性大鼠(Sprague-Dawley male rat)中进行评估(每个治疗组N＝5只动物)。动物将接受单剂25微克/大鼠iv或50微克/大鼠sc，并且根据预先定义之时程获取约5-7个血液样品，一般未结合于水溶性聚合物的包括非天然编码的氨基酸的抗原结合多肽历时约6小时，并且包括非天然编码的氨基酸并结合于水溶性聚合物的抗原结合多肽历时约4天。在若干物种中充分研究抗CD3抗体的药物动力学数据，并且可以直接与针对包括非天然编码的氨基酸的抗CD3抗体获得的数据比较。
根据本发明的抗CD3抗体的比活性可以通过所属领域中已知的各种测定来测定。根据本发明获得和纯化的抗CD3抗体突变蛋白或其片段的生物活性可以通过本文中所描述或所提及的方法或所属领域的技术人员已知的方法来测试。
施用和药物组合物
本发明的多肽或蛋白质(包含(但不限于)抗CD3抗体、合成酶、包括一或多种非天然氨基酸的蛋白质等)任选地用于治疗用途，包含(但不限于)与合适药物载剂组合。举例来说，这类组合物包括治疗有效量的化合物和药学上可接受的载剂或赋形剂。这类载剂或赋形剂包含(但不限于)生理盐水、缓冲生理盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。配制品应该适合施用模式。一般来说，施用蛋白质的方法是所属领域中众所周知的并且可以应用于本发明的多肽的施用。
根据所属领域中众所周知的方法，任选地在一或多个适当的患有疾病的体外和/或体内动物模型中测试包括一或多个本发明多肽的治疗性组合物，以证实疗效、组织代谢，并且评估剂量。具体来说，首先可以通过本文中非天然与天然氨基酸同源物的活性、稳定性或其它合适的量度(包含(但不限于)，比较被修饰成包含一或多个非天然氨基酸的抗CD3抗体与天然氨基酸抗CD3抗体)，即在相关测定中确定剂量。
施用是通过通常用于引入分子与血液或组织细胞最终接触的任一种途径实现。本发明的非天然氨基酸多肽以任何合适的方式任选地与一或多种药学上可接受的载剂一起施用。可以获得在本发明的情形下向患者施用这类多肽的合适方法，并且虽然超过一个途径可以用于施用特定组合物，但特定途径常常可以提供比另一途径更直接且更有效的作用或反应。
通过所施用的特定组合物以及通过用以施用组合物的特定方法来部分确定药学上可接受的载剂。因此，存在本发明的药物组合物的各种合适的调配物。
多肽组合物可以通过大量途径，包含(但不限于)经口、静脉内、腹膜内、肌肉内、经皮、皮下、局部、舌下或直肠方式来施用。包括修饰或未修饰的非天然氨基酸多肽的组合物还可以经由脂质体施用。所述施用途径和适当调配物一般是所属领域的技术人员已知的。
包括单独或与其它合适的组分组合的非天然氨基酸的抗CD3抗体还可以制成经由吸入施用的气溶胶调配物(即，其可以“雾化”)。气雾剂调配物可以被放置在诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等可接受加压推进剂中。
适合于肠胃外施用，例如通过关节内(关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径的调配物包含水性和非水性的等张无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与预期接受者的血液等张的溶质；和水性和非水性无菌悬浮液，其可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。包装抗CD3抗体的调配物可以呈现于例如安瓿和小瓶的单位剂量或多剂量密封容器中。
肠胃外施用和静脉内施用是优选的施用方法。具体地说，已经用于天然氨基酸同源物治疗剂的施用途径(包含(但不限于)通常用于EPO、GH、抗CD3抗体、G-CSF、GM-CSF、IFN、白细胞介素、抗体和/或任何其它药学上递送的蛋白质的施用途径)以及目前使用的调配物提供用于本发明的多肽的优选的施用途径和调配物。
在本发明的情形下施用于患者的剂量足以随着时间推移在患者中具有有益的治疗反应，或包含(但不限于)抑制病原体感染，或其它适当活性，取决于应用。通过特定载体或调配物的功效和所采用的非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期和患者的病状以及待治疗的患者的体重或表面积来确定剂量。剂量的大小还由特定患者中伴随特定载体、调配物等的施用的任何不良副作用的存在、性质和程度决定。
在测定待施用的载体或调配物治疗或预防疾病(包含(但不限于)癌症、遗传性疾病、糖尿病、AIDS等等)的有效量时，医师评估循环血浆水平、调配物毒性、疾病进展和/或相关时抗非天然氨基酸多肽抗体的产生。
例如施用于70公斤患者的剂量通常在等于当前使用的治疗蛋白质的剂量范围内，针对相关组合物的改变活性或血清半衰期调整。本发明的载体可以通过任何已知的常规疗法，包含抗体施用、疫苗施用、细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物反应调节剂的施用等来补充治疗条件。
对于施用来说，本发明的调配物以由相关调配物的LD-50或ED-50和/或在多种浓度下非天然氨基酸的任何副作用的观测结果决定，包含(但不限于)如适用于患者的体重和整体健康的速率施用。施用可以通过单次或分次剂量来实现。
如果输注调配物的患者出现发烧、寒战或肌肉疼痛，那么其可以接受适当剂量的阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、对乙酰氨基酚(acetaminophen)或其它疼痛/发烧控制药物。经历例如发烧、肌肉疼痛和寒战等输注反应的患者，在将进行输注之前30分钟，预先给予阿司匹林、对乙酰氨基酚或包含(但不限于)苯海拉明(diphenhydramine)。度冷丁(Meperidine)用于对退热剂和抗组胺剂未迅速起反应的更严重的寒战和肌肉疼痛。取决于反应的严重度，减缓或中断细胞输注。
本发明的人类抗原结合多肽可以直接施用于哺乳动物受试者。施用通过常用于向受试者引入抗CD3抗体的任一途径进行。根据本发明的实施例的抗CD3抗体组合物包含适合于经口、直肠、局部、吸入(包含(但不限于)经由气溶胶)、经颊(包含(但不限于)舌下)、***、肠胃外(包含(但不限于)皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、大脑内、动脉内、或静脉内)、局部(即，皮肤与粘膜表面，包含气道表面)和经皮施用的组合物，不过任何指定的情况下的最合适途径将取决于所治疗的病状的性质和严重度。施用可以是局部或全身的。化合物的调配物可以呈现于诸如安瓿和小瓶的单位剂量或多剂量密封容器中。本发明的抗CD3抗体可以与药学上可接受的载剂一起制备成单位剂量可注射形式的混合物(包含(但不限于)溶液、悬浮液或乳液)。本发明的抗CD3抗体还可以通过连续输注(使用包含(但不限于)微型泵，例如渗透泵)、单一推注或缓慢释放贮存调配物施用。
适合于施用的调配物包含水性和非水性溶液；等张无菌溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物等张的溶质；和水性和非水性无菌悬浮液，其可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。可以由先前所描述的种类的无菌散剂、颗粒和片剂制备注射溶液和悬浮液。
本发明的药物组合物可以包括药学上可接受的载剂。通过所施用的特定组合物以及通过用以施用组合物的特定方法来部分确定药学上可接受的载剂。因此，存在各种合适的本发明的药物组合物的调配物(包含任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂)(参见例如《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,第17版.1985))。
合适的载剂包含含有磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐和其它有机酸的缓冲剂；包含抗坏血酸的抗氧化剂；低分子量(低于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；二价金属离子，例如锌、钴或铜；糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如TweenTM、PluronicsTM或PEG。
本发明的抗CD3抗体，包含连接到例如PEG的水溶性聚合物的抗CD3抗体还可以通过持续释放***或作为持续释放***的一部分施用。持续释放组合物包含(但不限于)半渗透聚合物基质，呈成形物件形式，包含(但不限于)薄膜或微胶囊。持续释放基质包含生物相容性材料，例如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(Langer等人,《生物医学材料研究杂志(J.Biomed,Mater.Res.)》,15：167-277(1981)；Langer,《化学技术(Chem.Tech.)》,12：98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人,同前文献)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)、聚丙交脂(聚乳酸)(美国专利第3,773,919号；EP 58,481)、聚乙交酯(乙醇酸聚合物)、聚丙交酯-共-乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)、聚酸酐、L-谷氨酸和L-谷氨酸-γ-乙酯的共聚物(U.Sidman等人,《生物聚合物(Biopolymers)》,22,547-556(1983))、聚(原)酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。持续释放组合物还包含脂质体包裹的化合物。含有化合物的脂质体通过本身已知的方法制备∶DE 3,218,121；Epstein等人,《美国国家科学院院刊》,82：3688-3692(1985)；Hwang等人,《美国国家科学院院刊》,77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP 102,324。所引用的所有参考文献和专利以引用的方式并入本文中。
脂质体包裹的抗CD3抗体可以通过例如以下中描述的方法制备：DE 3,218,121；Epstein等人,《美国国家科学院院刊》,82：3688-3692(1985)；Hwang等人,《美国国家科学院院刊》,77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP 102,324。脂质体的组成和大小是所属领域的技术人员熟知的或能够容易地由其凭经验确定。脂质体的一些实例如以下中所描述，例如Park JW等人,《美国国家科学院院刊》92:1327-1331(1995)；Lasic D和Papahadjopoulos D(编)：《脂质体医学应用(Medical Applications ofLiposomes)》(1998)；Drummond DC等人,《癌症疗法的脂质体药物递送***(Liposomaldrug delivery systems for cancer therapy)》,Teicher B(编)：《癌症药物发现与发展(Cancer Drug Discovery and Development)》(2002)；Park JW等人,《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》8:1172-1181(2002)；Nielsen UB等人,《生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)》1591(1-3)：109-118(2002)；Mamot C等人,《癌症研究(CancerRes.)》63：3154-3161(2003)。所引用的所有参考文献和专利都以引用的方式并入本文中。
在本发明的情形下，施用于患者的剂量应足以随时间推移而引起个体中的有益反应。一般来说，每剂肠胃外施用的本发明的抗CD3抗体的总药学上有效量在约0.01微克/千克/天到约100μg/kg或约0.05mg/kg到约1mg/kg患者体重范围内，不过这视治疗判断而定。给药频率也视治疗判断而定，并且可以比被批准用于人类的市售抗CD3抗体频繁或不频繁。一般来说，本发明的聚乙二醇化抗原结合多肽可以通过任一上述施用途径来施用。
本发明的抗原结合多肽的治疗用途
本发明的抗CD3抗体多肽适用于治疗多种病症。含有抗CD3抗体的药物组合物可以一种可有效通过各种方式向人类患者施用的强度调配，所述人类患者正在经历可以受抗CD3抗体激动剂或拮抗剂(例如(但不限于)所用的抗增生、消炎或抗病毒剂)影响的单独或作为病状或疾病的一部分的病症。抗CD3抗体的平均量可以变化，并且具体来说应基于合格医生的建议和处方。抗CD3抗体的准确量是视例如所治疗病状的准确类型、所治疗患者的病状以及组合物中的其它成分的因素而定的优先问题。本发明还提供治疗有效量的例如抗癌化学治疗剂的另一活性剂的施用。待给予的量容易由所属领域的技术人员基于用抗CD3抗体的疗法来确定。
实例
提供以下实例以说明而非限制所要求的发明。
实例1
本实例描述了用于选择将非天然编码的氨基酸并入抗CD3抗体中的优选位点的多组潜在准则之一。
本实例说明如何选择抗原结合多肽内用于引入非天然编码的氨基酸的优选位点。由两分子抗CD3抗体构成的三维结构或抗CD3抗体的二级、三级或四级结构用于确定可以引入一或多个非天然编码的氨基酸的优选位置。
以下标准用于评估用于引入非天然编码的氨基酸的抗CD3抗体的每个位置∶残基(a)基于三维结构的结构分析，或抗CD3抗体的二级、三级或四级结构，不应干扰抗CD3抗体的结合；b)不应受丙氨酸或同源物扫描诱变影响；(c)应暴露表面且展现与周围残基最小的范德华力或氢键相互作用；(d)可以在抗CD3抗体的一或多个暴露表面上；(e)可以是与第二抗CD3抗体或其它分子或其片段并置的抗CD3抗体的位点；(f)应该在抗CD3抗体变异体中缺失或变化；(g)在用非天然编码的氨基酸取代时将引起保守改变；(h)视需要通过改变完整结构的灵活性或刚性，可以调节抗CD3抗体本身或包括一或多种抗CD3抗体的二聚体或多聚体的构形；(i)可能在高柔性区或结构刚性区中发现和(j)在互补决定区(CDR)中发现或未发现。另外，使用Cx程序(Pintar等人《生物信息学(Bioinformatics)》,18,第980页)进一步计算抗CD3抗体分子来评估每一个蛋白质原子的突起程度。因此，在一些实施例中，非天然编码的氨基酸在(但不限于)抗CD3抗体的一或多个位置取代。
实例2
本实例详述大肠杆菌中包含非天然编码的氨基酸的抗CD3抗体克隆和表达。
所引入的包括正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的翻译***用于表达含有非天然编码的氨基酸的抗CD3抗体。O-RS优先用非天然编码的氨基酸氨酰化O-tRNA。随后，翻译***响应于所编码的选择密码子而将非天然编码的氨基酸***抗CD3抗体中。
用含有修饰抗CD3抗体基因和正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对(对所需非天然编码的氨基酸具有特异性)的质粒转化大肠杆菌允许非天然编码的氨基酸位点特异性地并入抗CD3抗体中。转化的大肠杆菌在37℃下在含有0.01-100mM之间的特定的非天然编码的氨基酸的培养基中生长，以高保真度和效率表达修饰的抗CD3抗体。His标记的含有非天然编码的氨基酸的抗CD3抗体通过大肠杆菌宿主细胞，呈包涵体或聚集体产生。使聚集体溶解在6M盐酸胍中并在变性条件下进行亲和力纯化。通过在4℃下，在50mM TRIS-HCl(pH 8.0)、40μMCuSO4和2％(w/v)月桂酰肌氨酸钠(Sarkosyl)中透析过夜进行再折叠。接着物质针对20mMTRIS-HCl pH 8.0、100mM NaCl、2mM CaCl2透析，接着去除His-标签。参见Boi ssel等人,(1993)268:15983-93。用于纯化抗CD3抗体的方法是所属领域中众所周知的并通过SDS-PAGE、西方墨点分析或电子喷雾电离离子阱质谱分析等来证实。
表达/抑制
用对乙酰基-苯丙氨酸(pAcF)抑制∶使用所属领域中已知的标准方案实现大肠杆菌中琥珀型突变的抑制。简单来说，对于大肠杆菌中抗体片段的周质抑制(scFv和Fab)，用编码来自詹氏甲烷球菌(M.jannaschii)的正交酪氨酰基-tRNA-合成酶(MjTyrRS)的质粒将表达载体构筑体转化成大肠杆菌宿主细胞。过夜细菌培养物1:100稀释到含有LB培养基(Luria-Bertani)或Superbroth的摇瓶中，并在37℃下生长到约0.8的OD。诱发Fab和scFv表达，同时通过加入对乙酰基-苯丙氨酸(pAcF)到4mM的最终浓度来实现琥珀型密码子的抑制。培养物在25℃下培育过夜。
用aa9.2抑制∶以与pAcF类似的方式实现用pAcF的衍生物(aa 9.2)抑制琥珀型突变，但使用的来自詹氏甲烷球菌的正交酪氨酰基-tRNA-合成酶(MjTyrRS)对此氨基酸具有特异性。通过在诱发时加入aa9.2(4mM)来实现抑制。
蛋白质提取和纯化
通过离心来收获细胞并再悬浮于补充有100μg/ml溶菌酶的周质释放缓冲液(50mMNaPO4、20％蔗糖、1mM EDTA，pH 8.0)中并在冰上培育30分钟。离心后，借助于His标签，将上清液中的抗体片段固定于ProBind珠粒(Invitrogen；Carlsbad,CA)上，珠粒用结合缓冲液彻底洗涤且接着用0.5M咪唑从珠粒洗脱结合片段。纯化片段在存储缓冲液(50mM HEPES、150mM NaCl、10％甘油、5％蔗糖，pH 7.8)中透析。对于细胞质中表达的scFv片段的小规模分析，通过离心从15ml培养物收集大肠杆菌，并再悬浮于1ml补充有10μg/ml DNA酶的溶解缓冲液(B-PER,Pierce Biotechnology；Rockford,IL)。将混合物在37℃下培育30分钟，在蛋白质负载缓冲液(Invitrogen；Carlsbad,CA)中稀释1倍并通过SDS-PAGE来分析。
实例3
本实例详述含有羰基的氨基酸的引入和随后与含有氨氧基的PEG的反应。
本实例展示一种产生并入有含酮的非天然编码的氨基酸的抗原结合多肽的方法，所述抗原结合多肽随后与约5,000MW的含氨氧基的PEG反应。根据实例1的准则鉴别的每个残基分别由具有以下结构的非天然编码的氨基酸取代：
一旦修饰，那么包括含羰基的氨基酸的抗CD3抗体变异体与以下形式的含氨氧基的PEG衍生物反应∶
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
其中R是甲基，n是3并且N是约5,000MW。含有对乙酰基苯丙氨酸的纯化的抗CD3抗体以10mg/mL溶解于25mM MES(Sigma Chemical,St.Louis,MO)pH 6.0、25mM Hepes(SigmaChemical,St,Louis,MO)pH 7.0或10mM乙酸钠(Sigma Chemical,St.Louis,MO)pH 4.5中，与10到100倍过量的含氨氧基的PEG反应，接着在室温下搅拌10-16小时(Jencks,W.J.《美国化学学会杂志(Am.Chem.Soc.)》1959,81,第475页)。随后将PEG-抗CD3抗体稀释到适当缓冲液中以用于立即纯化和分析。
实例4
与通过酰胺键连接到PEG的羟氨基组成的PEG结合。
使用实例3中描述的程序使具有以下结构的PEG试剂与含酮的非天然编码的氨基酸偶合：R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-O-NH2
其中R＝甲基，n＝4并且N是约20,000MW。反应、纯化和分析条件如实例3中所述。
实例5
本实例详述将两个相异的非天然编码的氨基酸引入到抗CD3抗体中。
本实例展示一种产生并入有在根据实例1鉴别的两个位置含酮官能团的非天然编码的氨基酸的抗原结合多肽的方法，其中X*表示非天然编码的氨基酸。如实例1和2中所描述制备抗原结合多肽，不同之处在于在核酸内的两个不同位点引入抑制性密码子。
实例6
本实例详述抗原结合多肽与含酰肼的PEG的结合和后续当场还原。
根据实例2和3中所描述的程序制备并入有含羰基的氨基酸的抗原结合多肽。一经修饰，将具有以下结构的含酰肼的PEG结合到抗CD3抗体上：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-X-NH-NH2
其中R＝甲基，n＝2并且N＝10,000MW并且X是羰基(C＝O)基团。将纯化的含对乙酰基苯丙氨酸的抗CD3抗体以介于0.1-10mg/mL之间溶解在25mM MES(Sigma Chemical,St.Louis,MO)pH 6.0、25mM Hepes(Sigma Chemical,St.Louis,MO)pH 7.0或10mM乙酸钠(Sigma Chemical,St.Loui s,MO)pH 4.5中，与1到100倍过量的含酰肼的PEG反应，并且通过加入溶解于H2O中的储备液1M NaCNBH3(Sigma Chemical,St.Loui s,MO)到最终浓度10-50mM来当场还原相应腙。反应在黑暗中在4℃到室温下进行18-24小时。通过加入约pH 7.6下1M Tris(Sigma Chemical,St.Louis,MO)到50mM的最终Tris浓度或在适当缓冲液中稀释来终止反应以用于立即纯化。
实例7
本实例详述将含炔烃的氨基酸引入到抗CD3抗体中并且用mPEG-叠氮基衍生化。
根据实例1鉴别的任一残基用以下非天然编码的氨基酸取代∶
含炔丙基-酪氨酸的纯化的抗CD3抗体以介于0.1-10mg/mL之间溶解于PB缓冲液(100mM磷酸钠、0.15M NaCl，pH＝8)中，并且将10到1000倍过量的含叠氮基的PEG加入反应混合物中。接着将催化量的CuSO4和Cu线加入反应混合物中。在混合物培育(包含(但不限于)在室温或37℃下约4小时，或在4℃下过夜)后，加入H2O并且经透析膜过滤混合物。可以(包含(但不限于))通过实例3中所述的类似程序来分析样品的加成情况。
在本实例中，PEG将具有以下结构：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-N3
其中R是甲基，n是4并且N是10,000MW。
实例8
本实例详述用炔丙基酪氨酸取代抗CD3抗体中的大疏水性氨基酸。
如实例7中所述，抗CD3抗体的序列内存在的Phe、Trp或Tyr残基经以下非天然编码的氨基酸取代∶
一旦修饰，那么PEG附接到包括炔烃的氨基酸的抗CD3抗体变异体上。PEG将具有以下结构：
Me-PEG(N)-O-(CH2)2-N3
并且偶合程序将遵循实例7中的那些程序。这将产生包括与天然存在的大疏水性氨基酸中的一者大致等比容的非天然编码的氨基酸并且在多肽内的不同位点处经PEG衍生物修饰的抗CD3抗体变异体。
实例9
此实例详述由一或多个PEG连接子分隔的抗CD3抗体均二聚体、杂二聚体、均多聚体或杂多聚体的产生。
使实例7中产生的含炔烃的抗CD3抗体变异体与以下形式的双官能PEG衍生物反应：N3-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)2-O-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)n-N3
其中n是4并且PEG的平均MW是大致5,000，以产生其中两个抗CD3抗体分子由PEG物理分隔的相应抗CD3抗体均二聚体。以类似方式，抗原结合多肽可以与一或多种其他多肽偶合以形成杂二聚体、均多聚体或杂多聚体。将如实例7和3中进行偶合、纯化和分析。
实例10
本实例描述测量包括非天然编码的氨基酸的抗CD3抗体和聚乙二醇化的抗CD3抗体的体外和体内活性的方法。
细胞结合测定
将细胞(3×106)在0℃下在PBS/1％BSA(100μl)中在缺乏或存在多种浓度(体积∶10μl)的未标记抗CD3抗体、抗CD3抗体或阴性对照下和在125I-抗CD3抗体(大约100,000cpm或1ng)存在下一式两份地培育90分钟(总体积∶120μl)。随后使细胞再悬浮于350μl塑料离心管中的200μl冰冷FCS上并且成层与离心(1000g；1分钟)。通过切断所述管的末端收集球粒并且在γ计数器(Packard)中分别计数球粒和上清液。
特异性结合(cpm)测定为在不存在竟争者的情况下的全部结合(重复实验的平均值)减去在存在100倍过量的未标记抗CD3抗体的情况下的结合(cpm)(非特异性结合)。测量所用每一细胞类型的非特异性结合。使用相同的125I-抗CD3抗体制剂在分开的数天执行实验并且所述实验应该展示内部一致性。结合以剂量依赖性方式被未标记的天然抗CD3抗体或抗CD3抗体抑制，但不被阴性对照抑制。抗CD3抗体竞争结合天然125I-抗CD3抗体的能力表明受体同等地充分识别两种形式。
聚乙二醇化的抗CD3抗体的体内研究
向小鼠或大鼠施用PEG-抗CD3抗体、未修饰的抗CD3抗体和缓冲溶液。结果将展示与未修饰的抗CD3抗体相比，本发明的聚乙二醇化的抗CD3抗体的活性优良并且半衰期延长。
测量结合和未结合的抗CD3抗体与其变异体的体内半衰期
使用雄性史泊格多利大鼠(约7周)。在施用当天，测量每只动物的重量。每公斤体重100μg的未结合和结合的抗CD3抗体样品各静脉内注射到三只大鼠的尾静脉中。在注射后1分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时和24小时，在CO2麻醉的同时从每只大鼠抽取500μl血液。血液样品存储在室温下1.5小时，接着通过离心(4℃，18000×g，5分钟)来分离血清。血清样品存储在-80℃下直到分析当天。血清样品中活性抗CD3抗体的量通过在样品在冰上解冻后抗CD3抗体的体外活性测定来定量。
实例11
包括非天然编码的氨基酸的聚乙二醇化的抗CD3抗体的安全性和/或功效的人类临床试验
目标 比较皮下施用的包括非天然编码的氨基酸的聚乙二醇化的重组人类抗CD3抗体与对相同标靶抗原具有特异性的市售产品(例如 或/>)的安全性和药物动力学。
患者 研究中招收20-40岁范围内并且体重在60-90kg之间的十八名健康志愿者。受试者的血液学或血清化学无临床上显著的异常实验值，并且具有阴性尿毒理学筛选、HIV筛选和乙型肝炎表面抗原。他们不应具有任何以下迹象：高血压；任何原发性血液病的病史；显著的肝、肾、心血管、胃肠、生殖泌尿、代谢、神经疾病的病史；贫血或癫痫发作(seizure disorder)的病史；已知的对细菌或哺乳动物源性产品、PEG或人类血清白蛋白的敏感性；含咖啡碱饮料的习惯性和重度消费者；在研究开始30天内参与任何其它临床试验或进行输血或献血；在研究开始三个月内已经暴露于抗CD3抗体；在研究开始七天内患有疾病；以及关于研究前的身体检查或在研究开始14天内的临床实验评估具有显著异常。针对安全性可评估所有受试者，并且如期收集所有血液收集物以用于药物动力学分析。所有研究都是在机构伦理委员会(institutional ethics committee)批准和患者同意的情况下进行。
研究设计 这将是在健康男性志愿者中的I期、单中心、开放标记、随机化的两周期交叉研究。十八名受试者随机分配到两个治疗顺序组之一(九名受试者/组)。使用同等剂量的聚乙二醇化的包括非天然编码的氨基酸的抗CD3抗体和所选市售产物，将抗CD3抗体在两个分开给药期内作为皮下推注施用。市售产物的的施用剂量和频率如包装标签中所说明。通过包含其它组的受试者，使用市售产品的其它给药、给药频率或视需要其它参数可以加入研究中。每个给药期由14天清除期分隔开。对于两个给药期中的每个给药期，在给药前的至少12小时和给药后的72小时，受试者被限制于研究中心，但在给药期之间不受限制。如果还存在有待于针对聚乙二醇化的抗CD3抗体测试的其它给药、频率或其它参数，那么可以加入其它组的受试者。抗CD3抗体的实验调配物是包括非天然编码的氨基酸的聚乙二醇化的抗CD3抗体。
血液采样 在施用抗CD3抗体之前和之后，通过直接静脉穿刺连续抽取血液。在给药前的约30分钟、20分钟和10分钟(3个基线样品)和在给药后的约以下时间获得用于确定血清抗CD3抗体浓度的静脉血液样品(5mL)∶30分钟和1小时、2小时、5小时、8小时、12小时、15小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小时、60小时和72小时。将每份血清样品分成两份等分试样。所有血清样品都存储在-20℃下。在干冰上运送血清样品。在第1天即将初始给药时、第4天早晨、第16天即将给药时和第19天早晨，进行空腹临床实验室测试(血液学、血清化学和尿分析)。
生物分析方法 放射免疫测定(RA)或ELISA试剂盒程序用于测定血清抗CD3抗体浓度。
安全性测定 在每次即将给药时(第1天和第16天)以及每个给药后的6小时、24小时、48小时和72小时，记录生命体征。安全性测定是基于不良事件的发生率和类型以及临床实验室测试中从基线发生的改变。另外，评估包含血压的生命体征测量结果和体检结果从研究前发生的改变。
数据分析 通过从给药后值中的每一个减去平均基线抗CD3抗体浓度，针对给药前基线抗CD3抗体浓度校正给药后血清浓度值，所述平均基线抗CD3抗体浓度是通过将在给药前的30分钟、20分钟和10分钟收集的三个样品的抗CD3抗体水平求平均值而确定。如果给药前血清抗CD3抗体浓度低于测定的定量水平，那么在计算平均值时不包含所述浓度。从针对基线抗CD3抗体浓度校正的血清浓度数据确定药物动力学参数。通过在Digital EquipmentCorporation VAX 8600计算机***上，使用最新版的BIOAVL软件进行与模型无关的方法来计算药物动力学参数。测定以下药物动力学参数：峰值血清浓度(Cmax)；到达峰值血清浓度的时间(tmax)；通过使用线性梯形规则计算的从零时到最后一次血液采样时间(AUC0-72)的浓度-时间曲线下面积(AUC)；和从消除速率常数计算出的最终消除半衰期(t1/2)。消除速率常数是通过线性浓度对数-时间曲线图的终末线性区域中连贯数据点的线性回归来估算的。计算每种治疗的药物动力学参数的平均值、标准偏差(SD)以及变异系数(CV)。计算参数平均值的比率(防腐的调配物/未防腐的调配物)。
安全性结果 不良事件的发生率在处理组之间同等分布。临床实验室测试或血压未从基线或研究前发生临床上显著的改变，并且体检结果和生命体征测量结果未从研究前发生显著的改变。两个处理组的安全性概况应呈现类似。
药物动力学结果 在每个测量时间点将所有18名受试者中接受单剂一或多种对相同标靶抗原具有特异性的市售产品后的平均血清抗CD3抗体浓度-时间曲线(未针对基线抗CD3抗体水平进行校正)与包括非天然编码的氨基酸的聚乙二醇化的抗CD3抗体相比。所有受试者的给药前基线抗CD3抗体浓度都应该在正常生理范围内。从针对给药前平均基线抗CD3抗体浓度校正的血清数据确定药物动力学参数并且确定Cmax和tmax。所选的临床比较产品的平均tmax显著短于包括非天然编码的氨基酸的聚乙二醇化的抗CD3抗体的tmax。所测试的市售抗CD3抗体产品的最终半衰期值显著短于包括非天然编码的氨基酸的聚乙二醇化的抗CD3抗体的最终半衰期。
虽然本研究在健康男性受试者中进行，但预期其它患者群体中吸收特征和安全性概况将类似；例如患有癌症或慢性肾衰竭的男性或女性患者、儿科肾衰竭患者、进行预存式自体程序的患者或预定进行选择性手术的患者。
总之，皮下施用单一剂量的包括非天然编码的氨基酸的聚乙二醇化的抗CD3抗体将是安全的并且健康男性受试者良好耐受。基于不良事件的发生率、临床实验室值、生命体征和身体检查的比较结果，市售形式的抗CD3抗体和包括非天然编码的氨基酸的聚乙二醇化的抗CD3抗体的安全性概况将是相同的。包括非天然编码的氨基酸的聚乙二醇化的抗CD3抗体潜在地向患者和医疗保健提供者提供巨大的临床实用性。
实例12
使用FR+和FR-细胞系评估抗CD3Fab-叶酸结合物的亲和力和特异性。在缺乏叶酸的培养基中培养后，如通过流式细胞术测定，FR在鼻咽(KB)和卵巢(OV-90、SKOV-3)癌细胞系中过度表达。未表达FR的肾癌细胞系CAKI-1和肺泡基底上皮细胞癌A549用作阴性对照。抗CD3Fab-叶酸结合物能够以类似于游离叶酸的亲和力结合于KB细胞(FR+)，表明由与抗CD3Fab结合引起的与叶酸受体的结合的损失最小。同样，抗CD3Fab-叶酸以与抗CD3类似的亲和力与Jurkat细胞(CD3+)结合；未观测到与A549细胞结合(FR-)。
实例13
然后，在体外细胞毒性测定中用KB和OV-90细胞(FR+)和CAKI-1和A549细胞(FR-)作为对照测试抗CD3Fab-叶酸结合物的活性。细胞与活化人类外周血单核细胞(PBMC；标靶:效应细胞的比率1:10)共培养并用多种浓度的抗CD3Fab-叶酸或单独抗CD3Fab处理。通过测量从溶解细胞释放的LDH水平并利用基于CellTiter-Glo和FACS的毒性测定来定量细胞毒性。抗CD3Fab-叶酸结合物展示在PBMC存在下分别以10pM和100pM的EC50有效杀死KB和OV-90细胞(图2A，补充图4)，而在100nM结合物下CAKI-1细胞(图2A)和A549细胞(补充图4)不受影响。在测试的所有细胞系上用单独抗CD3Fab处理都诱发可忽略的毒性(图2A)。此外，SKOV-3细胞(图2B)或KB细胞(补充图5)与活化PBMC(标靶:效应细胞的比率1:10)在缺乏叶酸的培养基中在抗CD3Fab-叶酸结合物存在下一起培育(16小时)会形成玫瑰花结，提供靶向T细胞的额外证据。相比之下，在不存在PBMC或KB细胞(补充图5)下抗CD3Fab对T细胞衔接无作用，并且未观测到簇。
实例14
然后检查抗CD3Fab-叶酸结合物和未结合的抗CD3Fab在啮齿动物中的药物动力学。单一剂量的1mg/kg或5mg/kg的于PBS中的抗CD3Fab-叶酸或1mg/kg未结合的抗CD3Fab静脉内注射在三只大鼠中，并且通过ELISA来分析以规律时间间隔收集的血清。抗CD3Fab-叶酸和对应的未结合的突变抗CD3Fab的血清浓度以相同速率减少，血清半衰期为60分钟(图3D)。因此，抗CD3Fab-叶酸的药物动力学与未结合的抗CD3Fab类似，这表明结合物的PK概况不受叶酸衍生影响。
实例15
然后使用雌性NOD-SCID小鼠，在异种移植模型中，评估抗CD3Fab-叶酸双特异性药剂的体内功效。动物维持低叶酸饮食，以减少可能与双特异性药剂竞争的叶酸的循环血清水平。当与未活化的人类PBMC(标靶:效应细胞的比率为1:100)或活化人类PBMC(标靶:效应细胞的比率为1:10)混合并皮下注射到小鼠中时KB(FR+)或A549(FR-)细胞能够形成肿瘤。因此，将与活化人类PBMC(标靶:效应细胞的比率为1:10)混合的KB细胞植入小鼠中，并且每天向小鼠静脉内注射1.5mg/kg抗CD3Fab-叶酸或PBS，与肿瘤细胞植入同一天开始，历时10天。此给药方案是基于抗CD3Fab-叶酸结合物的药物动力学特性和先前关于双特异性抗体的研究10而选择的。肿瘤体积展示PBS处理的小鼠中快速增加，加倍时间为约5天。相比之下，在整个研究持续时间期间，在用抗CD3Fab-叶酸处理的小鼠中几乎无法检测到肿瘤(图3A)。在平行研究中，小鼠植入与未活化的人类PBMC(标靶:效应细胞的比率为1:100)混合的KB细胞并且每天用1.5mg/kg抗CD3Fab-叶酸或PBS静脉内处理，在肿瘤细胞植入的同一天开始，历时10天。研究开始30天，由于注射部位的高负荷的PBMC，两组小鼠的肿瘤体积都减小。然而，抗CD3Fab-叶酸处理的小鼠中肿瘤的减小速率更高。研究第35天后，PBS处理的小鼠中的肿瘤体积不断地增加，而抗CD3Fab-叶酸处理的小鼠中的肿瘤减小到几乎不可检测的水平，这表明即使在不存在活化T细胞下，抗CD3Fab-叶酸结合物也能够衔接细胞毒性T细胞，从而消除肿瘤。为了测试抗CD3Fab-叶酸结合物对表达FR的肿瘤的体内选择性，将A549细胞(FR-)与未活化的人类PBMC(标靶:效应细胞的比率为1:100)混合并植入小鼠中。小鼠以类似方式用静脉内10个日剂量的1.5mg/kg抗CD3Fab-叶酸处理并且在处理后20天未显示与PBS处理的肿瘤显著的差异。在整个所有这些研究中，抗CD3Fab-叶酸和PBS处理的小鼠中都未观测到体重减轻或其它明显毒性(图3C，补充图6B)。对注射和未注射抗CD3Fab-叶酸的小鼠进一步进行组织病理学分析。来自用抗CD3Fab-叶酸或PBS处理的小鼠的肾的染色未显示T细胞浸润；观测例如脾、肺和肝等其它组织的处理组与对照组之间的苏木精和伊红(H&E)染色。
实例16
使用标准肽合成设备进行固相肽合成(SPPS)。使用制备型逆相-高效液相色谱法(RP-HPLC)仪器(Waters,xTerra C18 10μm；19×250mm)纯化所有肽和肽结合物，并通过分析型RP-HPLC(Waters,X-Bridge C18 5μm；3.0×50mm)和液相色谱/质谱分析(LC/MS)来分析。使用Varian 400MHz NMR谱仪获得1H谱。样品在DMSO-d6/D2O中运行；所有1H信号都参考残余物或DMSO(2.50ppm)以ppm记录，并且数据报导如下：s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，并且m＝多重峰或未拆分，b＝宽峰，耦合常数以Hz计。在Ambrx质谱分析设施(LaJolla,CA)获得蛋白质质量。
实例17
构筑表达质粒、大肠杆菌细胞系W3110B60、蛋白质产生
由pET-20b(+)和pET-24(+)质粒(EMD4Biosciences)构筑表达质粒(AXID)。将由修饰詹氏甲烷球菌合成酶(对pAcPhe具有特异性)组成的琥珀型抑制盒克隆到AXID的BamHI位点(II型克隆)中。从文献获得UCHT1Version.2Fab CD3序列1,2，并亚克隆到AXID载体中phoA启动子下游开放阅读框内。重链(HC-Lys136)的赖氨酸136速变(Stratagene)成TAG琥珀无义密码子。野生型大肠杆菌IC-12W3110细胞系(ATCC)通过同源重组3工程化以具有以下基因型∶F-IN(rrnD-rrnE)λ-araB::g1tetA fhuA::dhfr proSW375R::cat。在此表达质粒中W3110B60基因组中proS的温度敏感表型由proS的野生型功能拷贝互补。将载体转化到W311B60细胞并且细胞在发酵罐中在补充有硫酸卡那霉素(50μg/mL)的成分确定的培养基(2.1L)中在37℃、pH 7和480-1200rpm(级联)下生长。在OD600＝30下，对于产生期，pH转变成6.8，并加入成分确定的培养基，接着将溶解于水(100g/L)中的pAcPhe加入发酵罐中。在初始搅动(480-1200rpm)下溶解氧设定点以维持30％。24小时后，收获细胞并通过渗透休克，通过与TES缓冲液[0.2M Tris pH 8.0、0.5mM EDTA、0.5M蔗糖)以4:1(v/w)的比率在4℃下一起培育，从细胞提取UCHT1。通过离心(18000rpm，20分钟，和4℃)使提取物澄清，通过0.22微米过滤器过滤，并负载到蛋白G柱(GE healthcare)上。将柱用5柱床体积PBS pH 7.4洗涤，并且蛋白质用10柱床体积0.1M甘氨酸-HCl pH 3.0洗脱。将洗脱份收集到含有10％1MTri s-HCl pH 8的管中。汇集的洗脱份进一步通过阳离子交换[柱∶SP650S(TosohBioscience)，缓冲液A∶0.02M磷酸盐(pH 6.0)，缓冲液B∶0.02M磷酸盐(pH 6.0)，含0.5MNaCl]来纯化并通过SDS-PAGE凝胶和质谱分析来分析。
实例18
合成叶酸-N10(TFA)-Lys连接子(1)
使用标准固相肽合成，从H-Lys-(Boc)-2-ClTrt-树脂树脂(Peptide international)开始，合成叶酸-Lys。4简单来说，H-Lys-(Boc)-2-ClTrt-树脂树脂(500mg，0.89mM)用DCM(5mL)，接着(二甲基甲酰胺)(DMF，5mL)溶胀。加入Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH(1.5当量)、HATU(1.5当量)和DIPEA(4.0当量)于DMF(3mL)中的溶液。氩气鼓泡2小时，并将树脂用DMF(3×3mL)和i-PrOH(3×3mL)洗涤。通过Kaiser测试来评估耦合效率。在树脂在DMF(3mL)中溶胀后，加入蝶酸(1.5当量)、HATU(1.5当量)和DIPEA(4.0当量)于DMF(3mL)中的溶液。氩气鼓泡2小时，并将树脂用DMF(3×3mL)和i-PrOH(3×3mL)洗涤。通过Kaiser测试来评估耦合效率。在树脂在DCM(3mL)中溶胀，接着在氩气下干燥后，使用三氟乙酸(TFA):H2O三异丙基硅烷(95.5:2.5:2.5)混合物(3×5mL)自树脂裂解最终化合物，直接到含有***(300mL)的圆底烧瓶中，获得沉淀粗产物。在过滤和干燥后，使用制备型逆相(RP)-HPLC(C8柱，25分钟内0％B-50％B，缓冲液A∶含0.1TFA的水，缓冲液B：含0.1TFA的乙腈，λ＝280nm)纯化粗产物，在真空下去除ACN，并将纯洗脱份冷冻干燥，得到呈淡黄色固体状的1。1H NMR(DMSO-d6/D2O)：δ1.18(m,2H,Pep-H)；1.45(m,1H,Pep-H)；1.54(m,3H,Pep-H)；1.81(m,1H,Pep-H)；1.95(m,1H,Pep-H)；2.11(m,2H,Pep-H)；2.88(m,2H,Pep-H)；3.94(m,1H,Lys-αH)；4.12(m,1H,Glu-αH)；4.46(s,2H,Pte-H)；6.61(d,J＝8.5Hz,2H,Pte-Ar-H)；7.56(d,J＝8.5Hz,2H,Pte-Ar-H)；8.60(s,1H,Pte-Ar-H)。LC-MS(M+H)+：C27H30F3N9O8的计算值＝665.6；实验值＝666.0g/mol。
实例19
合成邻苯二甲酰亚胺-PEG4-COOH
在0℃下在氩气下向三苯膦(TPP，216.7mg，0.826mmol)和偶氮二甲酸二乙酯(DEAD，143.9mg，0.826mmol)于无水THF(0.50mL)中的溶液中加入含tBuOOC-PEG4-OH(200.0mg，0.751mmol)的无水THF。在搅拌反应15分钟后，经10分钟加入N-羟基邻苯二甲酰亚胺(134.8mg，0.826mmol)于无水THF中的溶液。在室温下在氩气下搅拌反应混合物12小时。在真空下去除溶剂后，将TFA:三异丙基硅烷:水(95:2.5:2.5；5mL)加入粗产物并在室温下搅拌1小时，以脱除叔丁基保护基。最终产物通过快速色谱法(己烷:EtOAc＝1:1)来纯化。合并的纯洗脱份的溶剂在真空下蒸发，得到呈油性液体状的最终产物。1HNMR(CDCl3)：δ2.63(m,2H)；3.59-3.65(m,14H)；3.88(m,2H)；4.38(m,2H)；7.75(m,2H),7.84(m,2H)LC/MS(ESI)(m/z)：(M+H)+C19H25NO9的计算值,411.4,实验值,411.4g/mol。
实例20
合成邻苯二甲酰亚胺-PEG4-NHS(2)
在氩气下向HOOC-PEG4-O-N-邻苯二甲酰亚胺(50mg，0.122mmol)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS，15.4mg，0.134mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，1.5mg，0.0122mmol)于无水DCM(0.5mL)中的溶液中加入含乙基(二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC，20.8mg，0.134mmol)的无水DCM(0.5mL)。在氩气下在室温下搅拌反应混合物4小时，并使用快速色谱法(己烷:DCM＝1:1)纯化，得到NHS-PEG4-O-N-邻苯二甲酰亚胺。在真空下去除合并的纯洗脱份的溶剂，得到呈油性液体状的最终产物。1HNMR：δ2.90(t,J＝6.4,2H)；2.75(bs,4H)；3.56-3.63(m,12H),3.83-3.87(m,4H),4.37(t,J＝4.5,2H)；7.75(m,2H),7.83(m,2H)。LC/MS(ESI)(m/z)：(M+H)+C23H28N2O11的计算值,508.5,实验值,509.0g/mol。
实例21
合成叶酸-Lys-PEG4-邻苯二甲酰亚胺(3)
在氩气下向NHS-OC-PEG4-O-N-邻苯二甲酰亚胺(21mg，0.041mmol)和叶酸-N10(TFA)-Lys(25mg，0.037mmol)于无水DMSO(300μL)中的溶液中加入DIPEA(101.4μL，0.601mmol)。反应混合物继续在室温下搅拌2小时并通过LC/MS追踪反应的进展。使用RP制备型HPLC(C18柱，25分钟内0％B-50％B，缓冲液A∶含0.1TFA的水，缓冲液B∶含0.1TFA的乙腈，λ＝280nm)纯化最终产物。在真空下去除ACN后，将纯洗脱份冷冻干燥，得到淡黄色固体。LC/MS(ESI)(m/z)：(M+H)+C46H53F3N10O16的计算值,1058.9,实验值,1059.0g/mol。
实例22
合成叶酸-Lys-PEG4-氨氧基连接子(4)
向叶酸-N10(TFA)-Lys-PEG-邻苯二甲酰亚胺(30mg，0.028mmol)于DMSO(1mL)中的溶液中加入肼(13μL，0.42mmol)并且反应的pH值维持在9.35下。使用LC/MS监测邻苯二甲酰亚胺和TEA基团的脱除保护基情况。使用逆相制备型HPLC(C18柱，25分钟内0％B-50％B，缓冲液A∶含0.1TFA的水，缓冲液B∶含0.1TFA的乙腈，λ＝280nm)纯化叶酸-Lys-PEG4-氨氧基连接子。在真空下去除ACN后，将纯洗脱份冷冻干燥，得到黄色固体。1H NMR(DMSO-d6/D2O)δ1.88(m,1H,Pep-H)；2.03(m,1H,Pep-H)；2.15(t,J＝7.4,2H)；2.28(t,J＝6.4,2H)；3.05(m,4H)；3.20-3.60(m,xH)；3.94(m,1H,Lys-αH)；4.23(m,1H,Glu-αH)；4.48(s,2H,Ptc-H)；6.64(d,J＝8.8Hz,2H,Ptc-Ar-H)；7.64(d,J＝8.8Hz,2H,Ptc-Ar-H)；8.63(s,1H,Pte-Ar-H)；LC/MS(ESI)(m/z)：(M+H)+C36H52N10O13的计算值,832.9g/mol,实验值,833.0g/mol。
实例23
叶酸-抗CD3结合物
将含有pAcPhe的抗CD3Fab(10mg，0.21μmol)于PBS pH 7.4(1mL)中的溶液缓冲液更换成50mM乙酸钠pH 4.0(900μL)。在加入1M乙酰肼(100μL)后，将叶酸-Lys-PEG4-氨氧基连接子(1.7mg，2.10μmol)加入反应混合物并在28℃下在震荡(50rpm)下培育48小时。反应的进展通过RP-HPLC(Zorbax 300SB C3柱，4.6×150mm；Agilent)来监测。结合物用30％B到90％B(A，水，含0.1％TFA；B，乙腈，含0.1％TFA)的线性梯度洗脱。Agi lent 1100系列HPLC***和Chemstation软件用于分辨和定量与叶酸-连接子结合的Fab的百分比。反应在48小时内完成，转化效率>95％。使用阳离子交换柱(SP 650S，Tosoh Biosciences)纯化最终结合物，缓冲液更换成PBS，并存储在4℃下直到使用。预期MS：48539.64Da,观测到的MS：48538.89Da。
实例24
体外功效研究
标靶细胞-KB、OVCAR-3、SKOV-3和OV-90细胞维持在补充有10％FBS和100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的无叶酸的RPMI-1640中，进行至少五次传代，然后其用于测定。Jurkat和A549细胞维持于补充有10％FBS和100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的的RPMI-1640中。所有细胞都在5％二氧化碳、95％空气潮湿的气氛中在37℃下生长成单层。
为进行FR表达，将细胞与来自R&D systems的抗FR-PE抗体(蓝色)和IgG1同型-PE对照(红色)一起在4℃下培育1小时并通过流式细胞术来分析结合。将KB或A549细胞接种至T75烧瓶中并使之在48小时内形成单层。在胰蛋白酶消化后，细胞转移到离心管(1×106个细胞/管)并离心。培养基被含有递增浓度的叶酸-FITC的新鲜培养基替换并在4℃下培育30分钟。在用新鲜培养基(2×1.0mL)和PB(1×1.0mL)冲洗后，使细胞再悬浮于PBS(1.0mL)中并使用流式细胞仪分析细胞结合的荧光(30,000个细胞/样品)。将KB细胞涂铺到T75烧瓶中并使之在48小时内形成单层。在胰蛋白酶消化后，将释放细胞转移到离心管(1×106个细胞/管)中并离心。每个管中用过的培养基被在新鲜培养基(0.5mL)中递增浓度(0.1nM-0.8nM)抗CD3Fab-叶酸存在下的100nM FA-FITC替换。在4℃下培育30分钟后，细胞用培养基(2×1.0mL)和PBS(1×1.0mL)冲洗以去除任何未结合的放射性。接着细胞再悬浮于PBS(0.5mL)中并使用流式细胞仪计数细胞结合的荧光。
使用Ficoll Hypaque Plus(GE Heathcare)梯度离心从白血球层(San Diego血库)中分离人类外周血单核细胞(PBMC)。如果来自单一供体的细胞不足够，那么使用若干个供体，但当体外或体内使用时各自保持分开(即不混合在一起)。在rhIL-2(100ng/ml)和GMCSF(100ng/ml)存在下PBMC用aCD3/aCD28超磁性珠粒(Life Technologies)活化。
对于细胞毒性测定，利用Accutase从烧瓶分离标靶细胞并接种到U形底96孔板中。将活化PBMC(效应细胞)或未活化PBMC(效应细胞)以规定标靶:效应细胞比率加入标靶细胞。抗CD3叶酸在完全培养基中稀释，加入共培养物中，并在短暂离心后，板在5％CO2下和在37℃下培育24小时。对于通过LDH释放测定细胞毒性，使用来自Promega的试剂盒，按照制造商的说明书，测量LDH。对于通过流式细胞术测定细胞毒性，细胞用DIO(绿色质膜染剂)标记并将碘化丙锭加入1μg/rnL的最终浓度。9对于通过ATP含量测定细胞毒性，在24小时后洗去PBMC，并使用Cell Titer Glo(Promega)测量KB细胞的ATP含量。
实例25
药物动力学研究
抗CD3Fab-叶酸和未结合的CD3Fab呈单次静脉内推注施用到史泊格-多利大鼠(Charles River Laboratories)。以规律时间间隔收集血液并通过ELISA定量大鼠血清中的抗CD3Fab-叶酸。结合物的药物动力学特性测量为时间对比血清浓度。
实例26
体内功效研究
从TSRI动物机构或从The Jackson Laboratory购买6到8周龄的雌性NOD-SCID小鼠，并维持进行γ-辐射的缺乏叶酸的特殊饮食(Teklad)至少2周，然后开始研究。动物以5只/笼圈养在有栅栏的无病原体的遮蔽支架中。随意给予高压处理的自来水和食品。通过在尾巴根部纹身或耳孔个别地鉴别小鼠。所有动物程序都经过斯克利普斯研究所动物照护和使用委员会(The Scripps Research Institute Animal Care and Use Committee)和Ambrx公司动物照护和使用委员会批准，并根据关于动物的人道处理的国内和国际准则进行。
将肿瘤细胞(KB细胞，5×105个/小鼠)与活化或未活化PBMC(以规定标靶:效应细胞比率)混合并呈200μl注射液皮下植入左侧腰窝中。将动物用1.5mg/kg抗CD3Fab-叶酸或PBS每天静脉内处理，在与肿瘤细胞植入同一天开始，注射10次(黑色箭头)，其中给药临时中断2天以过周末。通过在两个垂直方向上测量，每两周监测肿瘤生长。并使用式V＝(L×W×W)/2估算体积，其中V＝体积，W＝最短直径，并且L＝最长直径。通过在电子称重机上称重小鼠，确定体重。当组平均肿瘤大小达到约1,000mm3时或给药开始后35天(哪个先发生)，终止实验。
对于免疫组织化学分析，使用异氟醚处死动物，并分离肿瘤以及多种器官并且固定在***(Formalin)-锌中过夜。组织包埋于石蜡中并切片供染色。按照标准方案进行苏木精和伊红(H&E)染色并使用Leica扫描仪扫描载片。
应了解，本文所描述的实例和实施例仅为了说明性目的，并且所属领域的技术人员将想到根据其的各种修改或变化并且包含在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。本文所引用的所有公开、专利和专利申请都出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

Claims (7)

1.一种抗CD3抗体，其中所述抗CD3抗体包括结合域，所述结合域包括：
i.由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的VH结构域；以及
ii.由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成的VL结构域。
2.根据权利要求1所述的抗CD3抗体，其中所述抗体包括选自以下的非天然编码的氨基酸：对炔丙基氧基苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、或对乙酰基苯丙氨酸，其中所述非天然编码的氨基酸根据Kabat编号在重链的位置114处。
3.根据权利要求2所述的抗CD3抗体，其中所述非天然编码的氨基酸连接到水溶性聚合物，其中所述水溶性聚合物包括聚乙二醇部分。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述抗体连接到生物活性分子，其中所述生物活性分子是叶酸。
5.一种抗CD3抗体，其中所述抗CD3抗体包括结合域，所述结合域包括：
i.由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的VH结构域；以及
ii.由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成的VL结构域；
其中所述抗体包括非天然编码的氨基酸对乙酰基苯丙氨酸，其中所述非天然编码的氨基酸根据Kabat编号在重链的位置114处，其中所述抗体的所述非天然编码的氨基酸通过包括聚乙二醇部分的水溶性聚合物连接到叶酸。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗CD3抗体在制备治疗药物中的用途。
7.一种医药组合物，其包括治疗有效量的根据权利要求1至5中任一项所述的抗CD3抗体，和药学上可接受的载剂或赋形剂。
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