CN108339119A - miR-146a及其靶点在治疗骨关节炎中的应用 - Google Patents
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Abstract
公开了miR‑146a及其靶点在治疗骨关节炎中的应用。具体而言，提供了选自以下的一种或任意多种试剂的组合在制备促进软骨合成用的药物或在制备治疗或缓解骨关节炎用的药物中的应用：(a)下调miR‑146a的表达或活性的试剂；(b)上调Camk2d的表达或活性的试剂；(c)上调Ppp3r2的表达或活性的试剂；和(d)上调NAFT信号通路中的分子的表达或活性的试剂。
Description
技术领域
本发明涉及miR-146a及其靶点在治疗骨关节炎中的应用。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种最常见的退行性关节疾病，主要涉及软骨及周边组织。除了关节软骨的损伤丢失，软骨下骨结构重建(remodeling)、关节边缘骨赘形成、韧带松弛、关节周围肌肉弱化等都是OA的基本特征；滑膜炎也时有发生。OA通常导致患者关节疼痛、肿胀、僵硬化，严重妨碍患者的工作，是导致老年人下肢残疾的主要原因之一。
到目前为止，治疗OA的目的仅仅是缓解OA带来的疼痛，而非根治OA。当前OA治疗的指导方针建议综合使用药物和非药物的治疗方案。药物治疗包括使用扑热息痛，口服或局部用非甾体抗炎药,阿片类药物和皮质类固醇注射。非药物治疗包括物理疗法、针刺疗法以及使用助行器等手段。但是，关节内注射皮质类固醇通常会造成短寿；而非甾体抗炎药和阿片类药物有明显的副作用，尤其是在老年人群中。因此，目前仍然缺乏真正安全的治疗OA疼痛的手段。手术是缓解OA晚期病人疼痛的最后的治疗方法。手术通常是用称之为“假体”的人工关节来取代被影响的关节。人工关节一般可以维持10-15年甚至更长。然而，这些假体有限的使用寿命使其并不能满足日益增长的OA病人尤其是年轻患者的需要。
微小RNA(miRNA)在调节机体发育和分化过程中起着重要的作用；然而，人们对其在软骨内稳态维持及OA发育中的病理生理学作用所知甚少。
发明内容
本申请第一方面提供选自以下的一种或任意多种试剂的组合在制备促进软骨合成用的药物或在制备治疗或缓解骨关节炎中的药物中的应用：
(a)下调miR-146a的表达或活性的试剂；
(b)上调Camk2d的表达或活性的试剂；
(c)上调Ppp3r2的表达或活性的试剂；和
(d)上调NAFT信号通路中的分子的表达或活性的试剂。
在一个或多个实施方案中，所述试剂为核酸分子、碳水化合物、脂类或小分子化合物。
在一个或多个实施方案中，所述下调miR-146a的表达的试剂为敲除细胞中的miR-146a的打靶载体。
在一个或多个实施方案中，所述下调miR-146a的表达的试剂为miR-146a抑制剂，如表达miR-146a的反义互补序列的病毒。
在一个或多个实施方案中，所述上调Camk2d表达的试剂为Camk2d的表达载体。
在一个或多个实施方案中，所述上调Ppp3r2的表达的试剂为Ppp3r2的表达载体。
在一个或多个实施方案中，所述NAFT信号通路分子选自NAFT1和NAFT2。
在一个或多个实施方案中，所述上调NAFT信号通路中的分子的表达的试剂为所述分子的表达载体。
在一个或多个实施方案中，所述骨关节炎为衰老引起的自发性骨关节炎、关节不稳定诱导的骨关节炎、前交叉韧带撕裂诱导的骨关节炎或部分内侧半月板切除及内侧副韧带横断诱导的骨关节炎。
本申请第二方面提供一种以下试剂中的一种或多种在制备监测软骨合成或骨关节炎用的试剂盒的应用：
(a)用于检测miR-146a表达水平的试剂；
(b)用于检测Camk2d表达水平的试剂；
(c)用于检测Ppp3r2表达水平的试剂；和
(d)用于检测NAFT信号通路分子的表达水平的试剂。
在一个或多个实施方案中，所述用于检测Camk2d表达水平的试剂包括检测Camk2dmRNA水平过程中使用到的试剂和检测Camk2d蛋白含量过程中使用到的试剂。
在一个或多个实施方案中，所述用于检测Ppp3r2表达水平的试剂包括检测Ppp3r2mRNA水平过程中使用到的试剂和检测Ppp3r2蛋白含量过程中使用到的试剂。
在一个或多个实施方案中，所述用于检测NAFT信号通路分子表达水平的试剂包括检测NAFT信号通路分子mRNA水平过程中使用到的试剂和检测NAFT信号通路分子蛋白含量过程中使用到的试剂。
本申请第三方面提供一种促进软骨合成或治疗骨关节炎的方法，所述方法包括以下任一个或任意多个步骤的组合：
(a)下调对象中miR-146a的表达或活性的步骤；
(b)上调对象中Camk2d的表达或活性的步骤；
(c)上调对象中Ppp3r2的表达或活性的步骤；和
(d)上调对象中NAFT信号通路中的分子的表达或活性的步骤。
在一个或多个实施方案中，所述方法包括给予所述对象以下一种或任意多种试剂的组合的步骤：
(a)下调miR-146a的表达或活性的试剂；
(b)上调Camk2d的表达或活性的试剂；
(c)上调Ppp3r2的表达或活性的试剂；和
(d)上调NAFT信号通路中的分子的表达或活性的试剂。
在一个或多个实施方案中，所述试剂为核酸分子、碳水化合物、脂类或小分子化合物。
在一个或多个实施方案中，所述下调miR-146a的表达的试剂为敲除细胞中的miR-146a的打靶载体。
在一个或多个实施方案中，所述下调miR-146a的表达的试剂为miR-146a抑制剂，如表达miR-146a的反义互补序列的病毒。
在一个或多个实施方案中，所述上调Camk2d表达的试剂为Camk2d的表达载体。
在一个或多个实施方案中，所述上调Ppp3r2的表达的试剂为Ppp3r2的表达载体。
在一个或多个实施方案中，所述NAFT信号通路分子选自NAFT1和NAFT2。
在一个或多个实施方案中，所述上调NAFT信号通路中的分子的表达的试剂为所述分子的表达载体。
本申请第四方面提供一种诊断骨关节炎或监测骨关节炎病情发展的方法，所述方法包括检测对象体液中miR-146a、Camk2d、Ppp3r2和NAFT信号通路中的分子中的一种或多种的表达水平步骤。
在一个或多个实施方案中，所述检测Camk2d表达水平包括检测Camk2d mRNA水平和检测Camk2d蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述用于检测Ppp3r2表达水平包括检测Ppp3r2 mRNA水平和检测Ppp3r2蛋白含量。
在一个或多个实施方案中，所述用于检测NAFT信号通路分子表达水平包括检测NAFT信号通路分子mRNA水平和检测NAFT信号通路分子蛋白含量。
在一个或多个实施方案中，采用Northern杂交法、RT-PCR或RNA-seq检测所述mRNA的水平。
在一个或多个实施方案中，采用Western blot或ELISA检测蛋白的含量。
在一个或多个实施方案中，所述体液为外周血。
附图说明
图1：miR-146a在小鼠OA软骨中表达上调。
图2：TNF-α、IL-1β在小鼠OA软骨中的表达显著升高。
图3：TNF-α、IL-1β和IL-17诱导miR-146a表达。“Mock”为无细胞因子刺激。
图4：IL-1β通过NF-кB和ERK通路诱导miR-146a的表达。
图5：miR-146a KO抑制自发性OA。其中，F表示股骨，T表示胫骨。
图6：miR-146a KO缓解DMM诱导的OA退变。
图7：miR-146a KO缓解ACLT和PMM诱导的OA退变。
图8：miR-146a抑制软骨合成代谢。
图9：miR-146a靶向多个基因抑制软骨的合成代谢。
图10：关节内注射miR-146a对OA有治疗效果。
图11：Camk2d和Ppp3r2是miR-146a调节OA的功能靶标。
具体实施方式
本文通过在小鼠中构建自发性的OA动物模型以及创伤导致的关节不稳定OA模型〔小鼠前交叉韧带切断(ACLT)、小鼠内侧半月板去稳定(DMM)和小鼠部分内侧半月板切除术(PMM)〕，揭示了miR-146a在OA疾病中的作用。本文发现，miR-146a在损伤的软骨中的表达显著升高，这一趋势与损伤的软骨分泌的促炎性因子IL-1β和TNF-α有关。体外实验显示IL-1β和TNF-α均能不同程度的诱导软骨细胞中miR-146a的表达，主要是通过NF-кB和ERK信号通路。通过衰老导致的自发性OA模型及创伤性动物模型，本文发现miR-146a敲除(Knockout，KO)小鼠的软骨退变相比野生型(WT)小鼠有显著缓解的变化，表明在OA发育过程中，miR-146a的存在可能有促进OA的作用。通过体内体外的实验，本文发现：软骨细胞中敲除miR-146a显著增强了软骨的合成代谢；反之，miR-146a上调抑制了软骨的合成代谢；在OA早期干预miR-146a的表达影响到OA的进程，具体而言，在OA造模小鼠中过表达miR-146a使得小鼠的OA症状明显加剧，而敲除miR-146a的小鼠OA症状明显缓解。本文通过实验鉴定出miR-146a通过靶向Camk2d、Ppp3r2等基因抑制软骨合成代谢。对其靶点的功能研究表明在软骨细胞中高表达Camk2d和Ppp3r2促进软骨合成；而下调Camk2d和Ppp3r2表达则抑制软骨合成。进一步的，更深入的研究发现，Camk2d和Ppp3r2下游的NFAT信号通路在miR-146a KO小鼠中被活化，这一信号通路与软骨合成基因SOX9和COL2A1的转录密切相关，表明了炎症-miR-146a-Camk2d&Ppp3r2-NFAT-SOX-9&COL2A1这一中轴线在OA发育中的关键作用，由此完成本文。
因此，本文涉及调控对象软骨合成的方法，该方法包括调控miR-146a、Camk2d、Ppp3r2和NFAT通路蛋白中的一种或多种的表达或活性的步骤。
本文中，“对象”可以是哺乳动物，优选是人。miR-146a、Camk2d、Ppp3r2和NFAT通路蛋白通常为哺乳动物尤其是人的相应分子。
可从相应的数据库如Genbank中找到这些分子的蛋白序列及其编码序列。例如，miR-146a的序列可从miRbase数据库中获得，登陆号为MIMAT0000158；Camk2d、Ppp3r2、NFAT1和NFAT2的序列可从NCBI数据库获得，登陆号分别为108058、19059、18019和18018。应理解的是，来自不同物种来源的miR-146a、Camk2d、Ppp3r2和NFAT通路蛋白在氨基酸序列和/或核苷酸序列上可能存在一定的差异，甚至来自同一物种不同个体的这些分子也可能存在一定的序列差异，但只要这些分子的生物学功能与本申请所述的生物学功能相同或类似，这类分子均包括在本发明的范围之内。在某些实施方案中，本发明的NFAT通路蛋白包括NFAT1和NFAT2蛋白。
“调控”软骨合成包括抑制软骨合成和促进软骨合成。对于需要抑制软骨合成的情况，可通过上调miR-146a的表达或活性，下调Camk2d的表达或活性，下调Ppp3r2的表达或活性，和/或下调NAFT的表达或活性而实现。对于需要促进软骨合成的情况，可通过下调miR-146a的表达或活性，上调Camk2d的表达或活性，上调Ppp3r2的表达或活性，和/或上调NAFT的表达或活性而实现。
通常，可通过给予合适的试剂来实现miR-146a、Camk2d、Ppp3r2和NFAT表达或活性的上调或下调。例如，下调或抑制miR-146a、Camk2d、Ppp3r2和NFAT基因表达水平的试剂可包括但不限于：促进miR-146a降解的试剂，针对Camk2d、Ppp3r2和NFAT基因的siRNA，抑制Camk2d、Ppp3r2和NFAT mRNA翻译的试剂，敲除miR-146a、Camk2d、Ppp3r2和NFAT基因的试剂，和特异性识别Camk2d、Ppp3r2和NFAT基因的导向核酸并对其进行剪切以降低其表达水平的试剂等。在某些实施方案中，可通过给予打靶载体而将miR-146a、Camk2d、Ppp3r2和/或NFAT全基因敲除，从而实现表达水平的降低。在某些实施方案中，下调miR-146a的表达的试剂为miR-146a抑制剂。在某些实施方案中，miR-146a抑制剂为表达miR-146a的反义互补序列的病毒载体(如慢病毒载体)。
适用于本发明的反义互补序列是那些能特异性结合细胞内成熟的miR-146a，从而阻遏miR-146a的作用的反义互补序列。可根据对象所表达的miR-146a来设计其反义互补序列。适用于本发明的病毒载体(如慢病毒载体)可以是本领域周知的适合于哺乳动物，尤其是人体给药的病毒载体。
下调或抑制Camk2d、Ppp3r2和NFAT蛋白活性的试剂可以是这些蛋白各自的特异性抗体。
本文中，降低Camk2d、Ppp3r2或NFAT蛋白的活性包括使宿主细胞与对照细胞(野生型细胞)相比，Camk2d、Ppp3r2或NFAT蛋白的活性降低至少30％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，甚至完全不表达这些蛋白或完全检测不到这些蛋白的活性。
也可通过在Camk2d、Ppp3r2或NFAT蛋白中引入突变而使其活性降低。本文中，Camk2d、Ppp3r2或NFAT蛋白的活性尤其指其在本申请所述的炎症-miR-146a-Camk2d&Ppp3r2-NFAT-SOX-9&COL2A1这一中轴线发挥的促进或抑制软骨合成的活性。因此，在某些实施方案中，在Camk2d、Ppp3r2或NFAT蛋白的功能域中引入致其相应活性减弱或丧失的突变。突变可以是1个或数个甚至更多(例如10个以上、20个以上、30个以上)个氨基酸的***、缺失或取代。可通过给予作用于Camk2d、Ppp3r2或NFAT基因的试剂，使其所编码的Camk2d、Ppp3r2或NFAT蛋白的功能域中存在导致其相关生物学活性减弱或丧失的突变。这类试剂可改变Camk2d、Ppp3r2或NFAT基因的序列，导致所编码的Camk2d、Ppp3r2或NFAT蛋白存在相应的突变，从而具有减弱的活性，或活性丧失。例如，可通过同源重组技术用突变的Camk2d、Ppp3r2或NFAT基因替换野生型细胞中的Camk2d、Ppp3r2或NFAT基因，从而导致其表达弱活性或无活性的Camk2d、Ppp3r2或NFAT蛋白。
miR-146a、Camk2d、Ppp3r2和NFAT各自表达的上调可通过在宿主或宿主细胞中过表达这些分子而实现其表达的上调。例如，可利用本领域常规的技术构建适于在宿主细胞中表达这些分子的表达载体，并通过常规方法转入宿主细胞中，使得表达载体在宿主细胞中表达所述分子，从而实现其表达的上调。在某些实施方案中，可调控这些分子的上游基因的表达，从而提高这类分子的表达。例如，在某些实施方案中，可给予对象表达miR-146a成熟序列的病毒载体(如慢病毒载体)，从而提高miR-146a在对象细胞中的表达水平。
通常，蛋白活性的提高指与野生型相比，蛋白活性具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％的提高；或者与野生型细胞相比，宿主细胞中的蛋白活性有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％的提高。
因此，本发明抑制软骨合成的方法包括给予需要的对象以下一种或多种试剂：
(1)上调miR-146a的表达或活性的试剂；
(2)下调Camk2d的表达或活性的试剂；
(3)下调Ppp3r2的表达或活性的试剂；和
(4)下调NAFT的表达或活性的试剂。
本发明促进软骨合成的方法包括给予需要的对象以下一种或多种试剂：
(a)下调miR-146a的表达或活性的试剂；
(b)上调Camk2d的表达或活性的试剂；
(c)上调Ppp3r2的表达或活性的试剂；和
(d)上调NAFT的表达或活性的试剂。
本文的试剂可以是核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化合物和蛋白。本文中，核酸分子可以是例如siRNA、表达载体或打靶载体。小分子化合物通常指采用化学方法合成的分子量较低的化学合成化合物。蛋白包括特异性抗体。例如，试剂可以是与Camk2d、Ppp3r2或NFAT蛋白特异性结合的抗体。抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体或scFv。可采用本领域周知的方法制备Camk2d、Ppp3r2或NFAT蛋白的抗体，尤其是单抗。也可使用市售的抗体。在某些实施方案中，本发明的上述方法包括将过表达miR-146a的病毒载体(如腺病毒载体)或过表达miR-146a的反义互补序列的病毒载体(如腺病毒载体)注射到关节腔内，从而抑制或促进软骨合成。
上述试剂的给予方式和剂量可根据不同的对象、不同的病症以及不同的药剂形式给予。例如，在某些实施方案中，给药途径包括但不限于：直接裸RNA注射法；脂质体包裹RNA直接注射法；金包被RNA基因枪轰击法；繁殖缺陷细菌或复制缺陷腺病毒携带质粒DNA法；电穿孔法，等等。给予的剂量应是能使对象产生所需治疗或预防效果的量。可根据实际的治疗或预防情况，分若干次给予本发明的试剂或药物组合物。
当以药物组合物的形式给予时，药物组合物中还可含有药学上可接受的赋形剂。例如，在制备药物组合物时，通常将所述试剂与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊、纳米颗粒形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，药物组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、纳米颗粒等。药物组合物还可含有其它成分，例如湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯和甜味剂等。上述各试剂在药物组合物中的量应是治疗或预防有效的量。
通常，所述试剂在药物组合物的含量应是治疗或预防有效量的；具体的含量或给药剂量可考虑给药途径、病人健康状况等因素考虑。
本文所述的促进软骨合成的方法可用于治疗受益于软骨合成的各种疾病或缓解受益于软骨合成的各种疾病，包括但不限于骨关节炎。术语“治疗”和“缓解”具有本领域惯常理解的含义。例如，对象病情具有一定程度上的舒缓，均可认为达到了“缓解”的目的。本文中，骨关节炎包括但不限于衰老引起的自发性骨关节炎、关节不稳定诱导的骨关节炎、前交叉韧带撕裂诱导的骨关节炎、或部分内侧半月板切除及内侧副韧带横断诱导的骨关节炎。
因此，在某些实施方案中，本发明提供选自以下试剂中的一种或任意多种的组合在制备促进软骨合成用的药物中的应用：
(a)下调miR-146a的表达或活性的试剂；
(b)上调Camk2d的表达或活性的试剂；
(c)上调Ppp3r2的表达或活性的试剂；和
(d)上调NAFT的表达或活性的试剂。
通过检测对象体液中miR-146a、Camk2d、Ppp3r2和NFAT基因中的一种或任意多种的组合的表达水平，也可诊断与软骨合成相关的疾病，尤其是骨关节炎，或监测该疾病的病情发展。因此，本发明也提供一种诊断骨关节炎或监测骨关节炎病情发展的方法，所述方法包括检测对象体液中miR-146a、Camk2d、Ppp3r2和NFAT基因中的一种或任意多种的组合的表达水平的步骤。
检测对象体液中所述表达水平包括检测mRNA的水平和检测相应蛋白含量。可采用本领域常规的方法来进行所述检测。例如，对于mRNA的检测，可采用Northern杂交法、RT-PCR或RNA-seq；对于蛋白含量的检测，可采用Western blot或ELISA。例如，可采用现有的试剂盒来检测相关蛋白的含量或水平。当检测蛋白水平时，可使用相应的抗体进行ELISA检测。这些都是本领域技术人员所熟知的。体液可以是例如外周血。
因此，本文也提供以下试剂中的一种或任意多种的组合在制备诊断和监测软骨合成或骨关节炎用的试剂盒的应用：
(a)用于检测miR-146a表达水平的试剂；
(b)用于检测Camk2d表达水平的试剂；
(c)用于检测Ppp3r2表达水平的试剂；和
(d)用于检测NAFT信号通路分子的表达水平的试剂。
用于上述检测的试剂包括检测其mRNA水平过程中使用到的试剂和检测其蛋白含量过程中使用到的试剂。用于检测的这类试剂可以是核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化合物和蛋白(如抗体)。例如，当采用ELISA进行检测或监测时，所述试剂包括但不限于相应蛋白的特异性抗体。当检测或监测mRNA水平时，所述试剂包括但不限于相应的引物序列和/或探针序列，也包括进行PCR或其他生物学实验所需的试剂，例如相应的酶、溶剂和反应物等。在某些实施方案中，这类试剂还包括例如用于显色或其它便于进行定量或定性的物质。
在某些实施方案中，本公开还提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒含有以下试剂中的一种、任意两种、任意三种或全部四种：
(a)用于检测miR-146a表达水平的试剂；
(b)用于检测Camk2d表达水平的试剂；
(c)用于检测Ppp3r2表达水平的试剂；和
(d)用于检测NAFT信号通路分子的表达水平的试剂。
例如，所述试剂盒至少含有(a)，还可含有(b)、(c)和(d)项中的任意一种、任意两种或任意三种。或者，所述试剂盒可含有(b)和(c)项所述的试剂，或含有(a)、(b)和(c)项所述的试剂。优选地，用于这些检测的试剂包括检测其mRNA水平过程中使用到的试剂和检测其蛋白含量过程中使用到的试剂，更优选为Northern杂交法、RT-PCR或RNA-seq检测mRNA水平以及Western blot或ELISA检测蛋白含量时所用到的试剂，包括但不限于引物和探针，以及例如进行PCR所需的试剂。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，《分子克隆：实验室指南》(美国纽约州：冷泉港实验室出版社，1989)所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。对于试剂的用法和用量，除非另有说明，否则按照常规的用法和用量使用。
此外，应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。文中所用术语，除非另有说明，否则其具有本领域所惯常理解的含义。
一、实验材料和方法
1.1实验材料
1.1.1实验试剂
除非另有说明，实施例中所用的各种试剂盒、试剂、酶、抗体等，可获自Invitrogen(CA，美国)、Sigma(CA，美国)、Genecopoeia(CA，美国)、Roche、Omega bio-tek(CA，美国)、百泰克(中国北京)、Abcam(CA，英国)、CST(CA，美国)、Peprotech(CA，美国)、NEB(CA，美国)、Promega(CA，USA)、Proteintech(CA，美国)、Takara(中国大连)、TOYOBO(日本)、迈新(中国福州)、生工(中国上海)、吉玛(中国上海)、天跟(中国北京)等。
1.1.2实验动物
C57BL/6背景的miR-146a KO小鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司自Jackson Laboratory引进，动物饲养于中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所实验动物中心。该品系小鼠基因组上编码miR-146a前体的一段295bp的序列被移除。动物抵达后，首先与C57BL/6J小鼠杂交至少一代以确保可育；随后通过PCR鉴定基因型来挑选KO小鼠纯合子用于继续繁殖以及后续的实验。鉴定引物如下：
前向引物5’-ACCAGCAGTCCTCTTGATGC-3’(SEQ ID NO:1)；
反向引物5’-GACGAGCTGCTTCAAGTTCC-3’(SEQ ID NO:2)。
反应条件及反应体系见表1和2。
表1：miR-146a基因分型反应体系
表2：miR-146a基因分型热循环条件
C57BL/6J品系小鼠，雄性，8-10周，购自中国科学院上海实验动物中心，动物饲养于中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所实验动物中心。所有动物均维持在无病原体的环境中，所有动物实验均在中国科学院上海生命科学研究院生物医学伦理委员会的许可下执行。
1.2实验方法
1.2.1 miR-146a敲除鼠基因型鉴定
鼠尾基因组DNA的提取按照百泰克公司相关试剂盒的说明进行。鉴定引物如下：
前向引物5’-ACCAGCAGTCCTCTTGATGC-3’(SEQ ID NO:3)；和
反向引物5’-GACGAGCTGCTTCAAGTTCC-3’(SEQ ID NO:4)。
反应条件及反应体系见表1和2。
1.2.2小鼠手术诱导的骨关节炎模型的制备
小鼠前交叉韧带切断(ACLT)模型制备：取12周龄的雄性miR-146a KO和野生型C57小鼠制备ACLT模型。简言之，小鼠先腹腔注射水合氯醛(400mg/kg)进行麻醉，约需250微升可使小鼠在5分钟内充分麻醉。无菌条件下，用剪刀在小鼠右膝纵切一个约5mm左右的切口。解剖显微镜下打开关节囊后，轻轻把覆盖在前交叉韧带上面的脂肪垫拨到一边，用一个1ml注射器的针头把前交叉韧带横断，注意不要直接接触软骨组织；之后用蘸有碘伏的棉球擦拭伤口组织，并用医用缝合线缝合创口周围皮肤以避免感染。手术后，将小鼠放置在带有加温设置的仪器上，待小鼠基本解除麻醉状态后再转入饲养笼中。Sham(假手术)组在额外的老鼠上制备，经过麻醉，打开关节囊程序后，直接缝合创口周围皮肤，等小鼠解除麻醉状态后转入饲养笼中。术后八周脱颈处死小鼠，取出膝关节进行后续分析。
小鼠内侧半月板去稳定(DMM)模型制备：取12周龄的雄性miR-146a KO和野生型C57小鼠制备DMM模型。小鼠先腹腔注射水合氯醛(400mg/kg)进行麻醉。无菌条件下，用剪刀在小鼠右膝纵切一个约5mm左右的切口。解剖显微镜下打开关节囊后，小心用显微镊移除内侧半月板上方的脂肪垫，用一个1ml注射器的针头横断连接内侧半月板与下方胫骨平台的韧带，注意不要直接接触胫骨平台表面的软骨；之后用蘸有碘伏的棉球擦拭伤口组织，并用医用缝合线缝合创口周围皮肤以避免感染。手术后，将小鼠放置在带有加温设置的仪器上，待小鼠基本解除麻醉状态后再转入饲养笼中。术后四周脱颈处死小鼠，取出膝关节进行后续分析。
小鼠部分内侧半月板切除术(PMM)模型制备：取12周龄的雄性miR-146a KO和野生型C57小鼠制备PMM模型。小鼠先腹腔注射水合氯醛(400mg/kg)进行麻醉。无菌条件下，用剪刀在小鼠右膝纵切一个约5mm左右的切口。解剖显微镜下打开关节囊后，横断内侧副韧带并移除内侧半月板的颅面部分；之后用蘸有碘伏的棉球擦拭伤口组织，并用医用缝合线缝合创口周围皮肤以避免感染。手术后，将小鼠放置在带有加温设置的仪器上，待小鼠基本解除麻醉状态后再转入饲养笼中。术后四周脱颈处死小鼠，取出膝关节进行后续分析。
小鼠骨关节炎治疗模型制备：将12周大的C57BL/6雄鼠随机分成四组，每组8-9只，通过DMM手术制备关节炎模型。术后一周，用显微注射器将携带有miR-146a模拟物或者抑制剂，以及相应对照物的慢病毒颗粒注射到小鼠膝关节中。病毒滴度为109/ml,每只小鼠注射5μL，每隔一周注射一次，持续注射三次。术后四周取膝关节进行后续分析。
1.2.3小鼠自发性骨关节炎模型的制备
以不同年龄(3、6、9、12个月)的miR-146a KO和野生型C57小鼠为对象，脱颈处死后收集膝关节样本进行后续分析。
1.2.4组织学及免疫组化
1.2.4.1石蜡包埋及切片
1)固定：将取材的膝关节样本固定于4％多聚甲醛中，室温放置12h以上，不超过24h。确保有足够的固定液覆盖组织，固定液体积约为组织体积的5-10倍。2)冲洗：将固定完的标本置于包埋框中，流水冲洗过夜，去除多余的固定液。3)脱钙：将标本放进一个15ml离心管中，加入约10ml脱钙液，放在摇床上脱钙。每隔3天更换一次脱钙液，约需两周可以完成脱钙程序；此时用注射器针头可以无明显阻力的穿透组织时，表明脱钙完全。4)冲洗：将脱钙完的标本修剪至适宜大小并置于包埋框中，做好样本标记，流水冲洗过夜，去除多余的脱钙液。5)脱水：按以下程序进行梯度脱水：80％酒精一次，每次2h；95％酒精三次，每次2h；100％酒精两次，每次1h。6)透明：二甲苯两次，每次15分钟。7)浸蜡：将标本按以下程序浸于60℃石蜡中：石蜡I，30分钟；石蜡II，90分钟；石蜡III，90分钟(可过夜)。8)包埋与切片：常规方法包埋后，切片切至5-10μm厚度并转移到40-45℃水浴锅中。用载玻片捞起切片，37℃过夜烤干。
1.2.4.2切片脱蜡及水化
1)在二甲苯中脱蜡两次，每次10分钟。2)100％酒精两次，每次5分钟。3)95％酒精两次，每次5分钟。4)85％酒精一次，每次5分钟。5)75％酒精中放置5分钟，之后浸于双蒸水中。
1.2.4.3番红-快绿染色
1)石蜡切片常规脱蜡水化。2)自来水冲洗30秒。3)快绿染色5分钟。4)自来水冲洗1分钟，去除多余的固绿染液。5)番红染色5分钟。6)自来水冲洗1分钟，去除多余的番红染液。7)1％冰醋酸分色1秒。8)95％乙醇脱水1分钟，2次。9)100％乙醇脱水2分钟，2次。10)二甲苯透明5分钟，2次。11)中性树胶封固。
1.2.4.4免疫组化
1)石蜡切片常规脱蜡和水化后，PBST(PBS中加入Tween-20至终浓度为0.1％)洗涤三次，每次3分钟。2)用无尘纸巾吸除组织周围的水分，根据不同抗体的要求，对组织抗原进行相应修复。3)每张切片滴加足够的3％H2O2溶液(30％H2O2和甲醇按照1：9的比例配制)，室温下孵育10分钟，以阻断组织内内源性的过氧化物酶的活性。PBST洗涤三次，每次5分钟。4)去除组织周围水分，用免疫组化笔在组织周围画圈。5％山羊血清室温封闭30分钟，血清用PBST稀释。5)移除封闭液，根据不同抗体的要求，用2.5％山羊血清稀释一抗Mmp13(Abcam,1:200,ab39012),X型胶原(Abcam,1:1000,ab58632),GFP(Abcam,1:1000,ab290),Camk2d(Proteintech,1:100,20667-1-AP),Ppp3r2(Proteintech,1:100,14005-1-AP),Nfatc1(Abcam,1:50,ab175134),Nfatc2(Proteintech,1:100,22023-1-AP)。每张切片加50μl一抗，4℃过夜。6)去除一抗，PBST洗涤三次，每次5分钟。每张切片加1滴多聚酶结合物(迈新免疫组化试剂盒二抗)，室温孵育15分钟。7)去除二抗，PBST洗涤三次，每次5分钟。每张切片加50μl新鲜配制的DAB溶液，室温放置3-5分钟。8)去除多余的DAB溶液，自来水稍冲洗，苏木素复染10秒，自来水冲洗返蓝后，用1％盐酸酒精分化1秒。9)自来水冲洗返蓝，95％乙醇脱水5分钟，2次。10)100％乙醇脱水5分钟，2次。11)二甲苯透明5分钟，2次。12)中性树胶封固。
1.2.5小鼠关节软骨细胞的分离与鉴定
小鼠软骨细胞维持培养基：在DMEM低糖培养基中加入2mM L-GIn,1％penicillin-streptomycin(Hyclone)，以及10％FBS。胶原酶消化液：称取75mg胶原酶D，溶于25ml维持培养基中，使其终浓度为3mg/ml，0.22μm滤膜过滤。
1.2.5.1小鼠关节软骨细胞的分离
1)取一周大的C57BL/6小鼠，脱颈处死后，浸泡于75％乙醇中10分钟。2)将小鼠面朝上放置于超净工作台上，用剪刀、镊子将后腿剥离下来，尽可能去除肌肉等软组织。3)用无菌手术刀将股骨髁、胫骨平台以及股骨头表面的软骨(肉眼见为半透明状球体)削下来，浸于1X PBS中(含1％penicillin-streptomycin)，注意不要削到骨组织(棕色)。4)用含有抗生素的1X PBS洗涤软骨块两次。5)用软骨块放置于六孔板中，每孔加入4ml胶原酶消化液(3mg/ml)，于37℃细胞培养箱中消化45分钟。6)取出软骨块，放置于新的孔中，重复步骤5。7)取2.5ml胶原酶消化液，加入12.5ml维持培养基配成低浓度的消化液(0.5mg/ml)。用10ml的pipette吹打软骨块，去除软组织。小心用镊子去除软骨块，放于新的六孔板中并加入4ml胶原酶消化液(0.5mg/ml)于37℃细胞培养箱过夜消化。8)用10ml的pipette吹打软骨块，尽可能使软骨细胞从软骨块上解离；可用10ml注射器吹打细胞以获得单细胞悬液。9)用70μm滤膜过滤细胞，室温400g离心10分钟。10)加入适当的维持培养基，将细胞接种于培养皿中，约一周可长满。典型的软骨细胞呈圆形或多边形，胞质内颗粒感强。
1.2.5.2小鼠关节软骨细胞的鉴定(II型胶原免疫荧光)
1)将软骨细胞以每孔2x104Cells的密度接种于24孔板上。2)待细胞生长至汇合度约70％-80％，移除培养液，以PBS洗涤细胞两次。3)每孔加入1ml 4％多聚甲醛，室温固定10分钟。4)先以PBS快速浸洗细胞两次，然后每孔加入1ml PBS洗涤5分钟，两次。5)封闭液(5％BSA，0.3％triton)室温封闭1小时。6)4℃II型胶原抗体(1：100稀释比，以1％BSA,0.1％triton稀释)过夜孵育。7)移除一抗，PBS洗涤三次，各5分钟。8)二抗室温孵育2小时(1：1000稀释比，PBS稀释)，摇床上缓慢摇晃，此步骤后均需避光。9)移除二抗，PBS洗涤三次，各5分钟。10)Hoechst 33342(1μg/ml)染色5分钟。11)PBS洗涤三次，各5分钟。12)荧光显微镜下拍照，软骨细胞细胞质有强烈的II型胶原表达。
1.2.6实时荧光定量PCR
本文使用SYBR Green I染料法；而对于microRNA基因表达检测，本文采用TaqMan探针法进行相应检测。
1.2.6.1总RNA提取
按照Invitrogen公司TRIzol试剂的说明指示从小鼠软骨/软骨细胞中提取总RNA。
1.2.6.2第一链cDNA合成
A.使用takara公司cDNA第一链合成试剂盒，取1μg总RNA进行反转录，合成产物用于检测mRNA基因表达。
B.采用Applied Biosystems公司 MicroRNA Reverse Transcription试剂盒内包含的microRNA特异性的茎环引物(Applied Biosystems Inc)来合成第一链cDNA，生成的cDNA模板只能用于扩增该microRNA。
1.2.6.3 Real time PCR检测
A.mRNA基因表达检测：使用takara公司real-time PCR检测试剂(CAT:RR420A)。
B.miR-146a基因表达检测：使用Applied Biosystem公司的 UniversalMaster Mix II试剂检测(CAT：4440040)。
1.2.8表达载体构建与siRNA干扰
1.2.8.1 Tgif1、Camk2d、Ppp3r2基因表达载体构建
为了研究Tgif1、Camk2d、Ppp3r2基因在软骨细胞中的功能，我们克隆了小鼠的Tgif1、Camk2d和Ppp3r2基因。本文使用的是pEGFP-N1载体，该载体在多克隆位点后***了EGFP片段，便于评估转染效率。构建载体时，需把目的基因的终止密码子去除以免妨碍EGFP的表达。
Tgif1编码区序列扩增
1)合成以下引物，开始第一轮扩增：
前向引物：5’-AACTAAATGCACTCTTCGC-3’(SEQ ID NO:5)；
反向引物：5’-TTCGTCTGAGCAATCCC-3’(SEQ ID NO:6)。
2)在冰上配制PCR反应试剂，体系如下：
3)轻柔混匀，将反应管由冰上转移到梯度PCR仪上，运行以下程序：
4)取1μl PCR扩增产物，加入99μl无菌水稀释后备用。
5)合成以下引物，用于扩增小鼠Tgif1基因的全长编码区序列。前向引物：5’-CCGCTCGAGGCCACCATGGAGATGGTGCTCTCG-3’(SEQ ID NO:7)，其中CCG为保护碱基，CTCGAG为XhoⅠ酶切位点，GCCACC为Kozak序列；反向引物为5’-GGTCCCCCGGGAAGCTGTGAGTTTGGCCT-3’(SEQ ID NO:8)，其中GGTCC为保护碱基，CCCGGG为SmaⅠ酶切位点。
6)在冰上配制PCR反应试剂，体系如下：
7)轻柔混匀，在PCR仪上运行以下程序：
8)将扩增产物全部上样，使用1％琼脂糖凝胶电泳和EB(溴化乙锭)染色来分析。
Camk2d编码区序列扩增
步骤与Tgif1编码区序列扩增相同，区别在于：
步骤1)使用以下引物：前向引物：5’-GGGAAGCCAGGTCTGTTCG-3’(SEQ ID NO:9)；反向引物：5’-TGGTGCCTTGAGGACAGAATG-3’(SEQ ID NO:10)；
步骤5)合成以下引物，用于扩增小鼠Camk2d基因的全长编码区序列。前向引物：5’-CCGCTCGAGGCCACCATGGCTTCGACCACCAC-3’(SEQ ID NO:11)；反向引物：5’-GGTCCCCCGGGAGTTGATGGGTACTGTGGG-3’(SEQ ID NO:12)；以及
步骤6)反应体系中的扩增引物为步骤5)合成的引物。
Ppp3r2编码区序列扩增
使用以下引物，用于扩增小鼠Ppp3r2基因的全长编码区序列：
前向引物：5’-CCGCTCGAGGCCACCATGGGAAATGAGGCCAG-3’(SEQ ID NO:13)；
反向引物：5’-GGTCCCCCGGGAAGCTTTTAAGTCTTCTTGACC-3’(SEQ ID NO:14)。
在冰上配制PCR体系，体系如下：
PCR程序如下：
将扩增产物全部上样，使用1％琼脂糖凝胶电泳和EB染色来分析。
目的片段的回收、酶切、以及目的片段与载体的连接采用常规方法进行。
转化
1)从-80℃取出DH5α感受态细胞，置于冰上解冻。2)取10μl连接液加至30-50μl感受态细胞中，冰浴30分钟。3)42℃水浴热激1分钟，再放置于冰上3分钟。4)加入600μl无菌不含抗生素的LB培养基，37℃振荡培养60分钟，使细菌恢复正常生长状态,并表达氨苄抗性基因。5)取50-100μl菌液涂布于含Kanamycin的LB平板上，正面向上放置30分钟，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养12-16小时。
质粒提取
质粒DNA的提取使用Omega bio-tek公司的Endo-free Plasmid Mini KitⅡ,操作详见厂商说明书。
1.2.8.2 siRNA
siRNA由吉玛公司合成，本文为每个基因设计了三条siRNA序列，详见下表(SEQ IDNO:15-32)：
1.2.9 3’UTR克隆和荧光素酶检测
本文中使用的是promega公司的psiCHECKTM-2载体。载体中的Renillaluciferase(海肾荧光素酶)是主要的报告基因，目的基因可被克隆到海肾荧光素酶翻译终止密码子下游的多克隆位点。由于miRNAs与靶基因的结合多在目的基因mRNA序列的3’UTR，当将3’UTR***到载体上后，超量表达miRNAs可使miRNAs识别载体上的3’UTR序列，启动对靶向序列mRNA的降解。通过检测降低的海肾荧光素酶活力可以方便的辨别miRNAs与靶基因之间的关系。
1.2.9.1 3’UTR载体构建
首先通过TargetScan、miRNAorg等网站查找候选靶基因与miR-146a可能的结合位点，随后在该结合位点两侧设计引物，扩增含有该位点的区域片段。用于扩增Tgifl、Camk2d和Ppp3r2的3’UTR片段的引物序列如下所示(SEQ ID NO:33-38)：
1)在冰上按次序加入以下试剂：
2)混匀，在PCR仪上执行以下程序，不同基因的退火温度见表2.5。
3)手术刀切下目的条带，回收扩增片段，测定浓度。
4)将回收产物及psiCHECKTM-2载体使用NotⅠ及XhoⅠ限制性内切酶进行消化，随后凝胶纯化回收片段，测定载体及各目的基因扩增片段的浓度。
5)将酶切纯化后的psiCHECKTM-2载体与目的基因片段按0.01pmol:0.1pmol的比例，使用T4DNA连接酶16℃连接30分钟。
6)转化大肠杆菌DH5α，取100μl菌液在Amp抗性LB平板上37℃培养12-16小时。
7)超净工作台下用灭菌牙签挑取单克隆菌落，接种至3ml含有Amp的LB培养基中，37℃振荡培养12-16小时。
8)提取质粒，NotⅠ及XhoⅠ双酶切重组质粒，电泳检测***片段的有无。
9)挑取含有***片段的重组质粒，测序。
1.2.9.2突变3’UTR载体
为了进一步验证miRNA与靶基因3’UTR区域的结合性，我们将预测的miRNA与靶基因结合的核心位点进行突变，从而使miRNA不能识别突变后的3’UTR序列。通过使用AgilentTechnologies公司的QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit，对Tgif1,Camk2d和Ppp3r2基因的3’UTR区域进行相应突变。
1)合成3′UTR突变引物，序列如下所示(SEQ ID NO:39-46)：
2)在冰上按次序加入以下试剂：
3)最后加入1μlQuikChange Lightning Enzyme。
4)在PCR仪上执行以下程序：
5)直接加入2μl试剂盒内自带的Dpn I内切酶至PCR反应产物中。
6)轻柔混匀，简短离心，37℃消化5分钟，去除未突变的模板。
7)转化大肠杆菌DH5α，在Amp抗性LB平板上37℃培养12-16小时。
8)挑取单克隆菌落，摇菌，测序验证3′UTR位点突变是否完成。
1.2.9.3荧光素酶检测
转染
1)将293T细胞稀释至30000细胞/ml,每孔100μl接种至96孔板上。
2)过夜孵育后，每孔加入10μl转染复合物(含20ng 3’UTR重组载体，80ng miRNA过表达/对照载体，0.4μl lipofectamin 2000)。
3)孵育1小时后，每孔加入100μl无血清培养基。
4)转染后48小时，测定荧光素酶活力。
荧光素酶活力测定
1)移除培养基，PBS洗涤一次。
2)每孔加入50μl 1X PLB,将培养板放在摇床上，室温孵育15分钟。
3)在光度计上设置好检测参数，每管加入100μl LAR II溶液。
4)取20μl PLB裂解产物加入检测管中，测定firefly荧光素酶活力。
5)在同一试管中加入100μlStop&测定Renilla荧光素酶活力。
1.2.10统计分析
统计分析使用了SPSS公司的SPSS 19.0软件，数据以平均值±标准差的方式表现。两组之间的统计学差异以two-tailed Student’s t-test，或Mann-Whitney test来测定。P<0.05被认为具备统计学差异。
1.2.11 mRNA基因芯片
样本
RNA的浓度和质量用NanoDrop ND-1000测定，RNA的完整性以标准的变性琼脂糖凝胶电泳来评估。
DNA芯片
使用Agilent公司Mouse 4x44K Gene Expression Array平台分析，包含超过39，000个标准命名的基因和转录体。
RNA标记和阵列杂交
样本标记和阵列杂交根据Agilent One-Color Microarray-Based GeneExpression Analysis protocol(Agilent Technology)执行。简言之，总RNA线性化扩增后，标记Cy3-UTP，标记后的cRNAs用RNeasy Mini Kit(Qiagen)纯化。标记cRNAs(pmol Cy3/μg cRNA)的浓度和特异性活力以NanoDrop ND-1000测定。随后，每1μg标记的cRNA加入11μl10×Blocking Agent和2.2μl 25×Fragmentation Buffer，60℃加热30分钟使之片段化；最后加入55μl2×GE Hybridization buffer来稀释标记的cRNA。将100μl的杂交缓冲液加入到基因表达芯片slide上，在Agilent杂交箱中65℃孵育17个小时，随后洗涤，固定，并用Agilent DNA Microarray扫描仪扫描(part number G2505C)。
数据分析
Agilent Feature Extraction软件(version 11.0.1.1)用于分析所获得的阵列图像。分位数标准化和数据处理使用GeneSpring GX v11.5.1软件包(AgilentTechnologies)。不同变化的基因通过倍增变化来鉴定，分级群聚通过GeneSpring GXv11.5.1软件执行。GO分析和信号通路分析以标准的富集算法执行。
二、实验结果
1、炎症信号调控小鼠软骨细胞中miR-146a的表达
我们构建了创伤性小鼠OA模型，通过taqman探针法我们发现miR-146a在小鼠OA软骨中的表达显著高于取自假手术组的正常软骨(图1)。我们猜测在OA模型中损伤的软骨自身产生的细胞因子可能与miR-146a在OA软骨中的上调有关。Real time PCR结果显示TNF-α和IL-1β在小鼠OA软骨中的表达显著增高；IFN-γ的表达有所降低，但并无统计学变化。此外，和关节炎相关的基因MMP-3、MMP-13在OA软骨中的表达也是明显高于对照组，表明在创伤性OA模型中确实产生了局部的炎症环境(图2)。
为了研究炎症信号对软骨细胞miR-146a表达的调控作用，我们用不同的炎症因子刺激软骨细胞24小时。qPCR结果显示IL-1β、TNF-α以及IL-17均能显著2诱导miR-146a的表达，其中以IL-1β的作用最为强烈；而IL-6，IFN-γ和TGF-β1对miR-146a均无明显的调控作用(图3)。我们进一步发现抑制IL-1β诱导的NF-кB、ERK以及p38信号通路活化可以抑制miR-146a的表达(图4)，尤其以NF-кB和ERK信号通路最为显著，说明IL-1β对软骨细胞中miR-146a的诱导作用主要依赖于NF-кB和ERK信号通路。
2、评估miR-146a KO对衰老引起的自发性OA的影响
我们首先评估了在衰老引起的自发性的OA模型中miR-146a所起的作用。结果发现，当鼠龄达到12个月时，WT小鼠的关节软骨表面变得粗糙，软骨浅表层出现软骨损失以及蛋白聚糖染色强度减弱的现象。与此相反的是，miR-146a KO小鼠的关节软骨表面没有明显的磨损状况，蛋白聚糖染色强度维持不变(图5，a)。miR-146a KO小鼠的OA评分也是远远低于WT小鼠(图5，b)。此外，12个月龄的WT小鼠的内侧胫骨平台边缘有明显的骨赘形成，而miR-146a KO小鼠几乎没有显著的骨赘特征(图5，c-d)。我们进一步发现12个月龄的WT小鼠其透明软骨区超过80％的软骨细胞均表达X型胶原，而同龄的miR-146a KO鼠在透明软骨区X型胶原阳性率显著低于WT小鼠，表达强度也是明显降低。MMP-13在WT小鼠中的表达约为50％，远高于miR-146a KO小鼠的20％(图5，e-g)。由于IRAK-1和TRAF6是众所周知的miR-146a主要的靶向基因，我们检测了它们的分布，发现在WT和miR-146a KO小鼠中两者的表达并无显著区别(图5，h-j)，说明在OA发病过程中炎症并非miR-146a的调节目标。
3、miR-146a KO缓解关节不稳定诱导的OA退变
接下来我们通过三种不同的关节不稳定诱导的OA动物模型，即DMM、ACLT和PMM模型，来进一步评估miR-146a KO对OA病情的影响。首先我们在DMM导致的关节不稳定OA模型中进行评估。DMM造模后，WT小鼠的膝关节表面显示出明显的OA退变，表现为软骨表面变得粗糙，透明软骨损失，浅表层阳离子染色强度变弱，以及软骨下骨骨质增多，骨髓细胞减少。与此对应的是，miR-146a KO小鼠则呈现出较为光滑的软骨表面，浅表层关节磨损明显降低(图6，a-b)。在DMM引起OA损伤后，X型胶原和MMP-13在WT小鼠透明软骨区域的表达急剧上升,与之相反的是，X型胶原和MMP-13在miR-146a KO小鼠透明软骨区的表达和sham组相比基本没有变化，表明在DMM诱导的创伤性的OA过程中，敲除miR-146a会显著抑制软骨细胞发生病理性的表型迁移(图6，c-e)。在ALCT和PMM模型中，我们也发现了相同的趋势(图7，A-F)，表明在创伤诱导的小鼠骨关节炎模型中，敲除miR-146a有效保护了软骨，缓解了OA症状。
4、miR-146a抑制软骨合成代谢
如前所述，IL-1β、TNF-α以及IL-17在小鼠软骨细胞中均能促进miR-146a的诱导。我们接下来研究被诱导表达的miR-146a在炎症因子导致的软骨内稳态失衡过程中扮演的角色。结果发现，IL-1β、TNF-α以及IL-17均显著抑制软骨基质合成相关基因Col2a1和Sox9的表达，而过表达miR-146a进一步抑制了Col2a1和Sox9蛋白的表达(图8，a)。与此相反，在没有刺激或IL-17刺激下，下调miR-146a均大幅度增加Col2a1和Sox9的蛋白表达(图8，b)。在经历OA手术后，miR-146KO小鼠的关节软骨中Col2a1和Sox9的表达要显著高于WT小鼠(图8，c-d)。这些结果充分说明，促炎性因子诱导出的miR-146a，加速了前者介导的对软骨基质合成代谢的抑制作用。
5、miR-146a靶向多个基因抑制软骨的合成代谢
为了寻找miR-146a调节软骨基质合成代谢的靶向分子，我们将小鼠软骨细胞分别过表达或下调miR-146a表达，随后将总RNA送至公司进行mRNA基因表达谱分析。基于miR-146a和靶基因的识别序列在各物种间的保守性，我们选择了12个基因进行进一步验证(图9，a)。随后我们通过qPCR验证了基因表达谱芯片结果(图9，b)。
为了进一步验证miR-146a与靶标基因间的结合关系，我们执行了3’UTR荧光素酶检测。过表达miR-146a显著降低了多个报告基因载体的相对荧光素酶活力，包括Tgif1,Bag1,Camta1,Sox5,Sema3g,Camk2d,Ppp3r2和Stim2(图9，c)。为了缩小研究范围，我们测定了以上候选靶标基因在OA软骨中的表达状况。DMM造模4周后，miR-146a KO小鼠的关节软骨中Tgif1,Camk2d和Ppp3r2的mRNA表达显著高于WT小鼠(图9，e-g)。因此，我们针对这三个基因进行深入的验证。在野生型UTR存在下，过表达miR-146a显著降低了Tgif1,Camk2d和Ppp3r2报告载体的荧光素酶活力；而当3’UTR被突变后，miR-146a由于未能识别靶基因的3’UTR从而未能发挥作用，表现出相对荧光素酶活力与对照类似(图9，d)。
进一步研究了Tgif1,Camk2d和Ppp3r2这三个基因在miR-146a介导的对软骨合成代谢抑制的过程中的作用。首先通过PCR扩增了Tgif1,Camk2d和Ppp3r2的全长编码区序列。随后将Tgif1,Camk2d和Ppp3r2基因通过Xho I和Sma I酶切位点克隆至pEGFP-N1表达载体。接下来将构建好的靶基因过表达载体转染至小鼠软骨细胞。经转染表达载体后，软骨细胞内的Tgif1,Camk2d和Ppp3r2基因的mRNA表达分别提升了560±8.2、966±26.7和31102±1917.5倍。我们发现在软骨细胞中过表达Tgif1同时也会促进Ppp3r2的表达，可达到生理值的305±26.7倍之多。Western blot结果表明，软骨细胞中超表达Tgif1,Camk2d和Ppp3r2基因极大的增加了转录因子Sox9的蛋白总量，受Sox9调控的Col2a1的蛋白表达也显著增强，与软骨细胞中miR-146a下调导致的趋势一致(图9，h)。
通过siRNA干扰下调Tgif1、Camk2d和Ppp3r2的表达均能明显降低Col2a1和Sox9的蛋白表达(图9，i),这与在软骨细胞中过表达miR-146a导致的Col2a1和Sox9的蛋白表达下降保持一致。以上这些结果证明，miR-146a通过靶向Tgif1,Camk2d和Ppp3r2基因进而发挥抑制软骨基质合成的作用。
6、关节内注射miR-146a对OA有治疗效果
如前所述，敲除miR-146a无论是对年龄导致的自发性OA还是创伤导致的次生性OA都具有显著的抑制作用。为了研究在OA发病后调节miR-146a的水平对于OA恢复的影响，我们首先通过DMM在小鼠中制备了关节不稳定诱导的OA模型。DMM造模一周后，我们将小鼠以每组8～9只随机分成4组，将miR-146a过表达病毒(Lenti-mimic 146a)、miR-146a抑制剂病毒(Lenti-inhibitor 146a)及各自相应的对照病毒以5μl/只通过显微注射器注射到关节腔内。之后每隔一周注射一次，一共注射3次(图10，a)。DMM造模4周后，取样固定、脱钙做后续分析。番红-快绿染色显示，注射有miR-146a过表达阴性对照组(Lenti-mimic NC)关节软骨表面磨损明显，尤其是胫骨表面软骨；胫骨平台下软骨下骨有明显的硬化。与之相比，miR-146a过表达病毒注射组其软骨表明降解更为严重，无论是胫骨平台还是股骨髁表面均有明显退变；此外，软骨表面基质染色大幅下降，软骨下骨硬化程度和对照组相似，表明在OA早期给予miR-146上调会加重关节软骨的破坏。相反地，我们发现在OA起始阶段下调软骨细胞内miR-146a的表达可以显著缓解软骨退变。与注射有miR-146a抑制剂阴性对照组(Lenti-inhibitor NC)相比，miR-146a抑制剂组(Lenti-inhibitor 146a)维持较为光滑的关节软骨表面，没有明显的基质染色丢失状况(图10，b-c)。免疫组化结果显示在Lenti-mimic NC组，DMM导致透明软骨内X型胶原的阳性率达到64.6±11.7％；而注射了miR-146a过表达病毒后，明显加重了软骨细胞的表型向肥大化软骨细胞分化，X型胶原的阳性率达到87.2±7.1％之多。敲低miR-146a的表达显著抑制了软骨细胞的表型变化，相对于对照组的67.5±17.9％的阳性率，Lenti-inhibitor-146a注射组的X型胶原的阳性率仅有44.9±9.89％(图10，d和e)。
miR-146a过表达病毒(Lenti-mimic 146a)、miR-146a抑制剂病毒委托吉玛公司制备。具体的说，将含有miR-146a成熟体序列或其反义互补序列克隆至慢病毒载体(吉玛，中国上海)中，随后包装。
Mmu-mir-146a成熟体序列：5’-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3’(SEQ ID NO:47)；
Mmu-mir-146a反义互补序列：5’-AACCCATGGAATTCAGTTCTCA-3’(SEQ ID NO:48)。
7、Camk2d和Ppp3r2是miR-146a调节OA的功能靶标
Camk2d在12个月龄的WT小鼠关节软骨中的表达阳性率仅为25.7±14.0％，远远低于在成年WT小鼠关节软骨中68.8±15.6％的阳性表达率；表达强度也是大幅度降低。与此对应的是，miR-146a KO成年小鼠中Camk2d的阳性表达率为82.5±7.0％，与同龄的WT小鼠并无显著性差异；即使在进入老年期时，Camk2d在miR-146a KO小鼠透明软骨中的阳性表达率仍然高达56.7±6.1％，显著高于同龄的WT小鼠(P＝0.009)，并且维持着较强的表达强度。Ppp3r2的表达趋势和Camk2d类似(图11，a-c)。
在miR-146a关节腔注射实验中，miR-146a也是通过靶向抑制Camk2d和Ppp3r2这两个分子来行使功能。如图11(f-h)所示，节内注射miR-146a过表达病毒显著抑制了Camk2d在小鼠透明软骨区域的表达，使其阳性表达率由对照组的47.2±19.8％降至miR-146a过表达组的19.4±17.6％(P＝0.02)。miR-146a抑制剂则明显增加了Camk2d的表达，使其阳性表达率由对照组的40.9±12.4％增至抑制剂组的68.4±22.2％(P＝0.03)。类似地，miR-146a显著降低了Ppp3r2在关节软骨中的表达(P＝0.002)；而通过注射miR-146a抑制剂下调miR-146a表达可使Ppp3r2的表达从对照组的48.1±9.11％增加到抑制剂组的73.2±12.6(P＝0.0001)。
前面提到，miR-146a通过靶向Camk2d和Ppp3r2等分子抑制软骨的合成代谢基因如Col2a1和Sox9的表达；这里我们更深入的发现在OA的发育过程中miR-146a确实是通过抑制Camk2d和Ppp3r2表达从而加剧OA的发展。根据细胞信号通路分析和文献检索，我们发现活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFATs)很可能与之有关。我们发现NFAT2在3个月龄的WT小鼠关节软骨表面呈低表达，强度较弱；而miR-146a KO小鼠中NFAT2在关节软骨中高表达，阳性率为62.8±24.2％，远远高于WT小鼠的14.3±12.8％(P＝0.01)；其主要分布在透明软骨并且都在核内表达，表明正处于活化状态。在衰老小鼠中，NFAT2在miR-146a KO小鼠软骨中的表达仍然有30.0±9.4％，显著高于WT小鼠的12.3±4.7％(P＝0009)(图11，e)。我们还检测了NFAT1在小鼠中的组织分布。NFAT1在3个月龄WT小鼠透明软骨中的阳性表达率为33.2±9.6％,而在同龄的miR-146a KO小鼠透明软骨区的表达高达84.2±10.4％(P＝0.003)；在12个月龄KO小鼠98中的表达也有55.5±18.2％，远远高于WT小鼠的17.9±9.2％(图11，d)，充分说明NFATs的活化参与了miR-146a对OA的调节过程。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> miR-146a及其靶点在治疗骨关节炎中的应用
<130> 170317
<160> 48
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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accagcagtc ctcttgatgc 20
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<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
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<400> 3
accagcagtc ctcttgatgc 20
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<211> 20
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<220>
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gacgagctgc ttcaagttcc 20
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<212> DNA
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<220>
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aactaaatgc actcttcgc 19
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<400> 6
ttcgtctgag caatccc 17
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<400> 7
ccgctcgagg ccaccatgga gatggtgctc tcg 33
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ggtcccccgg gaagctgtga gtttggcct 29
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<400> 9
gggaagccag gtctgttcg 19
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<212> DNA
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<220>
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tggtgccttg aggacagaat g 21
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<212> DNA
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<220>
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ccgctcgagg ccaccatggc ttcgaccacc ac 32
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<212> DNA
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<220>
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<400> 12
ggtcccccgg gagttgatgg gtactgtggg 30
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<220>
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<400> 13
ccgctcgagg ccaccatggg aaatgaggcc ag 32
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 14
ggtcccccgg gaagctttta agtcttcttg acc 33
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<220>
<223> Tgifl-Mus-642的siRNA序列，有义链
<400> 15
ccacacuaca ggucuguaat t 21
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<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> Tgifl-Mus-642的siRNA序列，反义链
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uuacagaccu guaguguggt t 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tgifl-Mus-714的siRNA序列，有义链
<400> 17
gcaaagaucc aaaucaguut t 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tgifl-Mus-714的siRNA序列，反义链
<400> 18
aacugauuug gaucuuugct t 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tgifl-Mus-947的siRNA序列，有义链
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gcauugaagg augggccuut t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tgifl-Mus-947的siRNA序列，反义链
<400> 20
aaggcccauc cuucaaugct t 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Camk2d-Mus-1042的siRNA序列，有义链
<400> 21
ccugcguaaa gauccuuaut t 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Camk2d-Mus-1042的siRNA序列，反义链
<400> 22
auaaggaucu uuacgcaggt t 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Camk2d-Mus-1132的siRNA序列，有义链
<400> 23
ggaugaagau cagcauagat t 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Camk2d-Mus-1132的siRNA序列，反义链
<400> 24
ucuaugcuga ucuucaucct t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Camk2d-Mus-1433的siRNA序列，有义链
<400> 25
gcagccaaga guuuauugat t 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Camk2d-Mus-1433的siRNA序列，反义链
<400> 26
ucaauaaacu cuuggcugct t 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ppp3r2-Mus-203的siRNA，有义链
<400> 27
gagugaucga caucuucgat t 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ppp3r2-Mus-203的siRNA，反义链
<400> 28
ucgaagaugu cgaucacuct t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ppp3r2-Mus-316的siRNA，有义链
<400> 29
gccuucagaa ucuacgacat t 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ppp3r2-Mus-316的siRNA，反义链
<400> 30
ugucguagau ucugaaggct t 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ppp3r2-Mus-520的siRNA，有义链
<400> 31
cacaagaaau uggucgugut t 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ppp3r2-Mus-520的siRNA，反义链
<400> 32
acacgaccaa uuucuugugt t 21
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 33
ccgctcgagc aaatagcacc cagcaac 27
<210> 34
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
aagaatgcgg ccgcttcgtc tgagcaatcc c 31
<210> 35
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
ccgctcgaga gtttgtcttc tgcactaa 28
<210> 36
<211> 34
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 36
ataagaatgc ggccgcttgt gaggtcatag catc 34
<210> 37
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 37
ccgctcgagc ttgtgtatgt gggagaa 27
<210> 38
<211> 35
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
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ataagaatgc ggccgcactt ctatccctca aacat 35
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<211> 40
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 39
tttcaaacaa aactcaagag caaaatacgg tcctgattgc 40
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<211> 40
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 40
gcaatcagga ccgtattttg ctcttgagtt ttgtttgaaa 40
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
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agatgtgagg aaatcgtgat ttcaagagtc cagcacagtg 40
<210> 42
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
cactgtgctg gactcttgaa atcacgattt cctcacatct 40
<210> 43
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 43
atggcaagct gtttcaagag gctgcacgca gtg 33
<210> 44
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
cactgcgtgc agcctcttga aacagcttgc cat 33
<210> 45
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
tatgtgggag aagacaactc aagagttgtg gagtattagg 40
<210> 46
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
cctaatactc cacaactctt gagttgtctt ctcccacata 40
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<211> 22
<212> DNA
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<220>
<223> Mmu-mir-146a 成熟体序列
<400> 47
tgagaactga attccatggg tt 22
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mmu-mir-146a 反义互补序列
<400> 48
aacccatgga attcagttct ca 22
Claims (10)
1.选自以下的一种或任意多种试剂的组合在制备促进软骨合成用的药物或在制备治疗或缓解骨关节炎用的药物中的应用：
(a)下调miR-146a的表达或活性的试剂；
(b)上调Camk2d的表达或活性的试剂；
(c)上调Ppp3r2的表达或活性的试剂；和
(d)上调NAFT信号通路中的分子的表达或活性的试剂。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为核酸分子、碳水化合物、脂类或小分子化合物；
优选地，所述下调miR-146a的表达的试剂为敲除细胞中的miR-146a的打靶载体，或为miR-146a抑制剂，如表达miR-146a的反义互补序列的病毒；
所述上调Camk2d表达的试剂为Camk2d的表达载体；
所述上调Ppp3r2的表达的试剂为Ppp3r2的表达载体；
所述上调NAFT信号通路中的分子的表达的试剂为所述分子的表达载体；优选地，所述NAFT信号通路分子选自NAFT1和NAFT2。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述骨关节炎为衰老引起的自发性骨关节炎、关节不稳定诱导的骨关节炎、前交叉韧带撕裂诱导的骨关节炎或部分内侧半月板切除及内侧副韧带横断诱导的骨关节炎。
4.以下试剂中的一种或多种在制备监测软骨合成或骨关节炎病情进展用的试剂盒中的应用：
(a)用于检测miR-146a表达水平的试剂；
(b)用于检测Camk2d表达水平的试剂；
(c)用于检测Ppp3r2表达水平的试剂；和
(d)用于检测NAFT信号通路分子的表达水平的试剂。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，
所述用于检测Camk2d表达水平的试剂包括检测Camk2d mRNA水平过程中使用到的试剂和检测Camk2d蛋白含量过程中使用到的试剂；
所述用于检测Ppp3r2表达水平的试剂包括检测Ppp3r2mRNA水平过程中使用到的试剂和检测Ppp3r2蛋白含量过程中使用到的试剂；
所述用于检测NAFT信号通路分子表达水平的试剂包括检测NAFT信号通路分子mRNA水平过程中使用到的试剂和检测NAFT信号通路分子蛋白含量过程中使用到的试剂。
6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒含有：
采用Northern杂交法、RT-PCR或RNA-seq检测所述mRNA的水平的试剂；和/或
采用Western blot或ELISA检测蛋白含量的试剂。
7.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒含有以下试剂中的一种、任意两种、任意三种或全部四种：
(a)用于检测miR-146a表达水平的试剂；
(b)用于检测Camk2d表达水平的试剂；
(c)用于检测Ppp3r2表达水平的试剂；和
(d)用于检测NAFT信号通路分子的表达水平的试剂。
8.一种促进软骨合成或治疗骨关节炎的方法，其特征在于，所述方法包括以下任一个或任意多个步骤的组合：
(a)下调对象中miR-146a的表达或活性的步骤；
(b)上调对象中Camk2d的表达或活性的步骤；
(c)上调对象中Ppp3r2的表达或活性的步骤；和
(d)上调对象中NAFT信号通路中的分子的表达或活性的步骤。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括给予所述对象以下一种或任意多种试剂的组合的步骤：
(a)下调miR-146a的表达或活性的试剂；
(b)上调Camk2d的表达或活性的试剂；
(c)上调Ppp3r2的表达或活性的试剂；和
(d)上调NAFT信号通路中的分子的表达或活性的试剂。
10.一种诊断骨关节炎或监测骨关节炎病情发展的方法，其特征在于，所述方法包括检测对象体液中miR-146a、Camk2d、Ppp3r2和NAFT信号通路中的分子中的一种或多种的表达水平步骤；
优选地，所述检测Camk2d表达水平包括检测Camk2d mRNA水平和检测Camk2d蛋白；所述检测Ppp3r2表达水平包括检测Ppp3r2mRNA水平和检测Ppp3r2蛋白含量；所述检测NAFT信号通路分子表达水平包括检测NAFT信号通路分子mRNA水平和检测NAFT信号通路分子蛋白含量；
优选地，采用Northern杂交法、RT-PCR或RNA-seq检测所述mRNA的水平；采用Westernblot或ELISA检测蛋白的含量；
优选地，所述体液为外周血。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109762895A (zh) * | 2019-01-07 | 2019-05-17 | 中国医学科学院北京协和医院 | miR-146a在制备诊断激素性股骨头坏死产品中的应用 |
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2017
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
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