CN108342478A - 循环肿瘤细胞代谢分型标志物及其应用 - Google Patents

循环肿瘤细胞代谢分型标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了循环肿瘤细胞代谢分型标志物的应用，包括磷酸甘油酸激酶1PGK1和6‑磷酸葡萄糖脱氢酶G6PD。是从代谢活性的角度对循环肿瘤细胞(CTCs)进行功能分型，能更好地反映CTCs的变化趋势和生物学行为。在***癌标本的验证结果表明与EMT分型相比，GM+CTCs亚型与肿瘤转移更为相关，并可作为肿瘤转移的辅助诊断标志物。因此，CTCs糖代谢分型是对CTCs计数和EMT表型分型的重要补充，可为临床疾病评估提供有益信息，在肿瘤转移诊断和监测中有良好的应用前景。

Description

循环肿瘤细胞代谢分型标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，特别涉及一种循环肿瘤细胞代谢分型标志物的应用。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTCs)的分子生物学分析主要是对肿瘤特异标志物的表达及突变的检测分析，包括细胞形态学表型标志物(如EpCAM/CKs/Vimentin/Twist)、肿瘤干细胞标志物(如CD44/CD133/ALDH1)、组织类型特异标志物(如ER/PSA/ERCC1)及药物靶标(如EGFR/ALK/VEGF)等。在CTCs分离计数的基础上，CTCs的特征分析能进一步提供与源肿瘤发生发展相关的信息，对肿瘤的临床诊疗有重要意义。近来最受关注的是CTCs的上皮-间质转化(EMT)表型检测，即利用EMT相关的分子标志物将CTCs分为上皮型、混合型和间质型三种亚型。EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，是恶变的肿瘤细胞迁移和播散的重要环节，因此与上皮型CTCs相比，混合型和间质型CTCs被认为与肿瘤的转移和不良预后更为相关。但是，EMT是一个动态转变的过程，且血液中的CTCs在到达合适的定植部位时可以发生间质-上皮转化(MET)，因而增加了CTCs的表型异质性，即根据EMT标志物鉴定的同一种亚型CTCs可能具有不同的变化趋势和转归结局。这种转归不确定性给CTCs亚型分析的结果解读带来了挑战，从而限制了CTCs分子生物学检测的临床应用。因此，亟需发展新的CTCs分子分型方法和标志物，建立更为明确的CTCs亚型和肿瘤发生发展特点之间的关联，以促进CTCs检测的扩大应用。
代谢重编程是肿瘤细胞的重要特征之一，与肿瘤的发生和转移密切相关。肿瘤细胞糖代谢主要特点是有氧糖酵解异常活跃，此外还有磷酸戊糖途径和谷氨酰胺代谢增强等。代谢重编程对肿瘤的作用一方面是，能量代谢为肿瘤细胞的生长和快速增殖提供必需的ATP和生物大分子；另一方面，旺盛的能量代谢及相关的细胞信号激活与肿瘤的迁移性和侵袭性密切相关。糖代谢的异常调节对肿瘤细胞的生物学行为有决定性作用，上调的代谢酶和活跃的信号通路可以参与诱导肿瘤细胞的增殖、失巢凋亡抵抗、免疫逃逸、血管新生等，从而促进肿瘤的转移。因此，检测CTCs的糖代谢特征和代谢亚型可以实现对CTCs代谢活性的分析，有助于判断CTCs的变化趋势和转归进而评估特定亚型CTCs的功能，从而弥补静态的CTCs形态学表型分析在临床解释方面的不足，促进CTCs分子特征分析在肿瘤转移诊断和评估中的应用。
发明内容
本发明的首要目的在于提供***癌循环肿瘤细胞代谢分型标志物的应用。
本发明另一目的在于提供一种循环肿瘤细胞糖代谢分型方法。
本发明所采取的技术方案是：
磷酸甘油酸激酶1PGK1和6-磷酸葡萄糖脱氢酶G6PD同时作为循环肿瘤细胞糖代谢分型标志物的应用。
定量检测PGK1和G6PD的试剂在制备循环肿瘤细胞糖代谢分型试剂盒中的应用。
进一步的，上述定量检测PGK1和G6PD的试剂选自检测PGK1和G6PD的探针、检测PGK1和G6PD的定量PCR引物中的至少一种。
一种循环肿瘤细胞糖代谢分型标志物，其为PGK1和G6PD。
一种循环肿瘤细胞糖代谢分型的方法，包括以下步骤：分别定量检测多份循环肿瘤细胞样本中的参考基因TBP、TFRC、B2M的表达水平，将所有表达水平检测结果中的第25百分位数作为判断标准，记为P25；用相同的定量检测方法检测循环肿瘤细胞中PGK1和G6PD的表达水平，若PGK1和G6PD的总表达水平＞P25，该循环肿瘤细胞记为GM+亚型；若PGK1和G6PD的总表达水平≤P25，该循环肿瘤细胞记为GM-亚型。
进一步的，所述定量检测方法包括RNA原位杂交技术、RT-qPCR、基因芯片检测、测序。
进一步的，用于检测参考基因表达水平的循环肿瘤细胞样本份数不少于8份。
定量检测PGK1和G6PD的试剂在制备肿瘤转移辅助诊断或诊断试剂盒中的应用。
进一步的，所述的肿瘤为***瘤。
一种肿瘤转移辅助诊断试剂盒，该试剂盒中含用定量检测PGK1和G6PD的试剂。
本发明的有益效果是：
本发明是从代谢活性的角度对循环肿瘤细胞(CTCs)进行功能分型，能更好地反映CTCs的变化趋势和生物学行为。在***癌标本的验证结果表明与EMT分型相比，GM+CTCs亚型与肿瘤转移更为相关，并可作为肿瘤转移的辅助诊断标志物。因此，CTCs糖代谢分型可为临床疾病评估提供很好的价值。
附图说明
图1是糖代谢功能分类芯片筛选PC-3M 2B4和PC-3M 1E8差异表达基因的结果；
图2是PGK1和G6PD在5种***癌细胞中的mRNA表达水平(*P＜0.05)；
图3是PGK1和G6PD在5种***癌细胞中的蛋白表达水平(*P＜0.05：PC-3M 2B4和PC-3M 1E8组间比较；#P＜0.05：LNCAP，PC-3及DU145组间比较)；
图4是无转移和有转移***癌患者的GM+CTCs和H-CTCs数量；
图5是应用单独CTCs分型及联合tPSA和Gleason评分诊断转移与无转移***癌的ROC曲线。
具体实施方式
磷酸甘油酸激酶1PGK1和6-磷酸葡萄糖脱氢酶G6PD同时作为循环肿瘤细胞糖代谢分型标志物的应用。
定量检测PGK1和G6PD的试剂在制备循环肿瘤细胞糖代谢分型试剂盒中的应用。
优选的，上述定量检测PGK1和G6PD的试剂选自检测PGK1和G6PD的探针、检测PGK1和G6PD的定量PCR引物中的至少一种。
一种循环肿瘤细胞糖代谢分型标志物，其为磷酸甘油酸激酶1PGK1和6-磷酸葡萄糖脱氢酶G6PD。
一种循环肿瘤细胞糖代谢分型的方法，包括以下步骤：分别定量检测多份循环肿瘤细胞样本中的参考基因TBP、TFRC、B2M的表达水平，将所有表达水平检测结果中的第25百分位数作为判断标准，记为P25；用相同的定量检测方法检测循环肿瘤细胞中PGK1和G6PD的表达水平，若PGK1和G6PD的总表达水平＞P25，该循环肿瘤细胞记为GM+亚型；若PGK1和G6PD的总表达水平≤P25，该循环肿瘤细胞记为GM-亚型。
优选的，所述定量检测方法包括RNA原位杂交技术、RT-qPCR、基因芯片检测、测序。
优选的，用于检测参考基因表达水平的循环肿瘤细胞样本份数不少于8份。
定量检测PGK1和G6PD的试剂在制备肿瘤转移辅助诊断或诊断试剂盒中的应用。
优选的，上述定量检测PGK1和G6PD的试剂选自检测PGK1和G6PD的探针、检测PGK1和G6PD的定量PCR引物中的至少一种。
优选的，所述的肿瘤为***瘤。
一种肿瘤转移辅助诊断试剂盒，该试剂盒中含用定量检测PGK1和G6PD的试剂。
优选的，上述定量检测PGK1和G6PD的试剂选自检测PGK1和G6PD的探针、检测PGK1和G6PD的定量PCR引物中的至少一种。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1肿瘤转移相关糖代谢标志物的筛选与鉴定
1.材料及方法：
(1)细胞株：PC-3M 2B4，PC-3M 1E8，LNCAP，PC-3，DU145细胞。其中PC-3M 2B4和PC-3M 1E8是一对基因背景同源的***癌低转移和高转移细胞株，购于中国医学科学院细胞中心；LNCAP，PC-3和DU145是三种常用的***癌细胞株，其转移能力依次增强，购于中科院典藏细胞库。
(2)培养基及胎牛血清：购于广州鑫邦生物科技有限公司(Gibco生产)。其中DMEM培养基用于培养***癌PC-3M 2B4，PC-3M 1E8及PC-3细胞；RPMI 1640培养基用于培养***癌LNCAP和DU145细胞；培养时添加10％胎牛血清。
(3)基因芯片分析：用于检测***癌低转移细胞PC-3M 2B4和高转移细胞PC-3M1E8的糖代谢基因谱以筛选差异表达基因。糖代谢功能分类芯片类型为RT2ProfilerTM PCRArray Human Glucose Metabolism(PAHS-006Z)，购于上海康成生物有限公司。两种细胞各3皿(共6个样本)采用经典的Trizol法抽提6个细胞样品的总RNA，经氯仿萃取、异丙醇沉淀精提、75％乙醇洗涤后，干燥得到RNA样品并用适量的DEPC水溶解。随后，利用DNase I消化样品以去除其中可能含有的基因组DNA，并纯化RNA样本以检测样本的质量是否合格。提取纯化后的合格RNA样品经逆转录合成cDNA后再用功能分类芯片进行检测，按照标准说明书操作。
(4)实时荧光定量聚合酶链式扩增(qRT-PCR)：用于验证芯片筛选基因在5种***癌细胞中的mRNA表达水平。RNA提取及扩增相关试剂盒购于广州瑞真生物科技有限公司(Takara生产)。提取常规培养的PC-3M 2B4，PC-3M 1E8，LNCAP，PC-3及DU145细胞的RNA，纯化后经逆转录和qRT-PCR检测芯片差异基因的表达水平，以内参基因ACTB的表达水平对检测结果做标准化处理。PGK1，G6PD及ACTB的扩增引物如下：
PGK1-F:TGGACGTTAAAGGGAAGCGG(SEQ ID NO:1)，
PGK1-R:GCTCATAAGGACTACCGACTTGG(SEQ ID NO:2)；
G6PD-F:CGAGGCCGTCACCAAGAAC(SEQ ID NO:3)，
G6PD-R:GTAGTGGTCGATGCGGTAGA(SEQ ID NO:4)；
ACTB-F:CATGTACGTTGCTATCCAGGC(SEQ ID NO:5)，
ACTB-R:CTCCTTAATGTCACGCACGAT(SEQ ID NO:6)。
(5)蛋白质免疫印记分析(Western blot)：用于验证芯片筛选基因在5种***癌细胞中的蛋白表达水平。蛋白提取、定量及分离检测相关试剂购于广州鑫邦生物科技有限公司(凯基、Sigma生产)。PGK1，G6PD及内参蛋白ACTB的特异性一抗及标记二抗购于广州鑫邦生物科技有限公司(ABclonal生产)。提取5种细胞的总蛋白，经定量检测后取30ug蛋白用SDS-PAGE电泳进行分离，并转移到PVDF膜。经5％脱脂奶粉封闭、一抗孵育、二抗孵育后用化学发光试剂盒检测蛋白条带，并用Image J软件分析蛋白表达水平。
2.结果
(1)糖代谢标志物的芯片筛选
如图1所示，基因芯片分析筛选***癌高转移细胞株PC-3M 1E8和低转移细胞株PC-3M 2B4中差异表达的糖代谢基因共68个，其中PC-3M 1E8细胞与PC-3M 2B4细胞相比表达上调的基因51个、表达下调的基因17个。利用生物信息学对这些差异表达基因进行功能通路分析，结果表明它们主要是与细胞糖酵解、磷酸戊糖途径及三羧酸循环过程相关的酶和调控分子，表1列举了芯片筛选的部分差异表达基因，其他差异表达基因涉及到其他正在进行的项目研究，未列出。
表1.芯片筛选的部分差异表达基因
注：P<0.05时差异有统计学意义。
(2)芯片筛选结果验证
利用qRT-PCR和western blot对芯片结果进行验证，检测上调的基因在5种细胞中的mRNA及蛋白表达水平，结果显示与芯片筛选结果相似。其中基因PGK1和G6PD在转移能力较强的细胞(PC-3M 1E8，DU145)中的表达水平明显高于转移能力较弱的细胞(PC-3M 2B4，PC-3，LNCAP)，如图2和图3所示。
实施例2CTCs糖代谢分型
1.材料和方法
(1)CTCs分离及鉴定：CanPatrol CTCs分离试剂盒，购于广州益善生物技术公司。采集肿瘤患者5mL抗凝静脉血，裂解红细胞后用微孔膜过滤技术根据白细胞和CTCs大小的差异进行CTCs的分离富集。利用DAPI染料细胞核染色和CD45检测探针对滤膜上富集的CTCs进行荧光标记，结合细胞核的异型性特征和CD45表达阴性鉴定CTCs。
(2)CTCs糖代谢分型：
1)合成检测PGK1和G6PD的探针，靶向PGK1和G6PD的检测探针由Invitrogen公司设计合成，序列如下：
PGK1的探针(本实施例检测时使用以下这些探针的混合物以便提高检测灵敏度；实际上也可以有其他的探针设计及组合方式)：
PGK1-1：AGCTGAAGCTGCGGCTGAAG(SEQ ID NO:7)，
PGK1-2：GAGAAGCGCGCGTAGAAGTC(SEQ ID NO:8)，
PGK1-3：CAGGAACTGCTTCATGGAGA(SEQ ID NO:9)，
PGK1-4：AACTCTTGCCGCAGAAACAT(SEQ ID NO:10)，
PGK1-5：AATAGCTTTAGCATCCTCAG(SEQ ID NO:11)，
PGK1-6：ATGTTCTTCTAGGCCTTTCA(SEQ ID NO:12)，
PGK1-7：GCATAAACTAGAGACCTGCA(SEQ ID NO:13)，
PGK1-8：TAAAGATCATCTTGCAGGCC(SEQ ID NO:14)；
G6PD的探针(本实施例检测时使用以下这些探针的混合物以便提高检测灵敏度；实际上也可以有其他的探针设计及组合方式)：
G6PD-1：GAAGTGTACGACCGTTTCCG(SEQ ID NO:15)，
G6PD-2：AAAAGCTCTTCCCGCAGGAT(SEQ ID NO:16)，
G6PD-3：CGACTGATGGAAGGCATCGC(SEQ ID NO:17)，
G6PD-4：CACCAGATGGTGGGGTAGAT(SEQ ID NO:18)，
G6PD-5：ACGATGAAGGTGTTTTCGGG(SEQ ID NO:19)，
G6PD-6：AGGAGTTGCGGGCAAAGAAG(SEQ ID NO:20)，
G6PD-7：TAGGAGGCTGCATCATCGTA(SEQ ID NO:21)，
G6PD-8：CATTCATGTGGCTGTTGAGG(SEQ ID NO:22)。
2)利用上述探针和RNA原位杂交技术，检测PGK1和G6PD混合标志物同时在外周血CTCs中的表达水平。具体操作为：富集的CTCs经固定、透化、消化、杂交、信号放大等步骤后，用荧光显微镜扫描分析代谢标志物的表达水平，根据荧光信号区分CTCs的糖代谢亚型。首先，采用RNA原位杂交技术，对100份CTCs样本中参考基因TBP，TFRC及B2M的荧光信号分别进行检测，检测参考基因TBP，TFRC及B2M的探针数与PGK1和G6PD的探针数相同，在本实施例中均为8条探针(实际操作中不局限于8条探针，只要RNA原位杂交检测效果满足要求即可)。用荧光显微镜分别对100份CTCs样本中参考基因TBP，TFRC及B2M进行荧光信号检测后，获得300份荧光信号强度值。然后，以其中第25百分位数(P25)作为判断代谢基因PGK1和G6PD表达水平的标准，本例中P25为5。当荧光显微镜扫描分析样品中PGK1和G6PD的总信号强度＞5(即P25)，记为GM+CTCs亚型；当PGK1和G6PD的总信号强度≤5(P25)，记为GM-CTCs亚型。
已知TBP，TFRC及B2M基因在CTCs中的水平分别为低表达，中度表达和高表达，因此将它们作为参考基因。其他定量方法(如RT-qPCR、基因芯片检测、测序等定量检测方法)的结果判断标准也可以以此类推，即以这些基因的在对应方法检测结果的P25为参考，代谢基因检测结果＞P25时记为GM+亚型。
2.结果
CTCs检测结果的判读：首先以根据现在方法分离及鉴定出CTCs，具体方法包括根据细胞大小和白细胞标志CD45判断，如果细胞较小或CD45阳性则判断不是CTCs；其次以细胞核形态判定，CTCs细胞核经DAPI染色后呈现明显深浅不均匀的细胞核纹路，而非特异性的杂质呈均匀的蓝色。
根据糖代谢标志物的表达情况将CTCs分为GM+CTCs(PGK1和G6PD的总信号强度＞5(P25)为阳性)和GM-CTCs(总信号强度≤5(P25)为阴性)两种亚型，即为CTCs的糖代谢分型。
实施例3CTCs的糖代谢分型与肿瘤转移的相关性
1.材料和方法
(1)招募病理诊断为***癌的患者48例，其中伴发转移者26例，无转移者22例。经患者知情同意，采集5mL外周血利用上述方法检测CTCs数目及其糖代谢亚型。
(2)同时检测CTCs的EMT表型分型情况，利用经典的EMT分型标志物(E标志EpCAM/CKs和M标志Vimentin/Twist)将CTCs分为上皮型(E-CTCs)，混合型(H-CTCs)和间质型(M-CTCs)，检测试剂盒购于广州益善生物技术公司。
(3)比较转移与无转移患者CTCs糖代谢分型及EMT亚型的特点，用拟合受试者工作特征(ROC)曲线评价CTCs分型在判别***癌转移中的临床价值。
2.结果
有转移和无转移的***癌患者的总CTCs中位数分别为5个/5mL(IQR 2-8)和2个/5mL(IQR 0-3)，P＝0.001，两组的GM+CTCs检出率为80.8％和45.4％。
如图4所示，有转移的患者GM+CTCs中位数为2个/5mL(IQR 1-4)，显著高于无转移患者的GM+CTCs的中位数0个/5mL(IQR 0-2)，P＝0.003；有转移和无转移患者的H-CTCs中位数分别为2个/5mL(IQR 1-5)和1个/5mL(IQR 0-2)，P＝0.008；但有转移和无转移两组中E-CTCs和M-CTCs的数量无显著差异(P＞0.05)。这些结果表明GM+CTCs和H-CTCs的水平与***癌转移密切相关。
进一步用ROC曲线模拟CTCs亚型在判别有转移与无转移***癌中的诊断价值。以曲线下面积(AUC)评价，AUC为0.7-0.9时表示具有中等程度的诊断准确性，AUC大于0.9则表示具有较高的准确性。
tPSA，总***特异抗原，是***癌诊断的首选血清标志物，也与肿瘤进展和术后复发转移密切相关。其现有的检测方法是：采集病人静脉血4mL，3500rpm离心10min后用西门子全自动化学发光免疫分析仪检测血清tPSA浓度。检测原理为双抗体夹心法，具体步骤参照第3版全国临床检验操作规程(叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程.第3版.中华人民共和国***医司.2006.)。
Gleason评分，是现有***腺癌组织学分级的方法，通过对活检或手术取得的腺癌组织做切片病理学检查，根据腺体特征判断Gleason评分及预后分级。具体评分方法参考2016版WHO泌尿***和***官肿瘤分类(MochH,HumphreyPA,UlbrightTM,et al.WHOclassification of tumours of the urinary system and male genital organ[M].Lyon:IARC Press,2016.)。
如图5所示，分别单独使用H-CTCs和GM+CTCs时AUC分别为0.721和0.745，联合使用tPSA和GM+CTCs检测时AUC为0.848，而同时使用三联标志物tPSA-Gleason评分-GM+CTCs检测时AUC可达0.922，三联标志物tPSA-Gleason评分-GM+CTCs的灵敏度和特异度分别为84.6％和90.9％。这些结果表明GM+CTCs可作为良好的***癌转移的辅助诊断标志物，并且与tPSA、Gleason评分联合使用时AUC可达0.922，具有较高的准确性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学南方医院
<120> 循环肿瘤细胞代谢分型标志物及其应用
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Claims (10)

1.磷酸甘油酸激酶1PGK1和6-磷酸葡萄糖脱氢酶G6PD同时作为循环肿瘤细胞糖代谢分型标志物的应用。
2.定量检测PGK1和G6PD的试剂在制备循环肿瘤细胞糖代谢分型试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，定量检测PGK1和G6PD的试剂选自检测PGK1和G6PD的探针、检测PGK1和G6PD的定量PCR引物中的至少一种。
4.一种循环肿瘤细胞糖代谢分型标志物，其为PGK1和G6PD。
5.一种循环肿瘤细胞糖代谢分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：分别定量检测多份循环肿瘤细胞样本中的参考基因TBP、TFRC、B2M的表达水平，将所有表达水平检测结果中的第25百分位数作为判断标准，记为P25；用相同的定量检测方法检测循环肿瘤细胞中PGK1和G6PD的表达水平，若PGK1和G6PD的总表达水平＞P25，该循环肿瘤细胞记为GM+亚型；若PGK1和G6PD的总表达水平≤P25，该循环肿瘤细胞记为GM-亚型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述定量检测方法包括RNA原位杂交技术、RT-qPCR、基因芯片检测、测序。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，用于检测参考基因表达水平的循环肿瘤细胞样本份数不少于8份。
8.定量检测PGK1和G6PD的试剂在制备肿瘤转移辅助诊断或诊断试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为***瘤。
10.一种肿瘤转移辅助诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含用定量检测PGK1和G6PD的试剂。
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