CN108318464A - 一种超分辨荧光波动显微成像方法、装置及存储介质 - Google Patents

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CN108318464A CN201810062369.3A CN201810062369A CN108318464A CN 108318464 A CN108318464 A CN 108318464A CN 201810062369 A CN201810062369 A CN 201810062369A CN 108318464 A CN108318464 A CN 108318464A
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吴晶晶
李四维
曹慧群
陈丹妮
屈军乐
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Abstract

本发明公开了一种超分辨荧光波动显微成像方法、装置及存储介质，所述超分辨荧光波动显微成像方法为采集经荧光分子标记后的样品通过荧光显微成像***的若干幅探测图像；对所述探测图像进行傅里叶变换，获得所述若干幅探测图像的傅里叶频谱；设置样品结构和荧光强度波动的初始估计值，基于所述样品结构和荧光强度波动的初始估计值以及若干幅探测图像，根据预设迭代算法进行预设次迭代计算后输出所述样品的成像结果。通过将荧光闪烁的强度变化作为普通结构光成像中所需的随机散斑，并通过迭代算法获得超分辨图像，既不需要额外的实验装置引入结构光，也能在较少的探测次数下提高结构光照明显微成像的分辨率，实现了分辨率与成像成本之间的平衡。

Description

一种超分辨荧光波动显微成像方法、装置及存储介质
技术领域
本发明涉及显微成像技术领域，特别涉及一种超分辨荧光波动显微成像方法、装置及存储介质。
背景技术
荧光光学显微技术作为光学显微镜的一种，其空间分辨率同样受到衍射极限的限制。为了突破衍射极限，目前已有的方法包括结构光照明显微技术(SIM)、单分子定位显微(STORM,PALM)和荧光波动成像(SOFI)等等。其中SIM是利用设计的结构光照射样品，对***的点扩散函数进行调制，从而获得样品的高频信息，实现超分辨成像。但是这种方法在引入结构光时，就需要一些额外的装置，同时结构光的最高频率受到衍射极限的限制，这限制了普通SIM成像理论上可达到的最高的分辨率。
而STORM、PALM和SOFI则是利用荧光分子的开关效应、闪烁效应等特殊性质来实现超分辨成像的方法。其中，STORM和PALM属于单分子定位显微技术，是利用荧光光开关效应或其他机制随机稀疏激发荧光分子，再对稀疏的光斑进行定位的方法，可以达到纳米级分辨率。而SOFI则是利用荧光闪烁效应，对随时间变化的强度序列进行统计分析的方法。这几种方法所需要的探测次数远远大于SIM成像，这就使得这种方法的时间分辨率较低。
因而现有技术还有待改进和提高。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种超分辨荧光波动显微成像方法、装置及存储介质，通过将荧光闪烁的强度变化作为普通结构光成像中所需的随机散斑，并通过迭代算法获得超分辨图像，既不需要额外的实验装置引入结构光，也能在较少的探测次数下提高结构光照明显微成像的分辨率，实现了分辨率与成像成本之间的平衡。
为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：
一种超分辨荧光波动显微成像方法，其包括如下步骤：
采集经荧光分子标记后的样品通过荧光显微成像***的若干幅探测图像；
对所述探测图像进行傅里叶变换，获得所述若干幅探测图像的傅里叶频谱；
设置样品结构和荧光强度波动的初始估计值，基于所述样品结构和荧光强度波动的初始估计值以及若干幅探测图像的傅里叶频谱，根据预设迭代算法进行预设次迭代计算后输出所述样品的成像结果。
所述的超分辨荧光波动显微成像方法中，所述采集经荧光分子标记后的样品通过荧光显微成像***的若干幅探测图像的步骤中，所述若干幅探测图像为：其中N为探测图像的数量，S(r)为样品结构，Pn(r)(n＝1,…,N)为荧光强度波动，PSF(r)为荧光显微成像***的点扩散函数。
所述的超分辨荧光波动显微成像方法中，所述对所述探测图像进行傅里叶变换，获得所述若干幅探测图像的傅里叶频谱的步骤中，所述若干幅探测图像的傅里叶频谱为：其中，On＝S·Pn，和分别为In和On的傅里叶频谱，OTF为荧光显微成像***的光学传递函数。
所述的超分辨荧光波动显微成像方法中，所述设置样品结构和荧光强度波动的初始估计值，基于所述样品结构和荧光强度波动的初始估计值以及若干幅探测图像的傅里叶频谱，根据预设迭代算法进行预设次迭代计算后输出所述样品的成像结果的步骤包括：
设置样品结构S和荧光强度波动Pn(n＝1,…,N)在对第n个探测图像的其中一次迭代过程中的初始估计值分别为Sg和Pn,g(n＝1,…,N)；
根据Sg和Pn,g计算第n个探测图像的荧光分布及其傅里叶频谱；
根据第n个探测图像对所述荧光分布的傅里叶频谱进行更新，并通过傅里叶逆变换获得更新后的第n个探测图像的荧光分布；
根据第n个探测图像和更新后的第n个探测图像的荧光分布对Sg和Pn,g进行更新，获得更新值Sg update和Pn,g update；
判断当前n是否小于N，若是，则令n＝n+1，返回继续计算第n+1个探测图像的荧光分布及其傅里叶频谱，直到N个探测图像全部完成迭代，将Sg和Pn,g(n＝1,…,N)全部更新为Sg update和Pn,g update，(n＝1,…,N)；
将Sg update和Pn,g update，n＝1,…,N代替Sg和Pn,g，n＝1,…,N，重新作为代入值返回继续计算第n+1个探测图像的荧光分布及其傅里叶频谱，直到达到预设迭代次数，将输出结果Sg作为所述样品的成像结果。
所述的超分辨荧光波动显微成像方法中，所述根据Sg和Pn,g计算第n个探测图像的荧光分布及其傅里叶频谱的步骤包括：
根据Sg和Pn,g计算第n个探测图像的荧光分布On,g＝Sg·Pn,g；
对所述第n个探测图像的荧光分布进行傅里叶变换，获得第n个探测图像的荧光分布的傅里叶频谱
所述的超分辨荧光波动显微成像方法中，所述根据第n个探测图像对所述荧光分布的傅里叶频谱进行更新，并通过傅里叶逆变换获得更新后的第n个探测图像的荧光分布的步骤包括：
根据第n个探测图像对所述荧光分布的傅里叶频谱进行更新，获得更新后的荧光发布的傅里叶频谱
对更新后的荧光分布的傅里叶频谱进行傅里叶逆变换，获得更新后的第n个探测图像的荧光分布
所述的超分辨荧光波动显微成像方法中，所述根据第n个探测图像和更新后的第n个探测图像的荧光分布对Sg和Pn,g进行更新，获得更新值Sg update和Pn,g update的步骤包括：
基于方程和分别Pn,g对Sg和进行更新，获得更新值Sg update和Pn,g update，其中|·|表示绝对值。
一种超分辨荧光波动显微成像装置，其包括：处理器、存储器和通信总线；
所述存储器上存储有可被所述处理器执行的计算机可读程序；
所述通信总线实现处理器和存储器之间的连接通信；
所述处理器执行所述计算机可读程序时实现如上所述的超分辨荧光波动显微成像方法中的步骤。
一种计算机可读存储介质，其特征在于，所述计算机可读存储介质存储有一个或者多个程序，所述一个或者多个程序可被一个或者多个处理器执行，以实现如上所述的超分辨荧光波动显微成像方法中的步骤。
相较于现有技术，本发明提供的超分辨荧光波动显微成像方法、装置及存储介质中，所述超分辨荧光波动显微成像方法通过采集经荧光分子标记后的样品通过荧光显微成像***的若干幅探测图像；对所述探测图像进行傅里叶变换，获得所述若干幅探测图像的傅里叶频谱；设置样品结构和荧光强度波动的初始估计值，基于所述样品结构和荧光强度波动的初始估计值以及若干幅探测图像的傅里叶频谱，根据预设迭代算法进行预设次迭代计算后输出所述样品的成像结果。通过将荧光闪烁的强度变化作为普通结构光成像中所需的随机散斑，并通过迭代算法获得超分辨图像，既不需要额外的实验装置引入结构光，也能在较少的探测次数下提高结构光照明显微成像的分辨率，实现了分辨率与成像成本之间的平衡。
附图说明
图1为本发明提供的超分辨荧光波动显微成像方法的流程图。
图2为本发明提供的超分辨荧光波动显微成像装置的结构框图。
图3为本发明应用实施例中迭代过程示意图。
图4为现有的宽场成像的超分辨成像示意图。
图5为本发明第一优选实施例提供的超分辨荧光波动显微成像方法的成像示意图。
图6为本发明第二优选实施例提供的超分辨荧光波动显微成像方法的成像示意图。
图7为图4至图6中沿线1的归一化强度分布曲线图。
图8为图4至图6中沿线2的归一化强度分布曲线图。
具体实施方式
鉴于现有技术中荧光显微成像无法同时满足时间和空间分辨率以及低成本要求等缺点，本发明的目的在于提供超分辨荧光波动显微成像方法、装置及存储介质，通过将荧光闪烁的强度变化作为普通结构光成像中所需的随机散斑，并通过迭代算法获得超分辨图像，既不需要额外的实验装置引入结构光，也能在较少的探测次数下提高结构光照明显微成像的分辨率，实现了分辨率与成像成本之间的平衡。
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1，本发明提供的超分辨荧光波动显微成像方法包括如下步骤：
S100、采集经荧光分子标记后的样品通过荧光显微成像***的若干幅探测图像；
S200、对所述探测图像进行傅里叶变换，获得所述若干幅探测图像的傅里叶频谱；
S300、设置样品结构和荧光强度波动的初始估计值，基于所述样品结构和荧光强度波动的初始估计值以及若干幅探测图像，根据预设迭代算法进行预设次迭代计算后输出所述样品的成像结果。
本发明首先对样品进行荧光标记，利用荧光闪烁特性或者荧光开关效应，采集经荧光分子标记后的样品通过荧光显微成像***的若干幅探测图像，即一系列荧光强度随时间变化的探测图像，之后对所述探测图像进行傅里叶变换，获得若干幅探测图像的傅里叶频谱，之后设置样品结构和荧光强度波动的初始估计值，基于所述样品结构和荧光强度波动的初始估计值以及若干幅探测图像的傅里叶频谱，根据预设迭代算法进行预设次迭代计算后输出所述样品的成像结果，即本发明通过荧光闪烁的强度变化作为普通结构光成像中所需的随机散斑，并通过迭代算法获得超分辨图像，既不需要额外的实验装置引入结构光，也能在较少的探测次数下提高结构光照明显微成像的分辨率，实现了分辨率与成像成本之间的平衡。
具体地，所述步骤S100中，所述若干幅探测图像序列表示为：
其中N为探测图像的数量，S(r)为样品结构，Pn(r)(n＝1,…,N)为荧光强度波动，即荧光闪烁产生的一系列荧光强度波动，PSF(r)为荧光显微成像***的点扩散函数。
所述步骤S200中，对所述探测图像进行傅里叶变换，即在频域中，公式(1)表示为：
其中，On＝S·Pn，和分别为In和On的傅里叶频谱，OTF为荧光显微成像***的光学传递函数，In和OTF为已知，S和Pn为未知，后续则通过迭代算法来重构S，得出最终成像结果。
具体地，所述步骤S300包括：
S301、设置样品结构S和荧光强度波动Pn(n＝1,…,N)在对第n个探测图像的其中一次迭代过程中的初始估计值分别为Sg和Pn,g(n＝1,…,N)；
S302、根据Sg和Pn,g计算第n个探测图像的荧光分布及其傅里叶频谱；
S303、根据第n个探测图像对所述荧光分布的傅里叶频谱进行更新，并通过傅里叶逆变换获得更新后的第n个探测图像的荧光分布；
S304、根据第n个探测图像和更新后的第n个探测图像的荧光分布对Sg和Pn,g进行更新，获得更新值Sg update和Pn,g update；
S305、判断当前n是否小于N，若是，则令n＝n+1，返回继续计算第n+1个探测图像的荧光分布及其傅里叶频谱，直到N个探测图像全部完成迭代，将Sg和Pn,g(n＝1,…,N)全部更新为Sg update和Pn,g update，(n＝1,…,N)；
S306、将Sg update和Pn,g update，n＝1,…,N代替Sg和Pn,g，n＝1,…,N，重新作为代入值返回继续计算第n+1个探测图像的荧光分布及其傅里叶频谱，直到达到预设迭代次数，将输出结果Sg作为所述样品的成像结果。
本实施例中，先设置样品结构S和荧光强度波动Pn(n＝1,…,N)在对第n个探测图像的其中一次迭代过程中的初始估计值分别为Sg和Pn,g(n＝1,…,N)，之后开始迭代过程，先根据初始估计值计算第n个探测图像的荧光分布及其傅里叶频谱，具体所述步骤S302包括：
S3021、根据Sg和Pn,g计算第n个探测图像的荧光分布On,g＝Sg·Pn,g；
S3022、对所述第n个探测图像的荧光分布进行傅里叶变换，获得第n个探测图像的荧光分布的傅里叶频谱
之后利用第n个探测图像In对所述荧光分布的傅里叶频谱进行更新，并对其进行傅里叶逆变换获得更新后的第n个探测图像的荧光分布，具体所述步骤S303包括：
S3031、根据第n个探测图像对所述荧光分布的傅里叶频谱进行更新，获得更新后的荧光发布的傅里叶频谱
S3032、对更新后的荧光分布的傅里叶频谱进行傅里叶逆变换，获得更新后的第n个探测图像的荧光分布
之后根据第n个探测图像和更新后的第n个探测图像的荧光分布对Sg和Pn,g进行更新，获得更新值Sg update和Pn,g update，具体更新过程为基于方程和分别Pn,g对Sg和进行更新，获得更新值Sg update和Pn,g update，其中|·|表示绝对值；获得更新值后用更新值Sg update代替当前Sg，判断当前n是否小于N，若是，则令n＝n+1，返回继续计算第n+1个探测图像的荧光分布及其傅里叶频谱，并利用In+1来计算Pn+1,g的更新值，直到N个探测图像全部完成迭代，即n＝N，将Sg和Pn,g(n＝1,…,N)全部更新为Sg update和Pn,g update，(n＝1,…,N)；此时将Sg update和Pn,g update，n＝1,…,N代替Sg和Pn,g，n＝1,…,N，重新作为代入值返回继续计算第n+1个探测图像的荧光分布及其傅里叶频谱，重复上述荧光分布的傅里叶频谱更新、Sg和Pn,g的更新过程，直到达到预设迭代次数，将最终输出结果Sg作为所述样品的成像结果，进而实现超分辨成像，由于无需引入结构光，因此无需额外的实验装置，并且与单分子定位显微技术相比，本发明将荧光闪烁产生的强度编号作为随机散斑，并通过迭代算法获取超分辨图像，其所需的探测次数明显小于单分子定位显微技术，即满足了时间和空间分辨率的要求，也降低了超分辨成像***的成本。
基于上述实施例提供的超分辨荧光波动显微成像方法，本发明还相应提供一种计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质存储有一个或者多个程序，所述一个或者多个程序可被一个或者多个处理器执行，以实现如上所述的超分辨荧光波动显微成像方法中的步骤。由于上文已对所述超分辨荧光波动显微成像方法进行了详细描述，此处不作详述，具体请参阅上述方法对应的实施例。
基于上述实施例提供的超分辨荧光波动显微成像方法，本发明还相应提供一种超分辨荧光波动显微成像装置，如图2所示，所述超分辨荧光波动显微成像装置处理器10、与所述处理器10通信连接的存储器20，以及用于信号传输的通信接口30，所述处理器10、存储器20以及通信接口30均通过通信总线40连接。其中，所述存储器20存储有计算机可读程序，所述计算机可读程序被处理器10执行以实现如上所述的超分辨荧光波动显微成像方法；所述处理器10用于调用所述存储器20中的计算机程序，以执行如上所述的超分辨荧光波动显微成像方法。由于上文已对所述超分辨荧光波动显微成像方法进行了详细描述，此处不作详述，具体请参阅上述方法对应的实施例。
以下结合具体实施例对本发明提供的超分辨荧光波动显微成像方法的迭代过程以及超分辨荧光波动显微成像方法的成像重构结果进行说明：
1、选择具有闪烁特性的荧光探针和样本，对样本进行荧光标记；
2、结合样品的特性，选择合适的实验装置和***参数，包括光源波长、探测器大小、显微***数值孔径、放大倍率、采样频率、采样次数等等；
3、利用现有搭建好的荧光显微成像***对样品进行采样，获得一系列强度变化的图像；
4、选定样品结构和荧光强度波动的初始估计值，代入到迭代算法中进行迭代，满足条件后输出的图像就作为最终成像结果。
具体地，如图3所示，本发明提供的超分辨荧光波动显微成像方法的中迭代算法的迭代过程为：
(1)根据估计值Sg和Pn,g计算第n个荧光分布为On,g＝Sg·Pn,g，其频谱
(2)利用第n个探测图像In对频谱进行更新：
(3)通过逆傅里叶变换就可以得到
(4)利用迭代算法对Sg和Pn,g进行更新，同时考虑到荧光激发光场均为正值，因此更新的公式如下：
其中|·|表示绝对值。
(5)用Sg update代替Sg，回到步骤(1)，令n＝n+1，并利用In+1来计算Pn+1,g的更新值，直到N个探测图像全部完成迭代，此时原估计值Sg和Pn,g(n＝1,…,N)全部更新为Sg update和Pn,g update，(n＝1,…,N)。
(6)将Sg update和Pn,g update，n＝1,…,N代替Sg和Pn,g，n＝1,…,N，重新作为代入值，重复上述过程，直到满足预设迭代次数，结束迭代。
为了验证本发明提供的超分辨荧光波动显微成像(以下简称SRFB)方法的可行性以及分辨率，如图4至图8所示，对SRFB方法与现有宽场成像的成像结果进行说明，其中实验参数如下：荧光波长为690nm，帧频为25fps，探测图像大小为128pixel×128pixel,探测器有效像素大小为100nm,NA＝1.3，探测图像数量为500。为了提高激发浓度从而减少所需探测次数，可以将500幅图像每10幅叠加到一起得到50幅更高激发浓度的图像，也可以将每20幅叠加到一起得到25幅。针对这两种情况，图4、图5和图6分别为宽场图像(widefield)、SRFB处理25幅图像(srfb，N＝25)和50幅图像(srfb，N＝50)得到的超分辨成像结果，图7和图8为图4至图6中分别沿线1和线2的归一化强度分布曲线。计算图8中高斯分布的半高宽可以得到图4至图6中单根微管结构的半高宽分别为393nm,276nm和229nm，这说明当探测图像数量为50时，本发明提供的超分辨荧光波动显微成像方法得到的图像相比宽场成像，可以实现大于2倍分辨率提高，且无需增加额外的实验装置。
综上所述，本发明提供的超分辨荧光波动显微成像方法、装置及存储介质中，所述超分辨荧光波动显微成像方法通过采集经荧光分子标记后的样品通过荧光显微成像***的若干幅探测图像；对所述探测图像进行傅里叶变换，获得所述若干幅探测图像的傅里叶频谱；设置样品结构和荧光强度波动的初始估计值，基于所述样品结构和荧光强度波动的初始估计值以及若干幅探测图像的傅里叶频谱，根据预设迭代算法进行预设次迭代计算后输出所述样品的成像结果。通过将荧光闪烁的强度变化作为普通结构光成像中所需的随机散斑，并通过迭代算法获得超分辨图像，既不需要额外的实验装置引入结构光，也能在较少的探测次数下提高结构光照明显微成像的分辨率，实现了分辨率与成像成本之间的平衡。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种超分辨荧光波动显微成像方法，其特征在于，包括如下步骤：
采集经荧光分子标记后的样品通过荧光显微成像***的若干幅探测图像；
对所述探测图像进行傅里叶变换，获得所述若干幅探测图像的傅里叶频谱；
设置样品结构和荧光强度波动的初始估计值，基于所述样品结构和荧光强度波动的初始估计值以及若干幅探测图像的傅里叶频谱，根据预设迭代算法进行预设次迭代计算后输出所述样品的成像结果。
2.根据权利要求1所述的超分辨荧光波动显微成像方法，其特征在于，所述采集经荧光分子标记后的样品通过荧光显微成像***的若干幅探测图像的步骤中，所述若干幅探测图像为： 其中N为探测图像的数量，S(r)为样品结构，Pn(r)(n＝1,…,N)为荧光强度波动，PSF(r)为荧光显微成像***的点扩散函数。
3.根据权利要求2所述的超分辨荧光波动显微成像方法，其特征在于，所述对所述探测图像进行傅里叶变换，获得所述若干幅探测图像的傅里叶频谱的步骤中，所述若干幅探测图像的傅里叶频谱为： 其中，On＝S·Pn，和分别为In和On的傅里叶频谱，OTF为荧光显微成像***的光学传递函数。
4.根据权利要求3所述的超分辨荧光波动显微成像方法，其特征在于，所述设置样品结构和荧光强度波动的初始估计值，基于所述样品结构和荧光强度波动的初始估计值以及若干幅探测图像的傅里叶频谱，根据预设迭代算法进行预设次迭代计算后输出所述样品的成像结果的步骤包括：
设置样品结构S和荧光强度波动Pn(n＝1,…,N)在对第n个探测图像的其中一次迭代过程中的初始估计值分别为Sg和Pn,g(n＝1,…,N)；
根据Sg和Pn,g计算第n个探测图像的荧光分布及其傅里叶频谱；
根据第n个探测图像对所述荧光分布的傅里叶频谱进行更新，并通过傅里叶逆变换获得更新后的第n个探测图像的荧光分布；
根据第n个探测图像和更新后的第n个探测图像的荧光分布对Sg和Pn,g进行更新，获得更新值Sg update和Pn,g update；
判断当前n是否小于N，若是，则令n＝n+1，返回继续计算第n+1个探测图像的荧光分布及其傅里叶频谱，直到N个探测图像全部完成迭代，将Sg和Pn,g(n＝1,…,N)全部更新为Sg update和Pn,g update，(n＝1,…,N)；
将Sg update和Pn,g update，n＝1,…,N代替Sg和Pn,g，n＝1,…,N，重新作为代入值返回继续计算第n+1个探测图像的荧光分布及其傅里叶频谱，直到达到预设迭代次数，将输出结果Sg作为所述样品的成像结果。
5.根据权利要求4所述的超分辨荧光波动显微成像方法，其特征在于，所述根据Sg和Pn,g计算第n个探测图像的荧光分布及其傅里叶频谱的步骤包括：
根据Sg和Pn,g计算第n个探测图像的荧光分布On,g＝Sg·Pn,g；
对所述第n个探测图像的荧光分布进行傅里叶变换，获得第n个探测图像的荧光分布的傅里叶频谱
6.根据权利要求5所述的超分辨荧光波动显微成像方法，其特征在于，所述根据第n个探测图像对所述荧光分布的傅里叶频谱进行更新，并通过傅里叶逆变换获得更新后的第n个探测图像的荧光分布的步骤包括：
根据第n个探测图像对所述荧光分布的傅里叶频谱进行更新，获得更新后的荧光发布的傅里叶频谱
对更新后的荧光分布的傅里叶频谱进行傅里叶逆变换，获得更新后的第n个探测图像的荧光分布
7.根据权利要求6所述的超分辨荧光波动显微成像方法，其特征在于，所述根据第n个探测图像和更新后的第n个探测图像的荧光分布对Sg和Pn,g进行更新，获得更新值Sg update和Pn,g update的步骤包括：
基于方程和分别Pn,g对Sg和进行更新，获得更新值Sg update和Pn,g update，其中|·|表示绝对值。
8.一种超分辨荧光波动显微成像装置，其特征在于，包括：处理器、存储器和通信总线；
所述存储器上存储有可被所述处理器执行的计算机可读程序；
所述通信总线实现处理器和存储器之间的连接通信；
所述处理器执行所述计算机可读程序时实现如权利要求1-7任意一项所述的超分辨荧光波动显微成像方法中的步骤。
9.一种计算机可读存储介质，其特征在于，所述计算机可读存储介质存储有一个或者多个程序，所述一个或者多个程序可被一个或者多个处理器执行，以实现如权利要求1-7任意一项所述的超分辨荧光波动显微成像方法中的步骤。
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