CN108314734A - 抗pd－1单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗pd－1单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种新的抗PD‑1单克隆抗体以及该抗体的可变区序列，属于生物技术领域。本发明利用重组人PD‑1蛋白(rhEPD‑1)作为免疫原，免疫BAL b/c小鼠取免疫小鼠脾脏细胞并将其与骨髓瘤细胞sp2/0‑Ag14融合，获得了可表达抗PD‑1抗体的杂交瘤细胞株，此细胞株能够稳定分泌单一的单克隆抗体。本发明同时克隆了抗PD‑1单克隆抗体的H链、L链可变区核苷酸及氨基酸序列。本发明的抗PD‑1单克隆抗体可与PD‑1特异性结合，阻断PD1与PD‑L1的结合，恢复T细胞的功能。可作为免疫检查点抑制剂，用于癌症及感染性疾病的治疗。

Description

抗PD-1单克隆抗体及其应用
技术领域：
本发明涉及一种能特异性结合PD-1的单克隆抗体，属于生物技术领域。具体涉及所述单克隆抗体的制备方法，其可变区序列及其应用。
背景技术：
杂交瘤技术(hybridoma technique)，又称单克隆抗体技术，1975年Koehler和Milstein证明，将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞进行融合，可形成针对某一抗原的特异性强的单克隆抗体。杂交瘤技术利用了骨髓瘤细胞能在体外连续传代和淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的特性，将两种细胞进行融合，则成功融合的细胞可具有这两种细胞的主要特性。
PD-1/PD-L1免疫疗法是通过阻断二者间的相互作用来提高免疫应答，具有治疗多种类型肿瘤及感染性疾病的潜力。程序性死亡受体-1(programmed death-1，PD-1)是CD28超家族成员，为一种重要的免疫抑制分子，主要表达在激活的T细胞和B细胞上。PD-1与其配体PD-Ls(programmed death-1 ligands，主要是PD-L1与PD-L2)结合能够抑制T细胞的增殖、活化和相关细胞因子的分泌，使机体免受自身免疫***的攻击。但在机体的肿瘤微环境中，肿瘤细胞高表达PD-L1，与T细胞上的PD-1发生结合后，诱导T细胞的衰竭，抑制T细胞的功能，无法有效激活免疫***，引起肿瘤细胞的免疫逃逸。而针对PD-1、PD-L1的单克隆抗体可以阻断PD-1和PD-L1的结合，使T细胞恢复活力，从而增强免疫应答。目前，多株抗PD-1和PD-L1的抗体已上市，用于多种肿瘤的治疗，如Nivolumab(抗PD-1抗体)、Keytruda(抗PD-L1抗体)等。
本发明以重组人PD-1胞外区(rhEPD-1)蛋白为抗原，通过杂交瘤技术筛选制备得到高亲和力的抗PD-1特异性单克隆抗体，并通过体内外实验验证其高效生物学活性。
发明内容
发明目的
本发明目的之一在于提供一种抗PD-1单克隆抗体制备方法；
本发明目的之二在于提供了一种抗PD-1单克隆抗体；
本发明目的之三在于提供抗PD-1单克隆抗体的可变区氨基酸序列及核酸序列。
技术方案
本发明以实验室前期制备得到的重组人PD-1蛋白作为免疫原，多次免疫Bal b/c小鼠，待其血清效价达到融合要求，取其脾细胞与sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞进行细胞融合，通过HAT选择性培养基筛选得到能稳定分泌抗PD-1抗体的杂交瘤细胞株，经亚克隆化及扩大培养后，在分子水平上进行抗体重、轻链可变区基因的调取；单克隆抗体可通过将杂交瘤细胞注射至小鼠腹腔，取腹水收集后经Protein A/G亲和层析柱纯化获得。
有益效果
本发明成功制备了抗PD-1单克隆抗体，该抗体特异性好，结合率高，能阻断PD-1与PD-L1生物结合。在体外能有效恢复淋巴细胞活性，促进人外周血淋巴细胞(PBMC)分泌IFN-γ和IL-2，并在体内实验中显示了该单克隆抗体对荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用。体内外实验显示，此抗PD-1单克隆抗体是肿瘤免疫治疗的潜在药物。
附图说明：
图1.SDS-PAGE检测Protein A/G亲和层析柱纯化产物结果。泳道M为蛋白Marker；泳道1为洗脱液中的抗体蛋白；图1A.为非还原SDS-PAGE电泳结果；图1B.为还原性SDS-PAGE电泳结果。
图2.单克隆抗体亚型鉴定ELISA结果示意图。
图3.流式细胞术检测抗体与THP-1细胞表面天然的PD-1抗原结合情况。
图4.及图5.流式细胞术检测抗体的特异性结合情况。图4.为检测抗体与CHO细胞株的结合；图5.检测抗体与稳定表达PD-1的CHO细胞(CHO-PD-1)的结合。
图6.流式细胞术检测PD-L1蛋白与THP-1细胞表面PD-1的结合情况。
图7.流式细胞术检测抗PD-1单克隆抗体阻断PD-L1与细胞表面的PD-1结合。
图8.ELISA实验示出抗体与PD-1抗原蛋白的结合曲线。
图9.流式细胞术检测单克隆抗体Pi与HEK293F-PD-1细胞结合的浓度依赖性。
图10.通过生物膜干涉技术检测分子间相互作用力测定单克隆抗体Pi与抗原的亲和力。
图11.PCR扩增抗体重、轻链可变区基因产物琼脂糖电泳结果，泳道M为DNALadder；泳道1和2为PCR扩增抗体重链可变区基因产物；泳道3为PCR扩增抗体轻链可变区基因产物。
图12.及图13.检测抗PD-1单克隆抗体对PBMC细胞因子分泌的影响。图12.为检测PBMC分泌IFN-γ的变化；图13.为检测PBMC分泌IL-2的变化。
图14.体内药效学实验。图14A.为肿瘤增长曲线；图14B.为不同组别小鼠体重变化曲线图；图14C.为不同组别小鼠瘤重结果。
具体实施方式：
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。在本发明的构思前提下对本发明制备单克隆抗体及其制备方法的简单改造，都属于本发明要求保护的范围。
下述列举的实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1 动物免疫
利用实验室前期制备的重组人PD-1蛋白(溶于PBS缓冲液中，已进行初步鉴定，非此专利重点，不做展开)与Quick Antibody等体积混合后，肌肉注射到6-8周龄BAL b/c小鼠体内，50μg/200μl/只。免疫过程按照Quick Antibody说明书进行。共进行3-5次的免疫，每次免疫一段时间后，采取毛细管取血法对免疫小鼠进行眼眶取血(50μl)，采用间接ELISA，利用封闭液梯度稀释血清后测定小鼠血清抗体效价。选择血清中特异性抗体效价最高的小鼠用于细胞融合。最终检测结果显示免疫小鼠血清效价可达1∶100,000以上。
实施例2 杂交瘤细胞株的制备
1.细胞融合
细胞融合采用聚乙二醇法。具体操作如下：
1)融合前一周，复苏sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞，可用8-氮杂鸟嘌呤调整细胞状态。在细胞融合前两天，扩大培养sp2/0-Ag14，观察状态，使其在融合前一天接近对数生长期，融合前一天换液处理；
2)一般免疫小鼠检测血清效价达到100,000即可融合。选择血清中PD-1特异性抗体效价最高的小鼠，融合前3-4天进行冲击免疫，腹腔或尾静脉注射PD-1蛋白；
3)饲养层细胞的制备(小鼠腹腔巨噬细胞)：融合前一天铺饲养层细胞，选择周龄较大(e.g.8周龄以上)的ICR小鼠，断颈处死，无菌条件下抽取腹腔巨噬细胞。将细胞稀释到1×105个/ml后铺板，每孔100μl，做好标记后放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养过夜。
4)进行细胞融合前1小时，预先处理sp2/0-Ag14细胞，重悬sp2/0-Ag14细胞后离心1,200rpm×5min，无血清DMEM重悬细胞后计数，一般总细胞数范围是0.6-2×107个，4℃暂放备用。
5)将待融合的小鼠进行眼眶取血，同上操作收集血清，暂-20℃或-80℃保存，可做融合后的阳性对照。断颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中，转移到细胞房。取脾脏进行研磨，经70μm筛网过滤制成单细胞悬液，离心2,000rpm×5min，弃上清。细胞沉淀加入红细胞裂解液处理，反应5min后离心处理，并用无血清DMEM洗一次，最后重悬，活细胞计数。
6)根据计数结果，按1∶5比例混合sp20-Ag14骨髓瘤细胞和脾细胞，混匀后离心彻底吸尽上清。取650μl 37℃预温的PEG1450(SIGMA)，缓慢滴加到细胞沉淀上，作用90s，立即加入37℃预温的无血清DMEM培养基，混匀后离心1,200×5min，细胞沉淀重悬在含HAT(SIGMA)的20％FBS-DMEM培养基中，铺到已铺有饲养层细胞的96孔板中，200μl/每孔，于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。
7)融合后定期观察细胞状态。在融合第四天，进行半换液，即用新鲜20％FBS-HAT-DMEM培养基换出培养孔板中二分之一的培养基(100μl)；融合后第7-10天，换用含HT(SIGMA)的20％FBS-DMEM培养基进行培养。
2.阳性融合细胞的筛选及亚克隆化
通过ELISA检测各孔中细胞分泌抗体的情况。以rhEPD-1蛋白作为ELISA筛选包被抗原，HRP标记的Goat anti Mouse IgG作为检测抗体，选择ELISA阳性值高的孔，显微镜下观察若有成活的杂交瘤细胞或细胞团，进行标记，挑取阳性孔，采用有限稀释法将孔中的细胞进行克隆化，经过两次亚克隆后建立稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并进行扩大培养。
实施例3 抗PD-1单克隆抗体的制备及纯化
1.腹水收集
采取腹腔注射500μl石蜡油(SIGMA)至8-10周龄雌性Bal b/c小鼠体内。一周后，腹腔注射接种1×106个生长状态良好的杂交瘤细胞。在接种杂交瘤细胞的7-10天左右，小鼠腹部明显鼓出，此时采集腹水，4℃，12,000rpm离心5min，去除细胞碎片，收集上清用于后续纯化。
2.抗体纯化
采用ProteinA/G柱填料(Abmart)进行抗体纯化。具体操作：腹水上清需用BindingBuffer稀释到一定体积并过滤除菌后再上样。上样后用Binding Buffer进行清洗，洗去非特异性结合的杂质，最后进行洗脱，加入5-10ml Elution Buffer进行目的蛋白的洗脱，收集洗脱液并立即加入Neutralization Buffer使PH值偏中性，柱填料用Binding Buffer清洗后，20％乙醇，4℃保存。
3.抗体纯度及分子量测定
收集的洗脱液用SDS-PAGE电泳初步鉴定抗体，如图1A及图1B。
实施例4 单克隆抗体的特性鉴定
1.抗体亚型的鉴定
采用Mouse单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(Proteintech)，来鉴定得到的抗PD-1单克隆抗体的亚型，酶标板上预包被了针对小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgM、kappalight chain、lambda light chain的特异性抗体，具体实验操作见试剂盒说明书。结果如图2，我们得到的抗PD-1单克隆抗体的重链亚型为IgG1，轻链亚型为Kappa。
本发明的抗体可以作为其他同型重组表达，例如IgG2，IgG3，IgG4，IgM和IgA。
2.流式细胞术检测抗体与细胞膜上PD-1的结合情况
选择细胞表面表达人PD-1的人单核细胞白血病细胞株(THP-1)和稳定表达PD-1的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)CHO-PD-1，通过流式细胞术确定抗PD-1单克隆抗体的特异性。将生长状态良好的THP-1用PBS重悬后计数，细胞密度调整至1-2×106个/ml，分装至1.5ml EP管中，每管加入等体积细胞悬液，一般100-300μl，离心800g×5min，弃上清，加入100μl稀释好的实施例3中得到的抗PD-1单克隆抗体Pi，4℃孵育30min，取出后PBS洗2-3次，再加入AF647羊抗鼠荧光二抗，4℃避光孵育30min后，洗涤操作同前，最后加入适量PBS重悬细胞沉淀，上流式细胞仪进行检测。CHO-PD-1细胞的检测方法同THP-1，分别检测抗体与CHO和CHO-PD-1细胞的结合，说明其与PD-1的特异性结合。
从流式细胞术结合情况来看(图3)，抗PD-1单克隆抗体能较好地与人细胞表面的PD-1结合，结合率可达89.9％；图4显示Pi与未经转染的CHO细胞没有结合，图5说明该单克隆抗体Pi能特异性地与稳定表达PD-1的CHO细胞(CHO-PD-1)结合。
3.单克隆抗体Pi阻断PD-L1与细胞表面的PD-1结合
PD-L1是PD-1的配体，PD-L1蛋白能够与细胞表面的PD-1结合，流式检测如图6所示，PD-L1蛋白与THP-1细胞的结合率为83.1％。以此为依据，使用流式细胞术的方法检测抗PD-1单克隆抗体阻断PD-L1与细胞表面PD-1的结合。THP-1细胞处理同前，每组加入5μg PD-L1蛋白，同时将抗PD-1单克隆抗体Pi依次按0、1、10和50μg/ml的浓度加入共孵育，流式细胞术检测PD-L1蛋白与THP-1细胞的结合情况。
从流式结果来看(图7)，1μg/ml抗PD-1单克隆抗体阻断效果可达50％，10μg/ml和50μg/ml可完全阻断PD-L1蛋白结合到细胞表面。
4.ELISA检测单克隆抗体Pi与PD-1结合的EC50
以重组人PD-1蛋白作为固相抗原，10μg/ml包被过夜，次日5％脱脂牛奶封闭2小时，随后加入单克隆抗体的梯度稀释系列，室温下反应2小时，洗涤之后加入HPR标记的羊抗鼠二抗，检测OD450值，应用GraphPad Prism 7软件进行数据处理和作图分析，通过拟合，得到抗PD-1单克隆抗体对重组人PD-1蛋白的结合曲线及EC50值，结果见图8，结果表明抗PD-1单克隆抗体可与重组人PD-1蛋白特异性结合，EC50＝0.46nmol/L。
5.流式细胞术检测单克隆抗体Pi与HEK293F-PD-1细胞结合的浓度依赖性
HEK293F是人胚肾细胞，其细胞表面不表达人PD-1抗原，我们通过细胞转染的方法转染重组PD-1重组质粒，使HEK293F细胞表面能够表达人PD-1抗原，培养72小时后，PD-1的表达量达到最大值，收集细胞制备单细胞悬液，和梯度稀释的单克隆抗体Pi进行共孵育，通过流式细胞术检测不同浓度的Pi与HEK293F-PD-1的结合情况，FlowJo软件计算结合的平均荧光强度(MFI)，应用GraphPad Prism 7软件进行数据处理和作图分析，反映其与细胞结合的浓度依耐性。
从图9的实验结果可以看出，Pi与HEK293F-PD-1细胞的结合有很好的浓度依赖性。
6.抗PD-1单克隆抗体与抗原亲和力的测定
抗PD-1单克隆抗体与PD-1的亲和力使用ForteBio Octet生物分子相互作用仪，利用生物膜干涉技术(BLI)进行测定。首先将抗原进行生物素化，使其带有生物素标签，选择链霉亲和素的生物传感器。根据这一特性(SA)，将生物素化后的抗原锚定在探头上，进行抗原抗体亲和力的测定。依次按平衡、抗原的锚定、平衡、结合、解离的顺序设定程序，使用ForteBio Octet测定亲和力。利用Octet数据分析软件对数据进行处理分析。
从图10的实验结果可以看出，BLI测定的抗PD-1单克隆抗体Pi与PD-1的亲和力为3.66×10-10nmol/L。
实施例5 阳性杂交瘤细胞株重轻链可变区基因的克隆
1.抗PD-1单克隆抗体重轻链可变区基因提取、扩增及初步鉴定
收集对数生长期的杂交瘤细胞株，用TaKaRa公司的RNAiso Plus进行总RNA的提取，具体操作见产品说明书。加入70μl RNase-free水溶解沉淀，取10μl进行核酸电泳，200V/10min。其余暂放-80℃保存或进行第一条cDNA链的合成。
以总RNA为模板反转录合成第一条cDNA，试剂购自Vazyme公司。反应体系见说明书，按照说明书反应条件置于PCR仪中进行第一条cDNA合成反应。产物可立即进行PCR扩增反应或暂放-20℃保存。
PCR扩增重轻链可变结构域基因，参考文献中根据杂交瘤细胞株抗体重轻链可变区上游及下游基因序列所设计的简并引物，引物序列如下：
5’MH1：5’-ctt ccg gaa ttc SAR GTN MAG CTG SAG SAG TC-3’
5’MH2：5’-ctt ccg gaa ttc SAR GTN MAG CTG SAG SAG TCW GG-3’
3’VH：5’-gga aga tct CTT GAC CAG GCA TCC TAG AGT CA-3’
5’Kappa：5’-Gg gag ctc GAY ATT GTG MTS ACM CAR WCT MCA-3’
3’Kappa：5’-Ggt gca tgc GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC-3’
(简并密码子说明：R＝a，g；Y＝c，t；M＝a，c；S＝c，g；W＝a，t)。
反应体系50μl，反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30s；57℃ 30s；72℃ 45s，循环30次，72℃ 7min。取10μl PCR产物跑核酸电泳进行鉴定，如图11显示，PCR扩增获得450bp左右的重轻链可变结构域基因。用胶回收试剂盒(生工生物)对PCR产物进行纯化，操作同试剂盒说明书。
因PCR扩增反应步骤中利用的是Taq Plus DNA Polymerase(Vazyme)，PCR产物的3’端带腺嘌呤(A)，所以PCR产物无需进行3’端加A反应，可直接克隆至T载体。将PCR产物连接到18-T载体，取1μl T载体，PCR产物4μl或2μl(双蒸水补足体积到4μl)混匀后，加入5μl Solution I，16℃连接过夜。
采用氯化钙转化法将连接产物转化至感受态JM109中，转化操作：取10μl连接产物转化到100μl感受态细胞JM109中，混匀后于冰水浴中静置30min，42℃水浴中热激2min，立即取出冰浴1min，每管中加入37℃预温的1ml无抗性LB培养基，37℃，150rpm缓慢震摇1h。取出后离心4,000rpm×5min，沉淀用100μl LB培养基重悬后涂布氨苄抗性平板，倒置放置于37℃恒温培养箱中培养16-20h后，观察结果。
挑取平板上克隆，在含氨苄抗性的LB培养基中培养过夜。取5μl菌液，12,000rpm×2min，吸弃上清，将菌体沉淀作为模板进行菌落PCR，操作同前。取10μl菌落PCR产物进行核酸电泳验证，挑取有带条的阳性克隆送去测序。
2.抗PD-1单克隆抗体重轻链可变结构域的基因测序及分析
测序结果显示，成功获得杂交瘤细胞株抗体可变结构域基因。通过NCBI网站上的数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)分析抗PD-1单克隆抗体重轻链可变区基因，分析结果表明：杂交瘤细胞株抗体重链可变结构域VH的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；杂交瘤细胞株轻链可变结构域VL的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示；重链可变结构域VH依次包含高变区CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述的核苷酸序列依次为SEQ ID NO：3、5、7，氨基酸序列依次为SEQ ID NO：4、6、8；轻链可变结构域VL依次包含高变区CDRL1、CDRL2和CDRL3，所述的核苷酸序列依次为SEQID NO：11、13、15，氨基酸序列依次为SEQ ID NO：12、14、16。
实施例6 抗PD-1单克隆抗体对PBMC细胞因子分泌的影响
96孔板预先包被2μg/ml CD3抗体，每孔50μl，37℃孵育4小时后取出PBS洗3次备用。从健康体检者的血液中利用淋巴细胞分离液(购自CEDARLANE)分离出PBMC，操作按照产品说明书方法进行。计数后按照每孔2×105个细胞加到上述已处理的96孔板中，体积100μl。同时每孔加5μl CD28抗体(母液浓度为20μg/ml)刺激。实验分组如下：(1)仅CD3抗体和CD28抗体刺激的PBMC；(2)CD3抗体和CD28抗体刺激，并加入PD-L1蛋白共孵育的PBMC；(3)CD3抗体和CD28抗体刺激，加入PD-L1蛋白及Pi的PBMC，每组设置三个复孔。细胞在37℃和5％CO2下培养5天后，从每孔取出培养基上清用于细胞因子测定，测定按照市售人IFN-γ和IL-2检测试剂盒(联科生物)操作进行。
结果显示(图12及图13)，PD-L1可抑制淋巴细胞的活性，减少细胞因子IFN-γ和IL-2的分泌。抗PD-1单克隆抗体阻断PD-L1和淋巴细胞表面的PD-1结合，从而恢复细胞活力，促进IFN-γ和IL-2的分泌。
实施例7 抗PD-1单克隆抗体在荷瘤小鼠模型中的抑瘤作用
选择6-8周龄的雌性Bal b/c小鼠随机分成三个小组。每组5只老鼠，分组包括：(1)对照组，(2)抗体低剂量组，(3)抗体高剂量组。对照组采用同型对照IgG进行给药，抗体高低剂量组分别给予10mg/kg和5mg/kg的抗PD-1单克隆抗体Pi。在第0天第一次给药，第1天接瘤，小鼠在左上肢近心端腋下皮下注射稳转了人PD-L1的CT26-PD-L1小鼠结肠癌细胞，2×105个细胞/小鼠，转染的CT26细胞上表达的PD-L1已证实可与抗体较好地结合。每周给药两次，尾静脉注射给药，每天观测肿瘤体积变化，待肿瘤直径达到1mm以上，可用游标卡尺进行测量即可记录肿瘤体积数据，肿瘤体积计算按照a·b2/2(a为长径，b为短径)计算，当对照组肿瘤体积达到1000mm3以上时，对小鼠进行安乐死，剥瘤称重拍照结果显示如图14A，根据结果显示，在CT26-PD-L1小鼠肿瘤模型中，根据肿瘤生长曲线，可以看出给药组较对照组对肿瘤生长有一定的抑制作用，且高剂量组抑制效果优于低剂量组，图14B显示小鼠体重组间组内均无显著差异。小鼠处死后剥瘤称重结果见图14C，给药组不论低剂量组和高剂量组与对照组比较，均有显著性差异(P＜0.01和P＜0.05)。

Claims (10)

1.抗PD-1单克隆抗体的可变区序列，其特征在于所述的抗体包括重链可变结构域VH和轻链可变结构域VL；其中，重链可变结构域VH的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO：2；重链可变结构域VH依次包含高变区CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述的核苷酸序列依次为SEQ ID NO：3、5、7，所述氨基酸序列依次为SEQ ID：4、6、8；轻链可变结构域VL的核苷酸序列为SEQ ID NO：9，氨基酸序列为SEQ ID NO：10；轻链可变结构域VL依次包含高变区CDRL1、CDRL2和CDRL3，所述的核苷酸序列依次为SEQ ID NO：11、13、15，所述氨基酸序列依次为SEQ ID：12、14、16。
2.一种抗体或抗原结合片段或多肽，能与PD-1结合，其特征在于其包含权利要求1中所述的任一一种氨基酸序列，包括SEQ ID：2、4、6、8、10、12、14、16。
3.一种抗体或抗原结合片段或多肽，能与PD-1结合，其序列与权利要求2所述的序列至少具有85％的序列相似性。
4.一种基因工程抗体，其特征在于，它所包含的重链和轻链可变区序列与权利要求1所述的可变区序列一致或具有至少85％的相似性；该基因工程抗体包括但不限于：人-鼠嵌合抗体(chimeric antibody)；或者是人源化抗体(humanized antibody，HAb)；或者是抗体的功能性片段Fab(Fragment of antigen binding，Fab)；或者是单链抗体(Single-chainvariable fragment，ScFv)；或者是重链可变区和完整轻链融合的抗体功能性片段VH-L；或者是双特异性抗体；或者是重链和轻链的一个或多个CDR的排列、串联或组合而成的抗体功能性片段；或者是上述抗体和抗体功能片段和其他各种蛋白或多肽进行连接、拼接、融合而得到的类抗体的功能性的融合蛋白。
5.一种核酸，包含权利要求1中所述的核苷酸序列，包括SEQ ID：1、3、5、7、9、11、13、15。
6.一种组合物，其包含权利要求1-5中任一项所述的抗体或抗体结合片段或多肽或核酸和至少一种药学上可接受的载体。
7.权利要求1-6中任一种抗体或抗原结合片段或多肽或核酸或组合物在肿瘤治疗中的应用。
8.权利要求1-6中任一种抗体或抗原结合片段或多肽或核酸或组合物在感染性疾病中的应用。
9.一种增强T细胞功能的方法，包括权利要求1-6中任一项所述的抗体，抗原结合片段或多肽或核酸或组合物，及其在医疗上的应用。
10.一种检测PD-1的方法，包括权利要求1-4中任一项抗体或抗原结合片段或多肽，及其在诊断中的应用。
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