CN108348575B - 用于治疗癌症或血管生成相关疾病的药物组合物和融合蛋白的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种药物组合物，其含有作为有效成分的融合蛋白，其中融合有组织穿透肽和抗血管内皮细胞生长因子(抗VEGF)剂，用于治疗癌症或血管生成相关疾病。更具体地，本发明涉及融合蛋白用于治疗癌症或血管生成相关疾病的用途，其中，所述融合蛋白改善了抗血管内皮细胞生长因子剂的组织穿透性并且发挥癌症靶向作用，从而产生优异的血管生成抑制作用并表现出对癌症的治疗效果，其中所述癌症表现出对抗VEGF剂的耐药性或无反应性。

Description

用于治疗癌症或血管生成相关疾病的药物组合物和融合蛋白 的用途
技术领域
本发明涉及一种包含作为有效成分的融合蛋白的药物组合物，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂形成。更具体地，本发明涉及融合蛋白用于治疗癌症或血管生成相关疾病的用途，其中所述的融合蛋白通过改善抗血管生成剂的肿瘤穿透性并发挥癌症靶向作用而具有优异的血管生成抑制效果，并且通过提升抗血管生成剂的疗效，甚至在对抗血管生成剂显示出耐药性或无反应性的癌症上也能表现出治疗效果。
背景技术
本申请要求于2015年9月1日提交的韩国专利申请No.10-2015-0123878的优先权和权益，在此通过引用将其全部内容并入本文。
血管生成是指由预先存在的微血管形成新毛细血管的过程。血管生成是一种正常的生理作用，并且，已知它在发育、伤口愈合和女性生殖周期中发挥重要作用。此外，有多种疾病是由血管生成的自我调节失效和血管的异常生长而引起的。例如，已知异常过度的血管生成在癌症生长和转移等疾病中起决定性作用，诸如糖尿病性视网膜病，年龄相关性黄斑病变，类风湿性关节炎，子宫内膜异位，牛皮癣和慢性炎症。反之，血管生成不足是冠状动脉疾病、中风、心肌梗塞、溃疡或伤口愈合延迟的原因。
在这些疾病中，癌症是指一种疾病，其中，构成身体的细胞由于某种致癌因子的作用而不规则地***，从而细胞本身不受身体控制，导致杂乱无章地增殖。进一步地，细胞侵入周围组织，并且通过血管、***发生远处转移到其它器官，并造成类似障碍。忽视这种状态是致命的，因此，该状态被称为恶性肿瘤或恶性赘生物，而这种细胞被称为癌细胞或恶性细胞。
根据癌症类型而存在各种各样的疗法，通常采用手术，诱导细胞凋亡的化疗，放射疗法，癌细胞靶向疗法，免疫疗法，高温疗法，干细胞移植，光动力疗法等。靶向疗法最近经常被实施，以尽量减少由于破坏正常细胞而引起的不良反应并提高药物的疗效，而其类型包括：用于抑制癌症特异性生长的信号传导阻断剂，用于阻断氧气和营养物质向癌细胞供应的血管生成抑制剂，凋亡诱导剂，免疫增强剂等。
血管生成，是从现有血管形成新血管的过程，它是血管发生和发展，正常细胞和组织的***和生长，以及癌细胞的***和生长所必需的过程之一。
血管内皮生长因子(VEGF)是参与血管生成的多个生长因子之一，而已知VEGF-A在这些生长因子中的作用是重要的。抗VEGF单克隆抗体——贝伐单抗(阿瓦斯汀)，可特异性抑制VEGF-A以抑制血管生成，其与5-氟尿嘧啶组合在2004年和2005年分别被FDA和 EMA批准为转移性结肠癌的主要或次要药物。经过数百次临床试验之后，贝伐单抗(阿瓦斯汀)也被批准为用于治疗各种癌症的药物，如转移性肾癌，转移性非小细胞癌，进行性胶质母细胞瘤和转移性乳腺癌。
抗VEGF剂，如阿瓦斯汀，可以靶向伴有活性血管生成的癌症。然而，抗VEGF剂的副作用在诸如肾脏和胃等器官中是剂量依赖性的，因为具有高VEGF水平时，这种药剂不仅影响癌症，还影响其它器官。
除了VEGF-A之外，其它生长因子，如成纤维细胞生长因子(FGF)，缺口配体/受体***，胎盘生长因子(PIGF)，以及血小板衍生的生长因子-BB(PDGF-BB)，都参与血管生成的信号传导机制。于是，即使VEGF-A被如阿瓦斯汀之类的抗VEGF剂阻断，通过其它机制的补偿也是可能的。因此，据推测，许多患者对如阿瓦斯汀之类的抗VEGF剂无反应，或者对其有耐药性，是由于反复施用阿瓦斯汀而导致没有明显的效果。
因为如阿瓦斯汀的抗VEGF剂通过阻断VEGF-A介导的信号传导以抑制血管生成而具有强效的抗癌活性，它们可被用作有效的药剂，可用于单独或联合治疗包括难治性转移癌在内的各种癌症。不过，抗VEGF剂由于其作用机制和剂量，具有耐药性和副作用，所以该抗 VEGF剂表现出比预期的更低的临床效果并且其被限制性地使用。因此，有必要开发出能够克服如阿瓦斯汀等抗VEGF剂的这些缺点且增加其疗效的新药剂。
发明内容
技术问题
本发明人发现了一种融合蛋白，其中，靶向神经毡蛋白受体(NRP)的肿瘤穿透肽(TPP) 与抗血管生成剂融合，能够提升抗血管生成剂的肿瘤穿透，改善患者便利性并减少剂量依赖性副作用，由于其癌症靶向作用通过TPP发挥，以降低其高剂量，并且克服由于抗血管生成剂的连续使用导致的来自血管周微环境变化的阻力，于是本发明人完成了本发明。
因此，本发明的一个方面是提供一种用于治疗癌症或血管生成相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含作为有效成分的融合蛋白，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而获得。
本发明的一个方面是提供一种用于治疗癌症或血管生成相关疾病的药物组合物，所述药物组合物由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而获得。
本发明的一个方面是提供一种用于治疗癌症或血管生成相关疾病的药物组合物，所述药物组合物主要由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而获得。
本发明的另一个方面是提供一种用于抑制癌症转移的药物组合物，所述药物组合物包含作为有效成分的融合蛋白，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而获得。
本发明的另一个方面是提供一种用于抑制癌症转移的药物组合物，所述药物组合物由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而获得。
本发明的另一个方面是提供一种用于抑制癌症转移的药物组合物，所述药物组合物主要由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而获得。
本发明的又一个方面是提供融合蛋白用于制备治疗癌症或血管生成相关疾病的药剂的用途，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
本发明的另一个方面是提供一种在有需要的受试者中治疗癌症或血管生成相关疾病的方法，所述方法包括将有效量的组合物给药于有需要的受试者，其中所述的组合物包含作为有效成分的融合蛋白，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
本发明的另一个方面是提供一种在有需要的受试者中治疗癌症或血管生成相关疾病的方法，所述方法包括将有效量的组合物给药于有需要的受试者，其中所述的组合物由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
本发明的另一个方面是提供一种在有需要的受试者中治疗癌症或血管生成相关疾病的方法，所述方法包括将有效量的组合物给药于有需要的受试者，其中所述的组合物主要由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
本发明的另一个方面是提供融合蛋白用于制备用于抑制癌症转移的药剂的用途，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
本发明的另一个方面是提供一种在有需要的受试者中抑制转移的方法，所述方法包括将有效量的组合物给药于有需要的受试者，所述的组合物包含作为有效成分的融合蛋白，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
本发明的另一个方面是提供一种在有需要的受试者中抑制转移的方法，所述方法包括将有效量的组合物给药于有需要的受试者，其中所述的组合物由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
本发明的另一个方面是提供一种在有需要的受试者中抑制转移的方法，所述方法包括将有效量的组合物给药于有需要的受试者，其中所述的组合物主要由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
技术方案
根据本发明的一个方面，提供了一种用于治疗癌症或血管生成相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含作为有效成分的融合蛋白，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而获得。
根据本发明的一个方面，提供了一种用于治疗癌症或血管生成相关疾病的药物组合物，所述药物组合物由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而获得。
根据本发明的一个方面，提供了一种用于治疗癌症或血管生成相关疾病的药物组合物，所述药物组合物主要由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而获得。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于抑制癌症转移的药物组合物，所述药物组合物包含作为有效成分的融合蛋白，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于抑制癌症转移的药物组合物，所述药物组合物由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于抑制癌症转移的药物组合物，所述药物组合物主要由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而获得。
根据本发明的另一个方面，提供了融合蛋白用于制备治疗癌症或血管生成相关疾病的药剂的用途，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
根据本发明的另一个方面，提供了一种在有需要的受试者中治疗癌症或血管生成相关疾病的方法，所述方法包括将有效量的组合物给药于有需要的受试者，其中所述的组合物包含作为有效成分的融合蛋白，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
根据本发明的另一个方面，提供了一种在有需要的受试者中治疗癌症或血管生成相关疾病的方法，所述方法包括将有效量的组合物给药于有需要的受试者，其中所述的组合物由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
根据本发明的另一个方面，提供了一种在有需要的受试者中治疗癌症或血管生成相关疾病的方法，所述方法包括将有效量的组合物给药于有需要的受试者，其中所述的组合物主要由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
根据本发明的另一个方面，提供了融合蛋白用于制备用于抑制癌症转移的药剂的用途，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
根据本发明的另一个方面，提供了一种在有需要的受试者中抑制转移的方法，所述方法包括将有效量的组合物给药于有需要的受试者，所述的组合物包含作为有效成分的融合蛋白，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
根据本发明的另一个方面，提供了一种在有需要的受试者中抑制转移的方法，所述方法包括将有效量的组合物给药于有需要的受试者，其中所述的组合物由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
根据本发明的另一个方面，提供了一种在有需要的受试者中抑制转移的方法，所述方法包括将有效量的组合物给药于有需要的受试者，其中所述的组合物主要由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
在下文中，将详细描述本发明。
本发明提供了一种用于治疗癌症或血管生成相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含作为有效成分的融合蛋白，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而获得。
进一步地，本发明提供了一种用于治疗癌症或血管生成相关疾病的药物组合物，所述药物组合物由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而获得。
此外，本发明提供了一种用于治疗癌症或血管生成相关疾病的药物组合物，所述药物组合物主要由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而获得。
众所周知，血管内皮生长因子-A(VEGF-A)会诱发外渗。这也被称为血管渗透因子。已知该作用是通过其与血管内皮生长因子受体(VEGFR2)结合而诱导的，而有趣的是，血管内皮生长因子-A突变实验显示，即使血管内皮生长因子-A未能结合血管内皮生长因子受体，血管内皮生长因子-A的血管渗透性也增加了。这表明存在血管内皮生长因子-A的另一种受体(Stacker et al.,1999)。
Takagi等人(1987)和Fujisawa等人(1989)首次发现神经毡蛋白存在于爪蟾的神经***中。神经毡蛋白是一种跨膜糖蛋白，同时有两种类型的神经毡蛋白，即NRP1和NRP2。神经毡蛋白通过结合至VEGF家族配体而作为VEGF受体(VEGFR)的共受体。有消息称，通过NRP1改变VEGF165和VEGFR2之间的亲合力，NRP1通过作为VEGFR1，VEGFR2 和VEGFR3的共受体而结合于各种VEGF配体，从而增强配体和受体之间的结合强度(Soker et al.,1998)。另一方面，NRP2通过作为VEGFR2和VEGFR3的共受体而有助于***生成和细胞粘附。另外，在作为神经丛家族受体的共受体的同时，NRP1/NRP2(NRP1/2) 结合至分泌的3类信号素配体(Sema3A，Sema3B，Sema3C，Sema3D，Sema3E，Sema3F 和Sema3G)。
NRP1与VEGFR-2作为共受体以增加内皮细胞中的细胞迁移和血管生成，并且以参与血管重建过程，其中周细胞覆盖血管，因此NRP1是血管发育的主要因素。另外，NRP1增加血管内皮(VE)-钙粘蛋白和上皮特异性细胞粘附分子(E-钙粘蛋白)的表达，以维持细胞之间的粘附连接。特别是，NRP1在各种癌细胞系中高度表达，包括肺癌，乳腺癌，***癌，胰腺癌和大肠癌；而众所周知，在晚期结直肠癌患者中，NRP1的高度表达导致癌症转移到***或肝脏的可能性很高并造成低的存活率。于是，NRP1和癌症转移之间的关系也得到了临床验证。
如本文所使用的，术语“肿瘤穿透”是指具有以下任何一个特征：特异性识别NRP-过表达的组织并被积累在其中，增加血管内皮细胞之间的细胞间隙，以促进药物的外渗，以及调节用作防水溶性分子的屏障的组织的角膜细胞之间的间隙，以促进药物在组织中的分布。
血管生成需要一系列复杂多样的过程，如血管内皮细胞的简单生长，内皮细胞侵入基底膜，其迁移和分化，以及毛细血管形成。已报道了多种启动子和抑制剂来控制血管生成过程。此外，组织溶解酶之类的活化是血管生成所必需的，而这样一系列的过程与癌细胞的侵袭过程非常相似。
最著名的血管生成促进因子是血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF的大小为32～44kDa，其几乎在所有细胞中被分泌，并与肿瘤侵袭高度相关(Takahashi et al.,1995)。VEGF早先已知为血管渗透因子，并且，其表现出比组胺强50000倍的强效外渗作用(Sengeret al., 1983)。这种外渗特性的特点将血液中的蛋白质移出血管，以助于形成新的血管。
近年来，血管生成素蛋白已被重新分离和纯化，并且已知其在血管生成结构的形成中起关键作用。血管生成素(ANG)蛋白分为Ang-1和Ang-2，其特异性结合Tie-2受体且存在于内皮细胞中。Ang-1参与内皮细胞的分化和稳定化，而Ang-2结合至Tie-2受体，以抑制Ang-1的结合，这导致内皮细胞的非稳定化和血管退化。为了癌症组织中的血管生成，癌细胞首先选择一现有的血管，并受到血管共同选择和血管退化的影响，其是由Ang-2介导的(Holash et al.，1999)。
已知通过使用各种配体激活一系列受体来促进血管生成，所述配体除了上述VEGF和 ANG之外还包括胎盘生长因子(PIGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，肝细胞生长因子(HGF)，转化生长因子(TGF)，***(IGF)，肝配蛋白，白细胞介素和骨形态发生蛋白(BMP)。
如本文所使用的，“抗血管生成”包括干扰血管生成相关分子和天然受体之间相互作用的分子，例如，结合至VEGF或VEGF受体以防止或抑制VEGF和VEGF受体之间的相互作用的分子。VEGF拮抗剂包括抗VEGF抗体，抗VEGF受体抗体和基于VEGF受体的嵌合分子。所述“抗血管生成”还包括结合至PDGF，PIGF，FGF，TGF，ANG，HGF，IGF，肝配蛋白A，白细胞介素，BMP和它们的受体的分子，以防止或抑制它们之间的相互作用。其拮抗剂包括抗PDGF，抗PIGF，抗FGF，抗TGF，抗ANG，抗HGF，抗IGF，抗肝配蛋白A，抗白细胞介素与抗BMP抗体，以及对各自受体的拮抗性抗体和基于受体的嵌合分子。
如本文所使用的，术语“融合”是指将具有相同或不同功能或结构的两个分子结合起来，并且可以是通过任何物理的、化学的或生物学的方法进行的融合，由此肿瘤穿透肽可结合至抗血管生成剂。融合可以优选通过连接肽来完成，并且这样的连接肽，例如可结合至抗体中 Fc片段的C末端。
与此同时，抗血管生成剂是有效的药物，可以单独应用或以联合治疗形式用于各种癌症，包括难治性转移癌，因为所述抗血管生成剂通过阻断血管生成相关的信号传导以抑制血管生成,，而具有高抗癌活性。不过，由于其作用机制和剂量，所述抗血管生成剂具有耐药性和副作用，因此所述抗血管生成剂表现出低于预期的临床效果并且其被限制性地使用。据了解，抗VEGF剂——阿瓦斯汀(化学名称：贝伐单抗)是抗血管生成剂中最具代表性的药物之一，其不像其它抗体药物，其并非一种癌症特异性靶向药物；因此，阿瓦斯汀需要在高剂量下给药以发挥其疗效，并且其不仅可分布在癌组织中，而且可以高水平的VEGF分布在其它组织中，这就会导致不良的副作用。
本发明所述的融合蛋白靶向NRP，大量分布于肿瘤中，这是因为靶向NRP的肿瘤穿透肽与抗血管生成剂融合，以使得所述融合蛋白能提升抗血管生成剂的癌症特异性效应，以减少其剂量，从而增加患者便利性并减少剂量依赖性副作用。
此外，NRP1与VEGF-A以及其它生长因子结合，如VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D， VEGF-E和PDGF，同时与VEGFR-1或VEGFR-2一起作为共受体，以通过融合于本发明所述融合蛋白中的肿瘤穿透肽使得NRP1与生长因子的结合被抑制，从而增加抗血管生成剂的血管生成抑制作用。
本发明提供了一种药物组合物，其特征在于：癌症或血管生成相关疾病是对抗血管生成剂耐药性的或无反应的。
术语“耐药性的”或“无反应的”是指一种属性，在通常表现出治疗效果的药物浓度下不表现出治疗效果。
除了VEGF-A之外，其它生长因子，如FGF，缺口配体/受体***，PIGF和PDGF-BB，均参与血管生成的信号传导机制，并因此即使一个信号被阻塞，血管生成可通过其它机制作为补偿作用持续发生。因此假定许多患者对抗血管生成剂都没有反应或者由于重复给药而对其有耐药性，导致没有明显的治疗效果。
更具体而言，一个实施例可以是多种抗血管生成剂中的抗VEGF剂的用途。在血管生成中，血管生长在高VEGF浓度下通过细胞***和生长发生。此后，随着VEGF浓度降低，PDGF浓度升高，因此发生血管正常化或重建。由于血管周细胞覆盖，所述正常化过程与未成熟血管的数量和大小的减少一起，包含通过间隙液体降低血管压力的过程。在通过施用如阿瓦斯汀的抗VEGF剂降低VEGF浓度的情况下，所述血管周细胞覆盖通过正常化增加，从而降低了药物对肿瘤组织的渗透。据报道，阿瓦斯汀和多西他赛联合给药于非小细胞肺癌患者实际上降低了药物对肿瘤的渗透。这些结果表明，如阿瓦斯汀的抗VEGF剂和另一种药物的联合给药具有局限性并引起对抗VEGF剂的耐药性。
同时，本发明所述的融合蛋白具有抗血管生成剂和与其融合的肿瘤穿透肽，所述肿瘤穿透肽能够直接结合并作用于NRP，而NRP通过周细胞缔合参与血管重建。于是，本发明所述的融合蛋白中的组织穿透肽抑制NRP，从而直接抑制血管生成的发展并克服由于抗血管生成剂的连续使用，而使血管周微环境的变化所产生的耐药性。
此外，因为NRP1调节参与维持细胞间连接的VE-钙粘蛋白和E-钙粘蛋白的表达，本发明所述的融合蛋白通过抑制NRP1使细胞间隙更松弛了，由此增加了共同施用的药物如现有的抗体药物，的穿透能力，以及增加进入肿瘤块的免疫细胞，从而增加药物的疗效。
根据本发明的一个实施例，本发明人通过制备阿瓦斯汀-A22p融合蛋白评估了各种生理活性，其中，组织穿透肽A22p被融合至抗VEGF剂阿瓦斯汀的C末端，以及通过制备阿瓦斯汀-TPP11融合蛋白评估了各种生理活性，其中TPP11与其融合。具体地，根据本发明所述的融合蛋白显示出(i)对NRP1和VEGF具有优异的结合能力(实施例2)；(ii)与野生型阿瓦斯汀相比，显著增强了肿瘤靶向能力和组织穿透能力(实施例3)；(iii)明显减少的周细胞覆盖，这被推测为抗VEGF剂的耐药性机制(实施例4)；以及(iv)甚至在肿瘤动物模型中也具有优异的抗肿瘤活性(实施例5)。
本发明所述的融合蛋白之所以显示出上述优异的生理活性被认为是因为抗VEGF剂和肿瘤穿透肽通过同时分别作用于VEGF和NRP1而表现出协同效应。
根据本发明所述的药物组合物可单独含有融合蛋白或与药学上可接受的载体一起被配制成合适的形式，并且可进一步含有赋形剂或稀释剂。术语“药学上可接受的”组分是指一种无毒的组分，其为生理上可接受的，且当其施用于人类时不会引起过敏反应，如胃肠道紊乱或眩晕，或类似的反应。
药学上可接受的载体的例子可进一步包括口服给药载体或非消化道给药载体。口服给药载体可包括：乳糖，淀粉，纤维素衍生物，硬脂酸镁，硬脂酸等。此外，口服给药载体可包括适用于口服肽制剂的各种药物递送材料。另外，非消化道给药载体可包括：水，合适的油，生理盐水，葡萄糖水溶液和乙二醇，并还可包括稳定剂和防腐剂。稳定剂的合适的例子包括抗氧化剂，如亚硫酸氢钠，亚硫酸钠或抗坏血酸。防腐剂的合适的例子包括苯扎氯铵，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，以及三氯叔丁醇。除了上述成分之外，本发明所述的药物组合物可进一步包含润滑剂，润湿剂，甜味剂，调味剂，乳化剂，悬浮剂等。其它药学上可接受的载体和制剂可参考文献(Remington's Pharmaceutical Sciences,19th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA,1995)。
本发明所述的组合物可通过任何方法被给药于包括人类在内的哺乳动物。例如，本发明所述的组合物可以口服或非消化道给药。非消化道给药可以是但不限于静脉内给药，肌肉内给药，动脉内给药，髓内给药，硬膜内给药，心内给药，透皮给药，皮下给药，腹膜内给药，鼻内给药，肠道给药，局部给药，舌下给药或直肠给药。
根据如上所述的给药途径，本发明所述的药物组合物可配制成一种用于口服给药或非消化道给药的药剂。
对于口服给药的药剂，本发明所述的组合物可通过本领域内已知的方法被配制成粉剂，颗粒剂，片剂，丸剂，糖衣片剂，胶囊剂，液体，凝胶剂，糖浆，浆液和悬浮液。例如，用于口服给药的片剂或糖衣片剂可通过以下步骤获得：将有效成分与固体赋形剂混合，粉碎混合物，并向其中加入适合的佐剂，然后将该混合物加工成颗粒混合物。赋形剂的合适的例子可包括：糖类，包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，木糖醇，赤藓糖醇和麦芽糖醇；淀粉类，包括玉米淀粉，小麦淀粉，大米淀粉和土豆淀粉；纤维素类，包括纤维素，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素；以及填充剂，如明胶和聚乙烯吡咯烷酮。在某些情况下，交联的聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，海藻酸或海藻酸钠可作为崩解剂添加。进一步地，本发明所述的药物组合物还可含有抗凝剂，润滑剂，润湿剂，调味剂，乳化剂和防腐剂。
对于非消化道给药的药剂，本发明所述的组合物可通过本领域内已知的方法被配制成注射剂，乳剂，洗剂，外用软膏，油剂，保湿剂，凝胶剂，气雾剂，以及鼻吸入剂。这些剂型在文献中被公开，这是整个药物化学中通常已知的剂型(Remington's PharmaceuticalScience,19th ed.,Mack Publishing Company,East on,PA,1995)。
本发明所述组合物的总有效量可以单剂量给药于患者，或长期内可通过分次治疗方案以多剂量给药。在本发明所述的药物组合物中，有效成分的含量可因疾病的严重程度而异。本发明所述药物组合物的总剂量可优选为每千克患者体重每天约0.01μg至10,000mg，并进一步优选为0.1μg至1,000mg。至于本发明所述的药物组合物的剂量，患者的有效剂量是根据多种因素确定的，如制剂方法，给药途径，治疗的次数，患者的年龄，体重，健康状况和性别，疾病的严重程度，饮食和***率。因此，考虑到这些因素，本领域技术人员就可以确定本发明所述组合物的合适有效量。根据本发明所述的药物组合物并不特别受限于剂型，给药途径，及其给药方法。
本发明提供了一种药物组合物，其特征在于，抗血管生成剂选自由以下组成的组：
抗血管内皮生长因子(抗VEGF)剂，抗血小板衍生的生长因子(抗PDGF)剂，抗胎盘生长因子(抗PlGF)剂，抗成纤维细胞生长因子(抗FGF)剂，抗转化生长因子(抗TGF) 剂，抗血管生成素(抗ANG)剂，抗肝细胞生长因子(抗HGF)剂，抗*** (抗IGF)剂，抗激活素受体样激酶1(抗ALK1)剂，抗肝配蛋白A剂，抗白细胞介素剂，抗骨形态发生蛋白(抗BMP)剂；
对VEGF受体，PDGF受体，PIGF受体，FGF受体，TGF受体，ANG受体，HGF受体，IGF受体，ALK1受体，肝配蛋白A受体或白细胞介素受体的拮抗性抗体；和
基于所述受体的嵌合分子。
在本发明中，抗血管内皮生长因子(抗VEGF)剂可选自由以下组成的组：贝伐单抗，兰尼单抗，r84(PLoS One.2010Aug 6；5(8))，阿柏西普，康柏西普，CT01(WO2005056764A2)，DOM15-10-11(WO2008149147A2)，DOM15-26-593 (WO2008149143A2)，PRS-050(PLoS One.2013Dec 13；8(12))，CT-322(BMC Cancer 2008,8:352)，ESBA903(EurJ Pharm Biopharm.2015Mar 14.pii: S0939-6411(15)00089-2)，EPI-0030(WO2011023130A1)，和抗体-药物偶联物，其中融合有抗VEGF抗体和药物。所述抗VEGF剂包括生物仿制药及其变体。更优选地，所述抗 VEGF剂可以是兰尼单抗，贝伐单抗，阿柏西普或康柏西普，但不限于此。
术语“生物仿制药”是指一种仿制的医药产品，其通过模仿专利过期的原生物医药产品而在质量、功效和安全性上被验证为具有等同性，所述原生物医药产品通过使用生物技术而已经被开发或销售，所述生物技术例如为基因重组技术和细胞培养技术。
在保留了抗血管内皮生长因子剂的核心生理活性的同时，该变体包括所有类似的序列，所述类似的序列在不影响这种活性的氨基酸位置含有一个或多个变体。也就是说，该变体可以是一种功能变体，其与上面列出的抗血管内皮生长因子剂的氨基酸序列至少有80％相同，更优选至少有85％相同，还更优选至少有90％相同，并且最优选至少有95％相同。
如本文所使用的，术语“对受体的拮抗性抗体”是指可抑制VEGF受体，PDGF受体，PIGF 受体，FGF受体，TGF受体，ANG受体，HGF受体，IGF受体，ALK1受体，肝配蛋白A 受体和白细胞介素受体的至少一种生物活性的抗体。这些抗体可通过抑制受体与配体的结合而显示出抑制血管生成的分子生物学信号传导的功能。所述抗体可包括多克隆抗体，单克隆抗体，嵌合抗体，人源化抗体，Fv片段，Fab片段，F(ab')2片段，以及scFv片段，并且所述抗体包括整个抗体的形式和抗体分子的功能性片段。
如本文所使用的，术语“血管生成相关疾病”是指由血管生成所引起的疾病，其中，毛细血管以血管内皮细胞从现有血管中萌发并侵入组织的形式延伸。疾病的非限制性例子可包括类风湿性关节炎，牛皮癣，炎症，子宫内膜异位症和血管瘤。
在本发明中，所述癌症可选自由以下组成的组：鳞状细胞癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌，肺鳞状细胞癌，腹膜癌，皮肤癌，皮肤或眼内黑色素瘤，直肠癌，肛周癌，食道癌，小肠癌，内分泌腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，慢性或急性白血病，淋巴细胞性淋巴瘤，肝细胞瘤，胃肠癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，***，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞腺瘤，乳腺癌，结肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺肿瘤，肾癌，肝癌，***癌，外阴癌，甲状腺癌，以及头颈癌，但不限于此。
另外，本发明提供了一种药物组合物，其特征在于，肿瘤穿透肽同时结合神经毡蛋白1 (NRP1)和神经毡蛋白2(NRP2)，或者仅特异性结合神经毡蛋白1。
在本发明中，同时结合神经毡蛋白1和神经毡蛋白2的肿瘤穿透肽包含选自SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：4的氨基酸序列，而仅特异性结合神经毡蛋白1的肿瘤穿透肽包含选自SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
由选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4的氨基酸序列表示的所述组织穿透肽可同时结合神经毡蛋白1和2，并且它是根据以下事实设计的：对结合至神经毡蛋白的b1b2结构域的 VEGF165配体的结合区域的氨基酸序列和该氨基酸序列的长度进行分析，并对已知与神经毡蛋白结合的信号素3A和信号素3F的弗林蛋白酶C-末端的序列的核苷酸序列进行分析，因此，其C-末端的序列彼此相似。
由选自SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：7的氨基酸序列表示的所述组织穿透肽仅特异性结合神经毡蛋白1，而不结合神经毡蛋白2。本发明人分离并纯化了肽，其是通过以下步骤获得的：设计与重链恒定区(Fc)的C末端融合的肽文库，在酵母细胞表面表达肽文库，以构建Fc融合的肽文库，然后选择选择性结合神经毡蛋白1的b1结构域的克隆体。同时，为了从Fc-肽文库中分离所述肽，其对神经毡蛋白1是特异性的并且以高亲和力与神经毡蛋白1 结合，所述肽通过以下步骤获得：通过使用神经毡蛋白1的b1b2结构域蛋白和神经毡蛋白2 的b1b2结构域蛋白作为其竞争剂进行选择。
SEQ ID NO：1至SE ID NO：7的氨基酸序列如下所示：
TPP#1(SEQ ID NO:1) HTPGNSNKWKHLQENKKGRNRR
TPP#2(SEQ ID NO:2) HTPGNSNKWKHLQENKKGRPRR
TPP#3(SEQ ID NO:3) REAPGAPRSPEPQDQKKPRNRR
TPP#4(SEQ ID NO:4) REAPGAPRSPEPQDQKKPRPRR
TPP#5(SEQ ID NO:5) HTPGNSNQFVLTSTRPPR
TPP#6(SEQ ID NO:6) HTPGIATRTPR
TPP#7(SEQ ID NO:7) HTPGNSKPTRTPRR
在本发明中，所述融合蛋白的特征可在于：组织穿透肽和抗VEGF剂通过连接肽融合。所述连接肽可由1至100个氨基酸组成，优选由4至20个氨基酸组成，进一步优选由4至15个氨基酸组成。另外，所述连接肽可由甘氨酸(G)，丝氨酸(S)或丙氨酸(A)组成，并且，所述连接肽的序列可优选为(GA)n或(GGGGS)m的氨基酸序列(条件是n和m 各自独立地为1至20的整数)，并且更优选为GAGA或(GGGGS)3的氨基酸序列。在本发明的一个实施例中，由SEQID NO：8表示的氨基酸序列(GGGGSGGGGSGGGGS)被用作所述连接肽。
根据本发明的一个优选实施例，所述融合蛋白是阿瓦斯汀与组织穿透肽的融合物，其可以是具有作为重链的SEQ ID NO：9或10的氨基酸序列与作为轻链的SEQ ID NO：11的氨基酸序列的融合蛋白。另外，所述融合蛋白是阿瓦斯汀变体与组织穿透肽的融合物，其可以是具有作为重链的SEQ ID NO：12的氨基酸序列与作为轻链的SEQ ID NO：11的氨基酸序列的融合蛋白。
本发明提供了一种用于抑制癌症转移的药物组合物，所述药物组合物包含作为有效成分的融合蛋白，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
进一步地，本发明提供了一种用于抑制癌症转移的药物组合物，所述药物组合物由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
此外，本发明提供了一种用于抑制癌症转移的药物组合物，所述药物组合物主要由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
癌症转移指的是从原发癌到其它器官的癌细胞的传播而造成的新癌症的形成。由于转移是各类癌症患者中危及生命的重大疾病，转移的预防或控制是癌症研究的一个重要目标。虽然手术，化疗或放疗对于无转移癌症的早期诊断是有效的，但是，当诊断时存在转移的时候，这些疗法的效果会减少。另外，转移经常在治疗期间或之后被确认，而在诊断时尚未确认转移。
转移由一系列阶段组成：侵袭，内渗，停滞，外渗，移殖等。通过这个过程，癌症细胞从原发器官传播，最后在其它器官内形成癌症。作为第一阶段的侵袭是转移的起始阶段，并包括：癌细胞之间相互作用的变化或者癌细胞和细胞外基质之间相互作用的变化，周围组织的解体，以及癌细胞迁移到组织中，等等。
在本发明的一个实施例中，确认了用根据本发明所述的融合蛋白(阿瓦斯汀-A22p)处理表现出对阿瓦斯汀有耐药性的肿瘤细胞系，显著抑制了肿瘤细胞的迁移。原因被认为是，根据本发明所述的融合蛋白通过其它生长因子以及VEGF-A抑制信号传导，并因此还在对阿瓦斯汀有耐药性的肿瘤细胞上表现出优异的转移抑制效果。
与此同时，众所周知，癌细胞中PDGF与PDGF受体的结合增加了p130cas蛋白的磷酸化，以促进癌细胞的迁移和侵袭。然而，经证实，被阿瓦斯汀处理后并无明显变化的p130cas蛋白的磷酸化，由阿瓦斯汀-A22p处理后被抑制到对照组的磷酸化水平。换言之，可以认为，根据本发明所述的融合蛋白抑制了VEGF，还通过与NRP1结合而抑制PDGF介导的信号传导，从而通过PDGF抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。因此这表明，本发明所述的融合蛋白甚至在对抗VEGF剂具有耐药性的肿瘤细胞中也表现出有效的转移抑制作用。
因此，在本发明中，癌症可以是对抗血管生成剂耐药性的或无反应的。
本发明提供了融合蛋白用于制备治疗癌症或血管生成相关疾病的药剂的用途，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗癌症或血管生成相关疾病的方法，所述方法包括将有效量的组合物给药于有需要的受试者，所述组合物包含作为有效成分的融合蛋白，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
此外，本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗癌症或血管生成相关疾病的方法，所述方法包括将有效量的组合物给药于有需要的受试者，所述组合物由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
此外，本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗癌症或血管生成相关疾病的方法，所述方法包括将有效量的组合物给药于有需要的受试者，所述组合物主要由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
本发明提供了融合蛋白用于制备用于抑制癌症转移的药剂的用途，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
本发明提供了一种在有需要的受试者中抑制转移的方法，所述方法包括将有效量的组合物给药于有需要的受试者，所述的组合物包含作为有效成分的融合蛋白，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
进一步地，本发明提供了一种在有需要的受试者中抑制转移的方法，所述方法包括将有效量的组合物给药于有需要的受试者，所述的组合物由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
进一步地，本发明提供了一种在有需要的受试者中抑制转移的方法，所述方法包括将有效量的组合物给药于有需要的受试者，所述的组合物主要由作为有效成分的融合蛋白组成，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管生成剂而形成。
术语“有效量”是指表现出缓解，治疗，预防，检测或诊断癌症或血管生成相关疾病的效果，或者抑制或减少癌症转移的效果的量。术语“受试者”是指一种动物，优选一种哺乳动物，且特别优选包括人类的动物，并且可以是源自动物的细胞，组织和器官等。所述受试者可以是需要这种效果的患者。
如本文所使用的，术语“治疗”泛指缓解癌症或血管生成相关疾病，或者减轻癌症或血管生成相关疾病的症状，并可包括治愈，基本上预防，或缓解这些疾病的状况，并可包括减轻，治愈或预防由癌症或血管生成相关疾病引起的一个或大多数症状，但不限于此。
如本文所使用的，术语“包含”，与“包括”或“其特征在于”使用时的意思一样，并且并不排除组合物和方法中没有提及的另外的成分或步骤。术语 “由…… 组成”排除了未另有说明的其它元素，步骤或成分。术语“主要由…… 组成”的意思是，鉴于组合物或方法，该术语包括所描述的材料或步骤以及基本上不影响其基本特性的任何材料或步骤。
有利的效果
用于治疗癌症或血管生成相关疾病的所述药物组合物包含作为有效成分的融合蛋白，所述融合蛋白通过融合组织穿透肽和抗血管生成剂而形成，能够改善抗血管生成剂的肿瘤穿透性，能够发挥癌症靶向作用，从而即使采用小剂量也表现出优异的治疗效果，因此降低了抗血管生成剂的副作用，并且通过同时结合血管生成生长因子和NRP1，甚至在对抗血管生成剂有耐药性的癌症或血管生成相关疾病上也能表现出优异的治疗效果。
附图说明
图1是融合蛋白(阿瓦斯汀-A22p)的示意图，该融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管内皮生长因子而形成。
图2示出了确认融合蛋白的SDS-PAGE结果(车道1：阿瓦斯汀，车道2：阿瓦斯汀-A22p，车道3：阿瓦斯汀-TPP11)，该融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管内皮生长因子而形成。
图3示出了确认融合蛋白(阿瓦斯汀-A22p)的SE-HPLC结果(A：阿瓦斯汀，B：阿瓦斯汀-A22p)，该融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管内皮生长因子而形成。
图4示出了阿瓦斯汀-A22p与NRP1或VEGF的结合强度的评估结果(A：与NRP1的结合强度，B：与VEGF的结合强度)。
图5示出了在将阿瓦斯汀和阿瓦斯汀-A22p给药于SW620异种移植动物模型后，在经过的时间为3，8和16小时通过荧光显微镜观察到的癌组织中蛋白质的分布的结果(对照组：生理盐水给药组)。
图6示出了在用阿瓦斯汀-A22p处理的癌细胞中周细胞覆盖变化的评估结果(PECAM1：血管染色，NG2：周细胞染色)。
图7示出了在SW620异种移植动物模型中阿瓦斯汀-A22p的抗癌疗效的评估结果。
图8示出了确认迁移抑制效果的结果，在显示阿瓦斯汀耐药性的HCT116/bev细胞用 VEGF处理以诱导迁移并随后用1μM阿瓦斯汀或阿瓦斯汀-A22p处理的情况下(A：显微图像，B：量化的显微观察结果并绘制成图)。
图9示出了确认p130cas的蛋白磷酸化的结果，在用25μg/ml阿瓦斯汀或阿瓦斯汀-A22p 处理U87MG细胞，并且在30分钟后用50ng/ml PDGF处理的情况下，以便研究阿瓦斯汀-A22p是否抑制PDGE介导的信号传导(A：免疫印迹实验结果，B：量化免疫印迹实验结果制得的图，A22p+P：阿瓦斯汀-A22p 25ug/ml+PDGF 50ng/ml，P：PDGF 50ng/ml，C：对照组，A+P：阿瓦斯汀25ug/ml+PDGF 50ng/ml)。
图10示出了确认融合蛋白的SDS-PAGE结果(车道1：阿瓦斯汀(V)-A22p，车道2：阿瓦斯汀-A22p)，该融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管内皮生长因子而形成。
图11示出了确认融合蛋白的SE-HPLC结果(A：阿瓦斯汀(V)-A22p，B：阿瓦斯汀-A22p)，该融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管内皮生长因子而形成。
图12示出了阿瓦斯汀(V)-A22p和NRP1或VEGF的结合强度的评估结果，与阿瓦斯汀-A22p的结合强度进行对比(A：与NRP1的结合强度，B：与VEGF的结合强度)。
具体实施方式
在下文中，将详细描述本发明。
以下实施例仅用于说明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1：阿瓦斯汀-组织穿透肽(TPP)融合蛋白的制备
为了提高疗效并克服对抗VEGF剂——阿瓦斯汀的耐药性，本发明人已试图将组织穿透肽(TPP)融合至阿瓦斯汀的C末端，所述组织穿透肽能够同时结合神经毡蛋白1(NRP1)和神经毡蛋白2(NRP2)或者仅特异性结合神经毡蛋白1。TPP的氨基酸序列如下表1所示。在表1列出的序列中，具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4的氨基酸序列的TPP可同时结合神经毡蛋白1和2，而具有SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：7的氨基酸序列的TPP仅可特异性结合神经毡蛋白1。TPP与阿瓦斯汀融合于其中的融合蛋白的示意图如图1所示。
此处所使用的阿瓦斯汀是一种肽，具有作为重链的SEQ ID NO：13的氨基酸序列和作为轻链的SEQ ID NO：11的氨基酸序列，并且从www.Drugbank.com购买后用于本实验。
此时，在表1所示的TPP中，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的作为TPP的A22p 通过修饰VEGF165的C末端区域作为神经毡蛋白的内在配体和3类信号素配体而获得；并且，TPP11是通过使用神经毡蛋白1的b1b2结构域蛋白和神经毡蛋白2的b1b2结构域蛋白作为其竞争剂进行分离和鉴定来源于克隆体的肽而获得的，所述克隆体选择性结合至神经毡蛋白1的b1结构域。在此，作为连接肽的阿瓦斯汀与其融合以作为神经毡蛋白受体上的二价体，因此这些肽被设计成具有组织穿透的能力，同时对VEGF和Sema3A配体具有相似的亲和力。
表1TPP序列信息
TPP#1(SEQ ID NO:1) HTPGNSNKWKHLQENKKGRNRR
TPP#2(SEQ ID NO:2) HTPGNSNKWKHLQENKKGRPRR
TPP#3(SEQ ID NO:3) REAPGAPRSPEPQDQKKPRNRR
TPP#4(SEQ ID NO:4) REAPGAPRSPEPQDQKKPRPRR
TPP#5(SEQ ID NO:5) HTPGNSNQFVLTSTRPPR
TPP#6(SEQ ID NO:6) HTPGIATRTPR
TPP#7(SEQ ID NO:7) HTPGNSKPTRTPRR
具体地，融合蛋白，其中具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的TPP(A22p)和具有SEQID NO：7的氨基酸序列的TPP(TPP11)被分别融合至阿瓦斯汀的C末端。并且产生所述融合蛋白的细胞系按照如下方法制备。
<1-1>表达载体的构建和细胞转染
选择标记DHFR基因被***到pcDNA3.1(-)载体中，并且，分别用限制性内切酶NotI和BamHI克隆阿瓦斯汀-A22p和阿瓦斯汀-TPP11的重链和轻链。通过使用NeonTM电泳，一个质粒，编码通过融合每个构建的抗体重链恒定区，一个结合至NRP1的肽，和一个质粒，编码轻链蛋白，在CHO DG44细胞(由Chasin教授处获得)中表达为蛋白。在T25烧瓶里，用每个质粒转染的3X106个细胞被接种，并在37℃下孵育。使用选择标记保护稳定的细胞，然后在无血清SFM4CHO(Hyclone)中以漂浮状态培养7天，在100rpm，37℃，pH7.2， 50％DO2条件下的生物反应器中进行。上清液通过离心从细胞中被分离出来，并使用0.22μm 过滤器进行灭菌。
<1-2>融合蛋白的纯化
收集阿瓦斯汀，阿瓦斯汀-A22p和阿瓦斯汀-TPP11的培养物，并同时参照标准协议纯化其各自的蛋白。对于纯化柱，以200cm/h的线速度在XK16/20柱(Mabselect Sure树脂，GE医疗保健)中将蛋白质A树脂(Mabselect Sure树脂，GE医疗保健)填充至20mL。将 1L抗体施加到蛋白质A柱，并且用15倍柱体积的PBS冲洗该柱子(pH 7.4,137mM NaCl, 2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mM KH2PO4)。用100mL 0.1M甘氨酸缓冲液在pH3.0下洗脱抗体。在280nm的UV吸光度下收集10mAU至10mAU之间的蛋白质，并且使用0.7mL 的1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液将60mL的蛋白质中和至pH7.0。用0.2μm过滤器(Millipore) 过滤抗体部分，然后用amicon(30MWCO)浓缩器(Millipore)在3,500rpm下浓缩10分钟，随后与PBS缓冲液(pH 7.4)交换。使用在280nm的校正波长下的吸光度和吸收系数，纯化的抗体重链恒定区和所选择的特异性结合至NRP1的肽融合而成的纯化的融合蛋白被量化。纯化的抗体重链恒定区和所选择的特异性结合至NRP1的肽融合而成的纯化的融合蛋白，以还原和非还原条件在10％SDS-PAGE上进行分析。
所述蛋白分别从培养物中纯化，所述培养物收集自表达阿瓦斯汀，阿瓦斯汀-A22p和阿瓦斯汀-TPP11的细胞系，并通过SDS-PAGE分离。图2证实了，阿瓦斯汀-A22p和阿瓦斯汀-TPP11成功形成了抗体，肽在还原条件下与阿瓦斯汀融合，并且在还原条件下，阿瓦斯汀-A22p和阿瓦斯汀-TPP11大于阿瓦斯汀。另外，由于阿瓦斯汀-A22p和阿瓦斯汀-TPP11都以相似的水平表达，TPP融合不显著影响抗体表达得到了证实。
为了研究阿瓦斯汀-A22p纯化蛋白的纯度，实施了高效液相色谱(HPLC)分析。使用Agilent 1200(安捷伦)，并使用尺寸排阻柱(Biosuite 250，Waters)。
具体地，含有0.2M磷酸钾和0.25M氯化钾的缓冲溶液(pH6.2)被用作流动相，并使其以0.35ml/min的流速向下流动20分钟。根据保留时间检查蛋白的尺寸，并根据面积和高度检查其纯度。
如图3所示，使用SE-HPLC分析纯化的阿瓦斯汀-A22p的纯度。据证实，阿瓦斯汀-A22p 的纯度为97％以上，其纯度比阿瓦斯汀高。
随后，本发明人制备了阿瓦斯汀-A22p融合蛋白并评估了其活性，在所述阿瓦斯汀-A22p 融合蛋白中，具有由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的A22p作为TPP被融合至阿瓦斯汀。
实施例2：阿瓦斯汀-组织穿透肽(TPP)融合蛋白对NRP1和VEGF的结合能力
为了评估如实施例1中制备的融合蛋白阿瓦斯汀-A22p的N末端是否可以与阿瓦斯汀相同的方式与VEGF结合，同时其C末端可与NRP1结合，从而双重阻断相关的信号传导，分别评估阿瓦斯汀-A22p与NRP1和VEGF的结合。
以酶联免疫吸附测定(ELIA)考察了纯化的阿瓦斯汀-A22p与神经毡蛋白1-b1b2结构域的结合能力。使用赫赛汀-A22p(HCT-A22p)作为阳性对照并使用阿瓦斯汀(Roche co.,Swiss)作为阴性对照。靶分子神经毡蛋白1-b1b2结构域(273-586)在96孔Maxibinding 免疫板(SPL Life sciences.,Korea)中以1μg/孔在37℃下反应2h，然后，用0.1％PBST(0.1％Tween20，pH 7.4，137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4) 洗涤1分钟，重复3次。与含有5％脱脂乳的0.1％PBST反应1小时后，用0.1％PBST洗涤反应产物1分钟，重复3次。使用赫赛汀-A22p作为阳性对照并使用阿瓦斯汀(Roche co., Swiss)作为阴性对照。作为实验组的阿瓦斯汀-A22p用0.1％PBST稀释至50nM，25nM， 12.5nM和6.25nM，然后对于每种不同的浓度，将这些溶液在37℃下各处理1小时，并用 0.1％PBST洗涤1分钟，重复3次。HRP偶联的抗-kappa轻链抗体(Horseradish peroxidase-conjugated anti-humankappa light chain mAb,SIGMA-ALDRICH Co.,USA)用含有5％脱脂乳的0.1％PBST稀释100,000倍，随后在37℃处理30分钟。之后，反应产物用0.1％PBST洗涤1分钟，重复5次。为了彩色显影，所得产物用TMB HRP比色底物 (Surmodics co.,USA)处理，随后在室温下反应10分钟，用相同体积的1N HCl(终止缓冲液)处理，然后在450nm处测量吸光度。表达和纯化的阿瓦斯汀-A22p与神经毡蛋白1-b1b2 结构域的结合能力通过所获得的ELISA结果进行确认。
纯化的阿瓦斯汀-A22p与重组人VEGF 165(R&D systems co.China)的结合能力在ELISA中进行研究。使用阿瓦斯汀作为阳性对照并使用HCT-A22p作为阴性对照。靶分子重组人VEGF 165在96孔Maxibinding免疫板中以0.2μg/孔在37℃下反应2h，然后用0.1％ PBST洗涤1分钟，重复3次。与含有5％脱脂乳的1％PBST反应1小时后，反应产物用0.1％PBST洗涤1分钟，重复3次。使用阿瓦斯汀作为阳性对照并使用赫赛汀-A22p作为阴性对照。作为实验组的阿瓦斯汀-A22p用0.1％PBST稀释至1.5nM，0.75nM，0.35nM和0.17nM，然后对于每种不同的浓度，将这些溶液在37℃下各处理1小时，并用0.1％PBST洗涤1分钟，重复3次。HRP偶联的抗-kappa轻链抗体用含有5％脱脂乳的0.1％PBST稀释100,000 倍，随后在37℃处理30分钟。之后，反应产物用0.1％PBST洗涤1分钟，重复5次。为了彩色显影，所得产物用TMB HRP比色底物处理，随后在室温下反应10分钟，用相同体积的 1N HCl处理，然后在450nm处测量吸光度。表达和纯化的阿瓦斯汀-A22p与重组人VEGF 165的结合能力通过所获得的ELISA结果进行确认。
相关结果显示于图4中。
如图4所示，阿瓦斯汀-A22p与NRP1结合的水平与用作对照的HCT-A22p相同，并且阿瓦斯汀-A22p与VEGF结合的水平与阿瓦斯汀也相同，这一点得到了证实。
实施例3：阿瓦斯汀-A22p的癌症靶向实验
已知阿瓦斯汀不是一种癌症特异性靶向药物，其与其它抗体药物不一样，因此，阿瓦斯汀需要以高剂量给药以发挥疗效，并且其不仅可分布在癌组织中，而且可分布在具有高水平的VEGF的其它组织中，从而导致不良的副作用。因此，利用NRP1的癌症特异性分布预期可增加癌症靶向效应，以减少剂量，从而增加患者便利性并减少剂量依赖性副作用。本发明人已试图评估阿瓦斯汀-A22p是否能有效靶向癌症。
为了通过靶向存在于肿瘤组织和肿瘤块内的新血管中的NRP1研究阿瓦斯汀-A22p是否比阿瓦斯汀在癌细胞中分布更好，在SW620(从ATCC获得)移植于裸鼠体内之后当肿瘤体积达到约250mm3时，PBS，阿瓦斯汀-A22p或阿瓦斯汀分别以5mg/kg在静脉内施用，并且在经过3，8和16小时后收获肿瘤，并使用荧光显微镜通过免疫组织化学研究了癌组织中蛋白的分布。
更具体地，收获的肿瘤通过石蜡切片法切片成8μm的厚度，且用作为第一抗体的NG2 抗体(Cell Signaling technology,USA)和与Alexa(红色荧光,Life Technologies)偶联的第二抗体对血管周细胞进行染色，其中Alexa识别该NG2抗体。为了观察组织中分布的阿瓦斯汀和阿瓦斯汀-A22p，采用了与
Figure GDA0003535681090000191
488偶联的抗体(绿色荧光，LifeTechnologies)，其中
Figure GDA0003535681090000192
488识别IgG。
相关结果显示于图5中。
如图5所示，证实了从给药后3小时开始，阿瓦斯汀-A22p在肿瘤组织中的浓度高于阿瓦斯汀；随着时间的推移，在远离血管的细胞内也分布着更大量的阿瓦斯汀-A22p；并且，阿瓦斯汀-A22p也有效减少了肿瘤块内的血管生成。
从该荧光显微观察结果来看，可见与阿瓦斯汀相比，阿瓦斯汀-A22p预计将具有优异的癌症靶向能力和组织穿透能力；并且与阿瓦斯汀不同的是，阿瓦斯汀-A22p可通过抑制各种血管生成因子，如VEGF-B，VEGF-C，PIGF以及VEGF-A，而更有效地抑制血管生成。根据这些结果，即使是低剂量的阿瓦斯汀-A22p也能靶向肿瘤，导致副作用减少。进一步地，可以预期的是，由于高穿透能力，阿瓦斯汀-A22p不仅到达靠近血管的癌细胞，而且还到达肿瘤块内的癌组织，并因此抑制这些细胞中分泌的各种血管生成因子的活性，包括VEGF-A，从而抑制细胞***并由此增强抗癌活性。
总而言之，这样的结果证明了由于与其它血管生成因子相比对VEGF-A的相对较低的依赖性，阿瓦斯汀-A22p可用于治疗出现的阿瓦斯汀无反应性病例。
实施例4：阿瓦斯汀-A22p7对周细胞覆盖的影响
在血管生成中，血管生长通过在高VEGF浓度下的细胞***和生长发生，并且然后，随着VEGF浓度降低，PDGF浓度升高，于是发生血管正常化或重建。正常化包含，随着未成熟血管的数量和大小的减少，组织液降低血管压力的过程，此过程由血管周细胞覆盖引起。在通过施用阿瓦斯汀降低VEGF浓度的情况下，血管通过正常化增加周细胞覆盖，以削弱药物对肿瘤组织的渗透。据报道，阿瓦斯汀和多西他赛联合给药于非小细胞肺癌患者降低了药物对肿瘤的渗透(Arjaans et al.,2013)。这个事实表明，阿瓦斯汀和另一种药物的联合给药具有局限性并可能会引起对阿瓦斯汀的耐药性。
根据Fan等人的报告，用阿瓦斯汀连续处理原发性或转移性结直肠癌细胞系三个月导致细胞系适应来自两种细胞系的阿瓦斯汀，并且这些细胞系表现出与现有的细胞系相同的细胞生长，但具有增加的细胞迁移，因此在异种移植物中表现出比现有的癌细胞更快的转移。 VEGFR1和NRP1在这种阿瓦斯汀适应的细胞系中特异性地高表达，然后转化成细胞，所述细胞以较大的数量分泌各种血管生成因子，如VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C和PIGF，以表现出对阿瓦斯汀的耐药性(Fan et al.,2011)。因此，据了解，用能够结合至NRP1的阿瓦斯汀-A22p或阿瓦斯汀-TPP11进行治疗，以抑制包括VEGF-A在内各种血管生成因子的信号传导，将有效抑制显示出阿瓦斯汀耐药性的细胞系的生长和转移。
此外，基于该报告，其中，当抗NRP1抗体和VEGF抑制剂联合给药的时候，通过抗NRP1 抗体的血管周细胞覆盖的减少可直接与通过控制血管正常化的抗癌疗效的提升有关，并可能参与克服耐药性，本发明人在癌组织中实施了一种周细胞覆盖变化的荧光显微比较测试，所述癌组织处于分别施用了阿瓦斯汀和阿瓦斯汀-A22p的异种移植模型中。
为了研究小鼠模型中的阿瓦斯汀-A22p的血管生成和血管稳定抑制能力，SW620被移植于裸鼠体内，然后分别施用阿瓦斯汀-A22p和阿瓦斯汀，并且，通过荧光显微术监测癌组织中的周细胞覆盖。将SW620细胞注射到Balb/c裸鼠后，肿瘤体积达到250mm3左右时，PBS，阿瓦斯汀和阿瓦斯汀-A22p分别以每只小鼠5mg/kg静脉给药。16小时之后，从小鼠收获肿瘤，随后实施免疫组织化学法。通过石蜡切片法将收获的肿瘤切片至8μm的厚度。然后，血管细胞与作为第一抗体的PECAMl(Sigma)和偶联至
Figure GDA0003535681090000211
488的第二抗体染色，其中
Figure GDA0003535681090000212
488识别PECAM1，同时血管周细胞与作为第一抗体的NG2抗体和偶联至
Figure GDA0003535681090000213
594 的第二抗体染色，其中
Figure GDA0003535681090000214
594识别NG2抗体。
相关结果显示于图6中。
如图6所示，证实了相对于血管的周细胞覆盖在阿瓦斯汀-A22p给药组而非阿瓦斯汀给药组中显著降低，因此，通过阿瓦斯汀-A22p的抗癌效果的增加可预计包含在周细胞覆盖中。这些结果与由Genetech公司开发的抗NRP1抗体和阿瓦斯汀联合给药的动物测试结果相同。据证实，通过阿瓦斯汀-A22p的VEGF和NRP1抑制作用类似于通过各自独立的抗体的这些抑制作用。也就是说，可以验证阿瓦斯汀-A22p是双特异性抗体概念中的蛋白质，所述双特异性抗体同时抑制VEGF和NRP1。
这些结果可表明，通过A22p减少周细胞覆盖，阿瓦斯汀-A22p能够提升血管生成抑制作用，并且克服由于阿瓦斯汀的持续给药而产生的耐药性。
实施例5：阿瓦斯汀-A22p的体内抗癌效果的评价
为了研究阿瓦斯汀-A22p的抗癌效果，在结肠癌细胞系SW620异种移植模型上实施了与阿瓦斯汀对比的测试。该SW620细胞系是一种肿瘤细胞系，具有45％的RGI对VEGF，并且此动物实验是为了评估对普通肿瘤的抗癌效果这个目的而进行的。通过预实验可以确认，阿瓦斯汀-A22p显示出了等于或高于阿瓦斯汀的疗效(结果未显示)，并且在该实验里，分别以阿瓦斯汀5mg/kg和阿瓦斯汀-A22p 0.5，1.25，2.5mg/kg的剂量对SW620细胞-异种移植Balb/c-裸鼠静脉给药，每周两次，持续5周。
相关结果显示于图7中。
如图7所示，据证实，阿瓦斯汀5mg/kg给药组和阿瓦斯汀-A22p 1.25mg/kg给药组对癌症生长表现出相似的抑制作用。也就是说，可以看出，即使采用阿瓦斯汀的剂量的四分之一，所述阿瓦斯汀-A22p融合蛋白也能够表现出等同的抗癌疗效。
即使采用阿瓦斯汀的剂量的四分之一，阿瓦斯汀-A22p融合蛋白可表现出等同的抗癌疗效这一事实被认为是由于通过A22p阻断了NRP1信号传导，这表明，通过在临床应用中减少剂量也可降低不良副作用。
实施例6：阿瓦斯汀-A22p对细胞系迁移的抑制作用的验证实验
对阿瓦斯汀产生的耐药性和反应性的原因之一是：作为阿瓦斯汀的靶标的VEGF-A，和其它生长因子，如FGF，缺口配体/受体***，PIGF和PDGF-BB都参与信号传导机制。已知NRP1通过与VEGFR1，VEGFR3，C-met和PDGFR以及结合VEGF-A的VEGFR2一起作为共受体而影响信号传导。本发明人研究了融合阿瓦斯汀的A22p是否用结合NRP1的其它血管生成因子竞争性抑制与NRP1的结合。
通过用阿瓦斯汀连续处理HCT116细胞(从ATCC获得)，HCT116/bev细胞系(由LMEllis，MD anderson提供)已经获得了对阿瓦斯汀的耐药性，将HCT116/bev细胞系分别用阿瓦斯汀和阿瓦斯汀-A22p处理，以研究其迁移抑制能力。与其亲代细胞HCT116相比，HCT116/bev具有更高的VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C和PIGF的表达水平，具有更好的细胞迁移和转移能力(Fan et al.,2011)。于是，如果阿瓦斯汀-A22p抑制HCT116/bev细胞的迁移，则可确认阿瓦斯汀-A22p克服对阿瓦斯汀的耐药性并增加其疗效的可能性。具体的测试方法如下所述。
将HCT116和HCT116/bev细胞分别以4×105个细胞/孔接种于6孔板中，并孵育2天。之后，在每个孔内制作十字形空白。除去培养基，接着加入50ng/ml VEGF，并分配到补充有1％FBS的MEM-α培养基中。阿瓦斯汀和阿瓦斯汀-A22p各处理成1μM。药物治疗后立即拍摄空白(0小时)，并且从48小时开始以2小时的间隔拍摄相同的位置。通过根据图像 J程序产生的拍摄结果计算空的空白的宽度并反量化由此产生的细胞迁移程度，以比较阿瓦斯汀-A22p和阿瓦斯汀的细胞迁移抑制能力。
结果显示于图8中。
如图8所示，通过VEGF处理的HCT116细胞的迁移从51.7％增加到了67.4％，而用阿瓦斯汀和阿瓦斯汀-A22p处理则分别降至61.2％和61.7％的相同水平。与此不同，至于HCT116/bev细胞，即使在不用VEGF处理的组中，HCT116/bev细胞的迁移也为65.3％，这表明HCT116/bev细胞比HCT116细胞更具侵袭性，同时通过VEGF处理的HCT116/bev 细胞的迁移增加至72.9％。据观察，阿瓦斯汀处理的这种迁移为74.1％，其表明迁移没有差异；而阿瓦斯汀-A22p处理的这种迁移为66.2％，其表明迁移被抑制到与无VEGF处理组相同的水平。
无论是否添加VEGF-A，阿瓦斯汀-适应的细胞系——HCT116/bev，与其亲代细胞——HCT116相比显示出增加的迁移的这些结果表明，HCT116/bev的迁移不仅依赖于VEGF-A而且依赖于其它生长因子而增加。该阿瓦斯汀处理并不抑制迁移，而阿瓦斯汀-A22p处理将迁移减少到与没有VEGF-A处理相同的水平。这意味着，阿瓦斯汀-A22p通过其它生长因子以及VEGF-A抑制信号传导，从而表明阿瓦斯汀-A22p可有助于克服阿瓦斯汀耐药性。另外，该结果表明，不仅通过抑制VEGF-A信号传导而且通过抑制其它信号传导过程，阿瓦斯汀-A22p能够促进抗癌作用且降低出现耐药性的可能性。
实施例7：阿瓦斯汀-A22p对PDGF信号传导抑制的评估
NRP1作为PDGF受体的共受体，以通过PDGF增强信号传导。众所周知，PDGF与癌细胞中的其受体的结合增加p130cas蛋白的磷酸化，并且促进癌细胞的迁移和侵袭。本发明人研究了融合阿瓦斯汀的A22p是否通过结合至NRP1抑制PDGF信号传导。
用25μg/ml阿瓦斯汀或阿瓦斯汀-A22p处理U87MG细胞(从ATCC获得)，30分钟后，再用50ng/ml PDGF处理。5分钟后，提取蛋白质，然后使用抗磷酸化p130抗体和抗p130cas 抗体进行p130cas磷酸化的比较。
结果显示于图9中。
如图9所示，证实了通过PDGF增加了p130cas磷酸化，而阿瓦斯汀处理导致了无差异性，但是阿瓦斯汀-A22p处理组中的磷酸化被抑制到载体内的水平。
该结果表明，阿瓦斯汀-A22p去除VEGF-A，并且还通过结合至NRP1抑制PDGF信号传导，并且，阿瓦斯汀-A22p能通过由PDGF抑制迁移和侵袭来增加抗癌作用。
实施例8：制备阿瓦斯汀变体-组织穿透肽(TPP)融合蛋白
为了研究融合蛋白中组织穿透肽(TPP)是否与变体融合，所述变体含有其它抗体药物中频繁修改的序列而同时保留其特性，尝试将能够结合神经毡蛋白1(NRP1)和神经毡蛋白 2(NRP2)的组织穿透肽(TPP)融合至阿瓦斯汀变体肽(下文称之为“阿瓦斯汀(V)”)的C末端，所述阿瓦斯汀变体肽在阿瓦斯汀的氨基酸序列中修改了362和364位氨基酸。
具体地，一种融合蛋白，其中具有SEQ ID：2的氨基酸序列的TPP(A22p)被融合至阿瓦斯汀(V)的C末端，以及产生融合蛋白的细胞系，被分别制备。选择标记DHFR基因被***到pcDNA3.1(-)载体中，并且阿瓦斯汀(V)-A22p的重链和轻链通过限制性内切酶NotI和BamHI被克隆。一个质粒，其编码通过融合每个构建的抗体重恒定区而形成的蛋白，一个肽，其结合至NRP1，以及一个质粒，其编码轻链蛋白，一起使用NeonTM电泳，在CHO DG44细胞中表达为蛋白。在T25烧瓶里，用质粒转染的3X106个细胞被接种，并在37℃下孵育。使用选择标记保护稳定的细胞，然后在无血清SFM4CHO(Hyclone)中以漂浮状态培养7天，培养在100rpm，37℃，pH7.2，50％DO2条件下的生物反应器中进行。上清液通过离心从细胞中被分离出来，并使用0.22μm过滤器进行灭菌。
收集阿瓦斯汀(V)-A22p的培养物，并同时参照标准协议分别纯化蛋白。对于纯化柱，以200cm/h的线速度在XK16/20柱(Mabselect Sure树脂，GE医疗保健)中将蛋白质A 树脂(Mabselect Sure树脂，GE医疗保健)填充至20mL。将1L抗体施加到蛋白质A柱，并且用15倍柱体积的PBS冲洗该柱子(pH 7.4,137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mM KH2PO4)。用100mL 0.1M甘氨酸缓冲液在pH3.0下洗脱抗体。在280nm 的UV吸光度下收集10mAU至10mAU之间的蛋白质，并且使用0.7mL的1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液将60mL的蛋白质中和至pH7.0。用0.2μm过滤器(Millipore)过滤抗体部分，然后用amicon(30MWCO)浓缩器(Millipore)在3,500rpm下浓缩10分钟，随后与含有 10％甘油的PBS缓冲液(pH 7.4)交换。纯化的抗体重链恒定区和所选择的特异性结合至 NRP1的肽融合而成的纯化的融合蛋白，以还原和非还原条件在SDS-PAGE上进行分析。
所述蛋白分别从培养物中纯化，所述培养物收集自表达阿瓦斯汀(V)-A22p和阿瓦斯汀 -A22p的细胞系，并通过SDS-PAGE分离。图10证实了，阿瓦斯汀(V)-A22p成功形成了抗体，并且具有与阿瓦斯汀-A22p相似的分子量。
为了研究阿瓦斯汀(V)-A22p纯化蛋白的纯度，实施了高效液相色谱(HPLC)分析。使用Agilent 1200(安捷伦)，并使用尺寸排阻柱(Biosuite 250，Waters)。
具体地，含有0.2M磷酸钾和0.25M氯化钾的缓冲溶液(pH6.2)被用作流动相，并使其以0.35ml/min的流速向下流动20分钟。根据保留时间检查蛋白的尺寸，并根据面积和高度检查其纯度。
在图11中，使用SE-HPLC分析阿瓦斯汀(V)-A22p的纯度。据证实，阿瓦斯汀(V) -A22p的纯度为97％以上(图11A)，其与阿瓦斯汀-A22p的纯度相同(图11B)。
随后，本发明人制备了阿瓦斯汀(V)-A22p融合蛋白并评估了其活性，在所述阿瓦斯汀 (V)-A22p融合蛋白中，具有由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的作为TPP的A22p被融合至阿瓦斯汀(V)。
实施例9：阿瓦斯汀(V)-组织穿透肽(TPP)融合蛋白对NRP1和VEGF的结合能力
为了评估如实施例8中制备的融合蛋白阿瓦斯汀(V)-A22p的N末端是否可以与阿瓦斯汀相同的方式与VEGF结合，同时其C末端可与NRP1结合，从而双重阻断相关的信号传导，分别评估阿瓦斯汀(V)-A22p与NRP1和VEGF的结合。
以酶联免疫吸附测定(ELIA)考察了纯化的阿瓦斯汀(V)-A22p与神经毡蛋白1-b1b2 结构域的结合能力。使用阿瓦斯汀-A22p作为阳性对照。靶分子神经毡蛋白1-b1b2结构域(273-586)在96孔Maxibinding免疫板(SPL Life sciences.,Korea)中以1μg/孔在37℃下反应2h，然后，用0.1％PBST(0.1％Tween20，pH 7.4，137mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa2HPO4，2mM KH2PO4)洗涤1分钟，重复3次。与含有5％脱脂乳的0.1％PBST反应1 小时后，用0.1％PBST洗涤反应产物1分钟，重复3次。作为实验组的阿瓦斯汀(V)-A22p 用0.1％PBST稀释至50nM，25nM和12.5nM，然后对于每种不同的浓度，将这些溶液在 37℃下各处理1小时，并用0.1％PBST洗涤1分钟，重复3次。HRP偶联的抗-kappa轻链抗体(Horseradishperoxidase-conjugated anti-human kappa light chain mAb, SIGMA-ALDRICH Co.,USA)用含有5％脱脂乳的0.1％PBST稀释100,000倍，随后在37℃处理30分钟。之后，反应产物用0.1％PBST洗涤1分钟，重复5次。为了彩色显影，所得产物用TMB HRP比色底物(Surmodics co.,USA)处理，随后在室温下反应10分钟，用相同体积的1N HCl(终止缓冲液)处理，然后在450nm处测量吸光度。表达和纯化的阿瓦斯汀(V)-A22p与神经毡蛋白1-b1b2结构域的结合能力通过所获得的ELISA结果进行确认。
纯化的阿瓦斯汀(V)-A22p与重组人VEGF 165(R&D systems co.China)的结合能力在ELISA中进行研究。使用阿瓦斯汀-A22p作为阳性对照。靶分子重组人VEGF 165在96 孔Maxibinding免疫板中以0.2μg/孔在37℃下反应2h，然后用0.1％PBST洗涤1分钟，重复3次。与含有5％脱脂乳的0.1％PBST反应1小时后，反应产物用0.1％PBST洗涤1分钟，重复3次。作为实验组的阿瓦斯汀(V)-A22p用0.1％PBST稀释至6.25nM，3.12nM 和1.56nM，然后对于每种不同的浓度，将这些溶液在37℃下各处理1小时，并用0.1％PBST 洗涤1分钟，重复3次。HRP偶联的抗-kappa轻链抗体用含有5％脱脂乳的0.1％PBST稀释100,000倍，随后在37℃处理30分钟。之后，反应产物用0.1％PBST洗涤1分钟，重复 5次。为了彩色显影，所得产物用TMB HRP比色底物处理，随后在室温下反应10分钟，用相同体积的1N HCl处理，然后在450nm处测量吸光度。表达和纯化的阿瓦斯汀(V)-A22p 与重组人VEGF 165的结合能力通过所获得的ELISA结果进行确认。
结果显示于图12中。
如图12所示，阿瓦斯汀(V)-A22p与NRP1结合的水平与用作对照的阿瓦斯汀-A22p相同(图12A)，并且阿瓦斯汀(V)-A22p与VEGF结合的水平与阿瓦斯汀-A22p也相同(图12B)，这一点得到了证实。
工业实用性
用于治疗癌症或血管生成相关疾病的所述药物组合物包含作为有效成分的融合蛋白，所述融合蛋白通过融合组织穿透肽和抗血管生成剂而获得；所述药物组合物可以改善抗血管生成剂的肿瘤渗透性，并且发挥癌症靶向作用，从而即使以小剂量也可表现出优异的治疗效果，并因此减少抗血管生成剂的副作用，同时通过同时结合血管生成生长因子和NRP1,甚至在对抗血管生成剂具有耐药性的癌症或血管生成相关疾病中也显示出优异的治疗效果。因此，本发明在工业上是高度适用的。
<110> 日东制药株式会社
<120> 用于预防和治疗癌症或血管生成相关疾病的药物组合物，其含有作为有效成分的融合蛋白，该融合蛋白融合了肿瘤穿透肽和抗血管生成剂
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His Thr Pro Gly Asn Ser Asn Lys Trp Lys His Leu Gln Glu Asn Lys
1 5 10 15
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Arg Glu Ala Pro Gly Ala Pro Arg Ser Pro Glu Pro Gln Asp Gln Lys
1 5 10 15
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser His Thr Pro Gly Asn Ser Asn Lys Trp Lys His Leu
465 470 475 480
Gln Glu Asn Lys Lys Gly Arg Pro Arg Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
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Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
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Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
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225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
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Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
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Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
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Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser His Thr Pro Gly Asn Ser Lys Pro Thr Arg Thr Pro
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Arg Arg
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser His Thr Pro Gly Asn Ser Asn Lys Trp Lys His Leu
465 470 475 480
Gln Glu Asn Lys Lys Gly Arg Pro Arg Arg
485 490
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Avastin-HC
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
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195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
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Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
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Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
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Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
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Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
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Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
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Leu Ser Pro Gly Lys
450

Claims (13)

1.一种用于治疗癌症或血管生成相关疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含作为有效成分的融合蛋白，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管内皮生长因子剂而获得；
所述肿瘤穿透肽包括选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：7的任一种氨基酸序列；
所述抗血管内皮生长因子剂选自由以下组成的组：兰尼单抗，贝伐单抗，阿柏西普，康柏西普，r84，CT01，DOM15-10-11，DOM15-26-593，PRS-050，CT-322，ESBA903和EPI-0030。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述癌症或血管生成相关疾病是对抗血管管内皮生长因子剂有耐药性的或无反应的。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述肿瘤穿透肽同时结合神经毡蛋白1和神经毡蛋白2，或者仅特异性结合神经毡蛋白1。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，同时结合神经毡蛋白1和神经毡蛋白2的所述肿瘤穿透肽包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4的氨基酸序列，而仅特异性结合神经毡蛋白1的所述肿瘤穿透肽包含选自SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述肿瘤穿透肽和一种抗血管内皮细胞生长因子通过一种连接肽融合。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述连接肽包含由SEQ ID NO：8表示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述融合蛋白包含：由选自SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12中的任何一条氨基酸序列表示的重链，和由SEQ IDNO：11的氨基酸序列表示的轻链。
8.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述血管生成相关疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎，牛皮癣，炎症，子宫内膜异位症和血管瘤。
9.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述癌症选自由以下组成的组：鳞状细胞癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌，肺鳞状细胞癌，腹膜癌，皮肤癌，皮肤或眼内黑色素瘤，直肠癌，肛周癌，食道癌，小肠癌，内分泌腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，慢性或急性白血病，淋巴细胞性淋巴瘤，肝细胞瘤，胃肠癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，***，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞腺瘤，乳腺癌，结肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺肿瘤，肾癌，***癌，外阴癌，甲状腺癌，以及头颈癌。
10.一种用于抑制癌症转移的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含作为有效成分的融合蛋白，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管内皮生长因子剂而形成；
所述肿瘤穿透肽包括选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：7的任一种氨基酸序列；
所述抗血管内皮生长因子剂选自由以下组成的组：兰尼单抗，贝伐单抗，阿柏西普，康柏西普，r84，CT01，DOM15-10-11，DOM15-26-593，PRS-050，CT-322，ESBA903和EPI-0030。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述癌症对抗血管内皮生长因子剂是耐药性的或无反应的。
12.融合蛋白用于制备治疗癌症或血管生成相关疾病的药剂的用途，所述融合蛋白通过融合肿瘤穿透肽和抗血管内皮生长因子剂而形成；
所述肿瘤穿透肽包括选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：7的任一种氨基酸序列；
所述抗血管内皮生长因子剂选自由以下组成的组：兰尼单抗，贝伐单抗，阿柏西普，康柏西普，r84，CT01，DOM15-10-11，DOM15-26-593，PRS-050，CT-322，ESBA903和EPI-0030。
13.融合蛋白用于制备用于抑制癌症转移的药剂的用途，所述融合蛋白中的肿瘤穿透肽和抗血管内皮生长因子剂融合；
所述肿瘤穿透肽包括选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：7的任一种氨基酸序列；
所述抗血管内皮生长因子剂选自由以下组成的组：兰尼单抗，贝伐单抗，阿柏西普，康柏西普，r84，CT01，DOM15-10-11，DOM15-26-593，PRS-050，CT-322，ESBA903和EPI-0030。
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