CN108324736A

CN108324736A - 脐带间质干细胞用于治疗肺纤维化的用途

Info

Publication number: CN108324736A
Application number: CN201810050629.5A
Authority: CN
Inventors: 傅毓秀
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-01-18
Filing date: 2018-01-18
Publication date: 2018-07-27
Also published as: TWI746772B; TW201838636A; US10668111B2; US20180271917A1

Abstract

本发明涉及脐带间质干细胞用于治疗肺纤维化的用途。

Description

脐带间质干细胞用于治疗肺纤维化的用途

技术领域

本发明涉及脐带间质干细胞用于治疗肺纤维化的用途。

背景技术

肺组织损伤可以由诸如吸烟，老化，空气污染，细菌，病毒，自由基，辐射和化学治疗剂以及遗传因素等多种因素引起。当肺受损时，功能性肺泡数量减少，肺泡腔逐渐被纤维化组织替代，引起肺纤维化(pulmonary fibrosis)。肺纤维化是不可逆的，并导致肺功能逐渐恶化。迄今为止，肺纤维化尚无有效的治疗方法。危及的是，肺纤维化的死亡率每年都在增加。

肺泡上皮覆盖肺的内表面区域，并且由两种形态和功能不同类型的细胞组成：I型肺泡上皮细胞(AEC1s)和II型肺泡上皮细胞(AEC2s)。当肺泡损伤时，AEC2s增生并转分化成AEC1s，以修复及促进肺上皮的修复(1-3)。然而，当严重损伤导致AEC1s大量死亡时，受损区域分泌许多炎性细胞因子，如转化生长因子β(TGF-β)。TGF-β吸引众多免疫细胞浸润病灶，引发更多炎症反应。炎症信号增强AEC2s的上皮间质转化(EMT)，表示许多AEC2转化为肌成纤维细胞(myofibroblasts)。活化的肌成纤维细胞不仅增生并表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，还产生并释放细胞外基质(ECM)。ECM组分在肺间质和肺泡空间的沉积是肺纤维化的指标。肺泡隔壁增厚导致更严重和不可逆的肺实变(lung consolidation)，这阻碍了肺的换气能力，导致肺功能恶化(4-10)。

一些研究人员已经研究了来自不同来源的干细胞(例如，脂肪MSCs(20,21)，骨髓MSCs(14,22)和来自瓦顿氏凝胶的人类脐带间质干细胞)(HUMSC)(23,24)在肺中抑制炎症反应或急性损伤的作用。然而，在大多数相关研究中，干细胞是在肺损伤后立即或损伤后一天即进行移植，从而只聚焦在干细胞治疗急性损伤或预防肺部炎症，因而预防肺纤维化的形成。此外，据报导，骨髓MSCs于肺部辐射照射后立即注射到肺中可分化为功能性肺细胞，因此可用于治疗肺损伤，然而在辐射照射的后期注射的骨髓MSCs却造成纤维化的发展(26)。

在临床实务上，大部分因为呼吸问题寻求诊疗的患者并不是处于早期阶段，而是已经发展成肺纤维化的时候。有需要提供治疗肺部的纤维化病症的有效医疗方法，特别是能逆转肺纤维化的状态。

发明内容

本发明基于不可预期的发现，就是将脐带间质干细胞(UMSCs)递送到肺纤维化动物模型中可有效减少动物中的纤维化状况和恢复肺功能。

因此，本发明提供了脐带间质干细胞(UMSCs)在制造治疗肺部的纤维化症状的药物中的用途。

在一些具体实施态样中，UMSCs是从脐带的瓦顿氏凝胶获得。

在一些具体实施态样中，UMSCs是是人类脐带间质干细胞(HUMSCs)。

在一些具体实施态样中，UMSCs有效降低或缓解一或多种肺部的纤维化症状，所述的肺部的纤维化症状选自以下所组成的群组：肺部的胶原蛋白沉积水平升高，肺部的细胞浸润水平升高，肺部的密度水平升高，和肺部的纤维母细胞活化水平升高；与正常水平相比而言。

在一些具体实施态样中，UMSCs有效地增加降低的肺体积水平，降低的肺空间水平和/或降低的肺泡数量；与正常水平相比而言。

在一些具体实施态样中，UMSCs有效地改善降低的血氧饱和度水平，缓解增加的呼吸速率水平和/或恢复肺的萎缩。

在一些具体实施态样中，UMSCs有效促进已经在肺中发生的纤维化组织的降解。

在一些具体实施态样中，UMSCs有效促进肺上皮的恢复。

在下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。从以下几个实施例的详细描述以及从所附的权利要求中，本发明的其它特征或优点将是显而易见的。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解前面的概述以及以下对本发明的详细描述。为了说明本发明，在附图中示出了目前较佳的实施例。然而，应该理解的是，本发明不限于所示的精确布置和手段。

在附图中：

图1显示诱发大白鼠左肺纤维化、和移植人类脐带间质干细胞的实验流程图。

图2显示大白鼠单侧左叶肺脏纤维化的动物模式成功建立。大白鼠在给予BLM药物伤害后不同天数牺牲，取其左、右肺脏，观察肺部的外观型态。由前面观、与后面观照片显示，正常组大白鼠的左、右肺均可以看见白色肺泡结构，肺泡完整而平滑(标示B及b)。在BLM伤害后第7天至第49天，左肺明显的萎缩，健康的肺泡仅出现在左肺的外周围，左肺的中央区域已经呈现没有肺泡的病变组织(标示C-G及c-g)。移植低剂量的人类脐带间质干细胞没有明显的改善(标示H及h)。移植高剂量的人类脐带间质干细胞能改善左肺***，肺泡的范围(标示I及i)。

图3A至图3D显示以HE与天狼猩红染色分析，移植人类脐带间质干细胞，能修复肺纤维化病鼠左肺的肺泡结构。大白鼠左肺切片，以H&E染色，分别由低倍逐渐放大左肺中央区域、或左肺***区域。结果显示，给予BLM伤害后，左肺中央区域出现大量细胞浸润情形。移植高剂量的人类脐带间质干细胞能改善左肺中央，细胞浸润的现象，同时，中央区域也出现肺泡的构造。加总所有左肺切片，定量左肺的总体积，显示移植高剂量人类脐带间质干细胞能明显增加左肺总体积(图3A)、提升左肺的肺泡总体积(图3B)、有效减少左肺发炎细胞浸润的面积(图3C)。各组左肺切片以天狼猩红染色，呈现红色区域即代表含有胶原蛋白，由低倍率逐渐放大倍率显示，在正常组大白鼠的左肺中，胶原蛋白主要出现在支气管周边、血管旁边。BLM伤害组的左肺，在BLM伤害后第7天到第14天，染上红色胶原蛋白的面积没有明显增加。在BLM伤害后第21天开始，染上红色胶原蛋白的面积明显上升，则代表肺纤维化的病况也明显增加，而此纤维化病况一直到给药后第49天都没有改善。移植人类脐带间质干细胞，可降低左肺内胶原蛋白(图3D)。*：与Normal组相比，有统计差异，p<0.05。#：与BLM组相比，有统计差异，p<0.05。与BLM+HUMSCs(LD)组相比，有统计差异，p<0.05。◆与BLM+HUMSCs(HD)组相比，有统计差异，p<0.05。

图4A至图4C显示以MRI核磁共振造影显示，移植高剂量的人类脐带间质干细胞，能有效改善左肺的肺泡空间。正常(Normal)组之大白鼠进行MRI肺部影像扫描，以左、右支气管分岔位置(Carina of trachea)为中心，取五片扫描图像来进行定量。胸腔内黑色讯号代表肺泡占有的空间，可以清楚看到正常组大白鼠左、右胸腔内肺泡的存在空间。BLM伤害组大白鼠MRI肺部影像扫描图像，结果显示，在BLM伤害后的第7天，左肺的肺泡空间明显变小，开始有白色实质化组织的浸润，到第14天，左肺的肺泡空间几乎完全丧失，完全被白色实质化组织占据，并一直持续到第49天。BLM+HUMSCs(LD)组、BLM+HUMSCs(HD)组大白鼠MRI肺部扫描影像。加总每只大白鼠这五片MRI影像图中，左肺黑色肺泡空间。结果发现，在BLM伤害后，肺泡体积明显减少，移植高剂量人类脐带间质干细胞可以有效提升肺泡空间(图4A)。以HE染色图片，逐渐由低倍率放大左肺***区域，结果显示，左肺***区域，仍然保留着肺泡的结构，正常组左肺***的肺泡结构，呈现型态较小，单面面积下因此数目较多。BLM伤害后，肺泡型态变大，单面面积下因此数目较少。移植人类脐带间质干细胞则肺泡型态较小。定量左肺***区域，单位面积内所含有之肺泡数量(图4B)、或单位面积内所含肺泡的圆周总长度(图4C)，结果显示，移植人类脐带间质干细胞能有效提升单位面积的肺泡数量、及圆周总周长，以利气体的交换。*：与Normal组相比，有统计差异，p<0.05。#：与BLM组相比，有统计差异，p<0.05。与BLM+HUMSCs(LD)组相比，有统计差异，p<0.05。◆与BLM+HUMSCs(HD)组相比，有统计差异，p<0.05。

图5显示移植人类脐带间质干细胞，能改善肺纤维化病鼠的体重。各组大白鼠，从尚未给予BLM伤害的第0天，便开始记录体重，每周纪录，持续七周。结果显示，移植高剂量的人类脐带间质干细胞可以改善肺纤维化病鼠的体重。

图6A至图6B显示移植人类脐带间质干细胞，能改善肺纤维化病鼠的肺功能。各组大白鼠每周接受前肢动脉血氧饱和度的检测，照片显示第49天大白鼠的血氧饱和度，正常组为98％、BLM伤害组为80％、BLM+HUMSCs(LD)组为85％、BLM+HUMSCs(HD)组为93％。定量统计图显示，在接受BLM伤害后，第7天开始，血氧饱和度明显降低，此降低趋势一直维持到第49天，移植干细胞后，则有助于血氧饱和度的提升(图6A)。各组大白鼠每周纪录呼吸频率，定量图显示，在接受BLM伤害后，第7天开始，呼吸频率会明显增快；移植干细胞后则有助于舒缓呼吸速率(图6B)。*：与Normal组相比，有统计差异，p<0.05。#：与BLM组相比，有统计差异，p<0.05。与BLM+HUMSCs(LD)组相比，有统计差异，p<0.05。◆与BLM+HUMSCs(HD)组相比，有统计差异，p<0.05。

图7显示以荧光标示，照片显示人类脐带间质干细胞存活和分布于肺纤维化病鼠的左肺中。以BisBenzimide处理体外培养中的人类脐带间质干细胞48小时，用以标定干细胞的细胞核。BLM伤害后第21天，植入人类脐带间质干细胞于大白鼠气管内，移植四周后，经由连续冷冻切片，结果发现，BLM+HUMSCs(HD)组大白鼠从左肺最外侧(标记A、a、a1-a4)、中间位置(标记B、b、b1-b4)、到左肺内侧接近肺门处(标记C、c、c1-c4)，均可以发现数量不少的人类脐带间质干细胞的存活、与分布。左上为切片位置示意图，标记A、B、C分别表示左肺不同位置的Phase照片；a、b、c则分别为标记A、B、C的荧光照片，a1-a4为标记a、b1-b4为标记b、c1-c4为标记c中不同区域的放大照。

图8显示以抗体标示，照片显示人类脐带间质干细胞存活和分布于肺纤维化病鼠的左肺中。进一步，以抗人类核抗原抗体进行组织免疫染色，以标定人类脐带间质干细胞，由低倍率逐渐放大倍率，发现不论是低剂量移植组(标记D,D1-D3)、或高剂量移植组(标记E,E1-E3)的大白鼠左肺中，均可以发现数量不少的人类脐带间质干细胞的存在、与分布。

图9显示存活于肺纤维化病鼠左肺中的人类脐带间质干细胞，并没有分化成肺泡上皮细胞。以RT-PCR方式检测人类脐带间质干细胞的分化情形。A549为人类肺腺癌细胞株，作为人类SP-D、以及人类GAPDH的阳性对照组。HUVEC为人类脐静脉内皮细胞，作为人类PECAM-1、以及人类GAPDH的阳性对照组。结果显示，人类脐带间质干细胞在大白鼠左肺内，并没有分化为肺泡上皮细胞、或血管内皮细胞。

图10显示移植人类脐带间质干细胞，能降低肺纤维化病鼠左肺内纤维母细胞的活化。以抗-α-SMA抗体，标定各组大白鼠左肺中活化态的纤维母细胞。西方墨渍照片显示大白鼠左肺中α-SMA蛋白的含量。结果显示，BLM伤害后第7天到第49天，活化态纤维母细胞数目明显增加，移植高剂量的人类脐带间质干细胞后，活化态的纤维母细胞明显减少。*：与Normal组相比，有统计差异，p<0.05。◆与BLM+HUMSCs(HD)组相比，有统计差异，p<0.05。

图11显示移植人类脐带间质干细胞，能增加肺纤维化病鼠左肺内MMP-9的合成，以促进分解胶原蛋白。西方墨渍图片显示，各组大白鼠左肺中MMP-9、及MMP-2蛋白质的含量，定量结果显示，移植人类脐带间质干细胞，大白鼠左肺中MMP-9蛋白质的含量有显著的上升，然而，MMP-2则没有明显变化。

图12显示移植人类脐带间质干细胞，能增加肺纤维化病鼠左肺内TLR-4的产量，以促进肺泡上皮细胞更新与再生。西方墨渍图片显示，各组大白鼠左肺中TLR-4蛋白质的含量，定量结果显示，移植人类脐带间质干细胞，大白鼠左肺中TLR-4蛋白质的含量有显著的上升。

图13A至图13B显示植入的人类脐带间质干细胞，分泌生物激素，帮助肺纤维化病鼠的肺脏修复。取正常组第49天、BLM伤害组第49天、及BLM+HUMSCs组第49天的左肺，进行Human cytokine antibody array分析，结果显示，植入人类脐带间质干细胞的肺纤维化病鼠，左肺内人类的FGF-6、IGF-1浓度明显增加(图13A)。D为Cytokine array片子上相对应之生物激素名称。另一方面，也进行大鼠生物激素抗体点阵(Rat cytokine antibody array)分析(B)，结果显示，植入人类脐带间质干细胞，能够刺激肺纤维化病鼠左肺产生较高量的β-NGF、神经趋化蛋白(Fractalkine)、GM-CSF。BLM伤害会导致大白鼠左肺内的IL-13、瘦素(Leptin)、LIX、L-选择素(Selectin)、MCP-1浓度增加(图13B)。*：与正常(Normal)组相比，有统计差异，p<0.05。#：与BLM组相比，有统计差异，p<0.05。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。

如本文所使用的，冠词“一”和“一个”是指冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“一个元素”是指一个元素或多于一个元素。

术语“包括”或“包含”通常以包括/包括允许存在一个或多个特征，成分或组分的意义来使用。术语“包括”或“包含”涵盖术语“由...组成”或“由......组成”。

如本文所用，“脐带间质干细胞(UMSC)”是指哺乳动物脐带中的干细胞，较佳其中的间质组织(mesenchymal tissue)，包括未纯化的细胞培养物或纯化的细胞。UMSCs是多能的(multipotent)，可以分化成多种细胞类型，如成骨细胞，软骨细胞，肌细胞，脂肪细胞和神经元样细胞。UMSCs具有许多优点。出生后被认为是医疗废物的脐带很容易获得，没有道德上的顾虑，UMSCs可以通过从源头上的简单处理即可取得，并且细胞数量很多，还能够在培养物中快速扩增。具体而言，一些研究表示人类UMSCs具有免疫兼容性，因此适用于异体移植。

适用于本发明的UMSCs可以来自脐带“瓦顿氏凝胶(Wharton's jelly)”，其也被称为层间冻(inter-laminar jelly)，即脐带中发现的粘液***物质。如本文所述的UMSCs可以以多种方式获得。例如，它们可能来自脐带组织。脐带组织可以例如通过解剖，切碎，洗涤，酶促消化或其任何组合进行处理。术语“UMSCs”不仅包括从脐带中的间质组织直接分离的干细胞，而且还包括直接从脐带中的间质组织分离的干细胞经由体外培养的干细胞。细胞可以在任何合适的培养基如Dulbecco's改良的Eagle培养基(DMEM)中培养，所述培养基可以补充有任何合适的补充物，如胎牛血清(FBS)。细胞可以基于其在本领域中已知的特征来确认或选择，例如，它们贴附到基质的能力，例如，血管表面和/或细胞表面标志物的特定轮廓，例如CD105，CD44，CD90和/或CD73的阳性表达，和/或HLA，CD34，CD14，CD19和/或CD45的阴性表达。较佳地，UMSCs是人类脐带间质干细胞(HUMSCs)。用于从脐带分离UMSCs的方法，体外细胞培养/扩增和细胞表征是已知的并且可用于本领域，例如，美国专利申请公开号第20080305148号和第20150125950号中所述的方式获得。

如本文所用，“肺纤维化(PF)”或肺中的纤维化病症是涉及肺组织的疤痕或纤维***形成的肺部疾病或病症。在正常成人肺中，超过约25％(w/w)的肺是***，主要由细胞外基质(ECM)组成，例如胶原蛋白，弹性蛋白，蛋白聚醣和糖蛋白。一般而言，当肺受损时，肺纤维母细胞被激活，以产生ECM。ECM可以被蛋白酶降解，例如，某些基质金属蛋白酶(MMPs)。过量ECM的积聚导致壁增厚并导致呼吸问题。肺组织损伤也诱发炎症反应，增加肺中的细胞浸润。肺中纤维化的其它特征包括肺密度增加(例如，支气管肺泡灌洗液(BALF)中的总细胞计数(TCC))，肺体积/容积减小，肺空间和肺泡数量增加以及肺萎缩。肺部纤维化病人可能表现为呼吸频率快，气体交换不良。其他常见症状包括咳嗽，疲劳和虚弱，胸部不适，食欲不振，体重减轻。常规测试可用于鉴定患有肺纤维化病症的患者，例如胸部X射线，高分辨率计算器断层扫描(HRCT)，磁共振成像(MRI)，肺功能测试，脉搏血氧计，动脉血气体(ABG)测定，支气管镜检查，支气管肺泡灌洗(BAL)，肺部活组织检查，运动试验，esophogram和超声心动图(ECHO)。

在临床上，诊断为肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)的患者可以是特发性或非特发性(继发性)。当没有已知的肺纤维化发生的原因时，这种纤维化被称为特发性肺纤维化(IPF)。如果纤维化与另一种疾病明显相关，或者肺部纤维化/疤痕形成是特定药物的副作用或暴露于已知引起肺纤维化的药物，那么这种纤维化被称为非特发性肺纤维化。例如，与另一种疾病(例如，硬皮病或类风湿性关节炎)明显相关的肺纤维化可以被认为是继发于硬皮病或继发于类风湿性关节炎的肺纤维化。被认为促进肺纤维化的因素的一些其他例子包括吸烟，暴露于环境污染物或粉尘，病毒或细菌肺感染，特定药物如某些抗生素，化学治疗剂或治疗性辐射以及遗传倾向。

如本文所用，如本文所述的与肺纤维化病症有关的指数或症状的降低或升高的水平是参照其对照(或正常)水平。如本文所使用的，术语“正常水平”或“对照水平”是描述本领域普通技术人员和/或医疗专业人员预期一个健康的个体或具有类似身体特征和病史的人群具有的值。例如，升高的水平表示高于对照(或正常)水平5％，10％，20％，30％，50％，70％，90％，100％，200％，300％，500％或更多，与对照(或正常)水平比较而言；而降低的水平是指低于对照(或正常)水平5％，10％，20％，30％，50％，70％，90％，100％，200％，300％，500％或更多，与对照(或正常)水平相比而言。

如本文所用的术语“需要治疗方法的个体”是表示需要治疗肺纤维化或肺部的纤维化病症的人类或非人类动物。具体而言，需要治疗方法的个体是患有肺部的一或多种纤维化病症的个体。

在一些具体实施态样中，需要本发明治疗方法的个体表现出以下一种或多种病症：肺部的胶原蛋白沉积水平升高，肺部的细胞浸润水平升高，肺部的密度水平升高，和/或肺部的纤维母细胞的活化水平升高，与正常水平相比而言。

在一些具体实施态样中，需要本发明的治疗方法的个体表现出以下一或多种病症：降低的肺部体积水平，降低的肺部空间水平，降低的肺泡数量，与正常水平相比。

在一些具体实施态样中，需要本发明治疗方法的个体表现出下降的血氧饱和度水平和/或升高的呼吸速率(由于肺功能受损导致)，与正常水平相比。

在某些具体实施态样中，需要本发明治疗方法的个体是被诊断患有肺纤维化(PF)的患者。

在此使用的术语“个体”或“主体”包括人类和非人类动物，如伴侣动物(如狗，猫等)，农场动物(如牛，绵羊，猪，马等)，或实验动物(如大鼠，小鼠，豚鼠等)。

如本文所用的术语“治疗”是指将包含一种或多种活性剂的组合物施用或施用于患有疾病，疾病病症或疾病症状或疾病进展(恶化)的对象，目的是治愈，治愈，缓解，舒解，改变，改善，改良，增进或影响该疾病，该疾病的病症或症状，疾病诱发的障碍或障碍的进展。具体而言，如本文中所使用的，治疗肺纤维化或肺部纤维化的症状包括完全地或部分地帮助从纤维化恢复或逆转为正常状态。

本文使用的术语“治疗有效量”是指活性成分在治疗对像中提供所需的治疗或生物作用的量。例如，用于治疗肺部的纤维化症状的有效量可以是UMSCs的量，其足以使疾病状态完全地或部分地从疾病状态朝向正常水平恢复(或逆转)。

在一些具体实施态样中，治疗有效量的UMSCs是足以引起ECM(例如胶原蛋白)在肺中的ECM(如胶原蛋白)沉积，肺中的细胞浸润，肺密度和/或肺部的纤维母细胞的活化，降低5％，5％，10％，20％，30％，50％，70％，90％，100％，200％，300％或500％或更多，相对于施用UMSCs之前的对应水平。

在一些具体实施态样中，治疗有效量的UMSC是足以引起肺体积，肺空间(airspace)，肺泡数量和/或肺功能增加5％，5％，10％，20％，30％，50％，70％，90％，100％，200％，300％或500％或更多，相对于施用UMSCs之前的对应水平。

在一些具体实施态样中，治疗有效量的UMSCs是足以引起提升ECM(例如胶原蛋白)的降解和/或肺上皮的恢复，相对于施用UMSCs之前的对应水平。具体而言，ECM的降解可由某些特定基质金属蛋白酶(MMP)的活化引起，如MMP9。此外，肺上皮的修复可能涉及Ⅱ型肺泡上皮细胞(AEC2s)的增殖，并转分化为Ⅰ型肺泡上皮细胞(AEC1s)。

治疗有效量可以根据各种原因而改变，例如给药途径和频率，接受所述药物的个体的体重和种类，以及给药目的。本领域技术人员可以根据本文的公开内容，确定的方法和他们自己的经验确定每种情况下的剂量。例如，在某些具体实施态样中，UMSCs以每次施用至少10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或更多个细胞的量施用。

根据本发明，可以通过本领域已知的各种程序来施用UMSCs。细胞可以全身给药，例如，通过静脉内，动脉内，鼻腔或腹膜内给药，如，经由注射。细胞可以来自各种来源，包括自体的(autologous)，同种异体的(allogenic)或异种的(xenogenic)。

特别地，为了实施本发明的方法，可以将UMSCs直接递送至呼吸道(例如鼻或气管)并因此递送至肺。在本发明的较佳实施例中，通过直接注射将UMSCs递送至期望的区域。作为活性成分的UMSCs也可以与药学上可接受的载体一起配制以形成适合形式的药物组合物(例如，作为细胞悬浮液)以用于递送。取决于给药方式，本发明的药物组合物可包含约0.1重量％至约100重量％的活性成分，其中基于整个组合物的重量计算重量百分比。“医药上可接受的载体”在所采用的剂量和浓度下对个体是无毒的，并且与UMSCs和包含UMSCs的任何制剂的任何其他成分兼容。例如，用于含有UMSCs的制剂的合适的药学上可接受的载体可以包括但不限于甘露醇，水，林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。

在一些具体实施态样中，可以在合适的等渗液体，例如，磷酸盐缓冲盐水，培养基，例如，DMEM，生理盐水，葡萄糖水溶液和/或其混合物以及本领域技术人员已知的其它合适的液体中制备UMSCs溶液。应该保护最终的治疗形式免受污染，并应该能够抑制微生物如细菌或真菌的生长。可以施用单一的静脉内剂量。或者，可以使用缓慢的长期输注或多个短期的每日输注。如果需要，也可以使用每隔几天交替一天或一次给药。

通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例仅用于说明而不是限制。根据本公开内容，本领域技术人员应该理解，可以在所公开的具体实施方式中做出许多改变，并且仍然获得相似或相似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。

实施例

1.材料与方法

1.1实验动物

实验所使用的实验动物来源是阳明大学实验动物中心所提供六周龄大的雄性Srague-Dawley(S.D.)品系大白鼠，体重约200-250g，饲养方式为45×24×20cm的透明PC笼子饲养，每日照光12小时(上午七点半至下午七点半)，环境温度恒温空调(22±2℃)并且充分供应饲料(Laboratory Animal Diets MF18)与饮用水，每星期更换垫料一次。

1.2左肺纤维化之动物模式建立

将雄性大白鼠(SD rats，200-250g)以舒泰50(Zoletil 50)及盐酸赛拉嗪(Xylazine hydrochloride)(Sigma 23076359)腹腔注射麻醉后，在大白鼠颈部处以剃毛刀将毛剃除干净，并以棉花棒沾取碘酒溶液消毒大白鼠的皮肤后，将其颈部的皮肤划开，再用剪刀将皮下组织撑开至露出气管，2mg/200μl的博来霉素(blomycin)(简称BLM)，以30G针头，注入到大白鼠支气管内。将老鼠向左倾斜60度，90分钟。BLM购自于Nippon Kayaku Co.,Ltd，BLM粉末以无菌生理食盐水溶解，配置成5mg/100μl的保存液(Stock solution)，置于4℃保存。使用时，再将其以无菌生理食盐水稀释五倍，成1mg/100μl的作用浓度。

1.3人类脐带间质干细胞之分离、培养、与移植

本实验采用分娩后的脐带，以无菌方式收集并保存于4℃之汉克斯平衡盐溶液(HBSS，Hanks'Balanced Salt Solution)的缓冲溶液中，24小时内进行脐带***的分离培养，实验器械皆经由高温高压灭菌后使用，实验中全程以75％酒精消毒，并于使用前过火。于无菌操作台内将脐带取出，并以75％酒精浸泡进行消毒后，置于HBSS缓冲溶液。接着，用已灭菌的器械分离并切碎脐带间质组织(瓦顿氏凝胶，Wharton’s jelly)，离心4000rpm，5分钟。移除上清液，再将脐带间质组织加入胶原蛋白酵素(Collagenase)、及胰蛋白酵素(Trypsin)作用，接着，加入胎牛血清(FBS)(Gibco 10437-028)终止胰蛋白酵素反应。此时，脐带间质组织已经处理成为人类脐带间质干细胞(Human Umbilical Mesenchymal StemCell；简称HUMSCs)。最后，将脐带间质干细胞加入适量10％胎牛血清(FBS)Dulbecco's改良培养基(DMEM，Dulbecco's Modified Eagle Medium)打散细胞，计算细胞数，并进行细胞培养。

人类脐带间质干细胞先以0.05％胰蛋白酵素-乙二胺四乙酸二钠(Trypsin-EDTA)(Gibco 15400-054)处理2.5分钟，收集细胞液，再以10％FBS DMEM清洗两次，以1500rpm离心5分钟，去除上清液，取下层细胞，分别取5×10⁶、及2.5×10⁷人类脐带间质干细胞，并用200μl 0.1M无菌磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)悬浮。

将雄性大白鼠(SD rats，200-250g)以舒泰50(Zoletil 50)及盐酸赛拉嗪(Xylazine hydrochloride)(Sigma 23076359)腹腔注射麻醉后，在大白鼠颈部处以剃毛刀将毛剃除干净，并以棉花棒沾取碘酒溶液消毒大白鼠的皮肤后，将其颈部的皮肤划开，再用剪刀将皮下组织撑开至露出气管。分别将5×10⁶、及2.5×10⁷人类脐带间质干细胞，以Hamilton针移植入大白鼠气管内。

1.4实验分组

本实验动物共分四组：

第一组为正常(Normal)组，即在大白鼠六周龄时，气管内接受200μl生理食盐水(Saline)注射的正常大白鼠。

第二组为BLM组，即在大白鼠六周龄时，气管内接受2mg BLM注射的病鼠组，分别于第7天、第14天、第21天、第28天、以及第49天牺牲老鼠。

第三组为BLM+HUMSCs(LD)组，即在大白鼠六周龄时，气管内接受2mg BLM注射。在BLM注射后第21天，经气管内移植低剂量5×10⁶的人类脐带间质干细胞。

第四组为BLM+HUMSCs(HD)组，即在大白鼠六周龄时，气管内接受2mg BLM注射。在BLM注射后第21天，经气管内移植高剂量2.5×10⁷的人类脐带间质干细胞。实验流程图如图1所示。

1.5实验动物肺功能检测-动脉血氧饱和度的测定

将实验动物的前肢剃毛后，以爱尔能吸入剂(Isoflurane,Baxter 228-194)将老鼠麻醉40分钟后，使用脉冲式血氧浓度器(Pulseoximeter,Rossmax SB100)夹住已经剃毛的前肢，用以测得动脉血中的氧气饱和度。

1.6实验动物肺功能检测-肺部呼吸频率的测定

将实验动物放至于密闭式的圆筒呼吸侦测舱室(emka Technologies,Whole bodyplethysmograph)，以BIOPAC BSL 4.0 MP45软件收集大白鼠15分钟内呼吸气流的变化情形，进一步，定量大白鼠在舱室内静置不动时的呼吸频率。

1.7核磁共振造影(Magnetic Resinance Imaging，简称MRI)

使用台大贵重仪器中心的核磁共振造影(BRUKER BIOSPEC 70/30 MRI核磁共振影像/光谱仪)来获取大白鼠的肺部影像。大白鼠从吻侧端往尾侧端，以每1.5mm间距进行胸腔水平切面拍摄扫瞄并取相，直到扫描整个胸腔结束，每只老鼠因胸腔第一片取相的位置略有差异，因此胸腔所有水平切面的总片数，约20至25片之间。

使用Image-Pro Plus软件，取左右支气管分岔位置(Carina of Trachea)作为影像定位标志，以气管隆突(Carina)为中心，往前两片、及往后两片的影像图，再加上气管隆突(Carina)的水平面影像图，共五片MRI影像图进行黑色肺泡空间的定量，来代表这只老鼠左肺的肺泡体积。

1.8实验动物牺牲及灌流固定

各组实验动物，以舒泰50(Zoletil 50)及盐酸赛拉嗪(Xylazine hydrochloride)(Sigma 23076359)腹腔注射麻醉后，再进行灌流。先以0.1M磷酸盐缓冲生理盐水(英语：Phosphate buffered saline，简称为PBS)灌流后，取出左、右肺脏，泡入4％多聚甲醛(Paraformaldehyde)(Sigma 10060)、与7.5％苦味酸(Picric acid)(Sigma 925-40)溶于0.1M PB的固定液，在4℃环境中固定3天。再进行室温抽真空6小时，灌流后，取出左、右肺脏，置于4℃环境中后固定2天，接着，进行石蜡包埋与免疫染色。

1.9组织石蜡包埋、与切片

固定后之左、右肺脏，依序放入70％、80％、95％(I)、95％(II)(Takechi et al.,2013)的酒精中，置于震荡器上摇晃，每次20分钟。放入100％的酒精中，进行6次脱水，每次30分钟。组织脱水结束后，放入二甲苯(Xylene)(J.T.Baker 9490-03)中约1分钟，接着放入二甲苯(Xylene)：石蜡＝1:1混合液中15分钟，再放入二甲苯(Xylene)：石蜡＝1:3混合液中15分钟，之后放入纯蜡中浸泡3次，每次30分钟。最后进行纯蜡包埋组织。

将肺脏组织切成5μm厚度之切片。组织切片置于40℃至45℃温水中展平，再将肺脏组织切片贴于玻片上，放置50℃加热平台上烘干。

由肺脏最外侧进行矢状切面，连续切片收10片，依照1、2、3、……、10的顺序，分别放在不同玻片上，进行不同组织免疫染色。以正常(Normal)组为例，肺组织片1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分别将其放在玻片A、B、C、D、E、F、G、H、I、J，接着丢取11到30片，共20片。逐渐往肺门处，接着，如上所列举，按着顺序，将31、32、33、……、40分别将其放在玻片A、B、C、D、E、F、G、H、I、J，再丢20片后，以相同的方式，将整个肺脏组织收取结束。因此，A纵列的肺组织片，1、31、61、91、121～871皆进行苏木紫-伊红染色；B纵列的肺组织片，2、32、62、92、122～872皆进行组织纤维化染色；C纵列的肺组织片，3、33、63、93、123～873皆进行抗-ED1免疫组织染色，标定发炎的情形；D纵列的肺组织片，4、34、64、94、124～874皆进行Anti-proSPC免疫组织染色，标定第二型肺泡上皮细胞的变化情形；E纵列的肺组织片，5、35、65、95、125～875皆进行抗-α-SMA免疫组织染色，标定肌纤维母细胞的变化情形。横列A①～J①、A②～J②、A③～J③代表每叶左肺的最外侧区域；A⑥～J⑥、A⑦～J⑦则代表左肺靠近肺门的区域。根据不同组别，所能收取到的肺组织片数，略有不同，约330至880片之间。剩下的F～J纵列留为备用片。

1.10苏木紫-伊红染色(Hematoxylin&Eosion Stain，简称H&E Stain)

肺组织切片先进行脱蜡(依序放入二甲苯(Xylene)I、二甲苯(Xylene)II各5分钟)、复水(依序100％、95％、80％、70％酒精、及流动的水，各3分钟)后，置于苏木紫(Hematoxylin)溶液(MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD，No.3008-1)中染5分钟，再以流动的水冲洗30分钟，接着，将肺组织片置于伊红(Eosin)溶液(MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD，No.3200-2)中染2.5分钟，随即，组织片浸泡于冰醋酸3秒，以流动的水冲洗5分钟。肺组织切片浸泡至浓度递增的酒精内进行脱水(依序为50％、70％、80％、90％、95％、100％两次，各2分钟)，再浸泡于二甲苯两次，每次5分钟。最后，以封片胶(Permount,Fisher ScientificSP15-500)封片，进行光学显微镜观察、及拍照。

1.11组织纤维化染色(Sirius Red Stain)

肺组织切片脱蜡、复水后，置入0.1％天狼腥红(Sirius red)(Sigma 2610-10-8)于苦味酸中染10分钟，随即，肺组织片浸泡于二次水清洗30秒，接着，将肺组织片切片浸泡至浓度递增的酒精内进行脱水(依序为50％、70％、80％、90％、95％、100％两次，各脱水30秒)，再浸泡于二甲苯两次，每次5分钟。最后，以封片胶封片，进行光学显微镜观察及拍照。

1.12组织免疫染色(Immunohistochemistry，简称IHC)

首先，将烘干的肺组织切片先进行脱蜡、复水步骤，再置于0.296％柠檬酸三钠二水合物(Trisodium citrate dihydrate)(Kanto chemical 37150-00)溶液中，加热至沸腾后，计时10分钟，随后于室温降温，直到室温，再浸于0.1M PBS溶液30分钟，完成组织抗原的回复，即可进行免疫染色。

将抗原回复后的组织切片，以0.1M PBS清洗5分钟3次，再以阻断溶液(Blockingsolution)(3％牛血清白蛋白(Bovine serum albumin)、1％采酮(Triton)X-100、5％FBS)于室温下反应60分钟。再分别加入初级抗体小鼠抗-α-SMA抗体(Sigma，1：400)、小鼠抗-ED1抗体(Millipore，1：400)、兔抗-proSPC(Millipore，1：400)，于4℃下反应16至18小时。以0.1M PBS清洗5分钟3次，接着，与二级抗体山羊抗小鼠IgG-共轭生物素(KPL，1：250)、或者山羊抗兔IgG-共轭生物素(KPL，1：250)于室温下反应60分钟，同样以0.1M PBS清洗5分钟3次，再以卵白素(抗生物素)-生物素结合的辣根过氧化物酶复合物(Avidin-biotinylated-horseradish peroxidase complex)(ABC Kit，Vector Laboratories)于室温下反应60分钟后，以0.1M PBS清洗5分钟3次，最后，以DAB(5mg DAB，30％H₂O₂ 3.5μl in 10ml Tris-HClpH7.4)进行呈色。

染色完成后，将肺组织片于室温风干，并进行脱水。将肺组织切片浸泡于浓度递增的酒精内进行脱水(依序为50％、70％、80％、90％、95％、100％两次，各脱水30秒)，再浸泡于二甲苯(Xylene)两次，每次5分钟。最后，以封片胶封片，进行光学显微镜观察及拍照。

1.13以双苯酰亚胺(BisBenzimide)追踪人类脐带间质干细胞的存活及分布

为了追踪植入大白鼠肺脏之人类脐带间质干细胞的存活与分布情形，人类脐带间质干细胞在进行移植之前，加入最终浓度1μg/ml双苯甲酰胺(Bisbenzamide)(SigmaB2883)，用以标定细胞，48小时后，再以0.05％胰蛋白酵素(Trypsin)(Gibco 15400-054)处理，收集细胞进行移植手术。在大白鼠给予BLM第21天后，进行人类脐带间质干细胞移植，一个月后，牺牲大白鼠，先进行灌流固定，再准备冷冻切片的保护步骤，先以0.1M PBS灌流，再以4％多聚甲醛(Paraformaldehyde)(Sigma 10060)、与7.5％苦味酸(Picric acid)(Sigma925-40)溶于0.1M PB的固定液，进行灌流固定。将大白鼠的左、右肺脏取出，放入固定液室温下抽真空6小时后，放置4℃下固定16至18小时。接着，换入5％蔗糖(Sucrose)于0.1M磷酸缓冲液(PB)抽真空30分钟，接着，换入10％蔗糖(Sucrose)、及5％甘油(Glycerol)于0.1MPB抽真空30分钟，再换至15％蔗糖(Sucrose)、及10％甘油(Glycerol)于0.1M PB抽真空6小时，最后，左肺置入4℃下30％蔗糖(Sucrose)于0.1M PB，待组织沉底。再取出以冷冻包埋剂固定于组织放台上，使用冷冻切片机于-20℃下进行冷冻切片，将肺组织切成30μm的组织片，以包埋液(Fluoromount Aqueous Mounting Medium)(Sigma F4680-25ml)封片后，直接在荧光显微镜下拍照，并观察人类脐带间质干细胞的分布情形。

1.14以抗人类核抗原(Anti-human nuclear Ag)免疫染色标定人类脐带间质干细胞

以免疫组织染色观察人类脐带间质干细胞。以小鼠抗人类特异性核抗原抗体(Mouse anti-human specific nuclei antigen antibody)(Millipore，1:100)，于4℃下反应至少36-42小时，以0.1M PBS清洗5分钟3次，接着，与二级抗体山羊抗小鼠IgG-共轭生物素(KPL，1：250)于室温下反应60分钟，再以卵白素(抗生物素)-生物素结合的辣根过氧化物酶复合物(Avidin-biotinylated-horseradish peroxidase complex)(ABC Kit，VectorLaboratories)于室温下反应60分钟后，以0.1M PBS清洗5分钟3次，最后，以DAB(5mg DAB，30％H₂O₂ 3.5μl in 10ml Tris-HCl pH7.4)进行呈色，追踪人类脐带间质干细胞在大白鼠肺脏内的存活情形。

1.15反转录-聚合酶连锁反应(Reverse transcription-PCR，简称RT-PCR)

肺脏组织以Reagent(15596-018)萃取总RNA，并于定量后，取2μg RNA进行反转录(Bionovas AM0675-0050)，待cDNA合成后，将cDNA稀释10倍后，取1μl的cDNA进行聚合酶连锁反应(Polymerase Chain Reaction)，使用下叙引子。

(1)人类SP-D{F:5’-AGGAGCAAAGGGAGAAAGTGG-3’；(SEQ ID NO:1)

R:5’-GCTGTGCCTCCGTAAATGGT-3’、(SEQ ID NO:2)

(2)人类PECAM1{F:5’-TCAAGAAAAGCAACACAGTCC-3’；(SEQ ID NO:3)

R:5’-ACTCCGATGATAACCACTGC-3’、(SEQ ID NO:4)

(3)人类GAPDH{F:5’-TCCTCCACCTTTGACGCT-3’；(SEQ ID NO:5)

R:5’-TCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3’、(SEQ ID NO:6)

(4)大鼠GAPDH{F:5’-CTCTACCCACGGCAAGTTCAAC-3’；(SEQ ID NO:7)

R:5’-GGTGAAGACGCCAGTAGACTCCA-3’、(SEQ ID NO:8)

(5)人类/大鼠β-肌动蛋白(actin){F:5’-TTGTAACCAACTGGGACGATATGG-3’；(SEQID NO:9)

R:5’-GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG-3’(SEQ ID NO:10)

温度条件设定：在95℃下活化酵素10分钟后，在95℃变性(Denature)30秒；56-60℃黏合(Annealing)30秒；72℃延伸(Extension)1分钟，持续35个循环，最后在72℃5分钟。完成后的PCR产物，以2％琼脂糖凝胶(Agarose gel)进行电泳，完成后放到紫外光(UV)箱中显像与照相。

1.16西方墨渍(Western Blot)

取各组大白鼠的肺脏组织，放入钵中加入液态氮，磨碎后加入适量裂解缓冲液(lysis buffer)(Millipore 20-188)，于4℃作用至隔夜，待肺脏组织均质化后，在4℃以13000rpm离心30分钟，取上清液备用。以Bradford之蛋白质定量方法(Bradford,1976)测定蛋白质含量。

制备5％焦集胶体(stacking gel)和10％分离胶体(running gel)，将肺脏组织蛋白质分别加到个别的孔槽中，并在一空白孔槽中加入标准分子量溶液(Protein marker，Fermentas SM0671)。电泳槽中加入分离缓冲液(Running buffer)，以电压50V使蛋白通过焦集胶体(Stacking gel)，再以120V使蛋白质通过分离胶体(Running gel)，完成后取出十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-page)。

使用BIO-RAD中Trans-Blot Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell的***，由阳极到负极依序排列滤纸、聚偏氯乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF paper)、SDSpage、滤纸，并以操作移转缓冲液(working transfer buffer)润湿，将SDS page中的蛋白质以15V、50分钟，转到聚偏氯乙烯膜上。

将聚偏氯乙烯膜以0.1％PBST溶液(0.1％Tween-20in 0.1M PBS)清洗三次各5分钟。再以阻断溶液(Blocking solution)(3％牛血清白蛋白(Albumin bovine serumn)于0.1％PBST)于室温作用60分钟后，分别加入欲观察之初级抗体小鼠抗α-SMA抗体(Sigma，1：1000)、兔抗pro-SPC抗体(Millipore，1：1000)、兔抗MMP-2抗体(Abcam，1：1000)、兔antiMMP-9抗体(Abcam，1：1000)、小鼠抗TLR-4抗体(Abcam，1：1000)、与作为内部控制组(Internal control)的初级抗体小鼠抗β-肌动蛋白抗体(Sigma，1：10000)。置于4℃反应12-18小时。接着，进行二级抗体接合山羊抗小鼠IgG共轭(Abcam，1:10000)、山羊抗兔IgG共轭(Abcam，1:10000)，在室温下反应1小时，再以0.1％PBST清洗三次各5分钟，最后将膜(Membrane)夹出，充分吸干水分后，加上化学冷光剂(Chemiluminescent reagent)(Bio-rad 170-5060)作用，使用冷光仪(GE healthcare.,LAS4000-I冷光荧光影像撷取***)侦测讯号与照相。使用Image J软件计算各个蛋白质Band之数值，除以各自的内部控制组(Internal control)，进行定量比较。

1.17生物激素分析(Cytokine Array)

使用Human Cytokine Antibody Array C2000(AAH-CYT-2000-8)侦测人类脐带间质干细胞所合成、或分泌的生物激素(Cytokine)。另外，使用Rat Cytokine Antibody Array C2(AAR-CYT-2-8)侦测大白鼠肺脏组织本身所合成、或分泌的生物激素(Cytokine)。

收集正常组、病鼠组、人类脐带间质干细胞治疗组的肺脏蛋白样本后，于-80℃存放备用。将每组蛋白以阻断缓冲液(blocking buffer)配置成总蛋白量250ug于1ml阻断缓冲液(blocking buffer)，与生物激素抗体分析膜(cytokine antibody arraymembranes)，于室温下作用2小时。以2ml清洗缓冲液(wash buffer)I清洗三次，每次5分钟。加入1ml生物素结合的抗体鸡尾酒(biotinylated antibody cocktail)于室温下作用2小时。再加入2ml以1:1000比例稀释之HRP-链亲和素(Streptavidin)室温下作用2小时。最后将膜夹出，加上化学冷光剂(Chemiluminescent reagent)(Bio-rad 170-5060)作用，使用冷光仪(GE healthcare.,LAS4000-I冷光荧光影像撷取***)侦测讯号与照相。

1.18统计分析(Statistical Analysis)

所有实验数据以Mean±SEM(Standard error of the mean)表示。各平均值间的比较以单因子变异系数分析(One-Way ANOVA)、或双因子变异系数分析(Two-Way ANOVA)，再以Fishers least significant difference(LSD)test进行多重比较。实验数据皆以p＜0.05作为具有显著差异的最低起始标准。

2.结果

2.1大白鼠单侧左叶肺脏纤维化的动物模式成功建立

大白鼠在给予BLM药物伤害后不同天数牺牲，取其左、右肺脏，观察肺部的外观型态。由前面观、与背面观照片显示，正常组大白鼠的左、右肺均可以看见白色肺泡结构，肺泡呈现完整、平滑的情形(图2，标记B,b)。在BLM伤害后第7天，左肺明显的萎缩，健康的肺泡仅出现在左肺的外周围，左肺的中央区域已经呈现没有肺泡的病变组织(图2，标记C,c)。在BLM伤害后第14、21、28天，周围剩余的肺泡略为减少，并且，左肺中央区域的病变组织呈现干扁的情形，此现象一直持续到给药后的第49天图(图2，标记D-G)。

分离左肺，并单独进行前面观、与背面观的拍照观察，更清楚的显示，正常组大白鼠左肺的白色肺泡完整。BLM伤害组大白鼠在第7天，健康的肺泡仅出现在左肺的外周围，左肺中央区域肺泡消失，出现类似***的构造。从第14天到第49天，左肺肺泡只存在外周围，左肺中央区域的***日趋干瘪。

取BLM组伤害后不同天数大白鼠的左肺组织切片，经HE染色，由低倍率到高倍率放大左肺的中央区域照片显示，正常组大白鼠左肺肺泡完整，***多存在于支气管周围，肺泡与肺泡之间的***极少。BLM伤害组的左肺，第7天至第49天，完整的肺泡只出现在左肺的外周围，中央区域均为大量细胞浸润的现象。加总所有HE染色的左肺切片，结果显示，BLM伤害组在第7天开始，左肺体积明显萎缩至2cm³左右，萎缩的左肺，仍有肺泡结构的体积约占0.6cm³，大量细胞浸润的实质化组织，则占左肺体积的70％左右。这样的左肺结构一直维持到BLM伤害后第49天(图3A,图3B,图3C)。

取BLM组伤害后不同天数大白鼠的左肺，经天狼猩红(Sirius red)染色，由低倍率到高倍率放大照片显示，染上红色为胶原蛋白存在的位置。在正常组大白鼠的左肺中，胶原蛋白主要出现在支气管周边、血管旁边(图3D)。BLM伤害组的左肺，在BLM伤害后第7天到第14天，染上红色胶原蛋白的面积没有明显增加(图3D)。在BLM伤害后第21天开始，染上红色胶原蛋白的面积明显上升，则代表肺纤维化的病况也明显增加，而此纤维化病况一直到给药后第49天都没有改善，纤维化面积从第21天到第49天，也一直维持相当的稳定(图3D)。正因为如此，我们选择在BLM伤害后第21天，将干细胞植入大白鼠气管内。

从型态组织结果显示，大白鼠单侧左叶肺脏纤维化的动物模式已经成功建立。

2.2移植人类脐带间质干细胞，可以增加肺纤维化病鼠的体重

正常组大白鼠随着时间增加，体重也有逐渐上升的情形。BLM伤害组大白鼠体重在给予BLM伤害后第7天，体重有明显停滞的现象。之后，体重随着时间虽然也有增长，但与正常组大白鼠相较，呈现明显减少的现象，并且，体重较低的趋势一直持续到给药后第49天。在BLM+HUMSCs(LD)组、以及BLM+HUMSCs(HD)组大白鼠，在给予BLM伤害后的第7天，体重趋势与BLM伤害组趋势相同，都有明显的停滞，与正常组大白鼠相较，都有明显较轻的情形。在BLM伤害后第7天到第49天，BLM+HUMSCs(LD)组的大白鼠，体重虽然仍有增加，但与BLM伤害组大白鼠并没有统计差异，而且仍然较正常组大白鼠明显减轻。BLM+HUMSCs(HD)组的大白鼠，体重在第35天后，与BLM伤害组相较，已经呈现明显的增加情形，并且已与正常组没有差异，推测移植高剂量的人类脐带间质干细胞，可以改善肺纤维化病鼠的体重(图5)。

2.3移植人类脐带间质干细胞，能提升肺纤维化病鼠的动脉血氧饱和度(SpO2)

以脉冲式血氧浓度仪分析动脉血氧饱和度，藉此评估肺部气体交换的功能。结果显示，在实验的第49天，正常组大白鼠的血氧饱和度均维持在97.2±0.8％(图6A)。BLM伤害组大白鼠的血氧饱和度在BLM伤害后第7天显著的降低到82.9±3.2％，一直到第49天，血氧饱和度大约维持在80±2.7％，与正常组大白鼠相较，均呈现明显的减少(图6A)。BLM+HUMSCs(LD)组、以及BLM+HUMSCs(HD)组大白鼠，在BLM伤害后第7天到第21天之间，血氧饱和度显著的降低，趋势与BLM伤害组相同。干细胞在第21天进行移植，BLM+HUMSCs(LD)组在第35天，可以看到血氧饱和度有上升的情形，上升趋势一直到第49天，血氧饱和度维持在85.3±3.0％，相较BLM伤害组有明显改善，但与正常组大白鼠相较，还是呈现显著的减少情形(图6A)。BLM+HUMSCs(HD)组在第28天，即可看到血氧饱和度明显的提升，一直持续上升至第49天，维持在92.3±2.3％，相较于BLM伤害组有明显改善；甚至较BLM+HUMSCs(LD)组有更佳的改善效果；但与正常组大白鼠相较，还是呈现明显的减少(图6A)，推测移植人类脐带间质干细胞，可以提高肺纤维化病鼠的肺部气体交换功能(图6A)。

2.4移植人类脐带间质干细胞，能舒缓肺纤维化病鼠的呼吸速率

利用肺功能检测机来侦测大白鼠的呼吸状态，由定性图得知，正常组大白鼠一直都保持呼吸速率相当稳定的情形，两秒内的呼吸次数约为4到5次(图6B)。在BLM伤害后第7天到第49天，呼吸速率都明显增加为每分钟303.90±48.77～203.37±54.34次(图6B)。BLM+HUMSCs(LD)组、以及BLM+HUMSCs(HD)组大白鼠，在BLM伤害后第7天到第21天之间，呼吸频率明显增加，趋势与BLM伤害组相同。BLM+HUMSCs(LD)组大白鼠在第49天，可以看到呼吸频率有减缓到每分钟172.19±58.28次(图6B)。BLM+HUMSCs(HD)组大白鼠的呼吸频率，在第28天开始，与BLM伤害组相比，就已经有舒缓的情形，而此改善情形，一直维持到第49天(图6B)。推测移植人类脐带间质干细胞，可以提高肺纤维化病鼠肺部的呼吸效能，因此，舒缓呼吸急促的现象。

2.5核磁共振造影显示，移植人类脐带间质干细胞，能增加肺纤维化病鼠左肺的肺泡空间

各组大白鼠进行肺部水平切面MRI影像扫描，以左、右支气管分岔位置(Carina oftrachea)为定位标志，往前、及往后再各取两片扫描图片，因此，每只老鼠在每个实验的时间点，都选取这五片影像扫描的左肺黑色空间的总和，来代表这只老鼠左肺的肺泡体积。胸腔内黑色讯号代表肺泡占有的空间、白色讯号代表实质化的组织。结果发现，正常组大白鼠之左、右肺因肺泡的存在，影像均呈现黑色讯号。在BLM伤害后的第7天，可以发现左肺空间因为发炎、白血球与组织液浸润，因而出现白色讯号。到了第14天，左肺的肺泡空间几乎完全丧失，完全被实质化组织占据，此现象一直维持到BLM伤害后第49天(图4A)。

BLM+HUMSCs(LD)组、以及BLM+HUMSCs(HD)组大白鼠，在BLM伤害后第7天到第21天之间，左肺之肺泡空间开始出现白色讯号，肺泡空间逐渐丧失，被实质化组织占据。第21天进行移植人类脐带间质干细胞，在第28天到第49天之间，BLM+HUMSCs(LD)组大白鼠左肺的肺泡空间同样被白色实质组织所占据，和与BLM伤害组大白鼠相较，并没有改善的情形。BLM+HUMSCs(HD)组大白鼠的左肺，可以清楚观察到，左肺肺泡的空间，与BLM伤害组大白鼠相较，有统计上的增加；与正常组大白鼠相比，也没有明显差异(图4A)。因此，移植高剂量人类脐带间质干细胞，可以增加肺纤维化病鼠左肺的肺泡空间。

2.6由外型巨观显示，移植人类脐带间质干细胞，能改善肺纤维化病鼠左肺的萎缩

取出左、右肺脏，观察肺部的外观型态。BLM+HUMSCs(LD)组大白鼠左肺的变化与BLM伤害组相近(图2，标示H及h)。然而，BLM+HUMSCs(HD)组大白鼠的左肺肺泡明显较BLM伤害组改善许多(图2，标示I及i)。

2.7苏木紫-伊红染色显示，移植人类脐带间质干细胞，能修复肺纤维化病鼠左肺的肺泡结构

各组大白鼠的左肺组织切片，经HE染色，由低倍率到高倍率，分别放大左肺的中央区域、与左肺的外周围。由左肺的中央区域照片显示，正常组大白鼠左肺肺泡完整，***多存在于支气管周围，肺泡与肺泡之间的***极少。BLM伤害组的左肺，第7天至第49天，完整的肺泡只出现在左肺的外周围，中央区域均为大量细胞浸润的现象。BLM+HUMSCs(LD)组大白鼠的左肺，健康肺泡也仅存在于左肺的外周围，中央区域仍然是大量的细胞浸润。而BLM+HUMSCs(HD)组大白鼠，在第49天，左肺中央区域被细胞浸润的区域明显减少、肺泡空间明显增加。加总所有HE染色的左肺组织切片，经由统计定量，结果显示，BLM伤害组在第7天开始，左肺体积明显萎缩至2.08±0.67cm³左右，萎缩的左肺，仍有肺泡结构的体积约占0.59±0.22cm³，大量细胞浸润的实质化组织，则占左肺体积的70％左右。这样的左肺结构一直维持到BLM伤害后第49天(图3A,图3B,图3C)。BLM+HUMSCs(LD)组大白鼠左肺的总体积、肺泡总容积、和白血球浸润比例，都和BLM伤害组相近，并没有统计差异(图3A,图3B,图3C)。BLM+HUMSCs(HD)组大白鼠的左肺体积维持在6cm³左右，左肺肺泡所占体积约3.3cm³，与正常组大白鼠左肺的结构比例相当，而***与细胞浸润所占体积，与BLM伤害组相比，则有明显的减少，推测移植高剂量人类脐带间质干细胞，可以降低细胞浸润的情形，并且提升左肺的整体体积、回复左肺的肺泡空间(图3A,图3B,图3C)。

先前肺功能的实验结果，移植低剂量的人类脐带间质干细胞，大白鼠的肺功能，无论是血氧饱和度、或呼吸频率都有显著的进步，然而，在MRI影像定量、肺脏外观、与HE染色定量左肺的总体积，都没有显著的改善情形，因此，我们研究BLM+HUMSCs(LD)组大白鼠的肺部功能。进一步，定量各组大白鼠左肺外周围，仍保有肺泡的区域内，单位面积内所含肺泡的数量、及单位面积内所含肺泡的圆周总长度，藉以评估肺泡交换气体的效能。从HE染色的图片结果显示，正常组大白鼠左肺***区域的肺泡，肺泡较小，因此，在单位面积下肺泡数量较多、所能进行气体交换的肺泡圆周总长度较长(图4B及图4C)。BLM伤害后第7天至第49天，左肺***含有肺泡的区域内，肺泡体积逐渐变大，使得单位面积下的肺泡数量减少，并且，单位面积内肺泡圆周总长度也明显较正常组低，意味着，气体交换的截面积明显减少(图4B及图4C)。BLM+HUMSCs(LD)组、或是BLM+HUMSCs(HD)组，第49天，其左肺***区域内肺泡截面积明显回复，因此，单位面积内肺泡数量、与肺泡圆周总长度，与BLM伤害组相比，均有明显的增加，但仍然与正常组有统计差异，推测移植人类脐带间质干细胞，可以改善肺纤维化病鼠左肺***区域剩余的肺泡结构、因此提升肺泡交换气体的效能(图4B及图4C)。

2.8组织纤维化染色显示，移植人类脐带间质干细胞，能降低肺纤维化病鼠左肺内的胶原蛋白

各组大白鼠的左肺切片，经天狼猩红(Sirius red)染色，由低倍率到高倍率放大照片显示，染上红色为胶原蛋白存在的位置。在正常组大白鼠的左肺中，胶原蛋白主要出现在支气管周边、血管旁边。BLM伤害后第7天至第14天，左肺纤维化稍微的增加。在BLM伤害后第21天开始，染上红色胶原蛋白的面积明显上升，则代表肺纤维化的病况也明显增加，而此纤维化病况一直到给药后第49天都没有改善(图3D)。BLM+HUMSCs(LD)组大白鼠，在第49天时，左肺胶原蛋白的沉积量，与BLM伤害组大白鼠的第21天到第49天相较，有明显的减少，但是与正常组大白鼠相比，还是有统计上的增加(图3D)。BLM+HUMSCs(HD)组大白鼠左肺的胶原蛋白的沉积量，不仅较BLM伤害组的第21天到第49天来得低，和正常组大白鼠相较，也没有统计上差异，推测移植人类脐带间质干细胞，可降低肺纤维化病鼠左肺胶原蛋白的沉积(图3D)。

2.9移植入大白鼠肺脏中的人类脐带间质干细胞，可存活于大白鼠的肺脏组织内

以BisBenzimide标定人类脐带间质干细胞，显示干细胞存活并分布于肺纤维化病鼠的左肺中

培养中的人类脐带间质干细胞以Bisbenzimide处理48小时后，使干细胞的细胞核被标定上蓝色荧光，将被标定蓝色荧光之干细胞，在BLM伤害后的第21天植入病鼠的气管内，移植四周后，进行连续冷冻切片观察，不论是左肺的最外侧(图7，标示A,a,a1-a4)、中间部位(图7，标示B,b,b1-b4、及内侧靠近肺门处(图7，标示C,c,c1-c4)，均可观察到，被标定上蓝色荧光的人类脐带间质干细胞大量存活、并且分布在于BLM病鼠的肺脏内。

2.10以抗人类特异性核抗原进行组织免疫染色，显示人类脐带间质干细胞存活并分布于肺纤维化病鼠的左肺中

以抗人类特异性核抗原抗体进行组织免疫染色，以标识出人脐带间质干细胞。结果显示，无论是BLM+HUMSCs(LD)组、或BLM+HUMSCs(HD)组大白鼠的左肺，在第49天，仍然可以发现数量不少的人类脐带间质干细胞的存在，其中大都分布在左肺的***中，少数则分布在肺泡周围(图8，标示D,D1-D3,E,E1-E3)。

2.11移植入大白鼠肺脏中的人类脐带间质干细胞，并没有分化成肺泡上皮细胞

正常(Normal)组第49天、BLM伤害组第49天、和BLM+HUMSCs(HD)组第49天的大白鼠左肺组织，进行研磨，抽取RNA，转成cDNA后，利用人表面活性蛋白B(Human surfactantprotein D)(简称SP-D)与人血小板内皮细胞粘附分子(Human platelet endothelialcell adhesion molecule)(简称PECAM-1)的引子，探讨人类脐带间质干细胞是否有分化成人类的肺泡上皮细胞、或血管内皮细胞。RT-PCR的结果显示，BLM+HUMSCs(HD)组大白鼠因有接受人类脐带间质干细胞的移植，并且植入的人类脐带间质干细胞在移植四周后，仍然存在于大白鼠左肺组织中，因此侦测到人GAPDH的表达。然而，大白鼠的左肺中侦测不到人类SP-D、与PECAM-1的表达，所以，推测人类脐带间质干细胞在大白鼠的肺脏中并没有分化成为肺泡上皮细胞、及血管内皮细胞，意味植入的人类脐带间质干细胞并不是藉由分化来达到修复大白鼠的左肺(图9)。

2.12移植人类脐带间质干细胞，能降低肺纤维化病鼠左肺内纤维母细胞的活化

各组大白鼠的左肺脏切片，以抗-α-SMA抗体进行组织免疫染色、与西方墨渍法，以标识出活化态的纤维母细胞存在、及产量。结果显示，正常组大白鼠左肺中仅有极少量活化态纤维母细胞存在。BLM伤害组的左肺，在第7天到第49天，均可以看到α-SMA的表现量较正常组明显增加(图10)。BLM+HUMSCs(LD)组大白鼠，第49天，左肺的α-SMA的表现量，与BLM伤害组相较并没有明显的改善。BLM+HUMSCs(HD)组的大白鼠，在第49天，其左肺的α-SMA的表现量显著降低，推测移植高剂量的人类脐带间质干细胞，能降低肺纤维化病鼠左肺内纤维母细胞的活化(图10)。

2.13移植人类脐带间质干细胞，能刺激肺纤维化病鼠左肺内巨噬细胞的活化，并增加左肺内的MMP-9生成，促进胶原蛋白的分解

以西方墨渍法，定量各组大白鼠左肺中基质金属蛋白酶(Matrixmetallopeptidase)9(简称MMP-9)、及基质金属蛋白酶(Matrix metallopeptidase)2(简称MMP-2)蛋白质的含量，结果显示，不论是移植低剂量、或高剂量的人类脐带间质干细胞，都能增加左肺内的MMP-9的含量，而MMP-2则没有明显的改变，推测MMP-9的增加可以帮助肺脏已经纤维化的区域内，胶原蛋白的分解(图11)。

进一步，为了探求MMP-9是来自于人类脐带间质干细胞、或巨噬细胞，我们分别进行抗-MMP-9和抗-ED1、抗-MMP-9和抗-人类核酸(Anti-Human nuclei)双荧光免疫组织染色。在BLM+HUMSCs(HD)组大白鼠的肺脏中染上MMP-9的细胞数目极多，而大多数是由巨噬细胞所合成，然而，几乎侦测不到MMP-9与人类脐带间质干细胞同时标识在一起的情形。进一步，由抗-ED1和抗-人类核酸(Anti-Human nuclei)抗体双荧光免疫染色发现，肺纤维化大白鼠左肺内，几乎侦测不到ED1-阳性的巨噬细胞和人类脐带间质干细胞有共同定位在一起的现象。推测移植人类脐带间质干细胞，能刺激肺纤维化病鼠左肺内老鼠自体巨噬细胞的活化，活化的巨噬细胞大量合成MMP-9，因此帮助胶原蛋白的分解。

2.14移植人类脐带间质干细胞，可增进肺纤维化病鼠左肺内TLR-4表现，加速肺泡上皮细胞的修复

由西方墨渍法，各组大白鼠左肺中类铎受体(Toll-like receptor)4(简称TLR-4)蛋白质的含量。结果显示，正常组与BLM伤害组大白鼠的左肺中仅有少量的TLR-4表现。不论是BLM+HUMSCs(LD)组、及BLM+HUMSCs(HD)组、大白鼠左肺内TLR-4的表现量则明显增加，推测移植人类脐带间质干细胞，可增进肺纤维化病鼠左肺内TLR-4蛋白质的生成，以便增进肺泡上皮细胞的修复(图12)。

2.15移植的人类脐带间质干细胞，释出生物激素，帮助肺纤维化病鼠的肺脏修复

为了探讨植入大白鼠肺脏内之人类脐带间质干细胞是否分泌人类生物激素、以及是否进而影响大白鼠自体生物激素的改变，所以，分别以Human CytokineAntibody Array C2000(AAH-CYT-2000-8)检测各组大白鼠左肺中174种人类生物激素的变化情形。同时，使用Rat Cytokine Antibody Array C2(AAR-CYT-2-8)检测各组大白鼠左肺内34种自体生物激素的变化情形。结果显示，BLM+HUMSCs(HD)组大白鼠左肺中，有人类纤维母细胞生长因子(FGF)-6、和***(IGF)-1的大量存在(图13A)。同时，BLM药物的伤害，导致大白鼠左肺中自体IL-13、瘦素(Leptin)、LIX、L-选择素(Selectin)、单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)的表现大量增加(图13B)。因为移植高剂量人类脐带间质干细胞，也刺激大白鼠左肺产生较多的β-神经滋养因子(nerve growth factor)(NGF)、神经趋化蛋白(Fractalkine)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF),GM-CSF(图13B)。

3.结论

移植脐带间质干细胞，明显改善肺部白血球浸润、胶原蛋白沉积、肺泡空间减少的情形。在移植后一个月，植入大白鼠肺脏中的人类脐带间质干细胞仍然存活并分布于大白鼠肺脏中，并没有分化成肺泡上皮细胞，而是分泌生物激素，进行治疗肺脏纤维化。一方面产生抗发炎作用，降低纤维母细胞的活化；另一方面，刺激大白鼠巨噬细胞的活化、并合成大量的MMP-9，用以分解已经存在的胶原蛋白。第三，也促进大白鼠的肺泡上皮细胞大量表现TLR-4，以加速肺泡上皮细胞的修复。因此，我们使用HUMSC为肺纤维化患者提供了一种新颖且有效的治疗策略，其不仅防止了炎症反应的进展和纤维化的形成，而且促进了已发生的纤维化组织的降解和肺泡上皮细胞的恢复，供肺部再生，从而使患者在根本上从纤维化的损伤中恢复过来。

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序列表

<110> 傅毓秀

<120> 脐带间质干细胞用于治疗肺纤维化的用途

<130> 980004CG

<160> 10

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人类 SP-D

<400> 1

AGGAGCAAAGGGAGAAAGTGG

1 5 10 15 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人类 SP-D

<400> 2

GCTGTGCCTCCGTAAATGGT

1 5 10 15 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人类 PECAM1

<400> 3

TCAAGAAAAGCAACACAGTCC

1 5 10 15 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人类 PECAM1

<400> 4

ACTCCGATGATAACCACTGC

1 5 10 15 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人类 GAPDH

<400> 5

TCCTCCACCTTTGACGCT

1 5 10 15

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人类 GAPDH

<400> 6

TCTTCCTCTTGTGCTCTTGC

1 5 10 15 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 大鼠 GAPDH

<400> 7

CTCTACCCACGGCAAGTTCAAC

1 5 10 15 20

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 大鼠 GAPDH

<400> 8

GGTGAAGACGCCAGTAGACTCCA

1 5 10 15 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人类/大鼠 β-肌动蛋白(actin)

<400> 9

TTGTAACCAACTGGGACGATATGG

1 5 10 15 20

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人类/大鼠 β-肌动蛋白(actin)

<400> 10

GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG

1 5 10 15 20

Claims

1.一种脐带间质干细胞(UMSCs)在制造治疗肺部的纤维化症状的药物的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述的UMSCs是从脐带的瓦顿氏凝胶获得。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述的UMSCs是人类脐带间质干细胞(HUMSCs)。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述的UMSCs有效降低或缓解一或多种肺部的纤维化症状，所述的肺部的纤维化症状选自以下所组成的群组：肺部的胶原沉积水平升高，肺部的细胞浸润水平升高，肺部的密度水平升高，和肺部的纤维母细胞活化水平升高，上述症状是与正常水平相比而言。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述的UMSCs有效地提升一或多种选自以下所组成的群组的症状：降低的肺部体积水平，降低的肺部空间水平，和降低的肺泡数量，上述症状是与正常水平相比而言。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述的UMSCs有效地改善降低的血氧饱和度水平，缓解增加的呼吸速率和/或恢复肺的萎缩。

7.根据权利要求1所述的用途，其中所述的UMSCs有效促进已经在肺中发生的纤维化组织的降解。

8.根据权利要求1所述的用途，其中所述的UMSCs有效促进肺上皮的恢复。

9.根据权利要求1所述的用途，其中所述UMSCs经由注射施用。