CN108330202B - 鉴定水稻细胞质类型的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了鉴定水稻细胞质类型的方法，该方法以水稻线粒体基因组遗传变异为基础，通过对线粒体基因组序列进行分析比对，筛选出选自野败型、印尼水田谷型、冈型、K型、以及D型的水稻细胞质类型共有的特异线粒体基因组序列，该特异序列含有至少2个InDel位点。针对同一个InDel位点优化设计出2对引物，通过分子检测手段来鉴定水稻细胞质类型，或者鉴定水稻细胞质雄性不育系及其杂交水稻品种。本申请提供的方法能快速、准确、高效、稳定地鉴定水稻细胞质类型，以及相关水稻细胞质雄性不育系及其杂交水稻品种。

Description

鉴定水稻细胞质类型的方法
技术领域
本申请属于水稻分子标记检测鉴定领域，具体而言，涉及一种快速鉴定水稻细胞质类型的方法，适用于快速、定性鉴定选自野败型、印尼水田谷型、冈型、K型和D型的水稻细胞质类型。
背景技术
细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)是广泛存在于高等植物的现象，是细胞质基因组与细胞核基因组相互作用的结果：当细胞质为不育类型且细胞核基因组中不存在特定的恢复基因时，表现为不能产生正常的雄性配子，而雌性配子的发育和植株的营养生长正常；当细胞质为不育类型且细胞核基因组中存在特定的恢复基因时，育性得以恢复，表现为可育。研究表明，水稻的CMS现象与线粒体基因组的变异引起的功能性障碍或特异基因的表达关系密切，同时水稻线粒体属于母系遗传，因而通过线粒体标记可以追踪或分类水稻细胞质的来源(栾霁，水稻线粒体DNA遗传多态性及相关基因表达的研究，2012，66-90；以及Fuji et al，BMC Genomics,2010,11:209)。
CMS在水稻杂种优势利用方面具有重要的作用，杂交水稻在1970年代培育成功，实现了我国水稻单产质的飞跃(袁隆平，“21世纪论坛”2010年会议文集,2010，374-376)，其中野败型(CMS-WA)细胞质雄性不育在杂交稻领域应用最为广泛。自从野败型杂交水稻大面积推广应用以来，20世纪70年代到80年代中期，育种家们陆续发现了60余种不同细胞质来源的细胞质雄性不育系类型，包括野败型、包台型、红莲型、冈型、D型、K型、印尼水田谷型、矮败型和滇型等。根据败育组织特征这些细胞质雄性不育可以分为孢子体型细胞质雄性不育和配子体型细胞质雄性不育两种类型(朱英国，水稻雄性不育的生物学，2000)。
发明内容
一方面，本申请提供了鉴定水稻细胞质类型的方法，所述包括：i)利用选自以下的至少一种引物对来扩增待鉴定的水稻样品中的核酸片段，其中第一引物对包含正向引物：5’-ACGGTAAATCGCACAGGTT-3’，和反向引物：5’-CAGTAGATAGTAGAGAGGAGG-3’；和/或第二引物对包含正向引物：5’-ATTACCAACGGGTAGTGACAA-3’，和反向引物：5’-TACCATAATCCAAAGATTGAGTAC-3’；以及ii)确定所扩增的核酸片段的长度，其中，当第一引物对扩增的核酸片段长度为323bp和/或第二引物对扩增的核酸片段长度为247bp时，所述水稻样品为选自以下的细胞质类型：野败型、印尼水田谷型、冈型、K型和D型。
另一方面，本申请提供了鉴定水稻细胞质雄性不育系或其杂交水稻品种的方法，所述方法包括：i)利用选自以下的至少一种引物对来扩增待鉴定的水稻样品中的核酸片段，其中第一引物对包含正向引物：5’-ACGGTAAATCGCACAGGTT-3’，和反向引物：5’-CAGTAGATAGTAGAGAGGAGG-3’；和/或第二引物对包含正向引物：5’-ATTACCAACGGGTAGTGACAA-3’，和反向引物：5’-TACCATAATCCAAAGATTGAGTAC-3’；以及ii)确定所扩增的核酸片段的长度，其中，当第一引物对扩增的核酸片段长度为323bp和/或第二引物对扩增的核酸片段长度为247bp时，所述水稻样品为选自以下的水稻细胞质雄性不育系或其杂交水稻品种：野败型、印尼水田谷型、冈型、K型和D型。
在一实施方案中，所述方法中所使用的引物对还包含荧光基团。在另一实施方案中，所述荧光基团选自羧基荧光素、六氯荧光素、羧基四甲基罗丹明和羧基-X-罗丹明。
另一方面，本申请提供了区分水稻细胞质雄性不育系与其对应保持系的方法，所述方法包括：i)利用选自以下的至少一种引物对来扩增待鉴定的水稻样品中的核酸片段，其中第一引物对包含正向引物：5’-ACGGTAAATCGCACAGGTT-3’，和反向引物：5’-CAGTAGATAGTAGAGAGGAGG-3’；和/或第二引物对包含正向引物：5’-ATTACCAACGGGTAGTGACAA-3’，和反向引物：5’-TACCATAATCCAAAGATTGAGTAC-3’；以及ii)确定所扩增的核酸片段的长度，其中，当第一引物对扩增的核酸片段长度为323bp和/或第二引物对扩增的核酸片段长度为247bp时，所述水稻样品为选自以下的水稻细胞质雄性不育系：野败型、印尼水田谷型、冈型、K型和D型。
在一实施方案中，所述方法中所使用的引物对还包含荧光基团。在另一实施方案中，所述荧光基团选自羧基荧光素、六氯荧光素、羧基四甲基罗丹明和羧基-X-罗丹明。
又一方面，本申请提供了区分水稻细胞质雄性不育系杂交水稻品与其他类型杂交水稻品种的方法，所述方法包括：i)利用选自以下的至少一种引物对来扩增待鉴定的水稻样品中的核酸片段，其中第一引物对包含正向引物：5’-ACGGTAAATCGCACAGGTT-3’，和反向引物：5’-CAGTAGATAGTAGAGAGGAGG-3’；和/或第二引物对包含正向引物：5’-ATTACCAACGGGTAGTGACAA-3’，和反向引物：5’-TACCATAATCCAAAGATTGAGTAC-3’；以及ii)确定所扩增的核酸片段的长度，其中，当第一引物对扩增的核酸片段长度为323bp和/或第二引物对扩增的核酸片段长度为247bp时，所述水稻样品为选自以下的水稻细胞质雄性不育系杂交水稻品种：野败型、印尼水田谷型、冈型、K型和D型。
在一实施方案中，所述方法中所使用的引物对还包含荧光基团。在另一实施方案中，所述荧光基团选自羧基荧光素、六氯荧光素、羧基四甲基罗丹明和羧基-X-罗丹明。
此外，本申请还提供了用于鉴定水稻细胞质类型的引物对，其选自：第一引物对：正向引物：5’-ACGGTAAATCGCACAGGTT-3’，和反向引物：5’-CAGTAGATAGTAGAGAGGAGG-3’；和/或第二引物对：正向引物：5’-ATTACCAACGGGTAGTGACAA-3’，和反向引物：5’-TACCATAATCCAAAGATTGAGTAC-3’。
在一实施方案中，所述引物对还包含荧光基团。在另一实施方案中，所述荧光基团选自羧基荧光素、六氯荧光素、羧基四甲基罗丹明和羧基-X-罗丹明。
相应地，本申请提供了用于鉴定水稻细胞质类型的试剂盒，其包含第一引物对和/或第二引物对，其中第一引物对包含正向引物：5’-ACGGTAAATCGCACAGGTT-3’，和反向引物：5’-CAGTAGATAGTAGAGAGGAGG-3’；第二引物对包含正向引物：5’-ATTACCAACGGGTAGTGACAA-3’，和反向引物：5’-TACCATAATCCAAAGATTGAGTAC-3’。
在一实施方案中，所述试剂盒还包含：扩增缓冲液、dNTP混合物、DNA聚合酶、ddH2O。
进一步地，本申请还提供了引物对或者试剂盒的以下用途：i)用于鉴定水稻是否属于野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型细胞质类型；ii)用于鉴定野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型水稻细胞质雄性不育系或其杂交水稻品种；iii)用于鉴别野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型水稻细胞质雄性不育系与对应的保持系；iv)用于区分野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型杂交水稻品种与其他类型杂交水稻品种；或者v)用于区分野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型水稻细胞质雄性不育系或其杂交水稻品种与常规水稻品种。
可见，本申请提供了2对InDel分子标记扩增引物，使用其中任一对对待检测的水稻样品的核酸片段进行PCR扩增，均可得到稳定、特异性强的产物，可根据产物片段大小判定是否属于野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型水稻细胞质类型，或者是否属于野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型水稻细胞质雄性不育系及其杂交水稻品种，结果稳定、可靠且特异性强。
附图说明
图1为mtCMSID01荧光引物的ABI 3730XL DNA毛细管电泳检测结果图；其中A为扩增所得323bp带型；B为扩增所得326bp带型。
图2为mtCMSID02荧光引物的ABI 3730XL DNA毛细管电泳检测结果图；其中A为扩增所得117bp带型；B为扩增所得120bp带型。
图3为mtCMSID03荧光引物的ABI 3730XL DNA毛细管电泳检测结果图；其中A为扩增所得164bp带型；B为扩增所得165bp带型。
图4为mtCMSID04荧光引物的ABI 3730XL DNA毛细管电泳检测结果图；其中A为扩增所得267bp带型；B为扩增所得268bp带型。
图5为mtCMSID05荧光引物的ABI 3730XL DNA毛细管电泳检测结果图；其中A为扩增所得247bp带型；B为扩增所得250bp带型。
图6为mtCMSID06荧光引物的ABI 3730XL DNA毛细管电泳检测结果图；其中A为扩增所得154bp带型；B为扩增所得157bp带型。
具体实施方式
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。
***/缺失多态性(insertion/deletion,InDel)是由于等位基因位点处的DNA序列在不同个体间发生了核苷酸片段的***/缺失而产生的长度多态性变异。
根据目标位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增，扩增片段的长度多态性即是InDel标记，在整个基因组中，InDel的多态性频率仅次于SNP标记，远高于SSR标记。InDel标记为共显性标记，具有较好的稳定性和较为丰富的多态性，广泛应用于高分辨率图谱构建、关联分析、基因定位和目标性状分析标记筛选等领域。
越来越多的水稻细胞质雄性不育系线粒体基因组完成了测序，通过生物信息学分析，可以获得大量特异的DNA序列，这些特异的DNA序列在某一种水稻细胞质雄性不育系、某一类型(孢子体型细胞质雄性不育和配子体型细胞质雄性不育)不育系或某几种水稻细胞质雄性不育系中具有唯一性。
本申请通过针对所筛选的特异DNA序列设计引物，用于鉴定水稻细胞质类型、某一类型(孢子体型细胞质雄性不育和配子体型细胞质雄性不育)不育系或某几种水稻细胞质雄性不育系及其杂交品种。
具体地，本申请发明人以水稻线粒体基因组遗传变异为基础，对线粒体基因组序列进行分析比对，包括：Nipponbare(登录号BA000029)、WA-CMS(登录号JF281154)、Leadrice(登录号AP011077)、long-grained rice(登录号JF281153)、Hassawi(登录号JN861111)、Hassawi hybrid rice(IR1112 x Hassawi)(登录号JN861112)。以WA-CMS线粒体基因组序列为参照，分别与其他线粒体基因组序列进行BLAST分析比对，筛选出水稻细胞质雄性不育系(包括野败型、印尼水田谷型、冈型、K型、D型细胞质雄性不育系，均属于孢子体型细胞质雄性不育)共有的特异线粒体基因组序列，该特异DNA序列含有4个***缺失(InDel)位点，在Nipponbare线粒体基因组中的位置分别是ChrM:204670(1bp***)、ChrM:227762(3bp缺失)、ChrM:286920(3bp缺失)、ChrM:389371(1bp***)。
由于这些InDel位点是通过序列分析比对获得的，本申请发明人进一步通过实验来验证其真实性。此外，因针对这些InDel位点所设计的引物扩增效果及其分辨效果与InDel位点周边序列的结构密切相关，本申请发明人通过大量实验进行比较，筛选出最优的引物序列。
具体地，本申请发明人优化筛选出针对其中的一个InDel位点(在Nipponbare线粒体基因组中的位置为ChrM:227762的3bp缺失)具有特异性的两对引物：mtCMSID01(其中，mtCMSID01-F为5’-ACGGTAAATCGCACAGGTT-3’，和mtCMSID01-R为5’-CAGTAGATAGTAGAGAGGAGG-3’)；以及mtCMSID05(其中，mtCMSID05-F为5’-ATTACCAACGGGTAGTGACAA-3’，和mtCMSID05-R为5’-TACCATAATCCAAAGATTGAGTAC-3’)，其均能够准确、高效、稳定、可靠地鉴定出相关水稻细胞质类型，以及相关水稻细胞质雄性不育系和其杂交组合。
本申请所提供的引物还可包含本领域已知适用的任何荧光基团，以适应高通量检测需求，使扩增产物适用于荧光毛细管电泳检测。在具体实施方案中，荧光基团选自羧基荧光素、六氯荧光素、羧基四甲基罗丹明和羧基-X-罗丹明等，例如6-FAM，HEX等。
可以将本申请所提供的引物制备成试剂盒以便于使用。因此，本申请还提供了用于鉴定水稻细胞质雄性不育系或其杂交水稻品种的试剂盒，其包含引物mtCMSID01和/或mtCMSID05。
本申请所提供的试剂盒还可包含用于进行PCR反应所需的其他试剂，例如：扩增缓冲液、dNTP混合物、DNA聚合酶、ddH2O等。
在具体实施方案中，本申请所提供的鉴定水稻细胞质类型的方法，利用本申请所提供的引物对mtCMSID01和/或mtCMSID05来扩增待鉴定的水稻样品。具体地，当引物对mtCMSID01的扩增片段大小为323bp，和/或引物对mtCMSID05的扩增片段大小为247bp时，所述水稻样品为野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型水稻细胞质类型；相反地，当引物对mtCMSID01的扩增片段大小为326bp，和/或引物对mtCMSID05的扩增片段大小为250bp时，所述水稻样品不是野败型、印尼水田谷型、冈型、K型、D型水稻细胞质类型中的任一种。
在具体实施方案中，本申请所提供的鉴定水稻细胞质雄性不育系或其杂交水稻品种的方法，利用本申请所提供的引物对mtCMSID01和/或mtCMSID05来扩增待鉴定的水稻样品。具体地，当引物对mtCMSID01的扩增片段大小为323bp，和/或引物对mtCMSID05的扩增片段大小为247bp时，所述水稻样品为野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型水稻细胞质雄性不育系或其杂交水稻品种；相反地，当引物对mtCMSID01的扩增片段大小为326bp，和/或引物对mtCMSID05的扩增片段大小为250bp时，所述水稻样品不是野败型、印尼水田谷型、冈型、K型、D型水稻细胞质雄性不育系及其杂交组合中的任一种。
在另一具体实施方案中，本申请所提供的区分野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型水稻细胞质雄性不育系与对应的保持系的方法，利用本申请所提供的引物对mtCMSID01和/或mtCMSID05来扩增待区分的水稻样品。具体地，当引物对mtCMSID01的扩增片段大小为323bp，和/或引物对mtCMSID05的扩增片段大小为247bp时，所述水稻样品为野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型水稻细胞质雄性不育系或其杂交水稻品种；相反地，当引物对mtCMSID01的扩增片段大小为326bp，和/或引物对mtCMSID05的扩增片段大小为250bp时，所述水稻样品是野败型、印尼水田谷型、冈型、K型、D型水稻细胞质雄性不育系对应的保持系。
在又一具体实施方案中，本申请所提供的区分野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型杂交水稻品与其他类型杂交水稻品种的方法，利用本申请所提供的引物对mtCMSID01和/或mtCMSID05来扩增待区分的水稻样品。具体地，当引物对mtCMSID01的扩增片段大小为323bp，和/或引物对mtCMSID05的扩增片段大小为247bp时，所述水稻样品为野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型杂交水稻品种；相反地，当引物对mtCMSID01的扩增片段大小为326bp，和/或引物对mtCMSID05的扩增片段大小为250bp时，所述水稻样品是其他类型杂交水稻品种。
以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等《分子克隆实验手册》(Sambrook J&Russell DW,Molecularcloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 InDel标记的开发
在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载已公开的线粒体基因组序列，包括：Nipponbare(登录号BA000029)、WA-CMS(登录号JF281154)、Lead rice(登录号AP011077)、long-grained rice(登录号JF281153)、Hassawi(登录号JN861111)、Hassawihybrid rice(IR1112 x Hassawi)(登录号JN861112)。
以WA-CMS线粒体基因组序列为参照，分别与其他线粒体基因组序列进行BLAST分析比对，共找到4个InDel位点，分别是2个1bp的***位点，2个3bp的缺失位点。
上述差异位点在Nipponbare线粒体基因组中的位置分别是1bp***ChrM:204670、3bp缺失ChrM:227762、3bp缺失ChrM:286920、1bp***ChrM:389371。
利用Primer Premier 5分别针对上述各个InDel位点设计多对PCR扩增引物，引物长度设计参数为20±2bp，GC含量不小于45％，Tm值在55℃至60℃之间。
分别针对上述4个InDel位点设计了多对引物进行了PCR扩增验证，在此仅以其中的四对代表性引物为例，分别命名为mtCMSID01、mtCMSID02、mtCMSID03和mtCMSID04，其序列如下：
mtCMSID01(3bp缺失)：
mtCMSID01-F：5’-ACGGTAAATCGCACAGGTT-3’，
mtCMSID01-R：5’-CAGTAGATAGTAGAGAGGAGG-3’；
mtCMSID02(3bp缺失)：
mtCMSID02-F：5’-TGGAGTGGAGGCATTGCTATTC-3’，
mtCMSID02-R：5’-GTCTACGCTCGCTTTTGTTCTG-3’；
mtCMSID03(1bp***)：
mtCMSID03-F：5’-TAATGGGTGGCATAGCCCGTAG-3’，
mtCMSID03-R：5’-TGAGTCGCTCGTTCAACTGTCC-3’；
mtCMSID04(1bp***)：
mtCMSID04-F：5’-CTTTACTTCGGCTGTGGTCAT-3’，
mtCMSID04-R：5’-GGTTTCTTAATCGGTGTCTATC-3’。
为了适应高通量检测需求，使扩增产物适用于荧光毛细管电泳检测，可在上述引物中添加荧光基团。
在上游引物mtCMSID01-F、mtCMSID03-F和mtCMSID04-F的5’端添加6-FAM荧光基团，合成mtCMSID01-F-FAM、mtCMSID03-F-FAM和mtCMSID04-F-FAM引物，该引物仍可与对应的下游引物进行组合。
在上游引物mtCMSID02-F的5’端添加HEX荧光基团，合成mtCMSID02-F-HEX引物，该引物仍可与mtCMSID02-R进行组合。
根据前述设计过程可知：
当mtCMSID01扩增片段大小为323bp，或者mtCMSID02扩增片段大小为117bp，或者mtCMSID03扩增片段大小为165bp，或者mtCMSID04扩增片段大小为268bp时，该水稻材料为野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型水稻细胞质雄性不育系及其杂交组合；
当mtCMSID01扩增片段大小为326bp，或者mtCMSID02扩增片段大小为120bp，或者mtCMSID03扩增片段大小为164bp，或者mtCMSID04扩增片段大小为267bp时，该水稻材料不是野败型、印尼水田谷型、冈型、K型、D型水稻细胞质雄性不育系及其杂交组合中的任一种。
对新质源型不育系金农2A、野败型雄性不育系深95A及其对应的保持系深95B，使用上述引物进行检测，检验引物的分型效果，具体操作如下。
取单粒种子或约1cm长叶片，使用FOREGENE植物叶片直接PCR试剂盒(Plant LeafDirect PCR Kit,成都福际生物技术有限公司)进行检测。
PCR反应总体积为10μl，包括：DNA提取液，2μl；2xLeaf PCR EasyTM Mix，5μl；正向及反向引物，各0.1μl(10nmol/L)；ddH2O，2.8μl。
PCR反应程序为：94℃3min；94℃10sec，57℃20sec，72℃30sec，38个循环；72℃5min；25℃1sec。
对于使用未添加荧光基团的引物对扩增所得产物，使用聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析。
对于使用添加荧光基团的引物对扩增所得产物，稀释200倍后，取1μl与8.95μlHiDi、0.05μl Liz 500混合，于ABI 3730XL DNA分析仪上进行毛细管电泳，结果使用GeneMapper软件读取。
mtCMSID01荧光引物扩增带型如图1所示，mtCMSID02荧光引物扩增带型如图2所示，mtCMSID03荧光引物扩增带型如图3所示，mtCMSID04荧光引物扩增带型如图4所示。在各图中，上横坐标指示条带大小；下横坐标“al”代表等位基因型，数值表示最高峰对应的条带大小；纵坐标数值表示峰值；灰色区域为设置的Bin区间。
结果显示，在新质源型不育系金农2A和深95B中，mtCMSID01、mtCMSID02、mtCMSID03和mtCMSID04扩增产物大小依次为326bp、120bp、164bp和267bp；在野败型雄性不育系深95A中，mtCMSID01、mtCMSID02、mtCMSID03和mtCMSID04扩增产物大小依次为323bp、117bp、165bp和268bp；均与预期相符合，表明针对的InDel位点真实可靠。
此外，mtCMSID01和mtCMSID02扩增产物经***读取及识别，为单一主峰，易于判别，结果更准确可靠。mtCMSID03及mtCMSID04扩增产物均存在stutter峰，因位点本身仅有1bp差异，***读取时容易造成偏差，需手工校正，不适于大规模检测，故舍弃。
在与mtCMSID01相同InDel处，还获得了另一对能够准确可靠地进行鉴别的引物mtCMSID05，其序列为：
mtCMSID05-F：5’-ATTACCAACGGGTAGTGACAA-3’
mtCMSID05-R：5’-TACCATAATCCAAAGATTGAGTAC-3’；
当mtCMSID05扩增片段大小为247bp时，该水稻材料为野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型水稻细胞质雄性不育系及其杂交组合；当mtCMSID05扩增片段大小为250bp时，该水稻材料不是野败型、印尼水田谷型、冈型、K型、D型水稻细胞质雄性不育系及其杂交组合中的任一种。
在与mtCMSID02相同InDel处，还获得了另一对能够准确可靠地进行鉴别的引物mtCMSID06，其序列为：
mtCMSID06-F：5’-ACCGAACTCACATTATTTGG-3’
mtCMSID06-R：5’-CTAAATACAAAACAAGAGTC-3’；
当mtCMSID06扩增片段大小为154bp时，该水稻材料为野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型水稻细胞质雄性不育系及其杂交组合；当mtCMSID06扩增片段大小为157bp时，该水稻材料不是野败型、印尼水田谷型、冈型、K型、D型水稻细胞质雄性不育系及其杂交组合中的任一种。
采用前述方法，对新质源型不育系金农2A、野败型雄性不育系深95A及其对应的保持系深95B，使用mtCMSID05和mtCMSID06引物进行检测，检验引物的分型效果。
mtCMSID05荧光引物扩增带型如图5所示，mtCMSID06荧光引物扩增带型如图6所示。在各图中，上横坐标指示条带大小；下横坐标“al”代表等位基因型，数值表示最高峰对应的条带大小；纵坐标数值表示峰值；灰色区域为设置的Bin区间。
结果显示，在新质源型不育系金农2A和深95B中，mtCMSID05和mtCMSID06扩增产物大小分别为250bp和157bp；在野败型雄性不育系深95A中，mtCMSID05和mtCMSID06扩增产物大小分别为247bp和154bp；均与预期相符合，针对的InDel位点真实可靠。mtCMSID05和mtCMSID06扩增产物经***读取及识别，为单一主峰，易于判别，结果准确可靠。
最终，从所设计的多对引物中选定mtCMSID01、mtCMSID05、mtCMSID02和mtCMSID06用于鉴定不同类型水稻细胞质雄性不育系及其杂交组合。
实施例2利用InDel标记鉴定不同类型水稻细胞质雄性不育系
对表1所列的不育系及保持系各材料，以实施例1所述相同的方式进行基因型的检测。
各材料基因型检测结果参见表1和表2。
结果表明，mtCMSID01、mtCMSID05、mtCMSID02和mtCMSID06可将野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型水稻细胞质雄性不育系与其他类型不育系相区分。
因保持系与不育系细胞质基因组不同、细胞核基因组相同，所以mtCMSID01、mtCMSID05、mtCMSID02和mtCMSID06还可以将野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型水稻细胞质雄性不育系与其对应的保持系区分开。
表1利用mtCMSID01和mtCMSID05检测不同类型细胞质雄性不育系及保持系的结果
Figure BDA0001212538810000121
表2利用mtCMSID02和mtCMSID06检测不同类型细胞质雄性不育系及保持系的结果
Figure BDA0001212538810000131
实施例3利用InDel标记鉴定不同类型杂交水稻品种
三系杂交稻由细胞质雄性不育系与对应的恢复系配组而来，表3中“细胞质类型”为三系杂交水稻品种对应的雄性不育系类型，“丰两优4号”为两系杂交水稻品种。
对多个杂交水稻品种以实施例1所述相同的方式进行基因型的检测，结果如表3所示。结果表明，mtCMSID01、mtCMSID05、mtCMSID02和mtCMSID06可以准确的区分野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型杂交水稻品种与其他类型杂交水稻品种。
表3多个杂交水稻品种的检测结果
Figure BDA0001212538810000132
Figure BDA0001212538810000141
实施例4利用InDel标记鉴定常规水稻品种
对30份常规水稻品种以实施例1所述相同的方式进行基因型的检测，结果如表4和表5所示。
结果表明，在所检测的常规水稻品种中，mtCMSID01的扩增条带均为326bp，mtCMSID05的扩增条带均为250bp，mtCMSID02的扩增条带均为120bp，mtCMSID06的扩增条带均为157bp，均区别于野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型细胞质雄性不育系或其杂交水稻品种。
可见，mtCMSID01、mtCMSID05、mtCMSID02和mtCMSID06可以准确的将野败型或印尼水田谷型或冈型或K型或D型细胞质雄性不育系或其杂交水稻品种与常规水稻品种相区分。
表4利用mtCMSID01和mtCMSID05检测30份常规水稻品种的结果
Figure BDA0001212538810000142
Figure BDA0001212538810000151
表5利用mtCMSID02和mtCMSID06检测30份常规水稻品种的结果
Figure BDA0001212538810000152
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。
序列表
<110> 中国种子集团有限公司
<120> 鉴定水稻细胞质类型的方法
<130> 16C12755CN
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acggtaaatc gcacaggtt 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cagtagatag tagagaggag g 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tggagtggag gcattgctat tc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtctacgctc gcttttgttc tg 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
taatgggtgg catagcccgt ag 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgagtcgctc gttcaactgt cc 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctttacttcg gctgtggtca t 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggtttcttaa tcggtgtcta tc 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
attaccaacg ggtagtgaca a 21
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
taccataatc caaagattga gtac 24
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
accgaactca cattatttgg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ctaaatacaa aacaagagtc 20

Claims (13)

1.鉴定水稻细胞质类型的方法，其包括：
利用选自以下的至少一种引物对来扩增待鉴定的水稻样品中的核酸片段：
第一引物对：
正向引物：5’-ACGGTAAATCGCACAGGTT-3’，
反向引物：5’-CAGTAGATAGTAGAGAGGAGG-3’；
第二引物对：
正向引物：5’-ATTACCAACGGGTAGTGACAA-3’，
反向引物：5’-TACCATAATCCAAAGATTGAGTAC-3’；以及
确定所扩增的核酸片段的长度，
其中，当第一引物对扩增的核酸片段长度为323bp和/或第二引物对扩增的核酸片段长度为247bp时，所述水稻样品为选自以下的细胞质类型：野败型、印尼水田谷型、冈型、K型和D型。
2.鉴定水稻细胞质雄性不育系或其杂交水稻品种的方法，其包括:
利用选自以下的至少一种引物对来扩增待鉴定的水稻样品中的核酸片段：
第一引物对：
正向引物：5’-ACGGTAAATCGCACAGGTT-3’，
反向引物：5’-CAGTAGATAGTAGAGAGGAGG-3’；
第二引物对：
正向引物：5’-ATTACCAACGGGTAGTGACAA-3’，
反向引物：5’-TACCATAATCCAAAGATTGAGTAC-3’；以及
确定所扩增的核酸片段的长度，
其中，当第一引物对扩增的核酸片段长度为323bp和/或第二引物对扩增的核酸片段长度为247bp时，所述水稻样品为选自以下的水稻细胞质雄性不育系或其杂交水稻品种：野败型、印尼水田谷型、冈型、K型和D型。
3.区分水稻细胞质雄性不育系与其对应保持系的方法，其包括：
利用选自以下的至少一种引物对来扩增待区分的水稻样品中的核酸片段：
第一引物对：
正向引物：5’-ACGGTAAATCGCACAGGTT-3’，
反向引物：5’-CAGTAGATAGTAGAGAGGAGG-3’；
第二引物对：
正向引物：5’-ATTACCAACGGGTAGTGACAA-3’，
反向引物：5’-TACCATAATCCAAAGATTGAGTAC-3’； 以及
确定所扩增的核酸片段的长度，
其中，当第一引物对扩增的核酸片段长度为323bp和/或第二引物对扩增的核酸片段长度为247bp时，所述水稻样品为选自以下的水稻细胞质雄性不育系：野败型、印尼水田谷型、冈型、K型和D型。
4.区分水稻细胞质雄性不育系杂交水稻品种与其他类型杂交水稻品种的方法，其包括：
利用选自以下的至少一种引物对来扩增待区分的水稻样品中的核酸片段：
第一引物对：
正向引物：5’-ACGGTAAATCGCACAGGTT-3’，
反向引物：5’-CAGTAGATAGTAGAGAGGAGG-3’；
第二引物对：
正向引物：5’-ATTACCAACGGGTAGTGACAA-3’，
反向引物：5’-TACCATAATCCAAAGATTGAGTAC-3’； 以及
确定所扩增的核酸片段的长度，
其中，当第一引物对扩增的核酸片段长度为323bp和/或第二引物对的扩增片段大小为247bp时，所述水稻样品为选自以下的水稻细胞质雄性不育系杂交水稻品种：野败型、印尼水田谷型、冈型、K型和D型。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述引物对还包含荧光基团。
6.如权利要求5所述的方法，所述荧光基团选自羧基荧光素、六氯荧光素、羧基四甲基罗丹明和羧基-X-罗丹明。
7.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述水稻样品选自种子和叶片。
8.用于鉴定水稻细胞质类型的引物对，其选自：
第一引物对：
正向引物：5’-ACGGTAAATCGCACAGGTT-3’，
反向引物：5’-CAGTAGATAGTAGAGAGGAGG-3’；
第二引物对：
正向引物：5’-ATTACCAACGGGTAGTGACAA-3’，
反向引物：5’-TACCATAATCCAAAGATTGAGTAC-3’。
9.如权利要求8所述的引物对，其中所述引物对还包含荧光基团。
10.如权利要求9所述的引物对，所述荧光基团选自羧基荧光素、六氯荧光素、羧基四甲基罗丹明和羧基-X-罗丹明。
11.用于鉴定水稻细胞质类型的试剂盒，其包含权利要求8-10中任一项所述的引物对。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含：扩增缓冲液、dNTP混合物、DNA聚合酶以及ddH2O。
13.如权利要求8-10中任一项所述的引物对，或者如权利要求11或12所述的试剂盒，其用于以下的至少一种：
i) 鉴定水稻细胞质类型；
ii) 鉴定水稻细胞质雄性不育系或其杂交水稻品种；
iii) 鉴别水稻细胞质雄性不育系与其对应的保持系；
iv) 区分水稻细胞质雄性不育系杂交水稻品种与其他类型杂交水稻品种；
v) 区分水稻细胞质雄性不育系或其杂交水稻品种与常规水稻品种；
其中，所述水稻细胞质类型或者水稻细胞质雄性不育系选自：野败型、印尼水田谷型、冈型、K型和D型。
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